A methodological approach to investigate the steady state fucoxanthin chlorophyll a / c binding protein mRNA levels in Wadden Sea sediments / Una aproximación metodológica para el estudio de los niveles de estado sostenido de mRNAs de fcp en los sedimentos del mar de Wadden

ABSTRACT

A method was established to investigate the steady state levels of mRNAs from genes encoding fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (Fcp) of diatoms in situ. During the study, which was performed with Wadden Sea sediments from the German North Sea shore near Dangast, oxygenic photosynthesis was carried out mainly by pennate diatoms. Field samples were taken after tidal exposure from dawn up to late afternoon at 2-hourly intervals, and frozen in liquid nitrogen. In the laboratory, total RNA was isolated by isopycnic ultracentrifugation in caesium chloride gradients. Yields of approximately 10-300 micro g RNA per gram wet sediment were obtained. Defined amounts of total RNA were blotted onto nylon membranes and hybridised with probes against the fcp2 and 18S rDNA genes of Cyclotella cryptica. To estimate the steady state amount of fcp mRNAs, fcp signal intensities were normalized to the signal intensities obtained from hybridisation to an 18S rDNA gene probe. In the two time-course studies performed to demonstrate the applicability of the method, the steady state levels of fcp mRNA increased up to 12-fold with the onset of light, reaching a maximum 6-8 h after sunrise before they decreased again. Possible reasons for this time-course are discussed (AU)

RESUMEN

Se estableció un método para investigar in situ los niveles de estado sostenido de mRNAs de genes que codifican proteínas de unión a las clorofilas fucoxantinas a/c en diatomeas. Durante el estudio, llevado a cabo con sedimentos del mar de Wadden, en la costa norte alemana cerca de Dangast, la fotosíntesis oxigénica era llevada a cabo principalmente por diatomeas penadas. Las muestras se tomaron después de la marea alta, entre el amanecer y última hora de la tarde a intervalos de dos horas, y fueron congeladas en nitrógeno líquido. Una vez en el laboratorio, se aisló el RNA total por ultracentrifugación en un gradiente isopícnico de cloruro de cesio. Se obtuvieron entre 10-300 µg de RNA por gramo de sedimento húmedo. Cantidades definidas de RNA fueron transferidas a membranas de nylon y hibridadas con sondas que reconocen los genes fcp2 y rDNA 18S de Cyclotella cryptica. Para estimar la cantidad de estado sostenido de mRNAs de fcp, se normalizaron las intensidades de la señal de fcp según las intensidades de señal obtenidas en experimentos de hibridación en que se utilizó la sonda del gen rDNA 18S. En los dos estudios temporales, que se llevaron a cabo para demostrar la aplicabilidad del método, los niveles de estado sostenido de mRNA de fcp se multiplicaron hasta por 12 con el inicio de la fase de luz. Los niveles alcanzaron máximos entre 6 y 8 horas después del alba, antes de descender de nuevo. Se discuten posibles causas de esta evolución temporal. (AU)