Otimização de teste diagnóstico molecular e análises da variabilidade genética dos diferentes sorotipos do vírus dengue baseado na técnica proposta por Lanciotti (1992) / Optimization of molecular diagnostic technique and analysis of genetic variability of different dengue virus serotypes based on the proposed technique by Lanciotti (1992)

RESUMO

A dengue é a infecção viral transmitida por vetores artrópodes (arbovirose) mais importante no mundo e que re-emergiu nas ultimas décadas e acomete mais de 50 milhões de pessoas a cada ano em áreas tropicais e sub-tropicais do planeta (OMS, 1999). O diagnóstico molecular do vírus dengue é convencionalmente realizado utilizando a técnica proposta por Lanciotti et al, 1992, no entanto alguns autores já relataram dificuldades na detecção de pelo mesmo um sorotipo viral utilizando esta técnica. No Laboratório de Virologia e Terapia Experimental do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães foram realizadas no ano de 2003 análises moleculares baseadas na técnica de Lanciotti em amostras de soro de pacientes com suspeita de infecção pelo vírus dengue. Nas amostras analisadas e que apresentaram sorologia positiva para o vírus o teste apenas conseguiu detectar 20 por cento delas. Surgiu à hipótese de o teste proposto por Lanciotti (teste baseado na técnica de Nested-PCR), não estar detectando todas as linhagens do vírus dengue circulantes no Recife, pois a variabilidade genética a que estes vírus estão expostos pode ter sido imposta a seqüências de nucleotídeos da região do genoma viral que foi alvo do desenho dos primers. Neste trabalho foi realizado uma otimização da técnica de Lanciotti quanto a síntese de cDNA e condições da reação de PCR e foram 10 novas amostras foram detectadas dentre aquelas anteriormente testadas. Foi realizado um estudo das seqüências genômicas dos sorotipos dengue e os dados apresentados sugerem que o sorotipo dengue 2 é o que apresenta uma maior variabilidade genética, como demonstrado por Rico-Hesse (1989) e Holmes (2003). Os resultados das análises de homologia entre as seqüências virais e as seqüências dos primers sugerem que as linhagens dos sorotipos virais dengue apresentam pontos de mutações em suas seqüências em relação às seqüências dos primers e as mutações muitas vezes ocorrem em posições que podem comprometer o funcionamento do teste diagnóstico. Uma nova abordagem molecular de diagnóstico, inicialmente para o sorotipo viral 3, foi proposta baseadas na técnica de hemi-nested PCR em tubo único para tentar aumentar a detecção do vírus dengue.