Caracterização funcional de quatro termolisinas presentes nas espécies patogênicas de Leptospira

A leptospirose, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, é uma doença de importância médica e veterinária altamente difundida em todo mundo. Atualmente, as leptospiras são classificadas em mais de 300 sorovares agrupados em 64 espécies distintas (patogênicas e saprófitas). Estas espiroquetas produzem diversas proteases potencialmente capazes de produzir danos nos tecidos. Hoje, sabemos que proteínas presentes no sobrenadante de cultura de estirpes patogênicas são capazes de degradar diversas moléculas do hospedeiro incluindo proteínas da matriz extracelular, da cascata de coagulação e do sistema complemento, contribuindo para os processos de invasão e evasão imune. A análise dos genomas de leptospiras disponíveis nos levou à identificação de quatro termolisinas, presentes somente nas espécies patogênicas, codificadas pelos genes LIC13320, LIC13321, LIC13322 e LIC10715. Tendo em vista que enzimas da família das termolisinas são fatores cruciais na patogênese de várias doenças causadas por bactérias e representam alvos potenciais para intervenção terapêutica, este projeto teve por objetivo caracterizar funcionalmente essas metaloproteinases de Leptospira. As quatro termolisinas de L. interrogans foram obtidas na forma recombinante e realizou-se também a expressão heteróloga da termolisina codificada pela LIC13322 de L. interrogans (estirpe patogênica) em L. biflexa (estirpe saprófita). Os resultados indicam que as termolisinas de L. interrogans são capazes de degradar diversas proteínas envolvidas na ativação do sistema complemento humano, assim como algumas proteínas da matriz extracelular, e devem, portanto, auxiliar a bactéria nos processos de invasão e evasão imune. A expressão heteróloga da LIC13322 na estirpe saprófita não conferiu resistência ao soro, sugerindo que as termolisinas devem possuir um papel aditivo e certo grau de especificidade de ação.

Leptospirosis, caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira, is a disease of medical and veterinary importance highly widespread worldwide. Currently, leptospires are classified into more than 300 serovars grouped into 64 distinct species (pathogenic and saprophytic). These spirochetes produce several proteases potentially capable of causing tissue damage. Today, we know that proteins present in the culture supernatant of pathogenic strains are able to degrade several host molecules including proteins from the extracellular matrix, the coagulation cascade and the complement system, contributing to the invasion and immune evasion processes. The analysis of the genomes of leptospires available led us to the identification of four thermolysins, present only in pathogenic species, encoded by the genes LIC13320, LIC13321, LIC13322 and LIC10715. Bearing in mind that enzymes of the thermolysin family are crucial factors in the pathogenesis of several diseases caused by bacteria and represent potential targets for therapeutic intervention, this project aimed to functionally characterize these Leptospira metalloproteinases. The four thermolysins of L. interrogans were obtained in recombinant form and the heterologous expression of the thermolysin encoded by LIC13322 of L. interrogans (pathogenic strain) was also carried out in L. biflexa (saprophyte strain). The results indicate that L. interrogans thermolysins are capable of degrading several proteins involved in the activation of the human complement system, as well as some proteins of the extracellular matrix, and should, therefore, assist the bacteria in the processes of immune invasion and evasion. The heterologous expression of LIC13322 in the saprophyte strain did not confer resistance to the serum, suggesting that thermolysins must have an additive role and a certain degree of specificity of action.

Bothrops snake venoms and their isolated toxins, an L-amino acid oxidase and a serine protease, modulate human complement system pathways

Background Activation of the complement system plays an important role in the regulation of immune and inflammatory reactions, and contributes to inflammatory responses triggered by envenomation provoked byBothrops snakes. The present study aimed to assess whether Bothrops jararacussuand Bothrops pirajai crude venoms and their isolated toxins, namely serine protease (BjussuSP-I) and L-amino acid oxidase (BpirLAAO-I), modulate human complement system pathways.Methods Lyophilized venom and toxin samples solubilized in phosphate buffered saline were diluted in appropriate buffers to evaluate their hemolytic activity on the alternative and classical pathways of the complement system. Venom- and toxin-treated normal human serum was added to the erythrocyte suspension, and the kinetic of hemolysis was measured spectrophotometrically at 700 nm. The kinetic 96-well microassay format was used for this purpose. We determined the t ½values (time required to lyse 50 % of target erythrocytes), which were employed to calculate the percentage of inhibition of the hemolytic activity promoted by each sample concentration. To confirm complement system activation, complement-dependent human neutrophil migration was examined using the Boyden chamber model.Results At the highest concentration tested (120 μg/mL), B. jararacussu and B. pirajai crude venoms inhibited the hemolytic activity of the classical pathway (65.3 % and 72.4 %, respectively) more strongly than they suppressed the hemolytic activity of the alternative pathway (14.2 and 13.6 %, respectively). BjussuSP-I (20 μg/mL) did not affect the hemolytic activity of the classical pathway, but slightly decreased the hemolytic activity of the alternative pathway (13.4 %). BpirLAAO-I (50 μg/mL) inhibited 24.3 and 12.4 % of the hemolytic activity of the classical and alternative pathways, respectively. Normal human serum treated with B. jararacussu and B. pirajai crude venoms induced human neutrophil migration at a level similar to that induced by zymosan-activated normal human serum.Conclusion Together, the results of the kinetics of hemolysis and the neutrophil chemotaxis assay suggest that pre-activation of the complement system byB. jararacussu and B. pirajai crude venoms consumes complement components and generates the chemotactic factors C3a and C5a. The kinetic microassay described herein is useful to assess the effect of venoms and toxins on the hemolytic activity of the complement system.(AU)

Bothrops snake venoms and their isolated toxins, an L-amino acid oxidase and a serine protease, modulate human complement system pathways

