Diagnosis and management strategies for urospermia in stallions / Diagnóstico e estratégias de manejo na urospermia em garanhões

Urospermia, contaminação do sêmen com urina durante a ejaculação, é considerada a segunda causa mais frequente de disfunção ejaculatoria em garanhões. A presença de urina no sêmen pode afetar drasticamente a fertilidade através do pH alcalino e alta osmolaridade da urina, além de causar uma potencial inflamação uterina após a cobertura ou inseminação artificial. Esta condição pode estar associada a outras doenças como cistite, herpesvírus equino-1 e paralisia periódica hipercalêmica; no entanto, causas idiopáticas são as mais comuns. Por esse motivo, o tratamento da urospermia pode ser frustrante e o prognóstico para a resolução completa dessa condição costuma ser desfavorável. Garanhões que sofrem de urospermia são frequentemente diagnosticados após resultados frustrantes de fertilidade e baixa qualidade do sêmen. O diagnóstico de urospermia é baseado na aparência amarela e odor típico, presença de cristais de urina, pH alcalino, além do aumento da creatinina e níveis de nitrogênio. O tratamento da urospermia é desafiador, já que a maioria dos casos é idiopática, limitando as opções terapêuticas. No entanto, quando uma condição primária é diagnosticada, ela deve ser tratada para tentar resolver a causa da urospermia. Na maioria dos casos, as terapias direcionadas à redução da contaminação da urina incluem a redução da quantidade de urina na bexiga antes da cobertura ou coleta de sêmen, tratamento farmacológico para auxiliar o fechamento do colo da bexiga durante a ejaculação, ou a coleta apenas da porção rica em esperma através da coleta fracionada do ejaculado. O método mais simples e estabelecido para o manejo da urospermia é encorajar o garanhão a urinar antes da coleta de sêmen ou cobertura natural. No entanto, quando a coleta de sêmen livre de urina não é possível, o sêmen contaminado com urina pode ser processado para minimizar os efeitos adversos do pH e da osmolaridade ao esperma. O sêmen contaminado com urina deve ser diluído com diluente à base de leite no intuito de diminuir os efeitos deletérios da urina sobre os espermatozoides. A centrifugação com gradiente de densidade a fim de selecionar os espermatozoides com características superiores também é uma alternativa nesses casos. Além disso, a criopreservação de sêmen contendo baixos níveis de contaminação com urina pode ser realizada.

Urospermia is the contamination of semen with urine during ejaculation. Urospermia is the second most frequent ejaculatory dysfunction of stallions. It can drastically affect fertility mediated by alkaline pH, the high osmolarity of urine, and presumably excessive post-breeding inflammatory response. This condition can be associated with many other diseases (i.e., cystitis, equine herpesvirus-1, and hyperkalemic periodic paralysis); however, idiopathic causes appear to be predominant. For this reason, the treatment of urospermia can be frustrating, and the prognosis for complete resolution of this condition is often poor. Stallions suffering from urospermia are usually diagnosed after poor semen quality and fertility results. Diagnosis of urospermia is based on the yellow appearance, urine smell, urine crystal, alkaline pH, increased creatinine, and urea nitrogen levels. The treatment for urospermia is challenging. Most cases are idiopathic, thereby limiting therapeutic options. However, when a primary condition is diagnosed, it should be treated to solve the cause of urospermia. In most cases, therapies directed at reducing urine contamination include reducing the amount of urine in the bladder before breeding, pharmacological treatments to enhance bladder neck closure during ejaculation, or collecting only the sperm-rich portion of the ejaculate using an open-ended artificial vagina are used to manage stallions with urospermia. The simplest and most established method for managing urospermia is to encourage the stallion to urinate before semen collection or natural breeding. However, when the collection of semen free from urine is not possible, urine-contaminated semen can be processed to minimize the adverse effects of pH and osmolarity on the sperm. Semen contaminated with urine should be immediately extended with a milk-based extender to mitigate the deleterious effects of urine on the sperm. Single-layer gradient centrifugation can also be used to select sperm with superior traits for low urine contamination. In addition, semen cryopreservation can be performed in stallion semen with a low level of urine contamination.

Métodos de coleta de amostra para exame de citologia endometrial em éguas com endometrite / Sample collection methods for endometrial cytology examination in mares with endometritis

A endometrite é definida como uma inflamação do endométrio, podendo ser aguda ou crônica, infecciosa ou não infecciosa. Essa afecção é de grande importância econômica na medicina veterinária, podendo resultar em morte embrionária, aborto e até tornar a égua infértil, sendo uma das afecções que mais comprometem a sanidade uterina, colocando em risco os índices de prenhez obtidos pós-cobertura, pós-inseminação, e pós-inovulação de embriões. Existem diversos métodos para diagnóstico e o mais utilizado a campo é a citologia endometrial/uterina. Também existem algumas formas de coleta de amostra para análise laboratorial pela citologia, tais como: escova ginecológica, swab uterino guiado por mandril metálico ou plástico descartável e lavado uterino de baixo volume, seguido de sedimentação ou centrifugação podendo ser complementada por citocentrifugação. O diagnóstico pela citologia endometrial por meio da técnica da escova ginecológica é a mais utilizada entre os médicos veterinários, pois trata-se de um método prático para execução e rápido quanto à obtenção dos resultados sobre a presença ou não da endometrite, facilitando a conduta terapêutica quanto à utilização das éguas para reprodução ou descarte. Objetivou-se com esse estudo citaras formas de diagnóstico da endometrite em éguas, enfatizando a citologia endometrial e técnicas para obtenção de amostra, identificando a técnica mais indicada por diversos autores.(AU)

Endometritis is defined as an inflammation of the endometrium, which may be acute or chronic, infectious or noninfectious. This condition is of great economic importance in veterinary medicine, and may result in embryonic death, abortion and even render the mare infertile, being one of the conditions that most compromise uterine health, putting at risk the pregnancy rates obtained post-coverage, postinsemination, and post-embryo transfer. There are several methods for diagnosis and the most used in the field is endometrial/uterine cytology. There are also some forms of sample collection for laboratory analysis by cytology, such as: gynecological brush, uterine swab guided by metallic mandrel or disposable plastic and low volume uterine lavage, followed by sedimentation or centrifugation and may be complemented by cytocentrifugation. Diagnosis by endometrial cytology using the gynecological brush technique is the most used among Veterinary Practitioners, because it is a practical method to execute and fast to obtain the results in the presence of endometritis, facilitating the therapeutic conduct regarding the use of mares for breeding or discarding. The objective of this study was to cite the diagnostic methods of endometritis in mares, emphasizing endometrial cytology and its techniques for obtaining a sample, identifying the most indicated technique by several authors.(AU)

Métodos de coleta de amostra para exame de citologia endometrial em éguas com endometrite / Sample collection methods for endometrial cytology examination in mares with endometritis

A endometrite é definida como uma inflamação do endométrio, podendo ser aguda ou crônica, infecciosa ou não infecciosa. Essa afecção é de grande importância econômica na medicina veterinária, podendo resultar em morte embrionária, aborto e até tornar a égua infértil, sendo uma das afecções que mais comprometem a sanidade uterina, colocando em risco os índices de prenhez obtidos pós-cobertura, pós-inseminação, e pós-inovulação de embriões. Existem diversos métodos para diagnóstico e o mais utilizado a campo é a citologia endometrial/uterina. Também existem algumas formas de coleta de amostra para análise laboratorial pela citologia, tais como: escova ginecológica, swab uterino guiado por mandril metálico ou plástico descartável e lavado uterino de baixo volume, seguido de sedimentação ou centrifugação podendo ser complementada por citocentrifugação. O diagnóstico pela citologia endometrial por meio da técnica da escova ginecológica é a mais utilizada entre os médicos veterinários, pois trata-se de um método prático para execução e rápido quanto à obtenção dos resultados sobre a presença ou não da endometrite, facilitando a conduta terapêutica quanto à utilização das éguas para reprodução ou descarte. Objetivou-se com esse estudo citaras formas de diagnóstico da endometrite em éguas, enfatizando a citologia endometrial e técnicas para obtenção de amostra, identificando a técnica mais indicada por diversos autores.

Endometritis is defined as an inflammation of the endometrium, which may be acute or chronic, infectious or noninfectious. This condition is of great economic importance in veterinary medicine, and may result in embryonic death, abortion and even render the mare infertile, being one of the conditions that most compromise uterine health, putting at risk the pregnancy rates obtained post-coverage, postinsemination, and post-embryo transfer. There are several methods for diagnosis and the most used in the field is endometrial/uterine cytology. There are also some forms of sample collection for laboratory analysis by cytology, such as: gynecological brush, uterine swab guided by metallic mandrel or disposable plastic and low volume uterine lavage, followed by sedimentation or centrifugation and may be complemented by cytocentrifugation. Diagnosis by endometrial cytology using the gynecological brush technique is the most used among Veterinary Practitioners, because it is a practical method to execute and fast to obtain the results in the presence of endometritis, facilitating the therapeutic conduct regarding the use of mares for breeding or discarding. The objective of this study was to cite the diagnostic methods of endometritis in mares, emphasizing endometrial cytology and its techniques for obtaining a sample, identifying the most indicated technique by several authors.

