Seminal characteristics and sensitivity of Astyanax lacustris (Characiformes: Characidae) sperm to cryoprotective solutions based on dimethylsufoxide and methylglicol

This study aimed to determine the semen characteristics of Astyanax lacustris after hormonal induction and to evaluate the sensitivity of the species sperm to cryoprotective solutions based on the cryoprotectants dimethyl sulfoxide and methyl glycol. Volume, color, sperm concentration, total motility and aspects of sperm movement were analyzed using "Integrated Semen Analysis System". Three different extenders were tested: A) glucose 5%+egg yolk 10%, B) BTS®5% and C) glucose 5% and two permeable cryoprotectants: dimethyl sulfoxide (Me2SO) and methyl glycol (MTG). Fresh A. lacustris semen presented total motility of 76.6±11.2%, motility duration of 33.0±2.2s, sperm concentration of 7.22±3.2×109sptz/mL and seminal osmolality of 219±0.03mOsm/kg-1. The toxicity test showed the highest total motility values at the MTG15%+A, Me2SO15%+B and Me2SO10%+C dilutions, and the Me2SO10%+C and Me2SO15%+C dilutions presented the highest values for curvilinear velocity, linear velocity and average velocity. The tested protocol was not effective at maintaining the viability of A. lacustris semen after freezing because no motility was observed in any of the dilutions. However, the Comet Assay demonstrated that cryoprotectant solutions were effective in protecting the genetic material of cells, as DNA damage levels were low, with no difference between control and Me2SO10% + A, dilutions MTG10%+C, Me2SO10%+B and Me2SO15%+B.(AU)

O objetivo deste estudo foi determinar as características do sêmen de Astyanax lacustris após indução hormonal e avaliar a sensibilidade dos espermatozoides da espécie a soluções crioprotetoras baseadas nos crioprotetores dimetilsulfóxido e metilglicol. Volume, cor, concentração espermática, motilidade total e aspectos do movimento espermático foram analisados usando o "Sistema Integrado de Análise de Sêmen (ISAS®CASA)". Três extensores diferentes foram testados: A) glicose 5%+gema de ovo 10%, B) BTS® 5% e C) glicose 5% e dois crioprotetores permeáveis: dimetilsulfóxido (Me2SO) e metilglicol (MTG). O sêmen fresco de A. lacustris apresentou motilidade total 76,6±11,2%, duração da motilidade 33,0±2,2s, concentração de espermatozoides 7,22±3,2×109sptz/mL e osmolalidade seminal 219±0,03mOsm/kg-1. O teste de toxicidade apresentou maiores valores de motilidade total nas diluições MTG15%+A, Me2SO15%+B e Me2SO10%+C, e as diluições Me2SO10%+C e Me2SO15%+C apresentaram maiores valores de velocidade curvilínea, velocidade linear e velocidade média. O protocolo testado não foi eficaz em manter a viabilidade do sêmen de A. lacustris pós-congelamento, pois não foi observada motilidade em nenhuma das diluições. No entanto, o Ensaio Cometa demonstrou que as soluções crioprotetoras eram eficazes na proteção do material genético das células, pois os níveis de dano ao DNA eram baixos, sem diferença entre controle e Me2SO10%+A, MTG10%+C, Me2SO10%+B e Me2SO15%+B.(AU)

Seminal characteristics and sensitivity of Astyanax lacustris (Characiformes: Characidae) sperm to cryoprotective solutions based on dimethylsufoxide and methylglicol

This study aimed to determine the semen characteristics of Astyanax lacustris after hormonal induction and to evaluate the sensitivity of the species sperm to cryoprotective solutions based on the cryoprotectants dimethyl sulfoxide and methyl glycol. Volume, color, sperm concentration, total motility and aspects of sperm movement were analyzed using "Integrated Semen Analysis System". Three different extenders were tested: A) glucose 5%+egg yolk 10%, B) BTS®5% and C) glucose 5% and two permeable cryoprotectants: dimethyl sulfoxide (Me2SO) and methyl glycol (MTG). Fresh A. lacustris semen presented total motility of 76.6±11.2%, motility duration of 33.0±2.2s, sperm concentration of 7.22±3.2×109sptz/mL and seminal osmolality of 219±0.03mOsm/kg-1. The toxicity test showed the highest total motility values at the MTG15%+A, Me2SO15%+B and Me2SO10%+C dilutions, and the Me2SO10%+C and Me2SO15%+C dilutions presented the highest values for curvilinear velocity, linear velocity and average velocity. The tested protocol was not effective at maintaining the viability of A. lacustris semen after freezing because no motility was observed in any of the dilutions. However, the Comet Assay demonstrated that cryoprotectant solutions were effective in protecting the genetic material of cells, as DNA damage levels were low, with no difference between control and Me2SO10% + A, dilutions MTG10%+C, Me2SO10%+B and Me2SO15%+B.(AU)