Background Activation of the complement system plays an important role in the regulation of immune and inflammatory reactions, and contributes to inflammatory responses triggered by envenomation provoked byBothrops snakes. The present study aimed to assess whether Bothrops jararacussuand Bothrops pirajai crude venoms and their isolated toxins, namely serine protease (BjussuSP-I) and L-amino acid oxidase (BpirLAAO-I), modulate human complement system pathways.Methods Lyophilized venom and toxin samples solubilized in phosphate buffered saline were diluted in appropriate buffers to evaluate their hemolytic activity on the alternative and classical pathways of the complement system. Venom- and toxin-treated normal human serum was added to the erythrocyte suspension, and the kinetic of hemolysis was measured spectrophotometrically at 700 nm. The kinetic 96-well microassay format was used for this purpose. We determined the t ½values (time required to lyse 50 % of target erythrocytes), which were employed to calculate the percentage of inhibition of the hemolytic activity promoted by each sample concentration. To confirm complement system activation, complement-dependent human neutrophil migration was examined using the Boyden chamber model.Results At the highest concentration tested (120 g/mL), B. jararacussu and B. pirajai crude venoms inhibited the hemolytic activity of the classical pathway (65.3 % and 72.4 %, respectively) more strongly than they suppressed the hemolytic activity of the alternative pathway (14.2 and 13.6 %, respectively). BjussuSP-I (20 g/mL) did not affect the hemolytic activity of the classical pathway, but slightly decreased the hemolytic activity of the alternative pathway (13.4 %). BpirLAAO-I (50 g/mL) inhibited 24.3 and 12.4 % of the hemolytic activity of the classical and alternative pathways, respectively. Normal human serum treated with B. jararacussu and B. pirajai crude venoms induced human neutrophil migration at a level similar to that induced by zymosan-activated normal human serum.Conclusion Together, the results of the kinetics of hemolysis and the neutrophil chemotaxis assay suggest that pre-activation of the complement system byB. jararacussu and B. pirajai crude venoms consumes complement components and generates the chemotactic factors C3a and C5a. The kinetic microassay described herein is useful to assess the effect of venoms and toxins on the hemolytic activity of the complement system.(AU)

Bothrops snake venoms and their isolated toxins, an L-amino acid oxidase and a serine protease, modulate human complement system pathways

Background Activation of the complement system plays an important role in the regulation of immune and inflammatory reactions, and contributes to inflammatory responses triggered by envenomation provoked byBothrops snakes. The present study aimed to assess whether Bothrops jararacussuand Bothrops pirajai crude venoms and their isolated toxins, namely serine protease (BjussuSP-I) and L-amino acid oxidase (BpirLAAO-I), modulate human complement system pathways.Methods Lyophilized venom and toxin samples solubilized in phosphate buffered saline were diluted in appropriate buffers to evaluate their hemolytic activity on the alternative and classical pathways of the complement system. Venom- and toxin-treated normal human serum was added to the erythrocyte suspension, and the kinetic of hemolysis was measured spectrophotometrically at 700 nm. The kinetic 96-well microassay format was used for this purpose. We determined the t ½values (time required to lyse 50 % of target erythrocytes), which were employed to calculate the percentage of inhibition of the hemolytic activity promoted by each sample concentration. To confirm complement system activation, complement-dependent human neutrophil migration was examined using the Boyden chamber model.Results At the highest concentration tested (120 g/mL), B. jararacussu and B. pirajai crude venoms inhibited the hemolytic activity of the classical pathway (65.3 % and 72.4 %, respectively) more strongly than they suppressed the hemolytic activity of the alternative pathway (14.2 and 13.6 %, respectively). BjussuSP-I (20 g/mL) did not affect the hemolytic activity of the classical pathway, but slightly decreased the hemolytic activity of the alternative pathway (13.4 %). BpirLAAO-I (50 g/mL) inhibited 24.3 and 12.4 % of the hemolytic activity of the classical and alternative pathways, respectively. Normal human serum treated with B. jararacussu and B. pirajai crude venoms induced human neutrophil migration at a level similar to that induced by zymosan-activated normal human serum.Conclusion Together, the results of the kinetics of hemolysis and the neutrophil chemotaxis assay suggest that pre-activation of the complement system byB. jararacussu and B. pirajai crude venoms consumes complement components and generates the chemotactic factors C3a and C5a. The kinetic microassay described herein is useful to assess the effect of venoms and toxins on the hemolytic activity of the complement system.

AVALIAÇÃO DE GENES E MOLÉCULAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS EM JUNDIÁS (RHAMDIA QUELEN) VACINADOS OU INFECTADOS COM AEROMONAS HYDROPHILA