Changes induced by pathogens and metabolic stress on endometrial function in cattle: possible impacts of increased inflammation on fertility / Mudanças induzidas por patógenos e estresse metabólico na função endometrial de bovinos: possíveis impactos do aumento da inflamação na fertilidade

Harmonized embryo maternal relationships, are necessary at the beginning of pregnancy to insure the development of the young embryo and of the placenta. Specific mechanisms modulate the immune balance towards immune-tolerance for the embryo to be accepted by the endometrium. By the same time this tissue is submitted to intense remodelling, under complex signalling, allowing implantation. Some pathogens and metabolic stress, especially excessive mobilisation of fat tissue, disturb this delicate balance. This review describes how these stressors can alter endometrial function through pro-inflammatory mechanisms and by inducing changes of specific signals possibly altering the establishment of contacts and functional interactions between the embryo and the endometrium around time of implantation.(AU)

Changes induced by pathogens and metabolic stress on endometrial function in cattle: possible impacts of increased inflammation on fertility / Mudanças induzidas por patógenos e estresse metabólico na função endometrial de bovinos: possíveis impactos do aumento da inflamação na fertilidade

Harmonized embryo maternal relationships, are necessary at the beginning of pregnancy to insure the development of the young embryo and of the placenta. Specific mechanisms modulate the immune balance towards immune-tolerance for the embryo to be accepted by the endometrium. By the same time this tissue is submitted to intense remodelling, under complex signalling, allowing implantation. Some pathogens and metabolic stress, especially excessive mobilisation of fat tissue, disturb this delicate balance. This review describes how these stressors can alter endometrial function through pro-inflammatory mechanisms and by inducing changes of specific signals possibly altering the establishment of contacts and functional interactions between the embryo and the endometrium around time of implantation.

Impact and mechanisms of inflammatory diseases on embryonic development and fertility in cattle

Inflammatory diseases are prevalent in cattle and impair fertility. Cows affected by inflammatory disease from parturition to the day before breeding have reduced fertilization of oocytes, reduced survival of zygotes to the morula stage, impaired development to early stages of conceptus elongation, reduced secretion of interferon during the period of pregnancy recognition, altered transcriptome of preimplantation conceptus cells, and increased pregnancy loss. Consequently, these cows have reduced pregnancy and calving per breeding. Reduced oocyte competence is alikely reason for the carryover effects of diseases on developmental biology, But impaired uterine environment is also involved. Effects on pregnancy survival are observed up to 5 months after the diagnosis and treatment of disease, and effects on developmental biology seem to be extended into postnatal life in pregnancies that survive until term. Although the biological mechanism mediating the effects of inflammatory diseases are still not completely understood, control of inflammation during the clinical presentation of diseases seems to alleviate the negative effects on reproductive biology. It is increasingly evident that animal health, not only at the time of breeding or pregnancy development but also in the period preceding breeding, is imperative for optimal reproduction in cattle and should always be considered in herd evaluations and managerial decisions.

Impact and mechanisms of inflammatory diseases on embryonic development and fertility in cattle

Inflammatory diseases are prevalent in cattle and impair fertility. Cows affected by inflammatory disease from parturition to the day before breeding have reduced fertilization of oocytes, reduced survival of zygotes to the morula stage, impaired development to early stages of conceptus elongation, reduced secretion of interferon during the period of pregnancy recognition, altered transcriptome of preimplantation conceptus cells, and increased pregnancy loss. Consequently, these cows have reduced pregnancy and calving per breeding. Reduced oocyte competence is alikely reason for the carryover effects of diseases on developmental biology, But impaired uterine environment is also involved. Effects on pregnancy survival are observed up to 5 months after the diagnosis and treatment of disease, and effects on developmental biology seem to be extended into postnatal life in pregnancies that survive until term. Although the biological mechanism mediating the effects of inflammatory diseases are still not completely understood, control of inflammation during the clinical presentation of diseases seems to alleviate the negative effects on reproductive biology. It is increasingly evident that animal health, not only at the time of breeding or pregnancy development but also in the period preceding breeding, is imperative for optimal reproduction in cattle and should always be considered in herd evaluations and managerial decisions.(AU)

FATORES QUE INTERFEREM NA PREVALÊNCIA DE ENDOMETRITE CITOLÓGICA E PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VIVO EM VACAS GIROLANDO

Existem vários entraves que podem prejudicar a lucratividade da produção leiteira, entre eles estão as doenças uterinas que acometem os animais durante o período pós parto. Elas podem ser ocasionadas pela entrada de microrganismos patogênicos, capazes de romper as barreiras físicas de defesa do útero e adentrar o tecido endometrial liberando toxinas e ativando os mecanismos da imunidade inata, que leva a uma resposta inflamatória. Entre essas doenças que estão relacionadas a presença de microrganismos estão a metrite que pode ocorrer nos primeiros 10 dias após o parto, o animal pode apresentar uma descarga vermelho acastanhada com odor muito fétido, geralmente pode desenvolver sintomas clínicos sistêmicos como febre, infecção generalizada e se não receber o tratamento adequando pode vir a óbito e a endometrite clínica que é uma inflamação do endométrio que pode ocorrer após 21 dias pós parto, caracterizada por descarga muco purulenta ou purulenta. Ambas as doenças são capazes de comprometer a fertilidade, e eficiência reprodutiva dos rebanhos. A endometrite citológica apesar de não possuir sinais clínicos e o animal apresentar descarga vaginal com muco limpo, está relacionada com o desequilíbrio da resposta imune e permanência de células polimorfonucleares no tecido endometrial após 21 dias pós parto. O limiar para considerar os animais positivos pode variar de 4 a 18%. Essas células ao exercerem sua função de defesa, modificam o PH uterino quando liberam espécies reativas de oxigênio que comprometem as taxas de fecundação, qualidade de oocitos e embriões, impactando diretamente nos índices de taxa de prenhez. O diagnóstico da metrite e endometrite clínica pode ser feito por meio da avaliação da descarga vaginal com o dispositivo metricheck®.

There are several obstacles that can harm the profitability of dairy production, among them are the uterine diseases that affect animals during the postpartum period. They can be caused by the entry of pathogenic microorganisms, capable of breaking the physical barriers of defense of the uterus and entering the endometrial tissue releasing toxins and activating the mechanisms of innate immunity, which leads to an inflammatory response. Among these diseases that are related to the presence of microorganisms are metritis that can occur in the first 10 days after birth, the animal may present a brownish red discharge with a very foul odor, generally it can develop systemic clinical symptoms such as fever, generalized infection and if not receiving adequate treatment may result in death and clinical endometritis, which is an inflammation of the endometrium that can occur after 21 days postpartum, characterized by purulent or purulent mucus discharge. Both diseases are capable of compromising fertility, and reproductive efficiency of herds. Cytological endometritis, despite having no clinical signs and the animal has vaginal discharge with clean mucus, is related to the imbalance of the immune response and the permanence of polymorphonuclear cells in the endometrial tissue after 21 days postpartum. The threshold for considering animals positive can vary from 4 to 18%. These cells, when exercising their defense function, modify the uterine PH when they release reactive oxygen species that compromise fertilization rates, quality of oocytes and embryos, directly impacting the pregnancy rate indexes. The diagnosis of metritis and clinical endometritis can be made by assessing vaginal discharge with the Metricheck® device. For the diagnosis of cytological endometritis, techniques with gynecological brush, low volume washing, or endometrial biopsy can be used

DOENÇAS INFLAMATÓRIAS EM VACAS LEITEIRAS: FATORES DE RISCO E ASSOCIAÇÕES COM MANUTENÇÃO DA GESTAÇÃO APÓS TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO

