Gross and histopathological pitfalls found in the examination of 3338 cattle brains submitted to the BSE surveillance program in Brazil / Ciladas macroscópicas e histopatológicas encontradas no exame de 3338 encéfalos de bovinos submetidos ao programa de vigilância da EEB no Brasil

This study stems from the findings during the gross and histopathological exam of 3,338 cattle brains as part of the bovine spongiform encephalopathy (BSE) active surveillance program of the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock, and Supply from 2001 to 2005. The work was carried out in the Veterinary Pathology Laboratory of the Federal University of Santa Maria which at the time (2001-2007) was the national reference laboratory for the diagnosis of BSE and other transmissible spongiform encephalopathies. Both gross and histopathological aspects are described. Several gross aspects were annotated: anatomic normal structures not commonly recognized (non-lesions), lesions of no clinical significance, postmortem changes and artifacts; all these can amount to important pitfalls that distract the pathologist during the routine gross examination of the central nervous system (CNS). Accordingly, equivalent pitfalls were described in the histological examination. Non-lesions observed were the pineal body, embryo remnants such as the external germinal layer of the cerebellum, subependymal plates, and clusters of neuroblasts in the basal ganglia; or circumventricular structures such as area postrema, subcomisural organ, and melanosis in the leptomeninges and vessel walls. Lesions with little or no clinical importance included age-related changes as lipofuscin, hemosiderin, mineralization and hyalinization of vessel walls within the brain and meninges. Corpora amylacea and corpora arenacea were detected respectively in astrocyte processes and the pineal body. Cytoplasmic neuronal vacuolization was observed in the red nucleus and habenular nucleus. Sarcocystis sp. without a correspondent inflammatory reaction was rarely observed. Included within findings with no clinical manifestation were axonal spheroids and perivascular mononuclear cuffings. Changes in the CNS due to killing, sampling and fixation methods can obscure or distract from the more critical lesions...(AU)

Os resultados deste estudo foram obtidos pelo exame macroscópico e histopatológico de 3.338 cérebros de bovinos examinados durante o programa de vigilância ativa da encefalopatia espongiforme bovina (BSE) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), de 2001 a 2005. O trabalho foi realizado no Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) que, de 2001 a 2007, foi o laboratório nacional de referência para o diagnóstico da BSE e de outras encefalopatias espongiformes transmissíveis. Macroscopicamente, foram descritas estruturas anatômicas normais (não-lesões), mas que são, com frequência, interpretadas como lesões; lesões sem significado clínico; alterações pós-mortais e artefatos. Esses achados podem confundir e desviar a atenção do patologista durante o exame de rotina do sistema nervoso central (SNC). Da mesma forma, estruturas equivalentes foram descritas no exame histológico. As não-lesões observadas foram corpo pineal, remanescentes embrionários, como a camada germinativa externa do cerebelo, placas subependimárias e aglomerados de neuroblastos nos gânglios da base; ou estruturas circunventriculares, como área de postrema, órgão subcomissural e melanose em leptomeninges e paredes dos vasos. Lesões com pouca ou nenhuma importância relacionadas ao envelhecimento incluíram lipofuscina, hemossiderina, mineralização, hialinização das paredes dos vasos do encéfalo e das meninges. Corpora amylacea foram detectados em processos astrocíticos e corpora arenacea, no corpo pineal. Adicionalmente, foi observada vacuolização no citoplasma de neurônios do núcleo vermelho e do núcleo habenular. Sarcocystis sp. sem reação inflamatória correspondente foi raramente observado. Incluídos nos achados sem manifestação clínica estavam esferóides axonais e manguitos mononucleares perivasculares. Alterações no SNC causadas pelo método de abate, amostragem e fixação podem simular ou obscurecer lesões mais importantes...(AU)

Gross and histopathological pitfalls found in the examination of 3338 cattle brains submitted to the BSE surveillance program in Brazil / Ciladas macroscópicas e histopatológicas encontradas no exame de 3338 encéfalos de bovinos submetidos ao programa de vigilância da EEB no Brasil

This study stems from the findings during the gross and histopathological exam of 3,338 cattle brains as part of the bovine spongiform encephalopathy (BSE) active surveillance program of the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock, and Supply from 2001 to 2005. The work was carried out in the Veterinary Pathology Laboratory of the Federal University of Santa Maria which at the time (2001-2007) was the national reference laboratory for the diagnosis of BSE and other transmissible spongiform encephalopathies. Both gross and histopathological aspects are described. Several gross aspects were annotated: anatomic normal structures not commonly recognized (non-lesions), lesions of no clinical significance, postmortem changes and artifacts; all these can amount to important pitfalls that distract the pathologist during the routine gross examination of the central nervous system (CNS). Accordingly, equivalent pitfalls were described in the histological examination. Non-lesions observed were the pineal body, embryo remnants such as the external germinal layer of the cerebellum, subependymal plates, and clusters of neuroblasts in the basal ganglia; or circumventricular structures such as area postrema, subcomisural organ, and melanosis in the leptomeninges and vessel walls. Lesions with little or no clinical importance included age-related changes as lipofuscin, hemosiderin, mineralization and hyalinization of vessel walls within the brain and meninges. Corpora amylacea and corpora arenacea were detected respectively in astrocyte processes and the pineal body. Cytoplasmic neuronal vacuolization was observed in the red nucleus and habenular nucleus. Sarcocystis sp. without a correspondent inflammatory reaction was rarely observed. Included within findings with no clinical manifestation were axonal spheroids and perivascular mononuclear cuffings. Changes in the CNS due to killing, sampling and fixation methods can obscure or distract from the more critical lesions. The ones related to the process of killing included hemorrhages caused in cattle destroyed by a captive bolt. Artifacts related to sampling and handling of CNS tissue consisted of inclusion of bone sand in the neural tissue from sawing the calvarium; dark neurons produced by excessive handling of the brain, and micro-organisms that contaminated the tissues during sampling or histological processing. Postmortem autolytic or putrefactive changes observed included vacuolar changes in the myelin sheath, clear halos surrounding neurons and oligodendrocytes, clusters of putrefaction bacilli within vessels or dispersed throughout the brain tissue associated or not to clear halos. One interesting, and somewhat frequent, postmortem autolytic change found in the bovine brain was the partial dissolution of the granule cell layer (GCL) of the cerebellum, also referred to as conglutination of the GCL or as the French denomination "état glace". Due to the shortage of comprehensive publications in the subject, this review is intended to address the main pitfalls that can be observed in the brain of cattle hoping to help other pathologists avoiding misinterpret them.(AU)

Os resultados deste estudo foram obtidos pelo exame macroscópico e histopatológico de 3.338 cérebros de bovinos examinados durante o programa de vigilância ativa da encefalopatia espongiforme bovina (BSE) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), de 2001 a 2005. O trabalho foi realizado no Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) que, de 2001 a 2007, foi o laboratório nacional de referência para o diagnóstico da BSE e de outras encefalopatias espongiformes transmissíveis. Macroscopicamente, foram descritas estruturas anatômicas normais (não-lesões), mas que são, com frequência, interpretadas como lesões; lesões sem significado clínico; alterações pós-mortais e artefatos. Esses achados podem confundir e desviar a atenção do patologista durante o exame de rotina do sistema nervoso central (SNC). Da mesma forma, estruturas equivalentes foram descritas no exame histológico. As não-lesões observadas foram corpo pineal, remanescentes embrionários, como a camada germinativa externa do cerebelo, placas subependimárias e aglomerados de neuroblastos nos gânglios da base; ou estruturas circunventriculares, como área de postrema, órgão subcomissural e melanose em leptomeninges e paredes dos vasos. Lesões com pouca ou nenhuma importância relacionadas ao envelhecimento incluíram lipofuscina, hemossiderina, mineralização, hialinização das paredes dos vasos do encéfalo e das meninges. Corpora amylacea foram detectados em processos astrocíticos e corpora arenacea, no corpo pineal. Adicionalmente, foi observada vacuolização no citoplasma de neurônios do núcleo vermelho e do núcleo habenular. Sarcocystis sp. sem reação inflamatória correspondente foi raramente observado. Incluídos nos achados sem manifestação clínica estavam esferóides axonais e manguitos mononucleares perivasculares. Alterações no SNC causadas pelo método de abate, amostragem e fixação podem simular ou obscurecer lesões mais importantes. Aquelas relacionadas ao método de abate incluíram hemorragias causadas em bovinos dessensibilizados pelo dardo cativo ou por punção por faca da medula na articulação atlanto-occipital. Artefatos relacionados à amostragem e manuseio de tecido do SNC consistiram na inclusão de pó de osso no tecido neural em consequência do uso de serra para abrir a caixa craniana; neurônios escuros produzidos pelo manuseio excessivo do cérebro e micro-organismos que contaminaram os tecidos durante a amostragem ou processamento histológico. Alterações autolíticas pós-mortais ou de putrefação incluíram vacuolizações na bainha de mielina, halos claros em torno dos neurônios e oligodendrócitos, aglomerados de bacilos de putrefação dentro dos vasos ou dispersos em todo o tecido cerebral, relacionados ou não a halos claros. Uma alteração autolítica pós-mortal intrigante e relativamente frequente encontrada foi a dissolução parcial da camada de células granulares (CCG) do cerebelo, também referida como conglutinação da CCG ou "état glacé". Devido à escassez de publicações abrangentes neste assunto, esta revisão pretende abordar as principais ciladas que possam aparecer no cérebro de bovinos, na esperança de ajudar outros patologistas a evitar interpretá-las erroneamente.(AU)