Nesse estudo avaliamos a cinética da atividade hemolítica natural do sistema do complemento, atividade da lisozima e mieloperoxidase sérica, e a cinética de expressão dos genes responsáveis pela codificação do fator alfa de necrose tumoral (Tumoral necrosis fator alfa = TNF-), da interleucina 1 (Interleukin 1- = IL-1), da proteína kinase 4 associada ao receptor de interleucina (Interleukin receptor associated kinase-4 = IRAK-4) e da enzima mieloperoxidase (Myeloperoxidase = MPO), em jundiás vacinados com uma bacterina de Aeromonas hydrophila ou infectados pela mesma bactéria. Os peixes foram aclimatados por duas semanas antes do início do experimento em três tanques (n = 36/tanque) cada qual constituindo um grupo experimental: (i) grupo controle (inoculado com solução salina fosfatada - PBS, pH 7,4); (ii) grupo vacinado, inoculado com 5x108 bactérias inativadas contendo 20% do adjuvante Montanide® Gel PR1; e (iii) grupo inoculado com 2x108 bactérias viáveis. Foram coletadas amostras de sangue para as análises imunológicas e de tecido (rim cranial) para extração de RNA/confecção de cDNA dos peixes de cada grupo antes do início das inoculações e 24h e 72h pós-inoculação. As análises imunológicas no soro dos peixes demonstraram que a atividade do sistema do complemento estava elevada 24 e 72 horas pós-inoculação nos peixes vacinados e infectados; no entanto, a atividade da mieloperoxidase foi maior nesses grupos somente 24h pós-inoculação e a atividade da lisozima estava elevada apenas no grupo infectado, 72 horas pós-inoculação. Além disso, nossos resultados mostraram que, nos peixes vacinados e/ou infectados, a expressão dos genes TNF-, IL-1 e MPO, 24h após a inoculação, foi maior em relação ao grupo controle; no entanto, a expressão do gene IRAK-4 permaneceu inalterada nos tempos avaliados. Os níveis de mRNA de todos os genes avaliados estavam próximos dos basais 72 horas pós-inoculação, sugerindo a ativação de mecanismo de regulação da inflamação. Os resultados indicam que a vacina gera uma resposta pró-inflamatória mediada pela expressão dos genes TNF-, IL-1b e MPO e incrementa mecanismos de combate aos patógenos via ação da MPO e do sistema do complemento. Esse efeito ocorre em níveis compatíveis aos da infecção pela mesma bactéria. Concluímos que a vacina potencializa os mecanismos efetores da resposta imune inata e tem potencial para ser utilizada como profilaxia contra infecções por A. hydrophila em jundiás.

In this work we evaluated the kinetics of the natural hemolytic activity of complement, serum lysozyme and myeloperoxidase activity, and the expression kinetics of the tumoral necrosis factor alfa (TNF-), interleukin 1- (IL-1), interleukin receptor associated kinase-4 (IRAK-4) and myeloperoxidase enzyme (MPO) in silver catfish vaccinated with Aeromonas hydrophila or infected with the same bacteria. The fish were acclimatized for two weeks prior to the experiment in three tanks (n = 36 fish/tank) each composing an experimental group: (i) the placebo group, inoculated with sterile phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4); (ii) vaccinated group, inoculated with 5x108 inactivated A. hydrophila adjuvanted with Montanide® Gel PR1at 20%; and (iii) infected group, inoculated with 2x108 viable A. hydrophila. Blood samples were collected for immunological assays and head kidney for RNA extraction from fish (n=6/group) prior to and at 24 and 72 h post inoculation (p.i.). The natural hemolytic activity of complement, measured on serum samples, was higher at 24 and 72h p.i. in the vaccinated and infected groups; serum myeloperoxidase was also higher on these groups but only at 24h p.i. and lysozyme activity was higher only in the infected group at 72h p.i. In addition, in the vaccinated and or infected fish, the expression of TNF-, IL-1 e MPO genes at 24h p.i. was higher compared to the control group; however, the expression of IRAK-4 was not altered throughout the experiment. And, at 72h p.i., the mRNA levels of all evaluated genes were returned to basal levels as compared to the control group, suggesting the activation of a regulatory mechanism. Our results indicate that the vaccine induces a proinflammatory response mediated by the expression of TNF-, IL-1 e MPO genes and improved pathogen-combating mechanisms mediated by myeloperoxidase and natural complement system. We concluded the vaccine optimizes the effector mechanisms of the innate immune response and might be a useful tool in the prophylaxis of A. hydrophila infection in silver catfish.

Heat stress and vitamin E in diets for broilers as a mitigating measure / Estresse térmico por calor e vitamina E em rações para frangos de corte como medida atenuante

This review aimed to identify the importance of vitamin E dietary supplementation to broilers subjected to heat stress in relation to metabolism, growth performance and quality of animal products and its effects on immune system. Vitamin E is the concentration of tocopherol and tocotrienol, which can be found in natural or synthetic form. This vitamin is essential for the integrity of reproductive, muscular, circulatory, nervous and immune systems of the animals. In order to reduce the harmful effects of high temperatures in poultry production, vitamin E supplementation is a viable alternative for the sector. Some studies indicate its potential antioxidant effect able to modulate inflammatory responses and physiological adjustments to mitigate the undesirable effects of exposure of broilers to high temperatures. Moreover, it has been found increased viability of animals due to the greater activation of the immune system, and improved quality of animal products given to the deposition in tissues with consequent nutritional enrichment of meat products.

Objetivou-se, com esta revisão, identificar a importância da suplementação de vitamina E às rações de frangos de corte submetidos a estresse por calor, em relação ao metabolismo, ao desempenho produtivo e à qualidade dos produtos de origem animal, bem como seus efeitos no sistema imune das aves. A vitamina E corresponde à concentração de tocoferol e de tocotrienol, podendo ser encontrada na forma natural ou sintética. É sabido que, essa vitamina, é essencial para a integridade reprodutiva, muscular, circulatória, nervosa e imunológica dos animais. Para reduzir os efeitos prejudiciais das altas temperaturas na produção avícola, a suplementação de vitamina E apresenta-se como alternativa viável para o setor. Alguns estudos indicam seu potencial efeito antioxidante capaz de modular respostas inflamatórias e ajustes fisiológicos para atenuar os efeitos indesejáveis da exposição das aves a elevadas temperaturas. Além disso, tem sido verificado aumento da viabilidade dos animais, pela maior ativação do sistema imune, e melhora na qualidade dos produtos de origem animal, devido à sua capacidade de deposição nos tecidos, com consequente enriquecimento nutricional dos produtos cárneos.