O objetivo deste estudo foi determinar as características do sêmen de Astyanax lacustris após indução hormonal e avaliar a sensibilidade dos espermatozoides da espécie a soluções crioprotetoras baseadas nos crioprotetores dimetilsulfóxido e metilglicol. Volume, cor, concentração espermática, motilidade total e aspectos do movimento espermático foram analisados usando o "Sistema Integrado de Análise de Sêmen (ISAS®CASA)". Três extensores diferentes foram testados: A) glicose 5%+gema de ovo 10%, B) BTS® 5% e C) glicose 5% e dois crioprotetores permeáveis: dimetilsulfóxido (Me2SO) e metilglicol (MTG). O sêmen fresco de A. lacustris apresentou motilidade total 76,6±11,2%, duração da motilidade 33,0±2,2s, concentração de espermatozoides 7,22±3,2×109sptz/mL e osmolalidade seminal 219±0,03mOsm/kg-1. O teste de toxicidade apresentou maiores valores de motilidade total nas diluições MTG15%+A, Me2SO15%+B e Me2SO10%+C, e as diluições Me2SO10%+C e Me2SO15%+C apresentaram maiores valores de velocidade curvilínea, velocidade linear e velocidade média. O protocolo testado não foi eficaz em manter a viabilidade do sêmen de A. lacustris pós-congelamento, pois não foi observada motilidade em nenhuma das diluições. No entanto, o Ensaio Cometa demonstrou que as soluções crioprotetoras eram eficazes na proteção do material genético das células, pois os níveis de dano ao DNA eram baixos, sem diferença entre controle e Me2SO10%+A, MTG10%+C, Me2SO10%+B e Me2SO15%+B.(AU)

Cryopreservation of Prochilodus brevis semen: freezing media and thawing rates / Criopreservação do sêmen de Prochilodus brevis: meios de congelação e taxas de descongelação

Prochilodus brevis is a migratory fish, an important component of its river ecosystem and an appreciated animal in northeastern cuisine. However, human activities have threatened its survival. Thus, researchers have become interested in developing genetic material storage protocols, such as seminal cryopreservation. Therefore, determination of the appropriate freezing media and thawing rate is a fundamental step toward the use of this biotechnology in the production of common curimatã and for reducing risks to the species survival. As such, the aim of the current study was to evaluate the effect of different freezing media and thawing rates on the quality of cryopreserved semen from P. brevis. For this study, males received a single dose of pituitary extract of carp 18 hours before semen collection. The semen samples were diluted in 5% glucose + 10% methyl glycol (MG), 5% glucose + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO), 0.9% NaCl + 10% methyl glycol, and 0.9% NaCl + 10% dimethyl sulfoxide, loaded into 0.25-mL straws and frozen in liquid nitrogen vapor. The semen from each treatment was thawed at three different thawing rates: 25 C for 30 sec, 30 C for 16 sec and 40 C for 12 sec. Motility, vitality and morphology analyses were performed by computer-assisted sperm analysis (CASA). The characteristics of the fresh sperm mostly resembled those found in the literature. For the parameter...(AU)