Os objetivos do presente estudo de coorte prospectivo foram identificar fatores de risco para doenças inflamatórias em vacas leiteiras mestiças girolando e caracterizar as associações dessas doenças com a prenhez por transferência de embrião (TE). As doenças foram diagnosticadas nos primeiros 60 dias pós-parto em 252 vacas primíparas e 481 multíparas. As doenças uterinas (DUT) incluíram retenção de placenta, metrite, endometrite clínica e endometrite subclínica. As doenças não uterinas (DNUT) incluíram mastite, claudicação, pneumonia e abomaso deslocado. O sangue foi coletado no dia 0, 1 e 2 pós-parto e analisado quanto às concentrações de haptoglobina, ácidos graxos, Ca total (tCa), P e Mg, e novamente no dia 8 pós-parto e analisado quanto à concentração de -hidroxibutirato. A associação entre as concentrações de metabólitos no soro e doenças inflamatórias foi determinada. As vacas receberam um programa de TE cronometrado começando 28 ± 3 d pós-parto com a primeira TE aos 46 ± 3 d pós-parto usando embriões frescos produzidos in vitro. A prenhez foi diagnosticada nos dias 31 e 59 da gestação presumida. No geral, 63,3% das vacas foram diagnosticadas com DUT e 20,6% com DNUT. Os fatores de risco para DUT incluíram estação do parto, grupo de parto, problemas de parto, dias com hipocalcemia subclínica e concentrações séricas de haptoglobina e Mg, enquanto os fatores de risco para DNUT foram grupo paridade e concentração sérica de Mg. Vacas que desenvolveram DUT tiveram concentrações aumentadas de haptoglobina no d 2 e ácidos graxos no d 1 e 2, e concentrações reduzidas de tCa nos d 1 e 2 e de P e Mg no d 2 pós-parto em comparação com vacas sem DUT. Vacas que desenvolveram DNUT tiveram concentrações aumentadas de ácidos graxos no d 0 a 2 pós-parto e concentrações diminuídas de tCa e P em d 0 e 1, e de Mg nos dias 1 e 2 pós-parto em comparação com vacas sem DNUT. As vacas que desenvolveram DNUT tiveram uma redução de 340 kg na produção de leite nos primeiros 60 dias pós-parto. As doenças inflamatórias foram associadas a um menor escore de condição corporal e aumento da perda de condição corporal nos primeiros 70 dias pós-parto. A manutenção da prenhez após a TE foi reduzida em vacas DUT após o primeiro (41,7 vs. 25,4%) ou todos os TE (46,4 vs. 36,2%), enquanto a manutenção da prenhez foi reduzida em vacas DNUT apenas na segundo TE (39,0 vs. 25,9%). A redução da manutenção da prenhez em vacas DUT combinada com uma taxa de serviço reduzida de 21 dias (61,9 contra 54,8%) diminuiu a taxa de prenhez do ciclo de 21 dias (28,6 contra 19,9%) e o risco de prenhez para 300 dias pós-parto em 35%, resultando em uma abertura extra de 32 d. Em conclusão, as doenças inflamatórias deprimiram a fertilidade em vacas leiteiras recebendo TE, com o maior impacto observado em vacas DUT. Isso sugere que a inflamação local do útero prejudica a manutenção da prenhez em vacas leiteiras após a TE.

The objectives of the present prospective cohort study were to identify risk factors for inflammatory diseases in Holstein-Gyr crossbred dairy cows and characterize the associations of those diseases with pregnancy per embryo transfer (ET). Diseases were diagnosed in the first 60 d postpartum in 252 primiparous and 481 multiparous cows. Uterine diseases (UTD) included retained placenta, metritis, clinical endometritis, and subclinical endometritis. Nonuterine diseases (NUTD) included mastitis, lameness, pneumonia, and displaced abomasum. Blood was sampled on d 0, 1, and 2 postpartum and analyzed for concentrations of haptoglobin, fatty acids, total Ca (tCa), P, and Mg, and again on d 8 postpartum and analyzed for concentration of -hydroxybutyrate. The association between concentrations of metabolites in serum and inflammatory diseases was determined. Cows received a timed ET program starting 28 ± 3 d postpartum with first ET at 46 ± 3 d postpartum using fresh in vitro-produced embryos. Pregnancy was diagnosed on d 31 and 59 of presumptive gestation. Overall, 63.3% of the cows were diagnosed with UTD and 20.6% with NUTD. The risk factors for UTD included season of calving, parity group, calving problems, days with subclinical hypocalcemia, and serum concentrations of haptoglobin and Mg, whereas the risk factors for NUTD were parity group and serum Mg concentration. Cows that developed UTD had increased concentrations of haptoglobin on d 2 and fatty acids on d 1 and 2, and reduced concentrations of tCa on d 1 and 2 and of P and Mg on d 2 postpartum compared with cows without UTD. Cows that developed NUTD had increased concentrations of fatty acids on d 0 to 2 postpartum, and decreased concentrations of tCa and P on d 0 and 1, and of Mg on d 1 and 2 postpartum compared with cows without NUTD. Cows that developed NUTD had a 340-kg reduction in milk yield in the first 60 d postpartum. Inflammatory diseases were associated with lesser body condition score and increased loss of body condition in the first 70 d postpartum. Maintenance of pregnancy after ET was reduced in UTD cows following the first (41.7 vs. 25.4%) or all ET (46.4 vs. 36.2%), whereas maintenance of pregnancy was reduced in NUTD cows only at the second ET (39.0 vs 25.9%). The reduced pregnancy maintenance in UTD cows combined with a reduced 21-d service rate (61.9 vs. 54.8%) decreased the 21-d cycle pregnancy rate (28.6 vs. 19.9%) and the hazard of pregnancy to 300 d postpartum by 35%, resulting in an extra 32 d open. In conclusion, inflammatory diseases depressed fertility 35 in dairy cows receiving ET, with the greatest impact observed in UTD cows. This suggests that local inflammation of the uterus impairs maintenance of pregnancy in dairy cows following ET

Modulação da resposta inflamatória no útero de éguas tratadas com plasma rico em plaquetas

A endometrite é a causa mais comum de subfertilidade em éguas. Todas as éguas apresentam uma inflamação endometrial fisiológica pós-cobertura; entretanto, 15-20% das éguas têm endometrite persistente pós-cobertura (EPPC). Recentemente, o plasma rico em plaquetas (PRP) vêm se tornando popular no manejo reprodutivo de éguas susceptíveis a EPPC. Atualmente, não existe uma padronização dos métodos de preparação do PRP para uso intrauterino em éguas. Desta forma, este estudo teve como objetivo comparar três métodos de preparação de PRP para infusão intrauterina em éguas e avaliar a resposta inflamatória pós-cobertura, cultura endometrial e recuperação embrionária em éguas suscetíveis a EPPC tratadas com PRP. No primeiro estudo, o PRP foi produzido por três métodos. Método 1, o sangue foi coletado em bolsa de transfusão, transferido para tubos Falcon e duplamente centrifugadas; Método 2, sangue foi coletado em tubos vacutainer e centrifugado uma única vez; Método 3 sangue foi coletado em uma seringa de 60 mL contendo anticoagulante, a qual foi mantida em posição vertical para sedimentar por 4h. Após o processamento, a contagem de células e a viabilidade plaquetária foram avaliadas. Em um subgrupo de éguas (n = 6), o PRP foi avaliado 6 e 24h pós-refrigeração a 5 °C. No estudo 2, éguas (n = 12) suscetíveis a EPPC tiveram três ciclos atribuídos aleatoriamente para receber infusões intrauterinas de LRS (controle), ou PRP autólogo ou plasma pobre em plaquetas (PPP) antes (48 e 24h) e após a inseminação artificial (IA) (6 e 24h). Tanto o PRP quanto o PPP foram obtidos pelo Método 1 no experimento 2. As éguas foram inseminadas com sêmen fresco de um garanhão com fertilidade conhecida. O acúmulo de líquido intrauterino (IUF) e as células polimorfonucleares endometriais (PMNs) foram avaliados a cada 24h até 96h pós-inseminação. Citocinas uterinas (Il, IL6, CXCL8 e IL10) foram avaliadas antes (0h), 6 e 24h após IA, e cultura endometrial três e nove dias após IA. A lavagem do embrião foi realizada 8 dias após a ovulação. Os dados foram analisados com modelo misto, teste post-hoc de Tukeys e regressão multivariada. No estudo 1, o Método 1 resultou no maior e o método 3 nas menores concentrações de plaquetas, e o último teve maior concentração de leucócitos que os outros (P<0,05). A viabilidade das plaquetas foi semelhante entre os tratamentos. O resfriamento por 24h não afetou a contagem de plaquetas. No entanto, a viabilidade plaquetária foi reduzida após o resfriamento do PRP produzido pelo método 3. Estudo 2, o tratamento com PRP reduziu os PMNs endometriais, IUF pós-reprodução e citocinas pró-inflamatórias quando comparados aos ciclos atribuídos pelo controle, mas não significativamente diferente do PPP. Os controles tiveram uma porcentagem significativamente maior de culturas bacterianas positivas (33%) em comparação com os ciclos atribuídos a PRP (0%), enquanto os ciclos tratados com PPP não foram significativamente diferentes dos outros grupos (25%). Os ciclos atribuídos ao PRP tiveram taxas de recuperação embrionária significativamente maiores (83%) do que o controle (33%), embora não significativamente diferente do PPP (60%). Em conclusão, o Método 1 resultou nas maiores concentrações de plaquetas, enquanto o método 3 resultou em maiores contagens de leucócitos. O resfriamento afetou a viabilidade das plaquetas no PRP obtido com o método 3. Resta determinar se os diferentes métodos e o resfriamento afetariam a eficácia clínica do PRP. A infusão de plasma reduziu a duração e intensidade da resposta inflamatória pós-IA e melhorou a recuperação embrionária em éguas suscetíveis a EPPC. As plaquetas parecem ter uma propriedade antimicrobiana e anti-inflamatória dependente da dose

