Metodologia da criação de Galleria mellonella para uso como modelo de infecção e efeitos de Lactobacillus rhamnosus inativa do pelo calor in vivo e in vitro, desafiados por Staphylococcus aureuse Escherichia coli / Methodology for creation of Galleria mellonella for use as infection model and effects of inactivated Lactobacillus rhamnosus in vivo and in vitro challenged by Staphylococcus aureus and Escherichia coli

RESUMO

Galleria mellonella é utilizada para estudar a virulência de microorganismose a potência de antimicrobianos. Este estudo buscou estabelecer criação de lagartas utilizadas em ensaios in vivo e avaliar o efeito do probiótico Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469, inativado pelo calor, no modelo e in vitro. Os objetivos foram a) desenvolver uma metodologia de criação de G. mellonella, avaliando quatro dietas diferentes sobre crescimento larval, volume da hemolinfa, quantidade de hemócitos e resposta à infecção por meio da curva de sobrevivência b) avaliar os efeitos de L. rhamnosus sobre G. mellonella analisando curva de sobrevivência; contagem de hemócitos, melanização da hemolinfa, produção de óxido nítrico na hemolinfa e os efeitos de L. rhamnosussobre macrófagos RAW 264.7 desafiados por S. aureus ou E. coli, analisando o perfil de indução de citocinas e óxido nítrico. Os resultados foram analisados estatisticamente (ANOVA e Tukey, 5%) e a curva de morte e estimativa das diferenças na sobrevivência foram determinadas por Log-rank (Mantel-Cox, 5%). As rações a base de fubá e pólen apresentaram os melhores resultados, sendo semelhantes entre si e diferentes das demais rações (p < 0,05), sendo a ração a base de fubá escolhida por apresentar resultados semelhante ao pólen e menor custo. Os resultados in vivo demonstraram diminuição na mortalidade das lagartas no grupo com inoculação de L. rhamnosus, entretanto, sem diferença estatística. Houve aumento na contagem de hemócitos quando G. mellonella foi inoculada com S. aureus e E. coli, com ou sem inoculação de L. rhamnosus, além de haver melanização da hemolinfa,demonstraram que o L. rhamnosus melhorou a resposta de G. mellonella quando desafiada por bactérias. Os resultados in vitro demonstram que L.rhamnosus induziu alta produção de TNF-α, igualmente aos demais grupos (p ≤ 0,05), não havendo produção de IL-1β e IL-6 no grupo estimulado apenas por L. rhamnosus. Nos grupos que receberam o segundo estímulo...

ABSTRACT

Galleria mellonella is used to study microorganisms virulence and antimicrobial power. This study aimed to standardize the creation of worms used in In vivo assays and evaluate the effect of heat-killed probiotic, Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469, on this model and in in vitro studies. The objectives were a) developing a methodology for breeding G. mellonella with four different diets influence on larval growth,hemolymph volume, quantity of hemocytes and infection response bymeans of survival curve; b) evaluating the effects of L. rhamnosus on G.mellonella by means of the following analyzes survival curve, hemocytes counting, hemolymph melanization, nitric oxide release, and the effects ofL. rhamnosus on macrophages RAW 264.7 challenged by S. aureus or E.coli by means of cytokines and nitric oxide production. Results were statistically analyzed (ANOVA and Tukey, 5%). Death curve and estimation of differences in survival were determined by Log-rank (MantelCox, and pollen-based rations showed the best results, being similar to each other and different from the other ones (p <0.05).Cornmeal ration was chosen since it presents results similar topollen and lower cost. In vivo results showed reduction in mortality of caterpillars in the group inoculated with L. rhamnosus, with no statistical difference. Hemocyte counting increased when G. mellonella was inoculated with S. aureus and E. coli, with or with out inoculation of L. rhamnosus, add to that hemolymph melanization, showing that L.rhamnosus improved G. mellonella response challenged by bacteria. Invitro results show that L. rhamnosus induced high production of TNF-α,like other groups (p = 0.05), with no production of IL-1β and IL-6 in thegroup stimulated only by L. rhamnosus. The groups which received only the second stimulus or only the contact with S. aureus or E. coli, there wasIL-1β, IL-6 and IL-10 production. The highest nitric oxide production was observed in the groups challenged...