Desarrollo de las condicinones metodológicas para el estuio de receptores de cortisol en tejido / Optimization of the methodological conditions to study of cortisol-receptor complex in hypophyseal tissue by dextrain coated charcoal

RESUMEN

En este trabajo se desarrolló la metodología para establecer las condiciones óptimas para el estudio de la unión del complejo receptor-cortisol. Se utilizaron en est estudio 200 hipófisis provenientes de cadáveres. Las condiciones estudiadas fueron: la concentración de proteínas, el pH de los amortiguadores, la temperatura, el tiempo de incubación y la saturación. Los resultados mostraron que la máxima unión específica se logró a una concentración de proteínas de entre 8.5 y 10 mg/ml citosol. La temperatura que se logró la mejor unión fue de 0C. Las incubaciones realizadas mostraron como el tiempo óptimo par la unión, el de 18 hs. El pH óptimo del amortiguador fue entre 7.3 y 7.6, la saturación se logró a una concentración de 3nM de 3H-cortisol, con un exceso de 200 veces ((200x) de cortisol "frío". El método de separación entre el esteroide libre y el unido, utilizando carbón y dextrán, se obtuvo con una eficiencia de 98.7%. La estandarización de estas condiciones es necesaria para el estudio eficiente de las constantes fisico-químicas derivadas de la unión receptor-hormona. Se considera que los resultados del presente trabajo además de contribuir al conocimiento del receptor de cortisol ofrecen un marco de referencia de las condiciones óptimas de tiempo de incubación, temperatura, concentración de proteínas etc., requeridas para su estudio. Esta información facilita el estudio de las constantes de disociación (Kd), asociación (Ka) y número de sitios de unión (n) de una hipófisis aislada en donde se cuenta con poca cantidad de tejido, (1 gramo) lo que no permite establecer todas las condiciones de estudio en cada caso