Caracterização termodinâmica e funcional da proteína não estrutural 3 (NS3) do vírus da dengue do tipo 2

RESUMO

O propósito deste trabalho foi a clonagem, expressão e purificação da proteína NS3 íntegra do DENV-2, seus domínios e complexos isoladamente, com objetivo de avaliar i) a estabilidade da NS3 íntegra e dos domínios protease e helicase; ii) o efeito do domínio protease sobre a atividade NTPásica; e iii) o papel do cofator NS2B na atividade e estrutura da NS3 protease. Utilizamos técnicas espectroscópicas para o monitoramento da fluorescência intrínseca do Trp e ensaios de atividade helicásica, ATPásica e proteásica. Nossos dados termodinâmicos demonstram a importância do domínio protease na estabilidade da NS3 íntegra, e que o interdomínio E169-K185 (que conecta os domínios protease e helicase) é importante na modulação da atividade proteolítica, interação da protease com o cofator NS2B, e estabilidade do domínio protease. Observamos que o cofator NS2B fornece maior estabilidade e cooperatividade ao domínio protease em pH básico, além de promover modificações conformacionais que reduzem a exposição de resíduos hidrofóbicos que parecem prejudicar na interação de resíduos dibásicos com a tríade catalítica. Ao avaliar se a baixa atividade ATPásica da NS3 íntegra em comparação com a NS3 helicase estaria associada com a oclusão do motivo Walker A pelo domínio protease, demonstramos que a NS3 helicase apresenta maior atividade ATPase, em pH 6,0, devido à exposição de resíduos hidrofóbicos que favorecem a ligação do ATP. Contudo, em pH fisiológico, a interação do ATP com o motivo Walker A foi maior na NS3 íntegra, demonstrando que a localização do domínio protease sobre o motivo de formação do complexo ATP-Mg2+ não interfere na interação. E finalmente, analisando a fenda de interação do ATP na NS3 íntegra dos 4 sorotipos do DENV, identificamos oito resíduos altamente conservados (R64, E66, G80, K201, R202, R209, K213 e R236) circundando esta região de ligação, que podem ser importantes no desenvolvimento de inibidores específicos desta enzima.

ABSTRACT

The aim of this work was the cloning, expression, and purification of the full-length NS3 protein of the DENV-2 as well as the its domains and protein complexes, aiming to study i) the thermodynamic stability of the full-length NS3, and of its protease and helicase domains; ii) the effect of the protease domain on ATPase activity; and iii) the effect of the NS2B cofactor on the structure and activity of the protease domain. We used fluorescence spectroscopy to monitor the Trp intrinsic fluorescence, and ATPase, helicase and protease activity assays. Our results thermodynamics showed the importance of the protease domain for the stabilization of the full-length NS3 protein of interdomain peptide (E169-K185) for activity, the interaction of the protease domain with cofactor NS2B, and the stability of the protease domain. We observed that the cofactor NS2B promoted not only a higher stability and cooperativity to the protease domain at basic pH, but also conformational changes that decreased the exposure of hydrophobic residues, disfavoring the interaction of dibasic residues with the catalytic triad. When we evaluated whether the decrease ATPase activity of the full-length NS3, in comparison with NS3 helicase, would be associated or not with the occlusion of the Walker A motif by protease domain, our results showed that the NS3 helicase increased ATPase activity at pH 6.0 because of the hydrophobic residue exposure favoring the ATP binding. On the other hand, the interaction of the ATP with Walker A motif was higher in the full-length NS3 than in the NS3helicase, suggesting that the localization of the protease domain on the helicase domain does not interfere with the interaction of the latter with the ATP-Mg+2. Finally, by analyzing the ATP binding site cleft in the full-length NS3 protein from the four DENV serotypes (DENV-1 to 4), we identified eight highly conserved residues (R64, E66, G80, K201, R202, R209, K213 and R236) surrounding this cleft that can be important in the development of specific inhibitors of that enzyme.