Estudo da função do gene kerV de Pseudomonas aeruginosa / Function of Pseudomonas aeruginosa kerV gene

RESUMO

P. aeruginosa PA14 é uma linhagem isolada de queimadura que apresenta vários fatores de patogenicidade comuns no quadro de infecção de hospedeiros filogeneticamente distintos (plantas, mamíferos ou invertebrados). O gene kerV foi revelado numa busca por mutantes atenuados em virulência em uma biblioteca de mutantes por transposons da linhagem PA14 (Rahme et al., 1997). A caracterização da linhagem D12, mutante em kerV, confirmou sua virulência atenuada (Apidianakis et al., 2005 e An et al., 2009) e resultados do transcriptoma mostraram alteração na expressão de mais de 500 genes, sendo alguns relacionados com o sistema de "quorum sensing" (Rahme et al, dados não publicados). O gene kerV está próximo à montante ao gene gloB, envolvido em detoxificação de metilglioxal, e à jusante aos genes rnhA e dnaQ, que codificam proteínas envolvidas na replicação e reparo do DNA. Este trabalho teve como objetivo estudar a função molecular do produto de kerV e a expressão dos genes do lócus kerV-rnhA-dnaQ. Análises de bioinformática indicam que a proteína KerV é uma metiltransferase dependente de S-adenosil-metionina (SAM), apresentando um domínio conservado de ligação a SAM e uma arquitetura de domínio compatível com a organização em fitas-beta e hélices-alfa alternadas descritas para a família das metiltransferases dependentes de SAM. Ela não apresenta outros domínios conservados que indiquem seu substrato de metilação. A expressão heteróloga desta proteína em E. coli, mostrou que ela é expressa de maneira parcialmente solúvel quando co-expressa com as chaperoninas GroEL/GroES em baixas temperaturas ou quando fusionada a MBP ou GST. A purificação desta proteína mostra que ela é co-eluída com a chaperonina GroEL sugerindo que para atingir sua conformação nativa ela necessita dessas proteínas acessórias. MBP-KerV purificado foi usado para ensaios "in vitro" de atividade de metiltransferase e ligação a SAM, que não foram conclusivos, pois não há certeza do seu ...

ABSTRACT

P. aeruginosa PA14 is a burn isolate multi-host pathogen strain. The screening for virulence attenuated mutants in a PA14 transposon mutant library revealed the kerV gene (Rahme et al., 1997). The characterization of D12 strain, a kerV mutant, confirmed the attenuated virulence phenotype (Apidianakis et al., 2005 and An et al., 2009) and transcriptome analysis showed the expression of more than 500 genes are affected in D12, some of these genes are related with quorum sensing (Rahme et al, unpublished data). kerV is upstream of the gloB gene, related with methylglioxal detoxification and downstream of the rnhA and dnaQ genes, both related with DNA replication and repair. The purpose of this work was to study the molecular function of KerV product and the expression of kerV-rnhA-dnaQ locus. Bioinformatics analysis indicated that KerV is a SAM dependent methyltransferase that have a conserved SAM binding domain with architecture compatible with classic alternating β-stranded and α-helical regions. KerV does not show any other conserved motif that could indicate its methylation substrate. Heterologous expression in E. coli showed that KerV is partially soluble only when co-expressed with GroeL/GroES chaperones at low temperatures or when KerV is in fusion with MBP or GST tag. During the purification process KerV was copurified with GroEL chaperone suggesting that this association may be required for the correct folding of KerV. Methyltransferase activity and SAM binding assays were done with purified MBPKerV and the results were not conclusive since the proper conformation of MBP-KerV cannot be verified. Yeast two-hybrid assays indicated that RNaseH and DnaQ are not interaction partners of KerV, suggesting that their functions are not directly related. The mutation frequency of D12 strain increased only about four times in relation to PA14, suggesting that KerV is not directly involved with DNA mismatch repair. The assays to detect methylation...