Aislamiento y caracterización de la miotoxina I del complejo Bothrops neuwiedi (yarará chica) / Isolation and characterization of myotoxin I from Bothrops neuwiedi complex (small yarará)

RESUMEN

En Argentina, más del 97% de los accidentes ponzoñosos son producidos por serpientes del género Bothrops, siendo aquellas pertenecientes al complejo Bothrops neuwiedi unas de las de mayor incidencia. El envenenamiento por esta especie es similar al descripto para otras especies Bothrops de América, presentando en el individuo accidentado daño tisular considerable dolor, inflamación, edema, exudación, mionecrosis, problemas en la coagulación y hemorragias importantes. Del veneno entero del complejo Bothrops neuwiedi se aisló una proteína básica por cromatografía de intercambio iónico y RP-HPLC, la que se denominó Miotoxina I. Esta proteína provocó edema, miotoxicidad local cuando se la ensayó en ratones, citotoxicidad en cultivos celulares y alteración a nivel de la coagulación sanguínea, con potencia comparable al de otros venenos del género Bothrops. Con el objeto de determinar en qué medida esta toxina era importante en el daño que provoca el veneno entero de serpientes del complejo Bothrops neuwiedi cuando se produce un accidente ofídico, se caracterizó la misma a nivel bioquímico determinando las siguientes actividades letal, necrótica, hemorrágica, miotóxica, edematizante, desfibrinogenante, citotóxica y enzimática (fosfolipasa A2). Al inyectar dosis de hasta 4,4 mg/kg de peso de ratón por vía endovenosa, se observó que la toxina no era letal, a su vez no produjo necrosis ni hemorragia, como se observa cuando se inyecta el veneno crudo, tampoco se detectó actividad fosfolipasa A2 cuando se la ensayó sobre fosfolípidos de yema de huevo. Sin embargo, sí se observó un aumento de la enzima cretinina kinasa (CK) debido al daño producido en tejido muscular, y de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) cuando se la inoculó a líneas celulares endoteliales (t-END) y mioblastos (C2C12) de ratón, observándose un daño en la monocapa celular a partir de las 3H de inoculada la toxina. A nivel sanguíneo se pudo determinar que esta nueva toxina posee actividad anticoagulante en un porcentaje menor al que provoca el veneno entero cuando es inoculado. Con el fin de determinar su peso molecular se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecyl sulfato de sodio, donde se observó que la Miotoxina I de BnC aparecía, al colorear el gel, como un homodímero de 15 kD. Al realizar una inmunodifusión en gel de agarosa, se observó que existe un patrón de identidad antigénica parcial entre esta nueva miotoxina aislada y la miotoxina II del veneno de la especie Bothrops asper de Costa Rica. A su vez, se secuenciaron los primeros 40 residuos aminoacídicos de esta miotoxina, lo que demostró una alta homología con varias miotoxinas fosfolipasas A2 clase II, de la familia de las Lys-49, de crotálidos. Estos resultados en conjunto sugieren que esta toxina es un nuevo miembro de las fosfolipasas A2 Lys-49, con actividades miotóxica, citolítica e inflamatoria por inducción de edema y con actividad anticoagulante probablemente por el consumo de fibrinógeno en el torrente sanguíneo.