Regulación de la plasticidad celular y senescencia encondrocitos articulares: conexina 43 como diana terapéutica para el tratamiento de la artrosis / A novel therapeutic target for osteoarthritis: control of cellular plasticity and senescence using connexin43

RESUMEN

Introducción: La artrosis (OA) es una enfermedad musculo esquelética degenerativa que afecta aproximadamente al13% de la población occidental. A día de hoy no existe un tratamiento eficaz que evite el progreso de la misma o facilite la regeneración del cartílago articular. La conexina43 (Cx43) es una proteína transmembrana que se encuentra en niveles elevados en el cartílago y en la membrana sinovial de pacientes con OA. Esta proteína forma canales que permiten el intercambio de moléculas e iones entre dos células en contacto o entre la célula y su entorno, denominados uniones co‐municantes (UCs) y hemicanales, respectivamente. En este estudio se investigó la función de la Cx43 y de las UCs en la degradación del cartílago articular de pacientes con OA. Material y métodos: Se han aislado condrocitos primarios del cartílago de donantes OA y sanos. Se evaluaron los niveles proteicos mediante Western blot, inmunofluorescencia y citometría de flujo. La expresión génica se ha evaluado mediante RT‐qPCR, mientras que la comunicación celular se estudió mediante el ensayo scrape loading/dye transfer. La senescencia celular se evaluó midiendo la actividad de la β‐galactosidasa mediante citometría celular o microscopía. Resultados: Los resultados obtenidos indican que la sobre actividad de la Cx43 y de la comunicación intercelular a través de UCs detectadas en OA están implicadas con el progreso de la enfermedad al activar procesos de desdiferenciación celular hacia un estado inmaduro y senescencia celular. Utilizando condrocitos en cultivo aislados del cartílago de donantes con OA hemos demostrado que el incremento de la Cx43 activa factores implicados en la transición epitelio‐me sénquima (TEM), como el factor de transcripción Twist‐1. El incremento en el número de células desdiferenciadas y con altos índices de proliferación celular desencadena en senescencia celular vía p53/p16INK4a, activando el fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP, del inglés Senescence-Associated Secretory Phenotype) que incluye la síntesis y liberación de factores inflamatorios como la interleuquina 6 (IL‐6). La disminución de los niveles de la Cx43 utilizando pequeñas moléculas como la oleuropeína o técnicas de edición genética como CRISPR/Cas9 revirtió el proceso dando lugar a re‐diferenciación celular, mejorando el fenotipo celular con incremento en proteínas implicadas en formación del tejido y diminuyendo la síntesis de MMPs y del componente inflamatorio y senescencia. Conclusiones: La disminución de la Cx43 en condrocitos artrósicos restaura regeneración tisular, por activación de re‐diferenciación celular y disminución de senescencia. Estos resultados corroboran el uso de la Cx43 como una diana terapéutica eficaz para restaurar regeneración del cartílago en pacientes con OA y evitar la progresión de la enfermedad

ABSTRACT

Introduction: Osteoarthritis (OA) is a degenerative musculoskeletal disease, which affects approximately the 13% of western population. Nowadays, there is no effective treatment for OA to avoid disease progression or to promote cartilage regeneration. Connexin43 (Cx43) is a transmembrane protein increased in cartilage and synovium from OA patients.Cx43 forms membrane channels that allow the exchange of molecules and ions between two adjacent cells through gapjunctions (GJs), or between a cell and its environment through hemichannels. In this study we investigated the involvement of Cx43 and GJ intercellular communication in the degradation of articular cartilage in chondrocytes from patientswith OA. Material and methods:Primary chondrocytes were obtained from cartilage from OA and healthy donors. Protein levelswere evaluated by western‐blot, immunofluorescence and flow cytometry. RNA expression was evaluated by RT‐qPCR.A scrape loading/dye transfer assay was used to evaluate cell communication. Cell senescence was analysed by flowcytometry or by light microscopy using β‐galactosidase assay.Results:Cx43 and GJs overactivities were correlated with the progression of OA, by promoting chronic cell dedifferen‐tiation and senescence in vitroassays. We found that Cx43 over expression activates factors involved in epithelial‐to‐me‐senchymal transition, such as Twist‐1. Increased levels of dedifferentiated cells, with high rates of cell proliferation, led to cell senescence via p53/p16INK4a, activating the senescence‐associated secretory phenotype (SASP) and promoting the synthesis and liberation of inflammatory factors, including the interleukin‐6 (IL‐6). Cx43 down regulation by using small molecules, such as oleuropein, or by genetic edition with CRISPR technology, led to the chondrocyte redifferentiation and an improved phenotype, with increased synthesis of extracellular matrix proteins such as Col2A1 and down‐regulating the synthesis of MMPs, inflammation and senescence. Conclusions: Down regulation of Cx43 in OA chondrocytes restores regeneration by activating chondrocyte re‐differentiation and decreasing cellular senescence. These results corroborate the use of Cx43 as an effective therapeutic target in order to restore cartilage regeneration and avoid OA progression