Proteolytic activity of excretory/secretory products of Cochliomyia hominivorax larvae (Diptera: Calliphoridae) / Atividade proteolítica de produtos de excreção/secreção de Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae)

ABSTRACT

The protein profiles and proteolytic activity of the excretory secretory products (E/SP) of the first (L1), second (L2) and third (L3) larval stages of Cochliomyia hominivorax were studied in the laboratory. Analysis on the E/SP protein profile was carried out using polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE). The E/SP of each larval stage (L1, L2 and L3) treated with protease inhibitors, containing 30µg, 40µg and 50µg of protein, was applied to the 10% polyacrylamide gel. The proteolytic activity of the crude E/SP was analyzed in gels copolymerized with gelatin and by colorimetric assays using azocasein as a substrate, with the characterization of the proteases using synthetic inhibitors. Different protein profiles were observed for the larval instars, with L1 presenting the most complex profile. Nevertheless, various protein bands were observed that were common to all the larval instars. The E/SP of all the instars showed proteolytic activity on gelatin, evidenced by proteolysis zones, predominantly with apparently higher molecular masses in L1, while for L2 and L3 the proteolysis zones could also be observed in regions with lower masses. Tests with protease inhibitors using gelatin as substrate showed that the E/SP of larvae were mainly composed of serine proteases. Additionally, inhibition was observed in L2 E/SP treated previously with EDTA, an inhibitor of metalloproteases. The assays with azocasein revealed a gradual increase of proteolytic activity on this substrate with larval development progress, with the strongest inhibitions being observed after treatments with 3,4-dichloroisocoumarin (DCI) for E/SP of L1, L2 and L3. These results suggest that C. hominivorax larvae produce different proteases, a fact that can be related to the parasite's vital processes for survival, such as penetration into the host's tissues and nutrition during the larval stage.(AU)

RESUMO

Os perfis protéicos e a atividade proteolítica dos produtos de excreção/secreção (PE/S) das larvas de primeiro (L1), segundo (L2) e terceiro (L3) estágios de Cochliomyia hominivorax foram estudados em laboratório. Os perfis protéicos foram obtidos por eletroforese em géis de poliacrilamida (SDS-PAGE). Os PE/S de cada fase larval (L1, L2 e L3), tratados com inibidores de proteases, contendo 30µg, 40µg e 50µg de proteína, foram aplicados em géis de poliacrilamida a 10%. A atividade proteolítica dos PE/S na sua forma nativa, foi analisada em géis co-polimerizados com gelatina e por testes colorimétricos usando a azocaseína como substrato, com a caracterização das proteases feita por meio de inibidores sintéticos. Diferentes perfis protéicos foram observados para os instares larvais, com L1 apresentando o perfil mais complexo. Apesar disso, foram observadas várias bandas protéicas comuns a todos os estágios larvais. Os PE/S de todos os instares mostraram atividade proteolítica sobre a gelatina, evidenciada por zonas de proteólise, com predominância de massas moleculares aparentes mais altas em L1, enquanto que para L2 e L3 as zonas de proteólise puderam ser observadas também em regiões de menores massas. Os testes com inibidores de proteases usando a gelatina como substrato mostraram que os PE/S de L1, L2 e L3 eram compostos principalmente de serina-proteases. Adicionalmente, inibição foi observada nos PE/S de L2 tratada previamente com EDTA, um inibidor de metalo-proteases. Os ensaios com a zocaseína revelaram um aumento gradual da atividade proteolítica sobre este substrato com o progresso do desenvolvimento larval, com a mais forte inibição sendo observada após o tratamento com 3,4 dicloroisocumarina (DCI) para os PE/S de L1, L2 e L3. Estes resultados sugerem que as larvas de C. hominivorax produzem diferentes proteases, fato que pode estar relacionado a processos vitais para a sobrevivência do parasita, tais como a penetração nos tecidos dos hospedeiros e nutrição durante os estágios larvais.(AU)