Endometritis is the most common cause of subfertility in mares. All mares display a physiological post-breeding endometrial inflammation; however, 15-20% of mares have persistent breeding-induced endometritis (PBIE). Recently, platelet-rich plasma (PRP) is becoming popular in mare practice to mitigate post-breeding induced endometritis and improve fertility. Currently, there is no standardization of methods to prepare PRP for intrauterine use in mares. This study aimed to compare three methods to prepare PRP for intrauterine infusion in mares and to assess the post-breeding inflammatory response, endometrial culture and embryo recovery in mares susceptible to PBIE treated with PRP. In the first study, PRP was produce by three methods. Method 1, blood was collected in blood transfusion bag, transferred to Falcon tubes and double centrifuged; Method 2, blood was collected in vacutainer tubes and centrifuged once; Method 3, blood was collected in a syringe containing anticoagulant, which was kept in an upright-position to sediment for 4h. After processing, cell counts and platelet viability were assessed. In a subset of mares (n=6), PRP was evaluated at 6 and 24h post-cooling at 5°C. In study 2, mares (n=12) susceptible to PBIE had three cycles randomly assigned in a crossover design to receive intrauterine infusions of LRS (control), or autologous PRP or platelet-poor plasma (PPP) pre- (48 and 24h) and post-breeding (6 and 24h). Both PRP and PPP were obtained by Method 1. Mares were bred with fresh semen from one stallion. Intrauterine fluid accumulation (IUF) and endometrial polymorphonuclear cells (PMNs) were assessed every 24h up to 96h post-breeding. Uterine cytokines (Il, IL6, CXCL8 and IL10) were evaluated before (0h), 6 and 24h post-breeding, and endometrial culture three and nine-days after breed. Embryo flushing was performed 8d post-ovulation. Data were analyzed with mixed model, Tukeys post-hoc test, and multivariate regression. In study 1, Method 1 resulted in the greatest and method 3 in the fewest platelet concentrations, and the latter had greater WBC than the others (P<0.05). Platelet viability was similar across treatments. Cooling for 24h did not affect platelet counts. However, platelet viability was reduced after cooling PRP produced by method 3. Study 2, PRP treatment reduced endometrial PMNs, post-breeding IUF and pro-inflammatory cytokines when compared to control-assigned cycles, but not significantly different than PPP. Controls had a significantly higher percentage of positive bacterial cultures (33%) in comparison to PRP-assigned cycles (0%), whereas cycles treated with PPP were not significantly different from the other groups (25%). The PRP-assigned cycles had significantly higher embryo recovery rates (83%) than the control (33%), though not significantly different than PPP (60%). In conclusion, Method 1 resulted in the greatest platelet concentrations, while method 3 resulted had greater WBC counts. Cooling affected platelet viability in PRP obtained with method 3. It remains to be determined whether the different methods and cooling would affect PRP's clinical efficacy. Plasma infusion reduced the duration and intensity of the post-breeding inflammatory response and improved embryo recovery in mares susceptible to PBIE. Platelets incrementally downregulate PBIE and appear to have a dose-dependent antimicrobial property.

EFEITO DA RETENÇÃO DE PLACENTA E MASTITE CLÍNICA PÓS-PARTO NA EFICIÊNCIA REPRODUTIVA E EXPRESSÃO GÊNICA DE CITOCINAS E RECEPTORES ESTEROIDOGÊNICOS NO ENDOMÉTRIO DE VACAS LEITEIRAS MESTIÇAS

As doenças uterinas e não-uterinas no pós-parto impactam na eficiência reprodutiva 10 de vacas leiteiras. No entanto, além de pouco conhecimento em relação a vacas 11 mestiças, ainda não está claro como estas enfermidades interferem negativamente 12 na fertilidade. A hipótese deste estudo foi que vacas mestiças com retenção de 13 placenta (RP) e mastite clínica no pós-parto apresentam piores índices reprodutivos 14 por estas patologias interferirem na imunidade inata endometrial e expressão de 15 receptores dos hormônios esteroidogênicos ao final do puerpério. Portanto, os 16 objetivos com este estudo foram: a) avaliar o efeito da RP e mastite clínica pós17 parto na eficiência reprodutiva, período de serviço e intervalo parto-primeira 18 inseminação artificial (IA) de vacas mestiças leiteiras (experimento 1); b) avaliar o 19 efeito destas doenças na imunidade inata endometrial e receptores dos hormônios 20 esteroidogênicos (experimento 2). Para o exp. 1, 232 vacas foram avaliadas e 21 divididas nos grupos saudável, RP e mastite clínica. As vacas foram inseminadas à 22 medida que se observava estro ou submetidas ao protocolo de IATF. As avaliações 23 de ocorrência das doenças se davam após o parto até o final do período voluntário 24 de espera e o diagnóstico de gestação em torno de 32 dias após IA. Para o exp. 2, 25 foram utilizadas 30 vacas, divididas em três grupos (n=10) iguais ao experimento 1. 26 Entre 40-50 dias pós-parto era realizado exame clínico, exame ginecológico e 27 coleta de amostra endometrial por cytobrush para citologia endometrial e expressão 28 gênica pela técnica de qRT-PCR de IL1, IL6, CCL5, ESR1 e PGR. No exp. 1, a 29 taxa de concepção na primeira IA e porcentagem de vacas gestantes aos 150 dias 30 foram menores em animais doentes (RP, mastite) e os dias do intervalo parto31 primeira IA e período de serviço foram maiores nos animais doentes. No exp. 2, 32 26,7% (8/30) dos animais apresentaram endometrite subclínica. A IL1 apresentou 33 maior expressão nos grupos doentes, IL6 apresentou menor expressão no grupo RP 36 34 e a CCL5 não teve diferença entre os grupos. Não foi observado diferença na 35 expressão gênica dos receptores de esteroides ESR1 e PGR entre vacas doentes e 36 saudáveis. Concluiu-se que vacas com retenção de placenta e mastite clínica no 37 pós-parto apresentam piores índices reprodutivos, alteração na expressão gênica 38 endometrial das citocinas IL1 e IL6, porém não apresentam alteração na expressão 39 de receptores dos hormônios esteroidogênicos ao final do puerpério.

The postpartum uterine and non-uterine diseases impact the reproductive efficiency 44 of dairy cows. However, in addition to little knowledge regarding crossbred cows, 45 it is not yet clear how these diseases negatively affect fertility. The hypothesis of 46 this study was that crossbred cows with placenta retention (RP) and clinical mastitis 47 in the postpartum period have worse reproductive rates because these pathologies 48 interfere with endometrial innate immunity and expression of steroidogenic 49 hormone receptors at the end of the puerperium. Therefore, the objectives with this 50 study were: a) to evaluate the effect of PR and postpartum clinical mastitis on 51 reproductive efficiency, service period and interval between birth and first artificial 52 insemination (AI) of crossbred dairy cows (experiment 1); b) to evaluate the effect 53 of these diseases on innate endometrial immunity and steroidogenic hormone 54 receptors (experiment 2). For exp. 1, 232 cows were evaluated and divided into the 55 healthy, PR and clinical mastitis groups. Cows were inseminated as estrus was 56 observed or submitted to the IATF protocol. The assessments of the occurrence of 57 diseases took place after delivery until the end of the voluntary waiting period and 58 the diagnosis of pregnancy around 32 days after AI. For exp. 2, 30 cows were used, 59 divided into three groups (n = 10) equal to experiment 1. Between 40-50 days 60 postpartum clinical examination, gynecological examination and endometrial 61 sample collection by cytobrush for endometrial cytology and gene expression by 62 IL1, IL6, CCL5, ESR1 and PGR qRT-PCR technique. In exp. 1, the conception 63 rate in the first AI and the percentage of pregnant cows at 150 days were lower in 64 sick animals (PR, mastitis) and the days of the birth-first AI interval and service 65 period were higher in sick animals. In exp. 2, 26.7% (8/30) of the animals had 66 subclinical endometritis. IL1 showed higher expression in sick groups, IL6 67 showed less expression in RP group and CCL5 had no difference between groups. 68 There was no difference in the gene expression of ESR1 and PGR steroid receptors 69 between sick and healthy cows. It was concluded that cows with placenta retention 70 and clinical mastitis in the postpartum period present worse reproductive indexes, 71 alteration in the endometrial gene expression of the cytokines IL1 and IL6, 72 however, they do not present changes in the expression of steroidogenic hormone 73 receptors at the end of the puerperium.