Heat stress and vitamin E in diets for broilers as a mitigating measure / Estresse térmico por calor e vitamina E em rações para frangos de corte como medida atenuante

This review aimed to identify the importance of vitamin E dietary supplementation to broilers subjected to heat stress in relation to metabolism, growth performance and quality of animal products and its effects on immune system. Vitamin E is the concentration of tocopherol and tocotrienol, which can be found in natural or synthetic form. This vitamin is essential for the integrity of reproductive, muscular, circulatory, nervous and immune systems of the animals. In order to reduce the harmful effects of high temperatures in poultry production, vitamin E supplementation is a viable alternative for the sector. Some studies indicate its potential antioxidant effect able to modulate inflammatory responses and physiological adjustments to mitigate the undesirable effects of exposure of broilers to high temperatures. Moreover, it has been found increased viability of animals due to the greater activation of the immune system, and improved quality of animal products given to the deposition in tissues with consequent nutritional enrichment of meat products.(AU)

Objetivou-se, com esta revisão, identificar a importância da suplementação de vitamina E às rações de frangos de corte submetidos a estresse por calor, em relação ao metabolismo, ao desempenho produtivo e à qualidade dos produtos de origem animal, bem como seus efeitos no sistema imune das aves. A vitamina E corresponde à concentração de tocoferol e de tocotrienol, podendo ser encontrada na forma natural ou sintética. É sabido que, essa vitamina, é essencial para a integridade reprodutiva, muscular, circulatória, nervosa e imunológica dos animais. Para reduzir os efeitos prejudiciais das altas temperaturas na produção avícola, a suplementação de vitamina E apresenta-se como alternativa viável para o setor. Alguns estudos indicam seu potencial efeito antioxidante capaz de modular respostas inflamatórias e ajustes fisiológicos para atenuar os efeitos indesejáveis da exposição das aves a elevadas temperaturas. Além disso, tem sido verificado aumento da viabilidade dos animais, pela maior ativação do sistema imune, e melhora na qualidade dos produtos de origem animal, devido à sua capacidade de deposição nos tecidos, com consequente enriquecimento nutricional dos produtos cárneos.(AU)

Complement activation-related pseudoallergy in dogs following intravenous administration of a liposomal formulation of meglumine antimoniate / Pseudoalergia relacionada à ativação do complemento em cães após administração intravenosa de uma formulação lipossomal de antimoniato de meglumina

The increasing use of nanotechnologies in advanced therapies has allowed the observation of specific adverse reactions related to nanostructures. The toxicity of a novel liposome formulation of meglumine antimoniate in dogs with visceral leishmaniasis after single dose has been investigated. Groups of 12 animals received by the intravenous route a single dose of liposomal meglumine antimoniate (group I [GI], 6.5 mg Sb/kg), empty liposomes (GII) or isotonic saline (GIII). Evaluation of hematological and biochemical parameters showed no significant changes 4 days after administration. No undesired effects were registered in the GIII. However, adverse reactions were observed in 67.7% of dogs from both groups that received liposomal formulations. The side effects began moments after bolus administration and disappeared during the first 15 minutes after treatment. Prostation, sialorrhea and defecation were the most frequent clinical signs, registered in 33.3% and 41.6 % of animals from the groups GI and GII, respectively. Tachypnea, mydriasis, miosis, vomiting and cyanosis were also registered in both groups. The adverse reactions observed in this study were attributed to the activation of the complement system by lipid vesicles in a phenomenon known as Complement Activation-Related Pseudoallergy (CARPA). The influence of the physical-chemical characteristics of liposomal formulation in the triggering of CARPA is discussed.(AU)

O crescente uso das nanotecnologias nas terapias avançadas tem permitido a observação de reações adversas específicas relacionadas às nanoestruturas. A toxicidade de uma nova formulação lipossomal de antimoniato de meglumina após dose única foi avaliada em cães com leishmaniose visceral. Grupos de 12 animais receberam por via intravenosa uma dose única de antimoniato de meglumina lipossomal (grupo I [GI], 6,5 mg Sb/kg), lipossomas vazios (GII) ou solução salina isotônica (GIII). A avaliação de parâmetros hematológicos e bioquímicos não revelou alterações significativas quatro dias após a administração. Nenhum efeito indesejável foi registrado no GIII. No entanto, reações adversas foram observadas em 67,7% dos cães de ambos os grupos que receberam formulações lipossomais. Os efeitos colaterais iniciaram momentos após a administração em "bolus" e desapareceram no decurso dos primeiros 15 minutos após o tratamento. Prostração, sialorréia e defecação foram os sinais clínicos mais frequentes, registrados em 33,3% e 41,6% dos animais dos grupos GI e GII, respectivamente. Taquipnéia, midríase, miose, vômitos e cianose também foram registrados em ambos os grupos. As reações adversas observadas neste trabalho foram atribuídas à ativação do sistema complemento pelas vesículas lipídicas em fenômeno conhecido como Pseudoalergia Relacionada à Ativação do Complemento (PARAC). A influência das características físico-químicas da formulação lipossomal no desencadeamento de PARAC é abordada.(AU)

Vacina contendo isolados de Corynebacterium pseudotuberculosis para avaliação da resposta imunológica em fêmeas ovinas