O Prochilodus brevis é um peixe reofílico, importante componente do ecossistema fluvial e apreciado na culinária nordestina. No entanto, ações antrópicas têm ameaçado sua sobrevivência. Desta forma, surge, nos pesquisadores, o interesse no desenvolvimento de protocolos de conservação do material genético, como a criopreservação seminal. Logo, a determinação do meio de congelação e da taxa de descongelação adequados, são passos fundamentais que possibilitarão a utilização dessa biotecnologia na produção de curimatã comum, reduzindo os riscos à sua sobrevivência. Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de diferentes meios de congelação e taxas de descongelação sobre a qualidade do sêmen criopreservado de P. brevis. Para isso, 18 horas antes da coleta de sêmen, os machos receberam dose única de extrato hipofisário de carpa. Cada animal foi sedado com solução à base de eugenol e o sêmen foi coletado. As amostras foram diluídas em quatro meios de congelação (5% Glicose + Metilglicol 10%; 5% Glicose + DMSO 10%; 0,9% NaCl + Metilglicol 10%; 0,9% NaCl + DMSO 10%) envasadas em palhetas de 0,25 mL e congeladas em vapor de nitrogênio líquido. O sêmen foi descongelado após sete dias em três taxas de descongelação: 25 C 30 s-1; 30 C 16 s-1; 40 C 12 s-1. Foram feitas as análises de motilidade, vitalidade e morfologia com auxílio de sistema automatizado de análise seminal...(AU)

Cryopreservation of Prochilodus brevis semen: freezing media and thawing rates / Criopreservação do sêmen de Prochilodus brevis: meios de congelação e taxas de descongelação

Prochilodus brevis is a migratory fish, an important component of its river ecosystem and an appreciated animal in northeastern cuisine. However, human activities have threatened its survival. Thus, researchers have become interested in developing genetic material storage protocols, such as seminal cryopreservation. Therefore, determination of the appropriate freezing media and thawing rate is a fundamental step toward the use of this biotechnology in the production of common curimatã and for reducing risks to the species survival. As such, the aim of the current study was to evaluate the effect of different freezing media and thawing rates on the quality of cryopreserved semen from P. brevis. For this study, males received a single dose of pituitary extract of carp 18 hours before semen collection. The semen samples were diluted in 5% glucose + 10% methyl glycol (MG), 5% glucose + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO), 0.9% NaCl + 10% methyl glycol, and 0.9% NaCl + 10% dimethyl sulfoxide, loaded into 0.25-mL straws and frozen in liquid nitrogen vapor. The semen from each treatment was thawed at three different thawing rates: 25 C for 30 sec, 30 C for 16 sec and 40 C for 12 sec. Motility, vitality and morphology analyses were performed by computer-assisted sperm analysis (CASA). The characteristics of the fresh sperm mostly resembled those found in the literature. For the parameter...

O Prochilodus brevis é um peixe reofílico, importante componente do ecossistema fluvial e apreciado na culinária nordestina. No entanto, ações antrópicas têm ameaçado sua sobrevivência. Desta forma, surge, nos pesquisadores, o interesse no desenvolvimento de protocolos de conservação do material genético, como a criopreservação seminal. Logo, a determinação do meio de congelação e da taxa de descongelação adequados, são passos fundamentais que possibilitarão a utilização dessa biotecnologia na produção de curimatã comum, reduzindo os riscos à sua sobrevivência. Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de diferentes meios de congelação e taxas de descongelação sobre a qualidade do sêmen criopreservado de P. brevis. Para isso, 18 horas antes da coleta de sêmen, os machos receberam dose única de extrato hipofisário de carpa. Cada animal foi sedado com solução à base de eugenol e o sêmen foi coletado. As amostras foram diluídas em quatro meios de congelação (5% Glicose + Metilglicol 10%; 5% Glicose + DMSO 10%; 0,9% NaCl + Metilglicol 10%; 0,9% NaCl + DMSO 10%) envasadas em palhetas de 0,25 mL e congeladas em vapor de nitrogênio líquido. O sêmen foi descongelado após sete dias em três taxas de descongelação: 25 C 30 s-1; 30 C 16 s-1; 40 C 12 s-1. Foram feitas as análises de motilidade, vitalidade e morfologia com auxílio de sistema automatizado de análise seminal...