Aspectos de manejo e condições genitais que podem constituir ameaça à longevidade reprodutiva de garanhões / Management aspects and genital conditions that may threaten the reproductive longevity of stallions

A longevidade reprodutiva de garanhões de potencial genético elevado constitui um objetivo desejado. Adequar o manejo de garanhões pode não ser uma tarefa fácil, considerando que vários aspectos simples, porém importantes, muitas vezes não são praticados. Essa realidade parece ter se agravado após a disponibilidade de novas biotecnologias da reprodução. Confinamento em cocheiras oferece condições contrárias às funções fisiológicas influentes na longevidade reprodutiva. Muitos garanhões confinados desenvolvem distúrbios de comportamento e metabólico. A ingestão de alimento na presença de ansiedade e compulsão contribui para aumento de peso corporal e predisposição a ocorrência de cólicas. Garanhões obesos estão em risco de inflamação além dos limites fisiológicos, acarretando possibilidade de lesões e sequelas. Além desses fatores relacionados ao manejo, essa apresentação se refere a afecções que ameaçam a longevidade reprodutiva do garanhão, entre elas priapismo, traumatismos, feridas, parafimose, tumores e torsão do cordão espermático.(AU)

Reproductive longevity of stallions with high genetic potential is a desired goal. Adapting the management of stallions may not be an easy task, considering that several simple but important aspects are often not practiced, what seems to have worsened after the availability of new biotechnology of reproduction. Live at stables offers conditions contrary to physiological functions in reproductive longevity and many stallions confined develops behavioral and metabolic disorders. Eating with anxiety of compulsion contributes to increased body weight and possibility of colic. Obesity in stallions carries risk of the inflammation through the physiological limits with possibility of lesions and sequels. In addition to these factors related to management, this presentation refers to conditions that threaten the reproductive longevity of Stallion, including priapism, trauma, wounds, paraphimosis, tumors and torsion of the spermatic cord.(AU)

Aspectos de manejo e condições genitais que podem constituir ameaça à longevidade reprodutiva de garanhões / Management aspects and genital conditions that may threaten the reproductive longevity of stallions

A longevidade reprodutiva de garanhões de potencial genético elevado constitui um objetivo desejado. Adequar o manejo de garanhões pode não ser uma tarefa fácil, considerando que vários aspectos simples, porém importantes, muitas vezes não são praticados. Essa realidade parece ter se agravado após a disponibilidade de novas biotecnologias da reprodução. Confinamento em cocheiras oferece condições contrárias às funções fisiológicas influentes na longevidade reprodutiva. Muitos garanhões confinados desenvolvem distúrbios de comportamento e metabólico. A ingestão de alimento na presença de ansiedade e compulsão contribui para aumento de peso corporal e predisposição a ocorrência de cólicas. Garanhões obesos estão em risco de inflamação além dos limites fisiológicos, acarretando possibilidade de lesões e sequelas. Além desses fatores relacionados ao manejo, essa apresentação se refere a afecções que ameaçam a longevidade reprodutiva do garanhão, entre elas priapismo, traumatismos, feridas, parafimose, tumores e torsão do cordão espermático.

Reproductive longevity of stallions with high genetic potential is a desired goal. Adapting the management of stallions may not be an easy task, considering that several simple but important aspects are often not practiced, what seems to have worsened after the availability of new biotechnology of reproduction. Live at stables offers conditions contrary to physiological functions in reproductive longevity and many stallions confined develops behavioral and metabolic disorders. Eating with anxiety of compulsion contributes to increased body weight and possibility of colic. Obesity in stallions carries risk of the inflammation through the physiological limits with possibility of lesions and sequels. In addition to these factors related to management, this presentation refers to conditions that threaten the reproductive longevity of Stallion, including priapism, trauma, wounds, paraphimosis, tumors and torsion of the spermatic cord.

Efeito do Lipopolissacarídeo (LPS) sobre o metabolismo, a reserva ovariana, modulação da expressão de genes do útero, ovário e oviduto em novilhas

A fim de avaliar os efeitos de exposições agudas ao LPS, sobre o metabolismo, útero, oviduto e ovário de bovinos, foram acompanhadas 16 novilhas de corte, europeias, distribuídas uniformemente em dois grupos, a partir do peso corporal: O grupo LPS (n=8) recebeu 2 aplicações contendo 0,5 g/kg de peso corporal de LPS diluídas em 2 mL de solução salina via intravenosa, com intervalo de 24 horas e o grupo controle (n=8) que recebeu 2 aplicações contendo 2 mL de solução salina via intravenosa, com o mesmo intervalo. Os resultados encontrados são apresentados através de 3 artigos. No artigo 1, o objetivo do estudo foi avaliar os parâmetros hematológicos, bem como alguns marcadores energéticos e inflamatórios e níveis de minerais e enzimas hepáticas. No artigo 2, o objetivo do estudo foi identificar os possíveis mecanismos moleculares no oviduto e útero pelos quais as endotoxinas podem influenciar a fertilidade em bovinos. No artigo 3 o objetivo foi verificar o efeito de duas aplicações de LPS sobre a reserva, ativação e apoptose de folículos primordiais. Como resultados, no artigo 1 os animais desafiados apresentaram aumento de temperatura acima dos valores fisiológicos (38,5-39,5°C) da 1 às 4,5 horas com pico na hora 1, no primeiro desafio. Em relação ao segundo desafio, foi observado uma elevação aguda na temperatura 2 horas após o segundo desafio com retorno as 3 horas. Ocorreu uma leucopenia por neutropenia no grupo LPS, sem alteração da série vermelha e das plaquetas. Em relação aos parâmetros bioquímicos ocorreu uma redução nos níveis de colesterol 8 horas após o primeiro desafio no grupo LPS. Os níveis de parâmetros energéticos, inflamatórios, de minerais de enzimas hepáticas não sofreram efeito do desafio. No artigo 2, ocorreu uma redução significativa na expressão dos genes PTGS2 e NANOG no útero, enquanto que os demais genes avaliados não apresentaram alteração. No estudo 3, não houve diferença na população folicular total, bem como nas diferentes categorias foliculares avaliadas. Além disso, o desafio com LPS não modulou a expressão de genes relacionados a reserva ovariana, sobrevivência oocitária, taxa de ativação e atresia folicular. Com isso concluímos que a exposição de animais ao LPS com intervalo de 24 horas, desencadeou uma resposta sistêmica com alteração na temperatura corporal, no leucograma e com um efeito a curto prazo no metabolismo lipídico. Além disso, promoveu a alteração na expressão de genes relacionados a produção de prostaglandinas e a renovação endometrial, sem alterar a população folicular total, taxa de atresia e ativação e a expressão de genes relacionados a reserva ovariana, a sobrevivência oocitária, e a ativação e atresia de folículos primordiais e antiapoptóticos.

In order to evaluate the effects of acute exposure to LPS, on the metabolism, uterus, oviduct and ovary of cattle, sixteen European heifers were uniformly distributed in two groups, based on body weight: The LPS group (n = 8) received 2 applications containing 0.5 g / kg of body weight of LPS diluted in 2 mL of saline intravenously, with an interval of 24 hours and the control group (n = 8) that received 2 applications containing 2 mL of solution saline via intravenously, with the same interval. The results found are presented through 3 articles. In article 1, the aim of the study was to assess hematological parameters, as well as some energy and inflammatory markers and levels of minerals and liver enzymes. In article 2, the objective of the study was to identify the possible molecular mechanisms in the oviduct and uterus by which endotoxemias can influence fertility in cattle. In article 3, the objective was to verify the effect of two applications of LPS on the reserve, activation and apoptosis of primordial follicles. The results of article 1 indicated that the challenged animals showed an increase in temperature above the physiological values (38.5-39.5 °C) from 1 to 4.5 hours with a peak at hour 1, in the first challenge. In relation to the second challenge, a sharp rise in temperature was observed 2 hours after the second challenge with a return at 3 hours. Leukopenia due to neutropenia occurred in the LPS group, with no change in the red series and platelets. Regarding the biochemical parameters, there was a reduction in cholesterol levels 8 hours after the first challenge in the LPS group. Levels of energy, inflammatory parameters, liver enzyme minerals were not affected by the challenge. In article 2, there was a significant reduction in the expression of the PTGS2 and NANOG genes in the uterus, while the other evaluated genes showed no change. In study 3, there was no difference in the total follicular population, as well as in the different follicular categories evaluated. Furthermore, the challenge with LPS did not modulate the expression of genes related to ovarian reserve, oocyte survival, activation rate and follicle atresia. Thus, we conclude that the exposure of animals to LPS with an interval of 24 hours, triggers a systemic response with changes in body temperature, leukogram and with a short-term effect on lipid metabolism. In addition, it promoted the alteration in the expression of genes related to the production of prostaglandins and endometrial renewal, without altering the total follicular population, rate of atresia and activation and the expression of genes related to ovarian reserve, oocyte survival, and primordial follicle activation and atresia and anti-apoptotics.

EFEITO DA ADIÇÃO DE MEIO CONDICIONADO POR CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS NA VIABILIDADE ESPEMÁTICA E RESPOSTA INFLAMATÓRIA UTERINA PÓS INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM EQUINOS

A endometrite persistente pós cobertura (EPPC) é uma das principais causas de infertilidade na égua devido uma inflamação exacerbada uterina pós cobertura/Inseminação Artificial (IA) diminuindo os índices de fertilidade. O uso do meio condicionado por células tronco mesenquimais demonstra grande efetividade na modulação inflamatória, podendo ser uma alternativa no tratamento e EPPC. O objetivo desse trabalho foi avaliar pela primeira vez diferentes concentrações de meio condicionado (MC) por células tronco mesenquimais equinas sobre a cinética espermática equina e capacidade imunomodulatória do MC na inflamação uterina pós IA em éguas resistentes e susceptíveis assim como sua fertilidade. Foram realizados 2 experimentos. No experimento 1 foi avaliado o efeito da adição de diferentes concentrações de MC sobre a cinética e integridade espermática equina. No Experimento 2 foi avaliado in vivo a capacidade moduladora do MC sobre o processo inflamatório endometrial de éguas resistentes e susceptíveis após inseminação artificial. O MC alterou o VCL (P<0,05) porém não alterou o restante dos parâmetros da cinética espermática (P>0,05). A integridade de membrana plasmática do sêmen equino não foi alterada (P<0,05). O MC reduziu a porcentagem de células polimorfonucleares (PMN) em éguas resistentes 6 horas após a inseminação artificial (P<0,05). Nas éguas susceptíveis o MC diminuiu as porcentagens de PMN e fluido intrauterino 6 e 24 horas após IA (p<0,05), com incremento na fertilidade; Controle 42,86%, IA-MC 57,14%, PRÉ-MC 85,71% (P>0,05). Conclui-se que o MC equino pode ser utilizado com segurança tanto antes como no momento da inseminação artificial juntamente com o sêmen. Além disso o MC possui efeito positivo na modulação da resposta inflamatória uterina pós IA, sendo o primeiro relato do seu uso para tratamento de EPPC.