Experimental and iatrogenic poisoning by sodium selenite in pigs

ABSTRACT: Following a case of iatrogenic selenium poisoning in a young pig, an experimental study was carry out. Sodium selenite was orally and parenterally administered to 13 pigs that were subdivided into three groups (G1, G2 and G3). The animals in groups G1 and G3 received sodium selenite intramuscularly (IM), G1 received a comercial formula, and G3 received sodium selenite mixed with distilled water at different dosages, and those in group G2 were fed commercial sodium selenite. Acute and subacute poisoning was observed in both groups, although the onset of clinical signs was slower in group G2. Only one pig (in group G1) that had received the highest dose showed a peracute course. Apathy, anorexia, dyspnea, vomiting, muscular tremors, proprioceptive deficit, ataxia and paresis of the hind limbs progressing to the front limbs evolving to tetraplegia were observed. Postmortem findings differed whether the animals received the injected (G1 and G3) or oral (G2) sodium selenite. The liver was moderately atrophic in some animals of G2. Some of the animals in groups G1 and G3 presented with lung edema. One pig in G3 had yellowish-brown areas in the ventral horns of the cervical intumescences of the spinal cord. The most important histological changes were present in the ventral horns of the cervical and lumbar intumescences of the spinal cord. In one animal, changes were present in the brainstem and mesencephalon. The initial lesion was a perivascular and astrocyte edema that progressing to lysis and death of astrocytes and neurons. In the chronic stage of the lesions, there were extensive areas of liquefaction necrosis with perivascular lymphocytic and histiocytic infiltration and occasional eosinophils. It seems that disruption of the blood-brain barrier due to astrocyte edema is the most likely mechanism of CNS lesion.

RESUMO: A partir de um caso de intoxicação iatrogênica por selenito de sódio injetável em suíno verificaram-se alguns aspectos patogenéticos não esclarecidos, o que ensejou o estudo experimental. Selenito de sódio foi administrado pelas vias oral e parenteral a 13 suínos, subdivididos em três grupos (G1, G2 e G3). Os grupos G1 e G3 receberam selenito de sódio por via intra-muscular (IM); (G1 - fórmula comercial e G3 - selenito de sódio misturado à água destilada, em diversas dosagens) e o grupo G2, por via oral (VO), misturado à ração. Quadros de evolução aguda e subaguda foram observados em todos os grupos, embora o início dos sintomas tenha sido mais lento no grupo G2. Um único porco (do grupo G1), que havia recebido a dose mais alta, apresentou evolução superaguda. Apatia, anorexia, dispneia, vômito, tremores musculares, déficit proprioceptivo, ataxia e paresia dos membros posteriores com progressão para os anteriores e evolução para tetraplegia foram observados. Os achados de necropsia foram diferentes entre os animais que receberam o selenito de sódio injetável (IM - G1 e G3) e oral (G2). Havia moderada atrofia hepática em alguns animais do G2. Parte dos animais dos grupos G1 e G3 apresentaram edema pulmonar. Em um suíno (G3) notaram-se áreas marrom-amareladas nos cornos ventrais da intumescência cervical. As alterações histológicas mais importantes ocorreram nos cornos ventrais do H medular das intumescências cervical e lombar. Em um animal, as alterações envolviam o tronco cerebral e o mesencéfalo. Inicialmente, a lesão caracterizava-se por edema perivascular e astrocitário que progredia para lise e necrose de astrócitos e neurônios. O estágio crônico das lesões caracterizava-se por extensas áreas de necrose liquefativa e infiltração perivascular linfocítica e histiocítica, com raros eosinófilos. Sugere-se que a ruptura da barreira hematoencefálica por edema astrocitário seja o mecanismo mais provável da lesão no SNC.

Experimental and iatrogenic poisoning by sodium selenite in pigs / Intoxicação iatrogênica e experimental por selenito de sódio em suínos

Following a case of iatrogenic selenium poisoning in a young pig, an experimental study was carry out. Sodium selenite was orally and parenterally administered to 13 pigs that were subdivided into three groups (G1, G2 and G3). The animals in groups G1 and G3 received sodium selenite intramuscularly (IM), G1 received a comercial formula, and G3 received sodium selenite mixed with distilled water at different dosages, and those in group G2 were fed commercial sodium selenite. Acute and subacute poisoning was observed in both groups, although the onset of clinical signs was slower in group G2. Only one pig (in group G1) that had received the highest dose showed a peracute course. Apathy, anorexia, dyspnea, vomiting, muscular tremors, proprioceptive deficit, ataxia and paresis of the hind limbs progressing to the front limbs evolving to tetraplegia were observed. Postmortem findings differed whether the animals received the injected (G1 and G3) or oral (G2) sodium selenite. The liver was moderately atrophic in some animals of G2. Some of the animals in groups G1 and G3 presented with lung edema. One pig in G3 had yellowish-brown areas in the ventral horns of the cervical intumescences of the spinal cord. The most important histological changes were present in the ventral horns of the cervical and lumbar intumescences of the spinal cord. In one animal, changes were present in the brainstem and mesencephalon. The initial lesion was a perivascular and astrocyte edema that progressing to lysis and death of astrocytes and neurons. In the chronic stage of the lesions, there were extensive areas of liquefaction necrosis with perivascular lymphocytic and histiocytic infiltration and occasional eosinophils. It seems that disruption of the blood-brain barrier due to astrocyte edema is the most likely mechanism of CNS lesion.(AU)

A partir de um caso de intoxicação iatrogênica por selenito de sódio injetável em suíno verificaram-se alguns aspectos patogenéticos não esclarecidos, o que ensejou o estudo experimental. Selenito de sódio foi administrado pelas vias oral e parenteral a 13 suínos, subdivididos em três grupos (G1, G2 e G3). Os grupos G1 e G3 receberam selenito de sódio por via intra-muscular (IM); (G1 - fórmula comercial e G3 - selenito de sódio misturado à água destilada, em diversas dosagens) e o grupo G2, por via oral (VO), misturado à ração. Quadros de evolução aguda e subaguda foram observados em todos os grupos, embora o início dos sintomas tenha sido mais lento no grupo G2. Um único porco (do grupo G1), que havia recebido a dose mais alta, apresentou evolução superaguda. Apatia, anorexia, dispneia, vômito, tremores musculares, déficit proprioceptivo, ataxia e paresia dos membros posteriores com progressão para os anteriores e evolução para tetraplegia foram observados. Os achados de necropsia foram diferentes entre os animais que receberam o selenito de sódio injetável (IM - G1 e G3) e oral (G2). Havia moderada atrofia hepática em alguns animais do G2. Parte dos animais dos grupos G1 e G3 apresentaram edema pulmonar. Em um suíno (G3) notaram-se áreas marrom-amareladas nos cornos ventrais da intumescência cervical. As alterações histológicas mais importantes ocorreram nos cornos ventrais do "H" medular das intumescências cervical e lombar. Em um animal, as alterações envolviam o tronco cerebral e o mesencéfalo. Inicialmente, a lesão caracterizava-se por edema perivascular e astrocitário que progredia para lise e necrose de astrócitos e neurônios. O estágio crônico das lesões caracterizava-se por extensas áreas de necrose liquefativa e infiltração perivascular linfocítica e histiocítica, com raros eosinófilos. Sugere-se que a ruptura da barreira hematoencefálica por edema astrocitário seja o mecanismo mais provável da lesão no SNC.(AU)

Experimental and iatrogenic poisoning by sodium selenite in pigs / Intoxicação iatrogênica e experimental por selenito de sódio em suínos

Following a case of iatrogenic selenium poisoning in a young pig, an experimental study was carry out. Sodium selenite was orally and parenterally administered to 13 pigs that were subdivided into three groups (G1, G2 and G3). The animals in groups G1 and G3 received sodium selenite intramuscularly (IM), G1 received a comercial formula, and G3 received sodium selenite mixed with distilled water at different dosages, and those in group G2 were fed commercial sodium selenite. Acute and subacute poisoning was observed in both groups, although the onset of clinical signs was slower in group G2. Only one pig (in group G1) that had received the highest dose showed a peracute course. Apathy, anorexia, dyspnea, vomiting, muscular tremors, proprioceptive deficit, ataxia and paresis of the hind limbs progressing to the front limbs evolving to tetraplegia were observed. Postmortem findings differed whether the animals received the injected (G1 and G3) or oral (G2) sodium selenite. The liver was moderately atrophic in some animals of G2. Some of the animals in groups G1 and G3 presented with lung edema. One pig in G3 had yellowish-brown areas in the ventral horns of the cervical intumescences of the spinal cord. The most important histological changes were present in the ventral horns of the cervical and lumbar intumescences of the spinal cord. In one animal, changes were present in the brainstem and mesencephalon. The initial lesion was a perivascular and astrocyte edema that progressing to lysis and death of astrocytes and neurons. In the chronic stage of the lesions, there were extensive areas of liquefaction necrosis with perivascular lymphocytic and histiocytic infiltration and occasional eosinophils. It seems that disruption of the blood-brain barrier due to astrocyte edema is the most likely mechanism of CNS lesion.(AU)

