Presence of opportunistic oil-degrading microorganisms operating at the initial steps of oil extraction and handling / Presencia de microorganismos oportunistas degradadores de petróleo en la extracción y manipulación iniciales de petróleo

ABSTRACT

Hydrocarbon-degrading microorganisms from natural environments have been isolated and identified using culture-dependent or molecular techniques. However, there has been little research into the occurrence of microorganisms incorporated into crude oil in the initial steps of extraction and handling, which can reduce the quality of stored petroleum. In the present study, a packed-column reactor filled with autoclaved perlite soaked with crude oil was subjected to a continuous flow of sterile medium in order to determine the presence of potential hydrocarbon degraders. Microorganisms developed on the surface of the perlite within a period of 73 days. DNA was extracted from the biofilm and then PCR-amplified using 16S rRNA bacterial and archaeal primers and 18S rRNA eukaryotic primers. No amplification was obtained using archaeal primers. However, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) revealed the presence of unique bands indicating bacterial and eukaryotic amplification. Excision of these bands, sequencing, and subsequent BLAST search showed that they corresponded to Bacillus sp. and Aspergillus versicolor. The fungus was later isolated from intact perlite in agar plates. A bacterial clone library was used to confirm the presence in the biofilm of a unique hydrocarbon-degrading bacterium closely related to Bacillus sp. Analysis of the petroleum components by gas chromatography showed that there n-alkanes, aromatic hydrocarbons, and carbazoles were degraded (AU)

RESUMEN

Algunos autores han aislado e identificado microorganismos degradadores de petróleo utilizando técnicas moleculares o dependientes de cultivo. Sin embargo, se ha investigado poco la presencia de microorganismos que entran en contacto con el petróleo en las fases iniciales de su extracción y manipulación, circunstancia que puede reducir la calidad del petróleo almacenado. Mediante un reactor con una columna cargada con perlita esterilizada en autoclave y empapada de petróleo, y sujeto a un flujo continuo de medio estéril, determinamos la presencia de posibles degradadores de hidrocarburos. En la superficie de la perlita se desarrollaron microorganismos en un período de 73 días. Se extrajo el DNA del biofilm, y se amplificó por PCR con cebadores para el 16S rRNA de bacterias y arqueas y con cebadores para el 18S rRNA de eucariotas. No se obtuvo ampliación del DNA de arqueas, pero el análisis por electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) reveló la presencia de bandas únicas en la amplificación de bacterias y eucariotas. La escisión de estas bandas, la secuenciación y la subsiguiente búsqueda en BLAST demostraron que correspondían a Bacillus sp. y a Aspergillus versicolor. El hongo fue aislado posteriormente en placas de agar a partir de perlita intacta. También se llevó a cabo una biblioteca genética bacteriana, que confirmó la presencia de una única bacteria degradadora de petróleo en el biofilm, muy próxima a Bacillus sp. El análisis de los componentes del petróleo por cromatografía de gases mostró que había habido degradación de n-alcanos, hidrocarburos aromáticos y carbazoles (AU)