Persistent mating-induce endometritis (PMIE) is a major cause of subfertility in the mare due to exacerbated uterine inflammation post breeding, so therapies have been studied to immunomodulate the inflammatory response. The objective of this work was to evaluate different concentrations of conditioned medium (MC) by equine mesenchymal stem cells on equine sperm kinetics and MC immunomodulatory capacity in uterine inflammation after breeding in resistant and susceptible mares as well as their fertility. Two experiments were performed. In experiment 1 the effect of the addition of different MC concentrations on the equine sperm kinetics and integrity was evaluated. In Experiment 2, the modulatory capacity of MC on the endometrial inflammatory process of resistant and susceptible mares after artificial insemination was evaluated, as well as its effect on conception rates. The MC did not significantly alter sperm kinetics and plasma membrane integrity of equine semen. Even in resistant mares MC reduced the percentage of neutrophils 6 hours after artificial insemination (p <0.05), not negatively interfering with fertility. In susceptible mares, MC decreased the percentages of neutrophils and intrauterine fluid 6 and 24 hours after AI (p <0.05). It was concluded that equine MC does not negatively affect the quality of equine semen or its fertility, modulating the inflammatory response after coverage in resistant and susceptible mares.

Marcadores inflamatórios, maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial em bovinos

A resposta inflamatória surge como mecanismo do sistema imune para combater agentes infecciosos. Estudos sugerem uma associação entre a inflamação e a fertilidade, principalmente devido à modulação e síntese de mediadores inflamatórios. A lipoproteína de alta densidade (HDL) é a principal lipoproteína no fluido folicular, tem propriedades anti-inflamatória e antioxidante, que derivam principalmente de sua composição lipídica, porção de apolipoproteína AI (ApoAI) e paraoxonase-1 (PON1). Por outro lado, os lipopolissacarídeos (LPS) são endotoxinas bacterianas que agem como potente estimulador da resposta inflamatória. Neste sentido, objetivou-se avaliar o efeito do HDL durante a maturação in vitro (MIV) sobre a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário, e avaliar o efeito da exposição de oócitos bovinos ao LPS in vitro e in vivo, sobre a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial em bovinos. No primeiro estudo, complexos cumulus oócito (COCs) foram suplementados com proteína HDL durante a MIV, após, foram fecundados (FIV) e cultivados in vitro (CIV). No segundo estudo, COCs foram desafiados com LPS durante a MIV e após, passaram pela FIV e CIV. Separadamente, COCs foram submetidos à MIV sem LPS, depois disso passaram pela FIV e, durante os 7 dias de CIV foram desafiados com LPS. Ainda no segundo estudo, novilhas foram desafiadas com LPS intravenoso durante a sincronização da onda folicular. Os animais foram abatidos, os ovários foram coletados e foi realizada a recuperação dos COCs. Os COCs selecionados passaram por MIV, FIV e CIV. Dessa forma, encontramos que, a adição do complexo HDL/ApoAI do plasma humano durante a MIV, na ausência de atividade da PON1, diminui o desenvolvimento embrionário inicial. Ainda, a exposição de oócitos bovinos ao LPS durante a MIV diminui a taxa de maturação nuclear, entretanto, não foi capaz de afetar o desenvolvimento embrionário inicial. Da mesma maneira, a exposição de zigotos ao LPS durante o CIV não afetou o desenvolvimento embrionário. No entanto, a infusão de LPS em novilhas diminuiu a taxa de clivagem, porém o desenvolvimento embrionário foi semelhante ao do grupo não desafiado com LPS. Conclui-se que a interação dos componentes do complexo HDL-ApoAI-PON1, pode afetar a fertilidade bovina, em nível de oócito e subsequente desenvolvimento embrionário. Da mesma, forma o LPS, pode afetar o oócito e desenvolvimento embrionário, entretanto, os mecanismos pelos quais isso acontecem parecem ser diferentes in vitro e in vivo.

The inflammatory response arises as a mechanism of the immune system to fight infectious agents. Studies suggest an association between inflammation and fertility, mainly due to the modulation and synthesis of inflammatory mediators. High-density lipoprotein (HDL) is the main lipoprotein in follicular fluid. It has anti-inflammatory and antioxidant properties, mainly derived from its lipid composition, apolipoprotein AI (ApoAI) and paraoxonase-1 (PON1). On the other hand, lipopolysaccharides (LPS) are bacterial endotoxins that act as potent stimulator of the inflammatory response. The objective of this study was to evaluate the effect of HDL during in vitro maturation (IVM) on oocyte maturation and early embryonic development and to evaluate the effect of bovine oocyte exposure to LPS in vitro and in vivo on oocyte maturation and embryonic development in cattle. In the first study, cumulus oocyte complex (COCs) were supplemented with HDL protein during IVM, after, were fertilized (IVF) and cultured in vitro (IVC). In the second study, COCs were challenged with LPS during IVM and after, underwent IVF and IVC. Separately, COCs were subjected to IVM without LPS, thereafter they underwent IVF and during the 7 days of IVC they were challenged with LPS. Still in the second study, heifers were challenged with intravenous LPS during follicular wave synchronization. The animals were slaughtered, the ovaries were collected and COC recovery was performed. All recovered COCs underwent IVM, IVF, and IVC. In this way, we found that the addition of the HDL/ApoAI complex of human plasma during IVM, in the absence of PON1 activity, decreases the initial embryonic development. Furthermore, the exposure of bovine oocytes to LPS during IVM decreases the nuclear maturation rate, however, it was not able to affect the initial embryonic development. Similarly, exposure of zygotes to LPS during IVC did not affect embryonic development. However, infusion of LPS into heifers decreased the rate of cleavage, but the embryonic development was similar to that of the non-LPS challenged group. It is concluded that the interaction of HDL-ApoAI-PON1 complex components may affect bovine fertility at oocyte level and subsequent embryonic development. In the same way, the LPS can affect the oocyte and embryonic development; however, the mechanisms by which this happens appear to be different in vitro and in vivo.

Ações da Prostaglandina F2 e Paraoxonase-1 na ovulação e prenhez de bovinos

A ovulação é um dos processos reprodutivos mais críticos para a fêmea, por envolver uma série de alterações que afetam o equilíbrio homeostático. A inflamação, por sua vez, é definida como uma resposta adaptativa de um tecido a um estímulo nocivo, que tem por finalidade reestabelecer a homeostase. Neste sentido, a ovulação é considerada um processo inflamatório, por envolver uma série de mediadores inflamatórios. A prostaglandina F2 (PGF) e a paraoxonase-1 (PON1), que são importantes mediadores inflamatórios, já demonstraram ter funções importantes no processo de ovulação e na resposta das fêmeas a biotécnicas reprodutivas. Assim, objetivou-se identificar os efeitos e possíveis mecanismos de ação da PGF na ovulação e avaliar potenciais associações entre a PON1 e a fertilidade em bovinos. No primeiro estudo se buscou identificar se a PGF seria capaz de estimular o eixo hipotalâmico-hipofisário no processo periovulatório. Os resultados demonstraram que, isoladamente a PGF não induz qualquer alteração nos níveis de LH, sugerindo que ela não atua em nível central. Com base nesses resultados, um estudo foi conduzido para avaliar o efeito local da PGF na ovulação. Após a injeção intrafolicular de PGF, todas as vacas ovularam em um intervalo de 24 horas, entretanto, o mesmo ocorreu com as vacas que receberam placebo. Em paralelo, um estudo foi conduzido para avaliar a relação da PON1 com taxa de ovulação, crescimento folicular e prenhez por inseminação artificial em vacas de corte Bos indicus. Os resultados indicaram que a atividade sérica de PON1 não afetou os parâmetros avaliados. Finalmente, outro estudo foi conduzido no intuito de caracterizar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) na região promotora do gene da PON1 bovina e relacionar com a atividade sérica de PON1 em vacas B. indicus. Oito SNPs foram identificados, entretanto não houve associação de nenhum SNP com atividade enzimática de PON1.Coletivamente, os estudos contribuíram para o entendimento acerca das relações de dois mediadores inflamatórios com parâmetros de fertilidade em fêmeas bovinas. Entretanto, os resultados obtidos demonstram que ainda existem lacunas a serem preenchidas no intuito de identificar o mecanismo de ação da PGF na ovulação. Além disso, sugere-se que, embora a PON1 já tenha demonstrado ser um bom biomarcador de fertilidade em vacas leiteiras B. taurus, o mesmo não se aplica à vacas de corte B. indicus. Dessa forma, estudos complementares são necessários para esclarecer o mecanismo de ação destes mediadores.