A ovino-caprinocultura é uma área que vem apresentando um forte crescimento no Brasil nas últimas décadas, com um rebanho constituído por 17.668.063 e 9.386.316 cabeças, respectivamente. Com o crescimento dos rebanhos, vem aumentando também a incidência das doenças bacterianas. Para o combate a essas enfermidades, tem-se estudado a utilização de vacinas. A constituição destas vacinas podem variar entre DNA, células bacterianas mortas, as bacterinas, e células bacterianas vivas, pela toxina inativada, os toxóides, do Corynebacterium pseudotuberculosis, ou pela associação destes componentes, utilizando ou não algum tipo de adjuvante. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi elaborar uma vacina à base de células bacterianas de C. pseudotuberculosis, avaliar a resposta imunológica com base na técnica da atividade bactericida do soro de fêmeas ovinas vacinadas, avaliando ainda a atividade hemaglutinante no extrato de C. pseudotuberculosis. Para o alcance desses objetivos foram utilizadas as seguintes metodologias: os isolados utilizados para elaboração da vacina foram isolados de caprinos pertencentes as cidades de Petrolândia e Jatobá, PE, isolados e cultivados na bacterioteca do laboratório de microbiologia e imunologia animal da Univasf. Os animais após vacinados, passaram por coletas de sangue semanais e com o soro obtido através destas coletas foi realizada a atividade bactericida. O extrato obtido dos três isolados, foi colocado em contato com hemácias de coelho para avaliar a atividade hemaglutinante no extrato, a qual foi avaliada visualmente. Foi possível observar que após a vacinação, o sistema imunológico dos animais respondeu de forma positiva, sendo possível observar do aumento da atividade bactericida do soro desses animais, diminuindo a contagem de UFC/mL com o passar das coletas, fato este que está relacionado com a ativação do sistema de defesa dos animais, conhecido como sistema complemento. O ensaio de hemaglutinação utilizando hemácias de coelho foi positivo para função biológica da proteína com o extrato proteico, indicando presença de lectinas no conjunto de proteínas do C. pseudotuberculosis.

The sheep-goat is an area that has shown strong growth in Brazil in recent decades, with a herd consisting of 17,668,063 and 9,386,316 heads, respectively. With the growth of herds, it has also increased the incidence of bacterial diseases. To combat these diseases, we have studied the use of vaccines. The constitution of these vaccines may vary between DNA killed bacterial cells, bacterins, and live bacterial cells, the inactivated toxin toxoids of Corynebacterium pseudotuberculosis, or the combination of these components, with or without some type of adjuvant. Thus, the objective of this study was to develop a vaccine based on bacterial cells of C. pseudotuberculosis, evaluate the immune response based on the technique of bactericidal activity of serum from vaccinated sheep females still evaluating the hemagglutination activity in extract C. pseudotuberculosis. To achieve these objectives, the following methodologies were used: the isolates used for the preparation of the vaccine were isolated from goats belonging to the towns of Petrolândia and Jatoba, PE, isolated and cultured in bacterioteca microbiology laboratory animal and Immunology UNIVASF. The animals vaccinated after, underwent weekly blood samples and serum obtained through these collections was held bactericidal activity. The extract obtained from three isolated, was put in contact with rabbit red blood cells to evaluate the hemagglutination activity in the extract, which was assessed visually. It was observed that after vaccination, the immune system of animals responded positively and are recording increased bactericidal activity of the serum of these animals, reducing the CFU / mL count over the collections, a fact that is related to activation of the animal defense system known as the complement system. The hemagglutination assay using rabbit erythrocytes was positive for biological function of the protein with the protein extract, indicating the presence of lectins on the set proteins of C. pseudotuberculosis.

ASPECTOS FISIOLÓGICOS E REPRODUTIVOS DA EXPOSIÇÃO DE VACAS LEITEIRAS AO ESTRESSE TÉRMICO

O estresse térmico reduz a eficiência reprodutiva em vacas leiteiras. O fluido folicular (FF) contém proteínas envolvidas na atividade e diferenciação celular do folículo e maturação oocitária. A caracterização das proteínas do FF pode contribuir para melhor compreensão dos mecanismos fisiológicos envolvidos na foliculogênese e comprometimento da função reprodutiva durante o estresse térmico. No primeiro experimento avaliou-se o perfil proteomico do FF de vacas em diferentes estágios do desenvolvimento folicular (pré-desvio, desvio, dominância e pré-ovulatório) e foi testada a associação das proteínas com as concentrações intrafoliculares de hormônios esteroides. Foram encontradas 22 proteínas diferentemente expressas (P < 0.05) entre as categorias foliculares, sendo o desvio um momento-chave na determinação da expressão das proteínas. Além disso, três proteínas foram correlacionadas (P < 0.05) com as concentrações intrafoliculares de estradiol, enquanto dezesseis foram correlacionadas (P < 0.05) com as concentrações locais de progesterona. A análise de vias canônicas identificou a ativação/inibição das vias associadas com a resposta de fase aguda, sistema de coagulação, sistema complemento, receptor X do fígado e retinóide e produção de óxido nítrico e espécies reativas de oxigênio. No segundo experimento, testou-se o efeito do estresse térmico sobre a expressão das proteínas do FF de vacas. Na validação do modelo experimental, foi observado que a exposição contínua ao estresse térmico afetou os mecanismos termorregulatórios, levando a um aumento pronunciado da frequência respiratória, seguido pelo aumento da temperatura retal. As variáveis ambientais do dia anterior foram mais importantes para explicar as respostas do parâmetros fisiológicos e ingestão de matéria seca, sendo a temperatura ambiente o principal fator envolvido na troca de calor. Embora a exposição prolongada ao estresse térmico indicar um ajuste adaptativo, neste estudo foi observada apenas aclimatação parcial. O crescimento folicular das vacas expostas ao estresse térmico foi afetado e pode, em parte, ser explicado pela expressão alterada das proteínas do FF. As 28 proteínas diferentemente (P < 0.05) expressas no FF de vacas estressadas por calor foram associadas, principalmente, às vias da função imune e cascata da coagulação. Tais achados indicam potenciais mecanismos moleculares e vias de sinalização envolvidos na foliculogênese e redução da fertilidade observada durante o verão.