A partir de um caso de intoxicação iatrogênica por selenito de sódio injetável em suíno verificaram-se alguns aspectos patogenéticos não esclarecidos, o que ensejou o estudo experimental. Selenito de sódio foi administrado pelas vias oral e parenteral a 13 suínos, subdivididos em três grupos (G1, G2 e G3). Os grupos G1 e G3 receberam selenito de sódio por via intra-muscular (IM); (G1 - fórmula comercial e G3 - selenito de sódio misturado à água destilada, em diversas dosagens) e o grupo G2, por via oral (VO), misturado à ração. Quadros de evolução aguda e subaguda foram observados em todos os grupos, embora o início dos sintomas tenha sido mais lento no grupo G2. Um único porco (do grupo G1), que havia recebido a dose mais alta, apresentou evolução superaguda. Apatia, anorexia, dispneia, vômito, tremores musculares, déficit proprioceptivo, ataxia e paresia dos membros posteriores com progressão para os anteriores e evolução para tetraplegia foram observados. Os achados de necropsia foram diferentes entre os animais que receberam o selenito de sódio injetável (IM - G1 e G3) e oral (G2). Havia moderada atrofia hepática em alguns animais do G2. Parte dos animais dos grupos G1 e G3 apresentaram edema pulmonar. Em um suíno (G3) notaram-se áreas marrom-amareladas nos cornos ventrais da intumescência cervical. As alterações histológicas mais importantes ocorreram nos cornos ventrais do "H" medular das intumescências cervical e lombar. Em um animal, as alterações envolviam o tronco cerebral e o mesencéfalo. Inicialmente, a lesão caracterizava-se por edema perivascular e astrocitário que progredia para lise e necrose de astrócitos e neurônios. O estágio crônico das lesões caracterizava-se por extensas áreas de necrose liquefativa e infiltração perivascular linfocítica e histiocítica, com raros eosinófilos. Sugere-se que a ruptura da barreira hematoencefálica por edema astrocitário seja o mecanismo mais provável da lesão no SNC.(AU)

Modelagem celular de bebês nascidos com microcefalia causada por infecção vertical por Zika vírus

Em 2015, um número incomum de casos de bebês nascidos com microcefalia no Nordeste do Brasil chamou atenção, especialmente por apontarem um arbovírus, o Zika vírus (ZIKV), como possível causador de uma infecção congênita. O ZIKV é um Flavivírus transmitido pelo mosquito Aedes aegypti e cuja infecção produz efeitos brandos em humanos, com raras manifestações neurológicas e ocasionalmente síndrome de Guillain-Barré. Entretanto, em função de esclarecer os casos de microcefalia, estudos foram realizados comprovando que o ZIKV era capaz de infectar células do Sistema Nervoso Central (SNC), como neurônios e células da glia e, em especial, células mais imaturas, como as progenitoras neurais (NPC), abundantes no feto. Quando as NPC são infectadas pelo ZIKV, há menos migração celular, comprometimento da neurogênese e morte celular por apoptose, o que provavelmente acaba contribuindo para a microcefalia em recém-nascidos. O intuito desse projeto foi o de modelar in vitro o SNC de pacientes que nasceram com microcefalia congênita causada pela infecção vertical por ZIKV. Nosso objetivo foi verificar os efeitos celulares e moleculares da ação do vírus nestes pacientes durante a formação do SNC sob a hipótese de que a infecção maternal tenha induzido modificações celulares e moleculares que sejam responsáveis pelo fenótipo patogênico apresentado na síndrome congênita do Zika vírus (CZS). Nossos resultados mostraram que os fibroblastos utilizados para a reprogramação e estudo desses pacientes in vitro foi uma ótima alternativa mediante a dificuldade de obtenção de amostras. Além disso, as iPSC geradas através da reprogramação via transfecção de plasmídeos epissomais nos fibroblastos foram diferenciadas em astrócitos e neurônios. De acordo com a porcentagem de células diferenciadas, os pacientes foram divididos em dois grupos: um com 20% de astrócitos na cultura mista de neurônios (CZS-A), semelhante ao grupo controle, e outro grupo que apresentou baixa expressão de marcadores de astrócitos (CZS-B). A investigação da quantidade de sinapses nos neurônios derivados das iPSC dos pacientes com a CZS apresentavam menor expressão nas proteínas pré e pós-sinápticas (em ambos os grupos), assim como na sua colocalização, indicando que esses pacientes apresentam uma redução significativa de sinapses comparado ao grupo controle. Entretanto, foi observado uma redução significativa de proteína pós-sináptica e sua colocalização com a proteína pré- sináptica ao comparar os dois grupos de neurônios, sendo menor em pacientes CZS- B. Um quadro de redução significativa na produção de glutamato também foi observado nos astrócitos dos pacientes com CZS em comparação ao grupo controle, porém a curva de recaptação de glutamato apresentou o mesmo padrão de recaptação em ambos os grupos. Com esse trabalho e os resultados obtidos, podemos dizer que é possível modelar a CZS in vitro focando nos fenótipos celulares e moleculares, porém mais estudos serão necessários para confirmar esses achados e eventualmente correlacioná-los com as características clínicas encontradas nestas crianças.

In 2015, an unusual number of cases of babies born with microcephaly in Northeastern Brazil drew attention, especially for pointing out an arbovirus, the Zika virus (ZIKV), as a possible cause of congenital infection. ZIKV is a flavivirus transmitted by the Aedes aegypti mosquito and whose infection produces mild effects in humans, with rare neurological manifestations and occasionally Guillain-Barré syndrome. However, to clarify the microcephaly cases, studies have been carried out proving that ZIKV was able to infect cells of the Central Nervous System (CNS), such as neurons and glial cells and, in particular, more immature cells, such as neural progenitors. (NPC), abundant in the fetus. When NPCs are infected with ZIKV, there is less cell migration, impaired neurogenesis, and cell death from apoptosis, which probably contributes to microcephaly in newborns. The aim of this project was to model in vitro the CNS of patients who were born with congenital microcephaly caused by vertical ZIKV infection. Our objective was to verify the cellular and molecular effects of the virus action in these patients during the CNS formation under the hypothesis that maternal infection has induced cellular and molecular changes responsible for the pathogenic phenotype presented in the congenital Zika virus syndrome (CZS). Our results showed that the fibroblasts used for reprogramming and studying these patients in vitro were a great alternative due to the difficulty of obtaining samples. Also, iPSCs generated by reprogramming via transfection of episomal plasmids in fibroblasts were differentiated into astrocytes and neurons. According to the percentage of differentiated cells, patients were divided into two groups: one with 20% of astrocytes in the mixed neuron culture (CZS-A), similar to the control group, and another group that presented low expression of astrocyte markers. (CZS-B). The investigation of the number of synapses in the iPSC-derived neurons of patients with CZS showed less expression in pre-and postsynaptic proteins (in both groups), as well as in their colocalization, indicating that these patients have a significant reduction in synapses compared to the control group. However, a significant reduction in postsynaptic protein and its colocalization with presynaptic protein was observed when comparing the two groups of neurons, lower CZS-B patients. A picture of a significant reduction in glutamate production was also observed in the astrocytes of patients with CZS compared to the control group. Still, the glutamate reuptake curve showed the same reuptake pattern in both groups. With this work and the results obtained, we can say that it is possible to model CZS in vitro, focusing on cellular and molecular phenotypes. However, more studies will be needed to confirm these findings and eventually correlate them with the clinical characteristics found in these children.