Ovulation is one of the most critical reproductive processes for the female involving a series of changes that affect the homeostatic balance. Inflammation, in turn, is defined as an adaptive response of a tissue to a harmful stimulus, which aims to reestablish homeostasis. In this sense, ovulation is considered an inflammatory process, as it involves a series of inflammatory mediators. Prostaglandin F2 (PGF) and paraoxonase-1 (PON1), which are important inflammatory mediators, have been shown to play important roles in the ovulation process and in the response of females to reproductive biotechniques. Thus, we aimed to identify the effects and possible mechanisms of action of PGF on ovulation and to evaluate potential associations between PON1 and fertility in cattle. In the first study we aimed to identify whether PGF would be able to stimulate the hypothalamic-pituitary axis in the periovulatory process. The results demonstrated that PGF does not induce any change in LH levels, suggesting that it does not act at the central level. Based on these results, another study was conducted to evaluate the local effect of PGF on ovulation. After intrafollicular injection of PGF, all cows ovulated within 24 hours, however, the same occurred in cows receiving placebo. In parallel, a study was conducted to evaluate the association among PON1 activity and ovulation rate, follicular growth and pregnancy by artificial insemination in Bos indicus beef cows. The results indicated that serum PON1 activity did not affect the evaluated parameters. Finally, another study was conducted to characterize single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the promoter region of bovine PON1 gene and to correlate with serum PON1 activity in B. indicus cows. Eight SNPs were identified, however there was no association of any SNPs and PON1 enzymatic activity. Collectively, these studies contributed to the understanding of the relationships of inflammatory mediators with fertility parameters in bovine females. However, our results shown that there are still gaps to be filled in order to identify the mechanism of action of PGF in ovulation. In addition, it is suggested that although PON1 has already been shown to be a good fertility biomarker in B. taurus dairy cows, the same can not be applied for B. indicus dairy cows. Thus, complementary studies are necessary to clarify the mechanism of action of these two mediators.

Resposta inflamatória uterina após inseminação artificial em éguas resistentes e susceptíveis à endometrite / Uterine inflammatory response after artificial insemination in mares resistant and susceptible to endometritis / Respuesta inflamatoria del útero después de la inseminación artificial en yeguas resistentes y susceptibles a endometritis

A endometrite persistente pós-cobertura (EPPC) é a principal causa da redução de fertilidade em éguas. Tal desordem pode acarretar grande prejuízo econômico para os produtores, devido à possível queda na taxa de concepção dos animais, aumento do número de serviço por concepção e sobrevivência embrionária prejudicada. O objetivo deste trabalho foi verificar o estímulo do sêmen na resposta inflamatória uterina de éguas resistentes e susceptíveis à endometrite após inseminação artificial (IA). 8 éguas resistentes e 15 susceptíveis à EPPC foram selecionadas com base nos seus índices reprodutivos e exames ultrassonográficos e citológicos. A concentração de células polimorfonucleares (PMNs) na secreção uterina, citologia exfoliativa uterina e acúmulo de fluido uterino verificado no exame ultrassonográfico foram analisados nos dois grupos de animais (1) 24 horas antes da IA e (2) 24 horas após a IA com sêmen fresco. As células polimorfonucleares na secreção uterina foram quantificadas com o uso da câmara de Neubauer e a leitura das amostras de citologia foi realizada por microscopia óptica utilizando imersão, considerando a porcentagem de neutrófilos/100 células de forma aleatória. Os resultados demonstraram que houve uma resposta inflamatória mais intensa nas éguas susceptíveis quando comparadas às resistentes, pelo aumento do acúmulo de fluido uterino verificado no exame ultrassonográfico, aumento do número de células polimorfonucleares observadas na citologia exfoliativa endometrial e pelo aumento da concentração destas células no fluido uterino. Portanto, foi constatado que o sêmen estimula uma resposta inflamatória mais severa no ambiente uterino das éguas susceptíveis.

Post breeding endometritis (PBE) is the major cause of fertility reduction in mares. Such disorder can result in a great economic injury to producers due to the possible fall in the rate of conception, increase in the number of service per conception and impaired embryonic survival. The aim of this study was to verify semen's stimulus on inflammatory response in mares resistant and susceptible to PBE after artificial insemination (AI). 15 mares susceptible to PBE and 8 mares resistant to PBE were selected based on their reproductive index, ultrasonographic and cytological examination. The concentration of polymorphonuclear (PMNs) cells in the uterine secretion, exfoliative cytology of the uterus and uterine fluid accumulation observed by ultrasonography were analyzed in both group of animals (1) 24 hours before AI and (2) 24 hours after AI with fresh semen. PMNs in uterine secretion were quantified by the use of Neubauer chamber and the lecture of endometrial cytology samples were analyzed by optical microscopy using immersion, considering the percentage of neutrophils/100 cells in an alleatory form. The results showed that semen can stimulate a major inflammatory response inside the uterine environment in susceptible mares when compared to resistant mares, by increasing the amount of fluid inside the uterus verified by ultrasonographic exam, increase in PMN number observed in uterine cytology, and increase in concentration of PMN in uterine fluid. Therefore, it was found that semen stimulate a more severe inflammatory response inside the uterine environment of susceptible mares.

Endometritis después de la cobertura es la principal causa de disminución de la fertilidad en yeguas. Este trastorno puede causar una gran pérdida económica para los creadores debido a la posible disminución de la tasa de concepción de los animales, el aumento del número de servicios por concepción y supervivencia de los embriones afectada. El objetivo de este estudio fue evaluar el estímulo del semen en la respuesta inflamatoria uterina de yeguas resistentes y susceptibles a la endometritis depués de la inseminación artificial (IA). 8 yeguas resistentes y 15 susceptibles a endometritis fueron seleccionadas en base a sus índices reproductivos, exámenes de ultrasonido y citologicos. La concentración de las células polimorfonucleares (PMN) en la secreción uterina, citología exfoliativa y la acumulación de fluido uterino observado en el examen de ultrasonido uterino se analizaron en ambos grupos de animales (1) 24 horas antes de la IA, y (2) 24 horas después de la inseminación artificial (IA) con semen fresco. Las células polimorfonucleares en las secreciones uterinas se cuantificaron utilizando una cámara de Neubauer y la lectura de las muestras para citología se realizó por inmersión usando microscopía óptica, mientras que el porcentaje de células neutrófilos/100 al azar. Los resultados mostraron que había una respuesta inflamatoria más intensa en las yeguas susceptibles en comparación con las resistentes al aumentar la cantidad de fluido observado en ultrasonido uterino, incremento en el número de células polimorfonucleares observados en citología exfoliativa endometrial y aumento de la concentración de estas células en el fluido uterino. Por lo tanto, se encontró que el semen estimula una respuesta inflamatoria en el entorno uterino más grave en yeguas susceptibles.

Associações de mutações genéticas com a fertilidade, produção de leite, metabolismo e saúde de vacas leiteiras

A seleção genética de bovinos leiteiros muito tem contribuído para o aumento dos índices produtivos da pecuária leiteira no Brasil e no mundo. Por outro lado, o incremento na produção leiteira tem aumentado alguns transtornos metabólicos do periparto das vacas, reduzindo a fertilidade após o parto. Além disso, a magnitude das respostas imune e algumas citocinas inflamatórias podem impactar negativamente o retorno das vacas a ciclicidade no início da fase de lactação. Neste sentido, os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) são mutações genéticas causadoras de diferenças biológicas, sendo comumente associados a alterações de interesse produtivo e econômico para o melhoramento animal. Sendo assim, buscou-se avaliar a associação de mutações genéticas com a fertilidade, produção de leite, metabolismo e saúde de vacas da raça Holandês. No primeiro estudo foi avaliada a associação de mutações no promotor do gene da Paraoxonase 1 (PON1) com a atividade plasmática desta enzima, fertilidade, ingestão de matéria-seca, metabolismo, produção leiteira e saúde no periparto. Em seguida, foi avaliada a associação de mutações em genes do sistema imune e ligados ao transporte de energia celular com a fertilidade, produção leiteira e ingestão alimentar, metabolismo e saúde de vacas leiteiras. Por fim, foi avaliada a associação de mutações em genes relacionados ao eixo somatotrópico com a fertilidade, produção leiteira e metabolismo pós-parto. Os SNPs no promotor do gene da PON1 tiveram efeito sobre a atividade da enzima no plasma, assim como SNPs nos genes do receptor do hormônio do crescimento (GHR) e fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-I) impactaram os níveis de IGF-I no sangue. Os SNPs PON1 -221, PON1 -392, fator de necrose tumoral alfa (TNF-), receptor tipo toll 4 (TLR-4), coenzima 9 (COQ9), IGF-I e a interação entre GHR/IGF-I tiveram efeito no intervalo parto-concepção. Além disso os SNPs PON1 -22, PON1 -221 e COQ9 tiveram efeito na contagem de células somáticas e o SNP TNF- teve efeito sobre os níveis circulantes de ácidos graxos não-esterificados (NEFA). Ainda, o SNP COQ9 foi associado com a ingestão de matéria-seca pré-parto e a mutação no IGF-I teve efeito nos níveis circulantes de beta-hidroxibutirato (BHBA). Portanto, as mutações nos genes PON1, TNF-, TLR-4, COQ9 e IGF-I, relacionadas a maior atividade da PON1, maiores níveis plasmáticos de IGF-I e menores níveis de NEFA e BHBA tiveram impacto no intervalo parto-concepção, sem afetar a produção de leite.