Induced reproduction of dourado (Salminus brasiliensis): fertilization with sperm cryopreserved in ACP®-104 / Reprodução induzida do dourado (Salminus brasiliensis): fertilização com sêmen criopreservado em ACP®-104

Experiments were conducted to improve the fertilization rate of cryopreserved semen of dourado, Salminus brasiliensis. The experiment tested two cryoprotectant solutions at different semen: cryoprotectant ratios (1:5, 1:15, 1:25 and 1:50). The standard solution for the species (mixture of dimethyl sulfoxide, glucose, egg yolk and distilled water) was compared to a 350 mOsm ACP®-104 solution, which is composed of powdered coconut water diluted in distilled water and methylglycol. Differences between the dilutions tested were significant only for ACP®. The fertilization potential by using the standard solution at the lowest dilution (1:5) is equated when the sperm is diluted in ACP® at 1:25 or 1:50. These results show that the standard solution is the most suitable for the cryopreservation of dourado sperm, since the dilution did not alter the fertilization rate, requiring smaller storage space.

Experimentos foram realizados, visando melhorar a taxa de fertilização com a utilização de sêmen criopreservado do dourado, Salminus brasiliensis. O experimento testou duas soluções crioprotetoras em diferentes diluições de sêmen:solução crioprotetora (1:5, 1:15, 1:25 e 1:50). A solução padrão para a espécie (mistura de glicose, água destilada, gema de ovo e dimetilsulfóxido) foi comparada com a solução ACP®-104 350 mOsm, composta por água de coco em pó diluída em água destilada e metilglicol. Foi observada diferença entre as distintas diluições testadas apenas para a ACP®. O potencial de fertilização com o uso da solução padrão na menor diluição testada (1:5) é igualado apenas quando o sêmen em ACP® é diluído em 1:25 ou 1:50. Os resultados apontam que a solução padrão é mais vantajosa para a criopreservação de sêmen do dourado, uma vez que a variação da diluição do sêmen não altera a taxa de fertilização, requerendo, assim, menor espaço para armazenamento das amostras.

Induced reproduction of dourado (Salminus brasiliensis): fertilization with sperm cryopreserved in ACP®-104 / Reprodução induzida do dourado (Salminus brasiliensis): fertilização com sêmen criopreservado em ACP®-104

Experiments were conducted to improve the fertilization rate of cryopreserved semen of dourado, Salminus brasiliensis. The experiment tested two cryoprotectant solutions at different semen: cryoprotectant ratios (1:5, 1:15, 1:25 and 1:50). The standard solution for the species (mixture of dimethyl sulfoxide, glucose, egg yolk and distilled water) was compared to a 350 mOsm ACP®-104 solution, which is composed of powdered coconut water diluted in distilled water and methylglycol. Differences between the dilutions tested were significant only for ACP®. The fertilization potential by using the standard solution at the lowest dilution (1:5) is equated when the sperm is diluted in ACP® at 1:25 or 1:50. These results show that the standard solution is the most suitable for the cryopreservation of dourado sperm, since the dilution did not alter the fertilization rate, requiring smaller storage space.(AU)

Experimentos foram realizados, visando melhorar a taxa de fertilização com a utilização de sêmen criopreservado do dourado, Salminus brasiliensis. O experimento testou duas soluções crioprotetoras em diferentes diluições de sêmen:solução crioprotetora (1:5, 1:15, 1:25 e 1:50). A solução padrão para a espécie (mistura de glicose, água destilada, gema de ovo e dimetilsulfóxido) foi comparada com a solução ACP®-104 350 mOsm, composta por água de coco em pó diluída em água destilada e metilglicol. Foi observada diferença entre as distintas diluições testadas apenas para a ACP®. O potencial de fertilização com o uso da solução padrão na menor diluição testada (1:5) é igualado apenas quando o sêmen em ACP® é diluído em 1:25 ou 1:50. Os resultados apontam que a solução padrão é mais vantajosa para a criopreservação de sêmen do dourado, uma vez que a variação da diluição do sêmen não altera a taxa de fertilização, requerendo, assim, menor espaço para armazenamento das amostras.(AU)

Metodologias para criopreservação e mecanismos de avaliação do sêmen de peixes characiformes

A criopreservação de sêmen é uma técnica que permite o armazenamento dos gametas a longo prazo. Existem várias metodologias para obter sucesso na criopreservação de sêmen de peixes, e podem ser variáveis dependendo da espécie. O objetivo deste trabalho foi fazer um levantamento das metodologias mais utilizadas na criopreservação e os mecanismos de avaliação de sêmen de peixes Characiformes. Um dos pontos mais importantes é a utilização do diluidor, composto por diluente e crioprotetor intra e/ou extracelular, com intuito de proteger os espermatozoides contra crioinjúrias. Os principais componentes de um diluidor utilizado para Characiformes são: diluente glicose 5%; crioprotetor interno o dimetilsulfoxido ou metilglicol; e crioprotetor externo a gema de ovo. Em relação aos equipamentos utilizados para redução da temperatura, o mais utilizado é o Dry shipper. As formas de avalição do sêmen mais importantes após a descongelação são: taxa de motilidade e morfologia espermática.