HIPERNUTRIÇÃO RESULTANTE DA REDUÇÃO DA NINHADA INDUZ COMPORTAMENTO TIPO DEPRESSIVO E REDUÇÃO DA EXPRESSÃO ASTROCITÁRIA DE GFAP EM RATOS PRÉ-PÚBERES, SEM INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO INTRANASAL COM OCITOCINA

A ocitocina (OXT) é um hormônio neuropeptideo hipofisário com funções importantes, como a modulação dos reflexos neuroendócrinos de vínculos com a prole. Estudos mostraram que a obesidade leva a um processo inflamatório crônico, detectado por aumento das citocinas periféricas e centrais, levando a uma neuroinflamação e promovendo astrogliose. Tratamentos com OXT apresentaram resultados satisfatórios para redução do ganho de peso e também como moduladora da resposta astrocitária. No presente estudo, foi induzido o sobrepeso em ratos machos a partir da redução da ninhada para estudar os efeitos do sobrepeso ainda no período da infância junto ao tratamento intranasal de solução com OXT em parâmetros bioquímicos e comportamentais e sobre a expressão astrocitária da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) no córtex frontal e hipotálamo. Os animais foram divididos em 2 grupos normonutrição (grupos N), nos quais não houve redução da ninhada e padronizados com 4 filhotes machos e 4 fêmeas, grupo NS, tratados com solução salina, e NOXT, tratados com ocitocina (OXT). Para indução de sobrepeso foram padronizados 2 grupos de ninhadas reduzidas com 3 machos e uma fêmea (grupos H), sendo um grupo tratado com OXT (HOXT) e um grupo tratado com solução salina (HS). Os animais foram pesados desde o dia pós-natal (DPN) 2 ao 31. No DPN 21 as fêmeas foram separadas para outro estudo e apenas os machos permaneceram nos experimentos. No DPN 31, os animais foram avaliados no teste de nado forçado, bem como para perfil bioquímico e expressão da GFAP. Os resultados obtidos mostraram maior ganho de peso entre os grupos hipernutrição (HS e HOXT), ausência de alteração bioquímica entre os grupos, comportamento tipo-depressivo nos animais de ninhadas reduzidas e redução da expressão da GFAP nos grupos HS e HOXT. A redução da ninhada ocasionou maior ganho de peso das proles estudadas e comportamento tipo-depressivo ainda no período da infância, o que justifica a redução na expressão astrocitária da GFAP. O tratamento intranasal de OXT, no entanto, não influenciou nos resultados obtidos.

Oxytocin (OXT) is a pituitary neuropeptide hormone with important functions, such as modulating neuroendocrine reflexes of offspring bonds. Studies have shown that obesity leads to a chronic inflammatory process, detected by increased peripheral and central cytokines, leading to neuroinflammation and promoting astrogliosis. OXT treatments showed satisfactory results for weight gain reduction and also as a modulator of astrocyte response. In the present study, overweight in male rats was induced from litter reduction to study the effects of childhood overweight with intranasal treatment of OXT solution on biochemical and behavioral parameters and glial fibrillary acidic protein expression (GFAP) in astrocytes from the frontal cortex and hypothalamus. The animals were divided into 2 normonutrition groups (groups N), with no litter reduction and standardized with 4 male and 4 female, NS group, treated with saline, and NOXT, treated with oxytocin (OXT). For overweight induction, 2 groups of reduced litters with 3 males and one female were standardized (groups H), being one group treated with OXT (HOXT) and one treated with saline (HS). The animals were weighed from postnatal day (PND) 2 to 31. In PND 21 females were separated for another study and only males remained in the experiments. In PND 31, the animals were evaluated in the forced swimming test, as well as for biochemical profile and GFAP expression. The results showed greater weight gain among the hypernutrition groups (HS and HOXT), no biochemical alteration between the groups, depressive-type behavior in the reduced litter animals and reduction of GFAP expression in the HS and HOXT groups. Litter reduction caused greater weight gain of the investigated offspring and type-depressive behavior during childhood, which justifies the reduction of GFAP astrocyte expression. Intranasal treatment of OXT did not influence the results obtained.

PREJUÍZOS NA INTERAÇÃO SOCIAL DO CAMUNDONGO MUTANTE EQUILÍBRIO: REDUÇÃO DA MEMÓRIA OLFATÓRIA, PERCEPÇÃO ESPACIAL E DA ÁREA DE ASTRÓCITOS NO COLÍCULO SUPERIOR E AUMENTO NA ATIVIDADE DA SEROTONINA NO CÓRTEX FRONTAL.

O camundongo mutante recessivo denominado equilíbrio (eqlb) apresenta deficiência de equilíbrio e incoordenação motora e foi desenvolvido utilizando o agente químico N-ethyl-N-nitrosourea (ENU). O mapeamento genético identificou a mutação no gene NADPH oxidase 3 (Nox3), cromossomo 17, descrito como responsável por defeitos vestibulares e na formação das otocônias. Foi observado que estes camundongos, dentre outros deficits, não apresentavam comportamento agressivo entre machos sugerindo prejuízo de seu comportamento social. O objetivo desse trabalho foi estudar o comportamento social dos camundongos eqlb e identificar qual ou quais seriam as causas que levariam à ausência deste tipo de agressividade. Foram avaliados em camundongos eqlb e BALB/c: 1) comportamento social e agressivo de machos em colônias estáveis e frente a um intruso; 2) comportamento social/ agressivo por isolamento; 3) memória olfatória; 4) percepção espacial; 5) níveis de serotonina e metabólito no córtex frontal;6) índice por área de astrócitos no colículo superior. Em relação aos camundongos BALB/C, os camundongos eqlb mostraram: 1) menor interação social entre os animais em colônias estáveis; 2) maior interação social com o intruso sendo atacados por mais tempo pelo intruso; 3) quando isolados interagiram menos com o intruso e exploraram mais a gaiola; 4) maior latência no teste olfatório; 5) maior imobilidade no teste de suspensão da cauda; 6) maior atividade do sistema serotoninérgico do córtex frontal e 7) redução no índice por área de astrócitos no colículo superior. Conclusões: sugere-se que a menor interação social na colônia estável, a maior interação social com o camundongo estranho bem como a ausência de resposta à agressão do intruso do camundongo eqlb possam ser consequências de deficits na memória olfatória, percepção espacial, aumento da atividade serotoninérgica no córtex frontal e redução do índice por área de astrócitos no colículo superior.

The recessive mutant mouse, called equilibrium (eqlb), presents balance deficiency and motor incoordination and was developed using the chemical agent N-ethyl-N-nitrosourea (ENU). The genetic mapping identified the mutation in the NADPH oxidase 3 (Nox3) gene, chromosome 17, described as responsible for vestibular defects and in the formation of otoconia. It was observed that these mice, among other deficits, did not present aggressive behavior among males suggesting impairment of their social behavior. The objective of this study was to investigate the social behavior of eqlb mice and to identify which or which would be the causes that would lead to the absence of this type of aggressiveness. Eqlb and BALB / c mice were evaluated to the: 1) social and aggressive behavior of males in stable colonies and front of an intruder; 2) social / aggressive behavior by isolation; 3) olfactory memory; 4) spatial perception. 5) levels of serotonin and metabolite in the frontal cortex, 6) index by area of astrocytes in the superior colliculus. In relation to the BALB / C mice, the eqlb mice showed: 1) lower social interaction between animals in stable colonies; 2) greater social interaction with the intruder being attacked for longer by the intruder; 3) when isolated they interacted less with the intruder and explored more the cage; 4) greater latency in the olfactory test; 5) greater immobility in the tail suspension test; 6) higher activity of the serotonergic system of the frontal cortex and 7) reduction in the index by area of astrocytes in the superior colliculus. Conclusions: it is suggested that the lower social interaction in the stable colony, the greater social interaction with the foreign mouse as well as the absence of response to the aggression of the mouse eqlb to intruder may be a consequence of olfactory memory deficits, spatial perception, increased activity serotonergic in the frontal cortex and reduction of the index by astrocyte area in the superior colliculus.

AVALIAÇÃO CITOTÓXICA DA MAMMEA A/BB EM LINHAGENS DE CÉLULAS DE GLIOMA

COSTA, I. B. Avaliação citotoxica da mammea A/BB em linhagens de células de glioma. 2019. 80 p. Dissertação (Mestre em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2019. O glioblastoma é a forma mais agressiva dentre os gliomas os recursos terapêuticos disponíveis são limitados e envolvem ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia. Nesse ínterim, a busca por alternativas farmacológicas mais eficazes e menos agressivas coloca a mammea A/BB em análise. Esse metabólito vegetal é encontrado na casca das raízes da família botânica Calophyllaceae, do gênero Kielmeyera. Objetiva-se a partir da realização deste estudo avaliar o potencial citotóxico da mammea A/BB em células de glioblastoma humano U251 e de glioma de rato C6. A ação farmacológica da mammea A/BB foi testada em ambas linhagens, por meio dos ensaios de viabilidade celular por MTT, teste de migração, quantificação de cariopicnose e da expressão de glicoproteína-p. Analisou-se também o efeito da droga em células normais astrocitárias de rato e uma comparação da viabilidade celular entre a droga teste e o quimioterápico de primeira linha, a temozolomida. Os experimentos desenvolvidos indicaram que as linhagens U251 e C6 apresentaram, em todas as amostras analisadas, uma sensibilidade concentração dependente à mammea A/BB e resistência à temozolomida no intervalo de concentração de 2 M a 200 M. As concentrações de 27 ± 2,31M e 56,85 ± 14,17 M da mammea A/BB foram capazes de inibir a população celular em 50% nas linhagens U251 e C6, respectivamente, bem como o potencial migratório das referidas linhagens. A droga teste não apresenta ação citotóxica em células astrocitárias de rato. Foram encontrados núcleos picnóticos em maior quantidade no tratamento com a mammea A/BB quando comparado com as condições controle e DMSO. A mammea A/BB não apresentou diferença significativa na indução da expressão da glicoproteína P. Os resultados obtidos indicam uma ação farmacológica potencial na indução da citotoxicidade da droga nas tipologias celulares tumorais e não citotóxica nas células normais avaliadas.