Heat stress reduces the reproductive efficiency in dairy cows. Follicular fluid (FF) contains proteins involved in the follicle activity and cell differentiation and oocyte maturation. The characterization of the proteome of FF may contribute to a better understanding of the physiological mechanisms involved in folliculogenesis and impairment of reproductive function during heat stress. In the first experiment, the FF proteomic profile of cows at different stages of follicle development (pre-deviation, deviation, dominance and pre-ovulatory) was evaluated and the association of proteins with intrafollicular concentrations of steroid hormones was tested. Twenty-two differentially expressed proteins (P < 0.05) were found among the follicular categories, with deviation being a critical time-point in the determination of protein expression. In addition, three proteins were correlated (P < 0.05) with the intrafollicular concentrations of estradiol, while sixteen were correlated (P < 0.05) with the local concentrations of progesterone. The canonical pathway analysis identified the activation/inhibition of the pathways associated with acute phase response, coagulation system, complement system, liver X receptor and retinoid, and production of nitric oxide and reactive oxygen species. In the second experiment, the effect of heat stress on the expression of cow FF proteins was tested. In the experimental model validation, we observed that the continuous exposure to heat stress affected thermoregulatory mechanisms, leading to a marked increase in respiratory rate, followed by an increase in rectal temperature. The influence of environmental variables from the previous day on physiological parameters and dry matter intake were more important than the immediate effect and ambient temperature represented the most determinant factor for heat exchange. Although prolonged exposures to heat stress indicate an adaptive adjustment, in this study the acclimation process was only partial. The follicular growth of cows exposed to heat stress was affected and may be partly explained by the altered expression of the FF proteins. The 28 differentially (P < 0.05) expressed proteins in FF from heat stressed cows were closely associated to the immune function and the coagulation cascade pathways. Such findings indicate potential molecular mechanisms and signaling pathways involved in folliculogenesis and reduction fertility observed during the summer. ¨¨

Caracterização da ação da saliva do carrapato Amblyomma cajennense (Acari; Ixodidae) sobre a via clássica do sistema complemento

Os carrapatos são motivo de grande preocupação na medicina humana e veterinária, pois exercem ação espoliante e transmitem diversos patógenos para seus hospedeiros. As atividades exercidas por moléculas produzidas pela glândula salivar e o intestino destes artrópodes são primordiais para obtenção de sucesso alimentar e reprodutivo. Dentre as diversas atividades desempenhadas na saliva, destaca-se a inibição do sistema complemento que tem como possíveis papéis retardar ao máximo o aparecimento de uma resposta imune contra as proteínas salivares e proteger o epitélio intestinal do ataque das moléculas efetoras do sistema complemento presentes no sangue recém-ingerido. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a ação da saliva do carrapato Amblyomma cajennense sobre a via clássica do sistema complemento humano. Foi avaliado se saliva e o EGS de partenóginas e teleóginas de carrapatos de diferentes dias de alimentação são capazes de inibir a ação do sistema complemento. Para isto, foram utilizados ensaios de hemólise com hemácias de carneiros e soro humano para avaliar a ação na via clássica. Também foi mensurado o valor do pH intestinal de fêmeas de A. cajennense e a eficiência do sistema complemento e dos inibidores neste pH. Os resultados mostraram que a saliva e o EGS são capazes de inibir a hemólise pela via clássica do sistema complemento humano, porém a saliva se mostrou mais eficaz do que o EGS. O EGS de teleóginas e partenóginas inibem a hemólise, sendo o de partenóginas mais ativo. O EGS de A. cajennense, quando alimentados em camundongos, possuem maior inibição da via clássica na fase final de alimentação (últimas 48 horas de alimentação) e a atividade apresentou uma correlação positiva significativa (r=0,585, p<0,001) com o peso, diferente dos alimentados em equinos, onde a inibição é igual em carrapatos de diferentes pesos. O valor do pH encontrado no intestino de A. cajennense foi de 8,04 e a alcalinização das soluções do ensaio hemolítico para pH 8,0 não interfere na ativação da via clássica e na atuação dos inibidores do sistema complemento, sendo a inibição mais eficaz do que em pH 7,0. O conhecimento de quando estes inibidores são expressos na saliva e como eles agem, poderá ser utilizado em futuros experimentos na busca de novos métodos de controle para carrapatos.

Ticks are a major concern in human and veterinary medicine because they cause blood loss and transmit several pathogens to their hosts. The activity performed by molecules produced by the salivary gland and gut of these arthropods are crucial for them to obtain blood and reach reproductive success. Among various activities performed by saliva, the inhibition of the complement system is important by delaying an immune response against salivary proteins and protecting the intestinal epithelium from the complement system, present within the ingested blood. The overall objective of this study was to characterize the anti complement activity of Amblyomma cajennense saliva on the classical pathway of the human complement system. We evaluated whether the saliva and EGS from partially engorged and engorged ticks after different days of feeding are capable of inhibiting the action of the complement system. For this, hemolysis assays were performed with sheep red blood cells and human serum to evaluate the action in the classical pathway. We also measured the female A. cajennenses intestinal pH and the efficiency of the human complement system at this pH. The results showed that both the saliva and EGS are able to inhibit the classical pathway hemolysis of human complement system, but the tick saliva was more effective than the EGS. The EGS of partially engorged and engorged ticks inhibit hemolysis, with extracts from engorged ticks being more effective. The EGS from A. cajennense fed to mice, presented greater inhibition of the classical pathway when dissected towards the end of the feeding stage (last 48 hours during feeding) and the activity showed a significant positive correlation (r = 0.585, p <0.001) with total weight, unlike EGS obtained from ticks fed on horses, where the inhibition is equal in ticks of different weights. The pH found in the A. cajennenses gut was 8.04 and the adjustments of the haemolytical assays to alkaline conditions did not interfere with classical pathway activation and the role of complement inhibitors, with the most effective inhibition occurring at pH 7.0. The knowledge of when these inhibitors are expressed in tick saliva and how they act may be used in future experiments searching new methods of tick control.

