Caracterização de antígenos de formas amastigotas de lesão e de cultura de Leishmania (L) amazonensis: um estudo bioquímico, imunológico e imunocitoquímico ultra-estrutura / Antigens characterization of amastigote forms of lesions and culture of Leishmania (L) amazonensis: a biochemical, immunologic and immunocitochemistry ultra-structure study

RESUMO

Neste trabalho, purificamos proteínas e frações de proteínas formas amastigotas de cultura e de lesão de Leishmania amazonensis da cepa LTB0016. Obtivemos soros policlonais produzidos em coelho em resposta a proteínas totais de amastigota de lesão e de frações purificadas de formas amastigotas de cultura assim como produzidos em camundongos infectados com formas amastigotas de lesão de L. amazonensis. Estes soros foram avaliados no processo de diferenciação das formas promastigotas para as formas amastigotas axênicas e nas formas obtidas de lesão e de cultura. Quando analisado bioquimicamente por Western Blot, o soro do coelho apresentou bandas comuns de 66 a 35 kDa, preservadas em todo o processo de diferenciação; a partir de 24 horas bandas específicas foram encontradas na faixa de 20 a 14 kDa nas formas amastigotas. Com o soro de camundongo, verificamos que houve o reconhecimento de bandas de alto peso molecular na faixa de 110 a 40 kDa. Nos estudos de ultra-estrutura o soro de coelho reconheceu proteínas de vesículas e, principalmente, do citoplasma e o soro de camundongo identificou núcleo e flagelo porém, preferencialmente, proteínas de membrana em todos os tempos testados. Por imunofluorescência, observamos que houve o reconhecimento das formas amastigotas e dos macrófagos J774/G8 infectados, enquanto as formas promastigotas não foram reconhecidas. Nos ensaios de citometria de fluxo, verificamos diferença entre os soros o soro de coelho mostrou maior intensidade de fluorescência, cerca de 90 por cento, e soro de camundongo menor intensidade de fluorescência, cerca de 76 por cento. Ensaios preliminares, feitos com o soro de coelho imunizado com a fração 6, 7, e 8 de proteínas hidrofóbicas de formas amastigotas de cultura, purificadas pelo método Prep Cell, mostraram que o soro imunizado de coelho reconheceu por imunofluorescência proteínas de formas amastigotas de lesão, com reação na membrana plasmática e em algunspontos no citoplasma, sendo necessários outros estudos para a melhor caracterização destas frações.