COSTA, I. B. Cytotoxic evaluation of the mammea A/BB to glioma cells. 2019. 80 p. MSc Thesis (Mestre em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2019. Glioblastoma is the most aggressive form of gliomas and the available therapeutic resources are limited and involve surgical resection, radiotherapy and chemotherapy. The search for more effective and less aggressive pharmacological alternatives places mammea A/BB under analysis. This plant metabolite is found in the bark of roots of the botanical family Calophyllaceae, of the genus Kielmeyera. The objective of this study was to evaluate the cytotoxic potential of mammea A/BB in human glioblastoma U251 and C6 rat glioma cells. The pharmacological action of mammea A/BB was tested in both strains by cell viability assays by MTT, migration test, cariopnosis quantification and p-glycoprotein expression.The effect of the drug on normal murine astrocytic cells and a comparison of cell viability between the test drug and the first-line chemotherapy, temozolomide, were also analyzed. The experiments showed that the U251 and C6 cell lines had a concentration dependent sensitivity to mammae A/BB and resistance to temozolomide in the concentration range of 2 M to 200 M in all the analyzed samples. The concentrations of 27 ± 2.31 M and 56.85 ± 14.17 M of mammea A/BB were able to inhibit the cell population in 50% in the lines U251 and C6, respectively, as well as the migratory potential of these lines. The test drug shows no cytotoxic action on murine astrocyte cells. Pinocytic nuclei were found in greater quantity in the treatment with mammea A/BB when compared to the control and DMSO conditions. Mammea A/BB showed no significant difference in the induction of P-glycoprotein expression. The results indicate a potential pharmacological action in the induction of cytotoxicity of the drug in tumor cell types and non-cytotoxic in the normal cells evaluated.

CAMUNDONGO MUTANTE BATE-PALMAS COMO POSSÍVEL MODELO PARA A SÍNDROME DE KABUKI: MAIOR SUSCEPTIBILIDADE A INFECÇÕES E PREJUÍZOS NA VOCALIZAÇÃO?

O camundongo mutante recessivo bate-palmas (BALB/cbapa, ou bapa), obtido pelo agente químico ENU, apresenta mutação no gene Kmtd2s (Mll2). A síndrome de Kabuki pode ser causada por mutação neste gene e caracteriza-se também pela maior susceptibilidade às infecções na infância, associadas a prejuízos na fala. Estudamos o bapa em fases de desenvolvimento quanto à susceptibilidade a infecções, comportamento doentio e sua comunicação. Foi administrada uma dose de LPS por camundongo bapa e controles (BALB/c, ou balb) machos e fêmeas, nos dias de vida pós-natal (PND) 30-32 (período pré-púbere). Eles foram avaliados quanto à atividade geral em campo aberto e vocalização ultrassônica (comunicação). Eles foram desafiados com uma dose de LPS nos PND45-47 (puberdade) e avaliados para os mesmos parâmetros. Nos PND30-32: (1) o LPS induziu comportamento doentio (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (2) os bapa apresentaram maior atividade motora/exploratória; (3) os bapa apresentaram menos comportamento doentio (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (4) as balb fêmeas foram mais sensíveis ao LPS que os balb machos, porém, os bapa machos foram mais sensíveis ao LPS que as bapa fêmeas. Nos PND45-47: (1) a exposição prévia ao LPS reduziu o comportamento doentio (tolerância); (2) os bapa desafiados com LPS apresentaram maior resposta comportamental doentia (parâmetros comportamentais e expressão astrocitária); (3) os camundongos machos apresentaram maior atividade motora; (4) os balb machos desafiados pelo LPS apresentaram redução do comportamento doentio devido à tolerância ao LPS administrado; (5) os bapa machos não desenvolveram tolerância ao LPS. Foram observadas vocalizações ultrassônicas de 31 kHz somente em fêmeas (balb e bapa) nos PND30-32 não expostas ao LPS. Assim, o LPS induziu comportamento doentio e a exposição prévia pode ter gerado uma resposta de tolerância. Os mutantes bapa apresentaram hiperatividade dopaminérgica bem como maior resposta comportamental doentia, corroborando nossa hipótese de modelo experimental da síndrome de Kabuki. O estudo das vocalizações ultrassônicas parece ter encontrado um padrão em camundongos ainda não reportado.

The mutant recessive knock-out mouse bate-palmas (BALB/cbapa, or bapa), induced by the chemical agent ENU, has a mutation in the Kmtd2s (Mll2) gene. Kabuki syndrome can be caused by mutation in this gene and is also characterized by increased susceptibility to infections associated with speech impairments during childhood. We studied bapa mice in developmental stages regarding susceptibility to infections, sickness behavior and their communication. LPS was administered in male and female bapa and in controls (BALB/c, or balb) mice, on the postnatal days (PND) 30-32 (pre-pubertal period). They were evaluated for the open-field general activity and ultrasonic vocalizations (communication). They were challenged with LPS on PND45-47 (puberty) and the same parameters were evaluated. On PND30-32: (1) LPS induced sickness behavior (behavioral parameters and astrocyte expression); (2) bapa mice presented increased motor/exploratory activity; (3) bapa mice presented a decreased sickness behavior (behavioral parameters and astrocyte expression); (4) female balb mice were more sensitive to LPS than male balb; however, male bapa were more sensitive to LPS than female bapa. On PND45-47: (1) previous exposure to LPS reduced sickness behavior (tolerance); (2) bapa mice challenged with LPS presented increased sickness behavior response (behavioral parameters and astrocyte expression); (3) male mice presented increased motor activity; (4) male balb mice challenged with LPS developed a sickness behavior decrease due to LPS tolerance; (5) male bapa mice did not developed tolerance to LPS. Ultrasonic vocalizations of 31 kHz were observed only in females (balb and bapa) on PND30-32 not exposed to LPS. Thus, LPS induced sickness behavior and a previous LPS exposure seems to have induced a tolerance response. The bapa mice presented dopaminergic hyperactivity as well as increased sickness behavior response, corroborating our hypothesis of bapa being a Kabuki syndrome experimental model. The study of ultrasonic vocalizations seems to have found a pattern in mice not yet reported.

Redução da expressão astrocitária de proteína glial fibrilar ácida em cães tratados com dexametasona

Glial fibrillary acidic protein (GFAP) is the most important marker of astrocytes, that are the major glial cells in the nervous tissue and exhibit receptors to several steroid hormones, which have an apparent influence in their genic expression. The aim of this study was to evaluate if dexamethasone (DX) administration in therapeutic protocols to dogs would be capable of affecting the astrocytic expression of the protein. Samples from the pons and the spinal cord of dogs, treated (n=6) or not (n=6) with DX, were submitted to GFAP immunohistochemical staining and astrocytic reactivity was determined by colorimetry in a computer system for image analysis. Difference statistically significant was noted for the mean areas stained with GFAP in the pons of dogs treated and non-treated with DX, as well as in the spinal cord of dogs which previously received or not DX, with clear tendency of drug-induced reduction in the astrocyte expression of this protein. GFAP expression in the spinal cord was greater than in the pons, regardless the use of DX or not.

A proteína glial fibrilar ácida (GFAP) constitui o principal marcador dos astrócitos, as células gliais mais numerosas do tecido nervoso e que exibem receptores a diversos hormônios esteroidais, os quais exercem aparente influência sobre a expressão gênica das mesmas. O objetivo do presente estudo foi o de avaliar se a administração de dexametasona (DX) em protocolos terapêuticos para cães seria capaz de afetar a expressão astrocitária dessa proteína. Para tal, amostras da ponte e da medula espinhal torácica de cães, tratados (n=6) ou não (n=6) com DX, foram submetidas à marcação imuno-histoquímica para a GFAP e a reatividade astrocitária foi determinada por colorimetria em um sistema computacional de análise de imagens. Diferença estatisticamente significativa foi constatada para as médias das áreas marcadas para GFAP na ponte de cães tratados e não-tratados com DX, assim como na medula espinhal torácica dos que haviam recebido previamente o corticoide ou não, com clara tendência, induzida pela droga, de redução da expressão astrocitária da proteína. Além disso, a expressão de GFAP na medula espinhal foi maior que na ponte, independentemente do emprego de DX ou não.

