Plasmin degradation of the alpha chain of fibrinogen/fibrin: improved activation constant and activity determination in assays for tissue plasminogen activator / Degradación por la plasmina de la cadena alfa del fibrinógeno/fibrina: mejoría de la constante de activación y determinación de la actividad en ensayos para el activador del plasminógeno tisular

ABSTRACT

Objectives. The aim of this investigation was to increase the efficiency of ternary complex formation (fibrin-plasminogen-tissue-plasminogen activator) in the degradation process of the three-dimensional soluble fibrin monomer. Materials and methods. Fibrinogen was purified from human plasma by repeating precipitation six times, using different concentrations of cold ethanol. Fibrinogen was converted to DesAAfibrinogen by degradation with bathroxobin. Human plasminogen was purified by affinity and ion-exchange chromatography, and activated to plasmin by incubation with urokinase. Digested DesAAfibrinogen was prepared by controlled digestion with plasmin. Results. This study demonstrates that the α-chains of DesAAfibrinogen sterically hinder the formation of the ternary complex and are first degraded by plasmin. The degradation of fibrin(ogen) facilitates the in vitro determination of tissue plasminogen activator activity. Finally, release of fibrinopeptide A from bathroxobin-cleaved fibrinogen was confirmed, optimized and evaluated by various methods. Conclusions. Use of digested desAAfibrinogen with plasmin yielded a more stable activation constant of the ternary complex than that of undigested DesAAfibrinogen.

RESUMEN

Objetivos. El propósito de la presente investigación fue incrementar la eficacia de la formación del complejo terciario (fibrina-plasminógeno-activador tisular del plasminógeno) en el proceso de degradación de la estructura tridimensional del monómero de fibrina soluble. Materiales y métodos. El fibrinógeno fue purificado de plasma humano, por seis precipitaciones repetidas, con diferentes concentraciones de etanol frío. El fibrinógeno fue convertido a desAAfibrinógeno por degradación con batroxobina. El plasminógeno humano fue purificado por cromatografías de afinidad e intercambio iónico y activado a plasmina con uroquinasa. El desAAfibrinogeno digerido fue preparado por digestión controlada con plasmina. Resultados. Este estudio demuestra que la cadena α del desAAfibrinógeno, dificulta la formación del complejo terciario, por impedimentos estéricos, por lo cual la cadena α se sometió a hidrólisis controlada con plasmina, facilitando así la determinación in vitro de la actividad del activador tisular del plasminógeno. Finalmente, la liberación del fibrinopéptido A por hidrólisis del fibrinógeno con batroxobina, fue confirmada, optimizada y evaluada por varios métodos. Conclusiones. El uso de desAAfibrinogeno digerido con plasmina da una constante de activación más estable en la formación del complejo terciario que el desAAfibrinógeno no digerido (fibrina-plasminogeno- activador tisular del plasminógeno).