The genetic selection of dairy cattle has greatly contributed to the increase of the productive indexes of dairy cattle in Brazil and around the world. On the other hand, the increase in milk production has contributed to some metabolic disorders in peripartum of cows, reducing fertility after calving. In addition, the magnitude of immune responses and inflammatory cytokine may negatively impact the return to early cyclicity lactation of dairy cows. In this sense, single nucleotide polymorphisms (SNPs) are genetic mutations that cause biological differences of productive and economic interest for animal breeding. Thus, we aimed to evaluate the association of genetic mutations with fertility, milk production, metabolism and health of Holstein cows. In the first study, the association of mutations in the Paraoxonase 1 (PON1) gene promoter with the plasma activity of this enzyme, fertility, dry matter intake, metabolism, milk production and health in the peripartum were evaluated. Next, we evaluated the association of mutations in genes of the immune system and linked to the transport of cellular energy with fertility, milk production, feed intake, metabolism and health of dairy cows. Finally, we evaluated the association of mutations in genes related to the somatotropic axis with fertility, milk production and postpartum metabolism. SNPs in the PON1 gene promoter had an effect on the activity of the enzyme in plasma, as well as SNPs in the growth hormone receptor (GHR) and insulin like growth factor I (IGF-I) genes impacted blood IGF-I levels. The SNPs PON1 -221, PON1-392, tumor necrosis factor alpha (TNF-), toll-like receptor 4 (TLR-4), coenzyme 9 (COQ9), IGF-I and the interaction between GHR/IGF-I had an effect on the calving conception interval. In addition, the SNPs PON1 -22, PON1 -221 and COQ9 had an effect on milk somatic cell count and the TNF- SNP had an effect on serum nonesterified fatty acids (NEFA) levels. Also, COQ9 SNP was associated with prepartum dry matter intake and the IGF-I mutation had an effect on serum beta-hidroxibutirate (BHBA). Therefore, the mutations in the genes PON1, TNF-, TLR-4, COQ9 and IGFI, related to higher PON1 activity, higher plasma levels of IGF-I and lower levels of NEFA and BHBA had an impact on the calving to conception interval, without affecting milk production.

MEIO CONDICIONADO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS NO TRATAMENTO DE ENDOMETROSE EM ÉGUAS

Durante a vida reprodutiva das éguas o endométrio é exposto a eventos como: cópula, parto, puerpério e infecções. Tais circunstâncias podem levar gradativamente a diminuição da capacidade funcional do endométrio com queda da fertilidade. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento com o meio condicionado de células tronco mesenquimais sobre o endométrio de éguas com fibrose uterina através de avaliação histopatológica. No experimento 1, 21 éguas que não pariram pelo menos em duas temporadas foram avaliadas por meio de exames ultrassonográfico, citológico, bacteriológico e histopatológico. No experimento 2, das 21 éguas avaliadas, quatro éguas classificadas como grau II e duas éguas classificadas como grau III na histopatologia endometrial, foram submetidas a infusão uterina com o meio condicionado de células tronco mesenquimais para promover a regeneração endometrial. No experimento 1, a presença de edema uterino foi observada em 81% (17/21) das fêmeas líquido intrauterino em 23,81% (5/21) e cistos uterinos em 57,14% das éguas (12/21). O crescimento bacteriano identificado em 42,90% (9/21) das éguas pelo exame bacteriológico revelou predominância de Escherichia coli (4/21). O exame citológico revelou processo inflamatório em 44,40% das fêmeas (4/9) com crescimento bacteriano, enquanto 16,70% (2/12) das éguas sem crescimento bacteriano tinham presença de processo inflamatório (P = 0,331). A inflamação uterina foi detectada em 28,60% (6/21) das éguas. A biópsia uterina e avaliação histopatológica revelou 14,30% (3/21) das éguas pertencentes à classe Grau I, 47,60% Grau II (10/21) e 38,10% Grau III (8/21). Verificou-se correlação positiva significativa (r = 0,69; P = 0,0005) entre o grau de endometrose pelo Índice de Caslick e o grau atribuído após exame histopatológico. Maior percentual de éguas com índice Caslick superior a 200 foi observado (P= 0,0242) em éguas classificadas como Grau III (87,5%; 7/8) do que Grau I (0,0%; 0/3). Não houve diferença (P= 0,59) entre as éguas Grau III e as Grau II (70%; 7/10); estas últimas tenderam (P= 0,07) a ter maior percentual com índice Caslick acima 5 de 200 do que as fêmeas com Grau I. O índice Caslick médio comparado entre os graus histológicos revelou maior índice nas éguas Grau III do que nas éguas Grau I (252,0 vs 78,3; P= 0,007). As éguas com Grau II apresentaram índice intermediário (174,6). Não houve associação entre a presença de cistos uterinos e o grau histopatológico das biópsias (P= 0,813). Éguas com cistos uterinos tiveram 16,7%, 41,7% e 41,7% das biópsias classificadas no exame histológico como Graus I, II e III, respectivamente . Esses percentuais nas éguas sem cistos foram de 11,1%, 55,6% e 33,3%, para os Graus I, II e III, respectivamente. A idade média das fêmeas foi similar (P= 0,112) entre as fêmeas com e sem cistos uterinos (20,3 vs 16,3 anos). No experimento 2, a aplicação de 20 mL de meio condicionado de células tronco no lúmen uterino das seis éguas com endometrose grau II e III não resultou em melhoria na condição endometrial.

During the mare reproductive life, the endometrium is exposed to events such as copulation, parturition, puerperium, and infections. Such circumstances may gradually lead to a decrease in the functional capacity of the endometrium, resulti ng in a drop in fertility. The objective of this study was to evaluate, by using ultrasonographic, cytological, bacteriological, and histopathological exams, the effect of a treatment with mesenchymal stem cell-conditioned medium on the endometrium of 21 mares with uterine fibrosis that did not foal in at least two seasons. In experiment 1, 21 mares were evaluated by using ultrasonographic, cytological, bacteriological and histopathological exams. In experiment 2, from the total 21 females, four mares classified by the endometrial histopathology as grade II and two mares classified as grade III were submi tted to uterine infusion with mesenchymal stem cell-conditioned medium to promote the endometrial regeneration. In experiment 1, the evaluation revealed the presence of uterine edema in 81% (17/21), intrauterine liquid in 23.81% (5/21), and uterine cysts in 57.14% of the mares (12/21). Bacteriological examination revealed that 42.86% (9/21) of the mares showed bacterial growth, and the microorganism with the highest incidence was Escherichia coli (4/21). The cytological exam showed inflammatory process in 44.40% (4/9) of the females with bacterial growth, while 16.70% (2/12) of the mares without bacterial growth showed inflammatory process (P = 0.331). Uterine inflammatory process was observed in 28.60% (6/21) of the mares. It was possible to identify by using uterine biopsy and histopathological evaluation that 14.30% (3/21), 47.60% (10/21), and 38.10% (8/21) of mares belong to Grade I, II and III, respectively. There was a significant positive correlation (r = 0.69, P = 0.0005) between the degree of endometrosis evaluated by the Caslick Index and the grade attributed after histopathological examination. The percentage of mares with Caslick index over 200 was higher in females classified as grade III (P= 0.0242) than in grade I females (0.0%; 0/3). There was no difference between mares grade III and grade II 7 (70%; 7/10). Grade II females tended to have a higher percentage with Caslick index above 200 (P = 0.07) when compared to the grade I females. The medium Caslick index compared between the histological grades revealed a higher index in grade III than in grade I mares (252.0 vs 78.3, P = 0.007). Mares grade II showed intermediate index (174.6). There was no association between the presence of uterine cysts and the histopathological grade of biopsies (P = 0.813). Mares with uterine cysts had 16.70%, 41.70%, and 41.70% of the biopsies classified in the histological examination as grades I, II, and III, respectively. The percentages in mares without cysts were 11.10%, 55.60%, and 33.30%, respectively, for Grade I, II and III. The mares mean age was similar (P=0.112) among females with or without uterine cysts (20.3 vs 16.3 years). In experiment 2, the application of 20 mL of mesenchymal stem cell-conditioned medium in the uterine lumen of six mares with endometrosis Grade II and III did not improv e the endometrial condition.