Redução da expressão astrocitária de proteína glial fibrilar ácida em cães tratados com dexametasona

Glial fibrillary acidic protein (GFAP) is the most important marker of astrocytes, that are the major glial cells in the nervous tissue and exhibit receptors to several steroid hormones, which have an apparent influence in their genic expression. The aim of this study was to evaluate if dexamethasone (DX) administration in therapeutic protocols to dogs would be capable of affecting the astrocytic expression of the protein. Samples from the pons and the spinal cord of dogs, treated (n=6) or not (n=6) with DX, were submitted to GFAP immunohistochemical staining and astrocytic reactivity was determined by colorimetry in a computer system for image analysis. Difference statistically significant was noted for the mean areas stained with GFAP in the pons of dogs treated and non-treated with DX, as well as in the spinal cord of dogs which previously received or not DX, with clear tendency of drug-induced reduction in the astrocyte expression of this protein. GFAP expression in the spinal cord was greater than in the pons, regardless the use of DX or not.

A proteína glial fibrilar ácida (GFAP) constitui o principal marcador dos astrócitos, as células gliais mais numerosas do tecido nervoso e que exibem receptores a diversos hormônios esteroidais, os quais exercem aparente influência sobre a expressão gênica das mesmas. O objetivo do presente estudo foi o de avaliar se a administração de dexametasona (DX) em protocolos terapêuticos para cães seria capaz de afetar a expressão astrocitária dessa proteína. Para tal, amostras da ponte e da medula espinhal torácica de cães, tratados (n=6) ou não (n=6) com DX, foram submetidas à marcação imuno-histoquímica para a GFAP e a reatividade astrocitária foi determinada por colorimetria em um sistema computacional de análise de imagens. Diferença estatisticamente significativa foi constatada para as médias das áreas marcadas para GFAP na ponte de cães tratados e não-tratados com DX, assim como na medula espinhal torácica dos que haviam recebido previamente o corticoide ou não, com clara tendência, induzida pela droga, de redução da expressão astrocitária da proteína. Além disso, a expressão de GFAP na medula espinhal foi maior que na ponte, independentemente do emprego de DX ou não.

EFEITO DO FLAVONOIDE AGATHISFLAVONA NA MODULAÇÃO DA RESPOSTA GLIAL E NA POPULAÇÃO DE NEURÔNIOS CORTICAIS EM MODELO IN VITRO DE TRAUMATISMO CRANIOENCEFÁLICO

Em um primeiro momento, utilizou-se a prospecção científica para a avaliação ao nível mais alto de desenvolvimento em artigos científicos sobre pesquisa com o flavonoide agathisflavona. A pesquisa prospectiva resultou em 81 produções científicas expressas em diversos periódicos, submetidas por diferentes países, com aumento no número de publicações verificado na última década. Entre as atividades biológicas do flavonoide agathisflavona, já demonstradas, estão efeito hepatoprotetor, antiprotozoario, antibiótico, antiviral, imunomodulador, neurogênico e neuroprotetor. Nesta perspectiva, foi possível investigar os avanços no estudo do flavonoide agathisflavona para desenvolvimento de novas terapêuticas. Em um segundo momento, testou-se os efeitos da agathisflavona em um modelo in vitro de TCE. O TCE é uma patologia multifatorial, sendo causa importante de incapacitação em seres humanos e animais. A depender do estresse mecânico causado pelo TCE, os astrócitos reagem com mudanças complexas de fenótipo e função conhecidas como astrogliose. Em casos de dano tecidual severo, os astrócitos proliferam na área imediatamente adjacente à lesão e se entrelaçam formando a cicatriz glial que, apesar de importante para mitigar o dano inicial do TCE também interfere na posterior regeneração do SNC. O flavonoide agathisflavona tem demonstrado efeito neuroprotetor, neurogênico e imunomodulador, o que pode ser benéfico em situações de TCE. Neste estudo foram investigados os efeitos do flavonoide agathisflavona em um modelo in vitro de TCE em culturas primárias de córtex cerebral embrionário murino em termos de modulação da resposta astrocitária, integridade de neurônios e modulação de fatores neurotróficos e imunomodulatórios. Comparado com os controles, tratamento com agathisflavona (1 µM) diminuiu a expressão de GFAP e espessamento de processos astrocitários observado nas culturas lesionadas, e gerou um aumento no número de corpos de neurônios e crescimento de neuritos que adentram a lesão. Agathisflavona (0,1 e 1 µM) também induziu aumento na expressão de fatores neurotróficos NGF e GDNF, assim como da enzima arginase-1, associada com microglias de perfil neuroprotetor M2. Os resultados encontrados no presente estudo demonstram que o flavonoide agathisflavona modula a resposta astrocitária e formação de cicatriz glial, estimulando a recomposição da rede neural em um modelo in vitro de TCE, o que pode ser considerado para terapia de TCE.

Initially, scientific prospecting was used for evaluation at the highest level of development in scientific papers on research with the flavonoid agathisflavone. The prospective research resulted in 81 scientific productions expressed in several journals, submitted by different countries, with an increase in the number of publications verified in the last decade. Among the biological activities of the flavonoid agathisflavone, already demonstrated, are hepatoprotective, antiprotozoal, antibiotic, antiviral, immunomodulatory, neurogenic and neuroprotective effect. In this perspective, it was possible to investigate the advances in the study of the flavonoid agathisflavone for the development of new therapeutics. In a second step, the effects of agathisflavone on an in vitro model of TBI were tested. ECT is a multifactorial pathology, being an important cause of incapacitation in humans and animals. Depending on the mechanical stress caused by TBI, astrocytes react with complex phenotype and function changes known as astrogliosis. In cases of severe tissue damage, astrocytes proliferate in the area immediately adjacent to the lesion and intertwine forming a glial scar which, while important to mitigate the initial damage of the TBI, also interferes with the subsequent regeneration of the CNS. The flavonoid agathisflavone has demonstrated neuroprotective, neurogenic and immunomodulatory effects, which may be beneficial in situations of TBI. In this study we investigated the effects of flavonoid agathisflavone on an in vitro model of TBI in primary cultures of murine embryonic cerebral cortex in terms of modulation of astrocytic response, neuron integrity and modulation of neurotrophic and immunomodulatory factors. Compared with the controls, treatment with agathisflavone (1 M) decreased GFAP expression and thickening of astrocyte processes observed in the injured cultures, and generated an increase in the number of neuron bodies and neurite outgrowth that entered the lesion. Agathisflavone (0.1 and 1 M) also induced increased expression of NGF and GDNF neurotrophic factors, as well as the arginase-1 enzyme, associated with M2 neuroprotective profile microglia. The results found in the present study demonstrate that the flavonoid agathisflavone modulates the astrocytic response and glial scar formation, stimulating the neural network recomposition in an in vitro model of TBI, which can be considered for TBI therapy.

Confluence between veterinary and human neuropathology

In 1906 a great man and scientist, Santiago Ramón y Cajal- together with Camilo Golgi- were awarded the Nobel Prize in Medicine for their extraordinary contribution to the understanding of the nervous system. Most of the subjects today recorded and discussed in the field of neurology/neuropathology were either discoveredor suggested by Dr Ramón y Cajal who had a symbiotic relationship with the microscope and a refined attitude for drawing. His history is fascinating and his mind as privileged as to announce matters as new synapses form throughout life to serve as physical basis of learning and memory, a fact only recently proven involving the glial cell named astrocyte by this magnificent researcher.

ATIVIDADE CITOTÓXICA E ANTI-INFLAMATÓRIA DE EXTRATO DE FOLHAS DE Jatropha curcas L. EM CÉLULAS GLIAIS

A Jatropha curcas L. (J. curcas L.), planta da família da Euforbeáceae, conhecida localmente como pinhão manso, apresenta alta plasticidade adaptativa, sendo cultivada em diferentes regiões de clima tropical e subtropical do mundo. Configura-se uma alternativa na medicina popular tradicional e veterinária para tratamentos de várias condições patológicas. Estudos demonstram que ação farmacológica como antimicrobiano, antifúngico, antioxidante, cicatrizante e anti-inflamatório possa está associado à presença de classes de compostos bioativos como os flavonoides e taninos. No entanto, não existem relatos da ação de compostos isolados desta planta no Sistema Nervoso Central (SNC). A escassez de conhecimento técnico-científico sobre a espécie gera uma demanda por estudos mais aprofundados. Assim o presente estudo objetivou realizar um mapeamento prospectivo sitemático sobre evolução tecnológica das diversas utilizações da planta Jatropha curcas L., obter extrato metanólico de folhas de J. curcas L. (EJC) e suas frações (FnEJC), realizar triagem fitoquímica qualitativa dos bioativos do EJC e investigar a atividade citotóxica e anti-inflamatória em culturas primárias de células gliais submetidas a estímulo inflamatório. A prospecção de registros tecnológicos a partir da base de dados do Escritório Europeu de Patentes (Espacenet®), entre o período de 1983 a 2012, não revelou documentos de tecnologiais (patentes) com finalidade terapêutica farmacológica da J. curcas L. A triagem fitoquímica do EJC apresentou resultado positivo para xantonas, leucoantocianidinas, catequinas (taninos catéquicos), flavanonas e flavonoides, xantonas, esteroides, terpenoides e saponinas. Foi observada atividade anti-inflamatória do extrato metanólico de folhas de J. curcas L. e frações em células gliais obtidas a partir de córtex cerebral de ratos Wistar neonatos, tratadas com lipopolissacarideo de Escherichia coli (LPS 1 g mL-1). O EJC (0,1 g mL-1 a 1.000 g mL-1) não foi citotóxica para as células gliais e apresentou EC50 de 10,794 g mL-1. O tratamento com LPS induziu ativação de astrócitos e microglias caracterizada por modificações morfológicas e da expressão de marcadores epecíficos GFAP e Iba-1, respectivamente além dada ativação do Fator Nuclear kaap B (NF-kB) em astrócitos além de aumento da produção de Oxido nítrico (NO). O Tratamento com o EJC preservou células quiescentes e atenuou ativação de células gliais pós indução inflamatória. Observou-se que EJC, F1EJC e F2EJC (0,1 g mL-1) inibiram a produção de NO, inclusive após estímulo inflamatório com LPS. Os resultados sugerem que o EJC inibe a ativação do NF-kB por apresentar compostos bioativos da J. curcas L. com possível bloqueio da resposta glial na regulação de genes envolvidos no processo inflamatório. Os resultados também contribuíram para a geração do documento de depósito de patente no Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI) no intuito de assegurar as novas descobertas desenvolvidas.

