Padronização da PCR em Tempo Real para o Diagnóstico da Hepatite B / Standardization of real-time PCR for the hepatitis B diagnosis

RESUMO

A hepatite B é uma doença de interesse em saúde pública, acometendo cerca de 2 bilhões de pessoas no mundo, das quais aproximadamente 350 milhões tornam-se portadoras crônicas. Os ensaios quantitativos de detecção do DNA viral são empregados para avaliar a infectividade do vírus e para o monitoramento do tratamento, sendo importante para avaliar a progressão da doença. O objetivo deste estudo foi padronizar a técnica de amplificação quantitativa em tempo real (PCR em tempo real) do DNA do vírus da Hepatite B e comparar a técnica com métodos comerciais (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan® e COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan®). A amostragem foi constituída por 397 amostras de soro ou plasma recebidas e estocadas no laboratório de hepatites virais do Centro de Virologia do Instituto Adolfo Lutz, no período de 2009 a 2011. Do total de amostras, 345 foram utilizadas para a comparação com os testes comerciais disponíveis e 52 amostras foram utilizadas para o teste de especificidade, sendo 27 amostras HIV positivas e 25 amostras HCV positivas, todas com AgHBS e Anti-HBc total não reagentes. Estas amostras foram inicialmente analisadas por testes comerciais e posteriormente pela técnica padronizada. Para o controle da quantificação, uma curva padrão foi construída em todas as reações, utilizando-se padrões internacionais produzidos pela Organização Mundial de Saúde, em diluições seriadas. Para a extração do DNA das amostras e padrão, foi utilizado kit comercial (QIAGEN®), seguindo os procedimentos descritos pelo fabricante. Os testes foram realizados empregando o método do TaqMan – PCR, em um equipamento ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os “primers” e sondas utilizadas para a padronização foram selecionados a partir da literatura e os que apresentaram melhores resultados nos testes iniciais foram escolhidos para o estudo. A técnica de sequenciamento foi realizada nas amostras com carga viral quantificável...

ABSTRACT

Hepatitis B is a disease of public health concern. Worldwide, it affects approximately 2 billion people, of whom approximately 350 million become chronic carriers. Quantitative assays for the detection of viral DNA are used to evaluate the infectivity of the virus and to monitor treatment, which is crucial to evaluate the progression of the disease. The aim of this study was to standardize real-time (real-time PCR) quantitative amplification of the DNA of hepatitis B and to compare this technique with commercial methods (COBAS AmpliPrep / COBAS ® TaqMan and COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan ®). The sample consisted of 397 serum or plasma samples received and stored at the laboratory of viral hepatitis from the Center of Virology, Instituto Adolfo Lutz, from 2009 to 2011. Of the total samples, 345 were used for comparison with the available commercial tests and 52 samples were used for the specificity test. Of these, 27 were HIV positive and 25, HCV positive, and all were HBsAg and anti- HBc nonreactive. These samples were initially analyzed by commercial tests and later by the standardized technique. To control the quantification, a standard curve was constructed in all reactions using international standards established by the World Health Organization, in serial dilutions. For the extraction of DNA samples and standard, a commercial kit used was (QIAGEN ®) according to the manufacturer’s instructions. The tests were performed using the TaqMan method - ABI 7300 PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primers and probes used for standardization were selected from the literature and those presenting better results in initial tests were chosen for the study. Sequencing technique was performed on samples with measurable viral load. The standardized real-time PCR technique yielded satisfactory results...