Snake antivenoms: adverse reactions and production technology

Antivenoms have been widely used for more than a century for treating snakebites and other accidents with poisonous animals. Despite their efficacy, the use of heterologous antivenoms involves the possibility of adverse reactions due to activation of the immune system. In this paper, alternatives for antivenom production already in use were evaluated in light of their ability to minimize the occurrence of adverse reactions. These effects were classified according to their molecular mechanism as: anaphylactic reactions mediated by IgE, anaphylactoid reactions caused by complement system activation, and pyrogenic reactions produced mainly by the presence of endotoxins in the final product. In the future, antivenoms may be replaced by humanized antibodies, specific neutralizing compounds or vaccination. Meanwhile, improvements in antivenom quality will be focused on the obtainment of a more purified and specific product in compliance with good manufacturing practices and at an affordable cost.

Activation of the alternative complement pathway in canine normal serum by Paracoccidioides brasiliensis

The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a human granulomatous disease. Recently the first case of natural disease in dogs was reported. The complement system is an important effector component of humoral immunity against infectious agents. Therefore, the aim of this study was to evaluate the activation of the dog alternative complement pathway by P. brasiliensis. Initially, the ability of erythrocytes of guinea pig, rabbit, sheep, chicken and swine to activate the dog alternative pathway was evaluated. The guinea pig erythrocytes showed the greatest capacity to activate dog alternative pathway. The alternative (AH50) hemolytic activity was evaluated in 27 serum samples from healthy dogs and the mean values were 87.2 AH50/ml. No significant differences were observed in relation to sex and age. The alternative pathway activation by P. brasiliensis was higher in serum samples from adult dogs when compared to puppies and aged dogs (p 0.05). This is the first report of dog alternative complement pathway activation by P. brasiliensis and suggests that it may play a protective role in canine paracoccidioidomycosis.

O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma doença granulomatosa humana. Recentemente, foi relatado o primeiro caso da doença natural em cães. O sistema complemento é um importante componente efetor da imunidade humoral contra agentes infecciosos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a ativação da via alternativa do complemento canina pelo P. brasiliensis. Inicialmente, foi avaliada a capacidade de eritrócitos de cobaia, coelho, carneiro, galinha e suíno ativarem a via alternativa do complemento canino. Os eritrócitos de cobaia apresentaram maior capacidade de ativar a via alternative do complemento canino. A atividade hemolítica da via alternativa (AH50) foi avaliada em 27 amostras de soro de cães saldáveis e os valores médios observados foram de 87,2 AH50/ml. Não foi observada diferença significativa ao sexo e idade. A ativação da via alternativa pelo P. brasiliensis foi maior nas amostras de soro de cães adultos quando comparada aos cães filhotes e idosos (p 0.05). Este é o primeiro relato da ativação da via alternative do complemento canino pelo fungo P. brasiliensis e sugere que pode ter um papel protetor na paracoccidioidomicose canina.

Treatment of serum with supernatants from cultures of Candida albicans reduces its serum-dependent phagocytosis

Candida albicans is a potent activator of the complement system, and heat labile opsonins produced by activation of C3 (C3b and iC3b) enhance phagocytosis of C. albicans mediated by complement receptors. In this study we treated mouse serum with supernatants from cultures of a protease producer strain of C. albicans and evaluated the ability of this serum to enhance phagocytosis of C. albicans. Cell-free supernatants from cultures of C. albicans were concentrated 5 fold and added to mouse serum for 30 min at 37ºC, before using this serum for opsonization of glutaraldehyde-fixed yeast cells. We observed that normal mouse serum increased about 3 fold the phagocytosis of C. albicans by mice peritoneal macrophages, whereas supernatant-treated serum did not increase phagocytosis. This effect of supernatants on serum was prevented by addition of pepstatin (5 µg/ ml; an inhibitor of C. albicans acid proteases) to the medium. Serum treated with supernatants from cultures of a protease-deficient mutant of C. albicans also increased about 3 fold phagocytosis of the yeast. These results suggest that a protease produced by C. albicans causes proteolysis of serum opsonins, thereby reducing the phagocytosis of the yeast.

Candida albicans é um potente ativador do sistema complemento, e opsoninas lábeis ao calor produzidas por ativação de C3 (C3b e iC3b) aumentam a fagocitose de C. albicans mediada por receptores de complemento. Neste estudo, tratamos o soro de camundongo com sobrenadante de culturas de uma cepa de C. albicans produtora de proteases e avaliamos a capacidade deste soro reduzir a fagocitose de C. albicans. Sobrenadantes livres de células obtidos de cultura de C. albicans foram concentrados 5 vezes e adicionados ao soro de camundongo por 30 minutos a 37ºC, antes deste soro ser usado para opsonização de C. albicans na forma de levedura e fixadas em glutaraldeido. Nós observamos que soro normal aumentou 3 vezes a fagocitose de C. albicans por macófagos peritoneais, enquanto que o soro tratado com sobrenadante não aumentou a fagocitose. Este efeito do sobrenadante sobre o soro foi evitado por adição de pepistatina (5 µg/ml; um inibidor de proteinase ácida) ao meio. Soro tratado com sobrenadantes de culturas de um mutante de C. albicans deficiente em produção de proteinase também aumentou em 3 vezes a fagocitose da levedura. Estes resultados sugerem que uma proteinase produzida por C. albicans causa proteólise de opsoninas do soro, desta maneira reduzindo a fagocitose da levedura.