Jatropha curcas L. (Euforbeáceae), known locally as pinhão manso, is a plant with highly adaptable plant cultivated in different regions of tropical and subtropical regions of the world. Its adopeted in traditional folk medicine for the treatment of various pathological conditions, including arthritis, wounds and especially inflammation. Parts of the plant heve been demonstrated biological activites, as antimicrobial, antifungal, antioxidant, healing and anti-inflammatort, however, there are no evidences about effects on the Central Nervous System (CNS). Increasing evidence shows that glia cells, in speciall astrocytes and microglia, play a crucial role in the inflammatory response in the CNS, implicated in the pathogenesis and progression of neurodegenerative diseases. The glial reaction (gliosis) is chacterized by a set of alterations including changes in the synthesis and distribution of cytoskeletal proteins, release of molecules involved in inflammation, and reduced ability to regulate extracellular neurotransmitters and ions. The objective of the present work was to perform a prospective study about the technological evolution of the various uses of the Jatropha curcas L., to obtain a methanolic extract from leaves of J. curcas L. (EJC) and its fractions (FnEJC), to perform qualitative phytochemical study of EJC and to investigate the cytotoxic and anti-inflammatory activity in primary cultures of glial cells submitted to inflammatory stimuli. The prospection of technological registrations from the database of the European Patent Office (Espacenet®), the platform with the largest number of associates in the world, between the yars of 1983 and 2012, did not reveal technology documents (patents) with pharmacological therapeutic purpose of J. curcas L. Phytochemical screening of EJC showed positive results for xanthones, leucoanthocyanidins, catechins (catheteric tannins), flavanones and flavonoids, xanthones, steroids, terpenoids and saponins. Glial cell cultures were obtained from the cerebral cortex of neonates Wistar rats and treated wit LPS (1 g mL-1). EJC at 0.1 1,000 g mL-1 was not toxic to glial cells, and presented EC50 of 10.794 g mL-1. Treatment with LPS induced astrocyte and microglia activation characterized by morphological modifications and changes on expression of GFAP and Iba-1, markers of astrocytes and microglia, respectively, as well as activation of transcription factor NF-kB and production of NO. EJC treatment associated with LPS attenuated gliosis and activation of the LPS-induced Nuclear kaap B Factor (NF-kB). Moreover, (EJC) and fractions F1EJC and F2EJC reduced LPS-induced prodution of NO. Togheter these results indicates that EJC presentes anti-inflammatory antivity in reative glial cells associated to inibition of NF-kB. The results also contributed to the generation of the patent document of invention in the National Institute of Industrial Property (INPI) in order to ensure the new discoveries developed.

TOXICIDADE DOS FRUTOS DE Eugenia uvalha Cambess (UVAIA) EM OVINOS

Os primeiros relatos de ocorrência de intoxicação por uvaia remetem ao ano de 2009 e surtos foram observados em 2012 e 2013, na região serrana de Santa Catarina. Após o surgimento desta enfermidade, a doença foi reproduzida por meio de intoxicação experimental com a administração de frutos inteiros para ovinos. Os animais intoxicados apresentam sinais neurológicos como apatia intensa, sialorreia, ranger de dentes, andar em círculos, cegueira, incoordenação motora, opistótonos e convulsões. Aqueles que sobrevivem à intoxicação desenvolvem sequelas ao longo do tempo, como opistótonos e convulsões. Para dar continuidade, novos experimentos foram conduzidos buscando-se avaliar quais as partes tóxicas do fruto e possíveis alterações em sistema nervoso de ovinos. Para isto, foram administradas diferentes partes do fruto de uvaia (semente/polpa/fruto inteiro) para sete ovinos. Uma ovelha que recebeu sementes trituradas na dose de 80g/kg por um período de dez dias e três outras que receberam a polpa nas doses diárias de 80g/kg, 40g/kg e 20g/kg pelo mesmo período, não manifestaram alterações. O ovino que consumiu a fruta inteira in natura na dose diária de 80 g/kg por três dias apresentou inquietude e desconforto, evoluindo para apatia, sialorréia, ranger de dentes e convulsões tônico-clônicas, morrendo 18 horas após o início dos sinais. Uma ovelha que apresentou sequelas da intoxicação foi eutanasiada e amostras foram coletadas para igual análise. As três ovelhas que consumiram o fruto inteiro in natura na dose de 40g/kg/dia e fruto inteiro triturado, na dose de 80g/kg, apresentaram um quadro brando de intoxicação, com apatia e leve incoordenação motora, recuperando-se nos dias seguintes. Amostras das vísceras foram coletadas para exame histopatológico. Fragmentos de tálamo, hipotálamo, córtex e cerebelo foram coletados para realização de microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Na análise histológica observou-se alterações sutis, como congestão e edema perivasculares leves, vacuolização leve multifocal da substância branca cortical e tumefação de astrócitos, que na MET foi caracterizada por formações de vesículas distendidas no citoplasma.

The first reports of occurrence of uvaia intoxication relates the year 2009 and outbreaks were observed in 2012 and 2013, in the mountainous land of Santa Catarina State. After the onset of this disease, it was reproduced through experimental poisoning by administration of whole fruits to sheep. Intoxicated animals presents clinical neurological signs such as intense apathy, sialorrhea, tooth grinding, walking in circles, blindness, motor incoordination, opisthotonos and seizures. Some of them survive to intoxication and develop sequelae, such as opisthotonos and seizures. To continue, new experiments were conducted to evaluate the toxic parts of the fruit as well as possible damages in the sheep nervous system. For this, different parts of the uvaia fruit (seed / pulp / whole fruit) were administered to seven sheep. A ewe that received crushed seeds at a dose of 80g / kg / 10 days and three others that received the pulp at daily doses of 80g / kg, 40g / kg and 20g / kg for the same period did not show clinical changes. The sheep that consumed the whole fruit in natura at the daily dose of 80g/kg, showed restlessness and discomfort, evolving to apathy, sialorrhea, teeth grinding and tonic-clonic seizures, dying 18 hours after the onset of signs. A sheep that presented sequelae of intoxication was euthanized and samples were collected for the same analysis. The ewes that consumed the whole in natura fruit at a dose of 40 g/kg/day and whole crushed fruit, at a dose of 80g/kg, presented mild symptoms of poisoning, since apathy and mild motor incoordination, recovering in the following days. Samples of viscera were collected for histopathological examination. Piece of thalamus, hypothalamus, cortex and cerebellum were collected for transmission and scanning electron microscopy. In the histological analysis subtle changes were observed, such as congestion and mild perivascular edema, multifocal light vacuolization of the cortical white matter, and astrocyte swelling, which in the MET was characterized by distal vesicle formations in the cytoplasm. INDEXING TERMS:

Privação alimentar materna na geração F0 e dieta hipercalórica na geração F1 reduzem a expressão de GFAP em diversas áreas do SNC após desafio imunológico da geração F2

No presente estudo, foram analisados os efeitos da privação alimentar na gestação da geração F0 combinada com a dieta hipercalórica (HD) na puberdade da geração F1 sobre o comportamento dos astrócitos das gerações F1 e F2. O comportamento dos astrócitos foi investigado pela análise imuno-histoquímica da expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) em diversas áreas do sistema nervoso central (SNC) incluindo córtex frontal, parietal, núcleo accumbens, núcleos periventricular e arqueado do hipotálamo, ponte e camadas molecular e granular do cerebelo das gerações F1 e F2. Além disso, foram observados os efeitos da ativação imunológica pelo LPS na geração F2. Na geração F1, foi observado um aumento da expressão de GFAP nos ratos fêmeas que receberam HD na puberdade em relação àqueles que receberam dieta normocalórica (ND) no mesmo período. Nos machos da geração F2, foi observada uma significativa redução da expressão de GFAP em ambos os grupos cujas mães receberam HD, tratados ou não com LPS, em comparação aos grupos cujas mães receberam ND, com ou sem LPS. Esses dados sugerem que a atenuação do efeito do LPS pode ter ocorrido pelo efeito transgeracional provocado tanto pela privação alimentar durante o período gestacional na geração F0, quanto pela HD na puberdade da geração F1.