Contribuição ao estudo da ação in vitro do veneno da aranha marrom, Loxosceles gaucho, sobre plaquetas humanas e de coelho. Participação das plaquetas na dermonecrose induzida experimentalmente pelo veneno loxoscélico em coelhos / Contribution to the study of the in vitro action induced by the venom of the brown spider, Loxosceles gaucho, on human and rabbit platelets. Platelet participation in the dermonecrotic lesion experimentally induced in rabbits by the loxoscelic venom

Os venenos de aranhas do gênero Loxosceles possuem uma ampla gama de atividades em diferentes células, tecidos e sistemas, e é notória a sua capacidade de causar a formação da lesão dermonecrótica. Em um trabalho prévio, relatamos uma intensa trombocitopenia induzida pelo veneno loxoscélico em coelhos. Objetivou-se no presente estudo avaliar primeiramente a interação in vitro entre as plaquetas, humanas e de coelhos, com o veneno de Loxosceles gaucho e seu principal componente, a fração esfingomielinásica. Posteriormente, investigou-se o papel da plaqueta no desenvolvimento da lesão dermonecrótica através de um modelo de trombocitopenia em coelhos. Nos estudos in vitro, os resultados de agregação em plasma rico em plaquetas evidenciou que tanto o veneno total quanto a fração esfingomielinásica induziram um aumento desta resposta nas plaquetas das duas espécies, que foi mais intensa nas plaquetas humanas. Uma vez que em plaquetas lavadas a agregação não foi constatada, confirmou-se a necessidade de componente(s) plasmático(s) para a indução desta resposta. Ainda, os dados de LDH indicaram que o veneno total, nas concentrações aqui utilizadas, não foi capaz de causar à lise plaquetária. Com relação à ativação, o veneno total, foi capaz de aumentar a expressão da LIBS1 nas plaquetas de ambas as espécies e de P-selectina na plaqueta de coelho. Sob as nossas condições experimentais, a fração não promoveu o aumento dos marcadores de ativação. Finalizando os estudos in vitro, o veneno total e a fração provocaram um aumento da adesão nas plaquetas das duas espécies, sendo que a resposta à fração esfingomielinásica mostrou-se dose-dependente. O estudo experimental, por vez, necessitou de uma etapa preliminar para a obtenção de um anticorpo anti-plaqueta, produzido em cabras, que mostrou-se eficaz em induzir um intenso quadro trombocitopênico em coelhos. Análises histopatológicas indicam que a ausência das plaquetas não diminuiu a formação de trombos intravasculares na área da derme sob a ação do veneno. O desenvolvimento da lesão dermonecrótica em coelhos injetados com o veneno loxoscélico mostrou-se mais intenso naqueles depletados de plaquetas do que nos animais com número normal de plaquetas, constatável pelo desenvolvimento de maiores áreas de equimose e das escaras necróticas. Os resultados semelhantes dos níveis plasmáticos do fator de von Willembrand, dos tempos de protrombina e de tromboplastina parcial ativada, assim como dos testes de fagocitose por polimorfonucleares isolados do sangue periférico, entre os coelhos trombocitopênicos e aqueles com contagem normal de plaquetas, evidenciam que não houve alterações expressivas nas células endoteliais, no sistema da coagulação e na capacidade fagocítica via C3b dos polimorfonucleares do sangue periférico. Os presentes resultados mostram que o veneno loxoscélico in vitro é capaz de elicitar em plaquetas humanas e de coelhos as respostas de agregação, de adesão e de ativação. Por fim, as diferenças no desenvolvimento da lesão, constatadas entre o animal trombocitopênico e o animal normal, evidenciam que a plaqueta é um fator importante para controlar a expansão e a gravidade da lesão dermonecrótica induiza em coelhos pelo veneno loxoscélico

Venoms from Loxosceles spiders exhibit a wide range of activities on different cells, tissues and systems, being specially evident their ability to cause a dermonecrotic lesion. In a previous paper, we showed that Loxosceles gaucho spider venom induces intense thrombocytopenia in rabbits. Thus, in the present study, we firstly aimed to evaluate the in vitro interaction between human and rabbits platelets and L. gaucho venom and its major component, the sphingomyelinase fraction. Secondly, we investigated the platelet role in the dermonecrotic lesion formation using an experimental model of thrombocytopenia in rabbits. Both total venom and its sphingomyelinase fraction stimulated in vitro aggregation per se in platelet-rich plasma from both species, but a more intense response was obtained with human platelets. Taking into consideration that neither total venom nor its sphingomyelinase fraction induced aggregation of washed platelets, it can be deduced that one or more plasma components are necessary to induce this response. Moreover, LDH data indicated that total venom, at least at the concentration levels used in this study, cannot induce platelet lysis. Regarding platelet activation, total venom was able to increase the expression of LIBS1 on both human and rabbit platelet surface and P-selectin on only rabbit platelet surface. However, the sphingomyelinase fraction did not increase the expression of any marker of platelet activation, at least in the experimental conditions used in this study. Another in vitro study showed that both total venom and its sphingomyelinase fraction induce an increase in human and rabbit platelet adhesion, with the sphingomyelinase fraction exhibiting a dose-dependent response. For the study using an animal model of thrombocytopenia, it was necessary to previously produce goat antibodies against rabbit platelets, which showed to be effective to induce an intense thrombocytopenia in rabbits. Histopathological analysis of venom-induced dermic tissue lesion indicated that platelet absence does not decrease the formation of intravascular thrombi in the injured area. Nonetheless, bigger areas of equimosis and necrotic scabs could be observed in the dermonecrotic lesion of rabbits injected with loxoscelic venom and depleted of platelets. In the different groups, plasma levels of von Willembrand factor, prothrombin and activated partial thromboplastin times, and data from phagocytosis tests using polymorphonuclear cells isolated from rabbit periferical blood were similar comparing thrombocitopenic rabbits with those exhibiting normal platelet count; therefore, we can deduce that there is not any expressive alteration in endotelial cells, coagulation system and phagocytic ability of polymorphonuclear leukocytes via their complement receptor C3b. In conclusion, the loxoscelic venom is able to unchain in vitro different mechanisms leading to adhesion, activation and aggregation of both human and rabbit platelets. Furthermore, due to differences in the dermic lesion patterns between thrombocitopenic and normal animals, we can conclude that platelets must play a key role in controlling the expansion and severity of the dermonecrotic lesion induced in rabbits by L. gaucho venom