In the present study, the effects of maternal food restriction in the pregnancy of F0 generation combined with hypercaloric diet (HD) in the puberty of F1 generation on astrocyte behavior of F1 and F2 generation were investigated. The astrocyte behavior was examined by assessing the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) by immunohistochemistry in astrocytes of several central nervous system (CNS) areas including frontal cortex, parietal cortex, nucleus accumbens, periventricular and arcuate nucleus, pons and cerebellar areas (molecular cell layer and granular cell layer) of F1 and F2 generations. In addition, the effects of immune activation by LPS in the F2 generation were observed. In the F1 generation, it was observed a larger GFAP expression in female rats that received HD on puberty than those that received normocaloric diet at the same time. In the male F2 generation, it was observed a significant reduced GFAP expression in both groups of dams generation fed with HD, treated or not with LPS, in relation to F2 generation of dams fed with normocaloric diet, treated or not with LPS. These data suggest that this attenuation of LPS effect can be occurred by a transgenerational effect of both, maternal food deprivation in pregnancy of F0 generation and HD diet in puberty of F1 generation

Transplante alogênico de células-tronco mesenquimais induz alteração do perfil de citocinas pró e antiflamatórias e de fatores neurotróficos no tratamento da lesão espinal

O objetivo deste estudo foi comparar dois protocolos de tratamento da lesão espinal aguda com células-tronco mesenquimais criopreservadas, extraídas do tecido adiposo (CTM-AD) de ratos Lewis eGFP. Avaliou-se a expressão de marcadores de superfície, capacidade de diferenciação e viabilidade celular pré e pós criopreservação de CTM-ADsubmetidas à três meios de criopreservação com concentrações distintas de soro fetal bovino (SFB). Os resultados demonstraram que as CTM-AD não perdem sua multipotência, não modificam a expressão fenotípica e apresentam alta viabilidade celular por até 90 dias de criopreservação. Avaliou-se também os efeitos imunomodulatórios e neuroprotetores do tratamento único (grupo GI) e duplo (grupo GII) com CTM-AD alogênicas criopreservadas por via intravenosa após lesão espinal Os grupos tratados (GI e GII) foram avaliados conjuntamente com o grupo sham (GS) e controle negativo (GC) atravéz da escala de função motora (BBB), expressão dos transcriptos gênicos de interleucina-10 (IL-10), interleucina-1 beta (IL-1), fator de necrose tumoral alfa (TNF-), fator de transformação do crescimento (TGF-), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neutrófico derivado da glia (GDNF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Adicionalmente realizou-se quantificação por imunohistoquímica do infiltrado inflamatório (anti-CD68), integridade neuronal (anti-NeuN), e ativação de astrócitos (anti-GFAP). Quando comparado ao grupo GC, os grupos tratados com CTM apresentaram maiores escores nas avaliações funcionais a partir de 72h após lesão, sendo a média dos maiores escores alcançada pelo grupo GII; menor expressão de CD68 e GFAP juntamente com a redução da degeneração da substância branca e maior expressão de NeuN. O tratamento com as células também resultou em aumento da expressão de IL-10, GDNF, VEGF e redução da expressão de TNF- e TGF-. Adicionalmente o grupo GII apresentou redução da expressão de IL-1 e aumento da expressão de BDNF. Conclui-se que o tratamento alogênico com duas aplicações de CTM-AD criopreservadas promove melhor recuperação da atividade motora, reduz o infiltrado inflamatório, ativa células da micróglia/macrógafos com fenótipo antinflamatório, aumenta a quantidade de neurônios íntegros, reduz a degeneração da substância branca e a ativação de astrócitos na medula espinal e aumenta a secreção do fator neurotrófico BDNF.

This thesis aimed to compare two treatment protocols with cryopreserved allogenic adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) after spinal cord injury. Experiment 1 evaluated pre-freeze and pos-freeze populations of AD-MSCs response to freezing at 30, 60 and 90 days following cryopreservation. Plasticity, cell surface phenotype and cell viability were evaluated at different times after thawing technique. Results showed that MSC do not lose their multipotency, do not alter phenotypic profile and have a high cell viability for up to 90 days of cryopreservation. Experiment 2 evaluated the immunomodulatory and neuroprotective effects of cryopreserved allogenic adipose-derived MSCs after spinal cord injury (SCI). Treatment effects were comparatively evaluated by quantitation of gene expression of interleukin-10 (IL-10), interleukin-1 beta (IL-1), tumor necrosis factor (TNF-), transforming growth factor (TGF -), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial derived neurotrophic factor (GDNF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). Immunohistochemical analyzes were used to quantify inflammatory infiltrate (anti-CD68), neural integrity (anti-NeuN), and astrocytes activation (anti-GFAP). Frozen adipose-derived MSCs were transplanted after three hours (GI) and three hours and seven days after SCI (GII). The results were compared with animals without SCI (GS) and SCI without treatment (GC). MSCs treated groups had higher scores in functional assessments from 72h after injury, being the average of the highest scores achieved by the GII; lower expression of CD68 and GFAP along with reducing of degeneration of the white matter and increased expression of NeuN. The treatment with the cells also resulted in increased IL-10 expression, GDNF, VEGF and reduced of TNF- and TGF- expression. Additionally the GII decreased IL-1 expression and increased BDNF expression. The results suggest that early intravenous injection of AD-MSCs after acute SCI promotes better recovery of function, prevent futher damage through enhancement of anti-inflammatory mechanisms, reduces the inflammatory infiltrate, active anti-inflammatory phenotype of microglia, increase neuron viability, reduces the degeneration of the white matter and astrocyte activation in SCI. In addition, treatment with double applications of AD-MSCs was superior to the single administration of these cells, resulting in improved motor response and secretion of BDNF.

Astrocyte intermediate filaments are important markers in olfactory bulb of bovine Herpesvirus type 5 natural infections

Astroglial cells are the most abundant cells in the mammalian central nervous system, yet our knowledge about their function in bovine Herpesvirus type 5 (BoHV-5) has been limited. The aim of this study was to detect by immunohistochemistry assay the reactive astrocytes for glial fibrilary acidic protein (GFAP) and vimentin (VIM), considered intermediate filaments of the cytoskeleton, localized in olfactory bulb from natural acute cases of BoHV-5 infection. All samples were submitted to virus isolation, real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH) technique to confirm the virus transcription and respective genome. Samples were classified into four groups according to the severity of histological lesions. Groups III and IV, which histological lesions were classified as alacia, gliosis, satellitosis, neuronophagia and neuronal necrosis, 35% (± 1.8-2.1) of the inflammatory mononuclear cells, corresponded to CD3 positive lymphocytes. In the same group, 35% (± 1.8) of astrocytes were described as reactive to GFAP and VIM proteins. An agreement of r = 1.0 (P<0.0001) was found between histological lesions, intermediate filaments expression, viral DNA and transcription and CD3 lymphocytes. However, samples with mild histological lesions, 10.8 to 14.2% of astrocytes were classified as reactive to GFAP and VIM filaments. Our findings suggest that GFAP and VIM reactive astrocytes, in primary site of virus replication, seems to play an important role in neurovirulence, in spite of many questions concerning the virus immunopathology remains unclear

Astrocyte intermediate filaments are important markers in olfactory bulb of bovine Herpesvirus type 5 natural infections

Astroglial cells are the most abundant cells in the mammalian central nervous system, yet our knowledge about their function in bovine Herpesvirus type 5 (BoHV-5) has been limited. The aim of this study was to detect by immunohistochemistry assay the reactive astrocytes for glial fibrilary acidic protein (GFAP) and vimentin (VIM), considered intermediate filaments of the cytoskeleton, localized in olfactory bulb from natural acute cases of BoHV-5 infection. All samples were submitted to virus isolation, real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH) technique to confirm the virus transcription and respective genome. Samples were classified into four groups according to the severity of histological lesions. Groups III and IV, which histological lesions were classified as alacia, gliosis, satellitosis, neuronophagia and neuronal necrosis, 35% (± 1.8-2.1) of the inflammatory mononuclear cells, corresponded to CD3 positive lymphocytes. In the same group, 35% (± 1.8) of astrocytes were described as reactive to GFAP and VIM proteins. An agreement of r = 1.0 (P<0.0001) was found between histological lesions, intermediate filaments expression, viral DNA and transcription and CD3 lymphocytes. However, samples with mild histological lesions, 10.8 to 14.2% of astrocytes were classified as reactive to GFAP and VIM filaments. Our findings suggest that GFAP and VIM reactive astrocytes, in primary site of virus replication, seems to play an important role in neurovirulence, in spite of many questions concerning the virus immunopathology remains unclear(AU)