Avaliação de diferentes crioprotetores e taxas de diluição na criopreservação seminal de Prochilodus brevis / Evaluation of different crioprotectants and dilution ratios on Prochilodus brevis sperm cryopreservation

Este estudo objetivou caracterizar o sêmen de Prochilodus brevis e avaliar os efeitos de diferentescrioproterores e taxas de diluição sobre a cinética e a morfologia do sêmen criopreservado. Inicialmente,amostras seminais de P. brevis (n = 40) foram analisadas quanto ao volume, pH, osmolaridade, concentração,motilidade e morfologia espermáticas. Para a criopreservação, o material coletado foi distribuído em 10 pools desêmen (n = 10), submetidos a seis tratamentos compostos pela combinação de glicose 5%, dois crioprotetores(DMSO ou MG) e três taxas de diluição (1:3, 1:6 ou 1:9 sêmen:diluidor). As amostras, in natura e pósdescongeladas,foram analisadas quanto à sua morfologia e cinética espermática utilizando o CASA. O sêmen deP. brevis apresentou características semelhantes a demais espécies de Prochilodus. O sêmen congelado comglicose e MG apresentou resultados significativamente superiores (P < 0,05) comparado àquele congeladoutilizando DMSO. As diluições 1:3 e 1:6 apresentaram melhores resultados para glicose + MG, enquanto 1:9 foimelhor para glicose + DMSO. Portanto, a associação glicose + MG, numa taxa de diluição de 1:3 ou 1:6, é amais indicada para a criopreservação do sêmen de Prochilodus brevis.(AU)

This study aimed to characterize Prochilodus brevis sperm and evaluate the effects of different diluentsand dilution ratios on kinetics and morphology of cryopreserved sperm. Initially, sperm samples of P. brevis(n = 40) were assessed for volume, pH, osmolality, spermatic concentration, motility and morphology. Forcryopreservation, the collected material was distributed in ten pools of semen (n = 10), submitted to sixtreatments composed by a combination of glucose 5% with two cryoprotectants (DMSO or MG) and threedilution ratios (1:3, 1:6 or 1:9 - sperm:diluent). In natura and post-thawed samples were assessed for spermaticmorphology and kinetics using CASA. The sperm of P. brevis showed similar characteristics to otherProchilodus species. Sperm cryopreserved in glucose plus MG presented significantly higher results (P < 0.05)compared to sperm frozen in DMSO. The dilution ratios of 1:3 and 1:6 yielded better results for glucose + MG,while 1:9 was the best dilution for glucose + DMSO. In conclusion, the association of glucose + MG, in adilution ratio of 1:3 or 1:6, is the most indicated for Prochilodus brevis sperm cryopreservation.(AU)

Avaliação de diferentes crioprotetores e taxas de diluição na criopreservação seminal de Prochilodus brevis / Evaluation of different crioprotectants and dilution ratios on Prochilodus brevis sperm cryopreservation

Este estudo objetivou caracterizar o sêmen de Prochilodus brevis e avaliar os efeitos de diferentescrioproterores e taxas de diluição sobre a cinética e a morfologia do sêmen criopreservado. Inicialmente,amostras seminais de P. brevis (n = 40) foram analisadas quanto ao volume, pH, osmolaridade, concentração,motilidade e morfologia espermáticas. Para a criopreservação, o material coletado foi distribuído em 10 pools desêmen (n = 10), submetidos a seis tratamentos compostos pela combinação de glicose 5%, dois crioprotetores(DMSO ou MG) e três taxas de diluição (1:3, 1:6 ou 1:9 – sêmen:diluidor). As amostras, in natura e pósdescongeladas,foram analisadas quanto à sua morfologia e cinética espermática utilizando o CASA. O sêmen deP. brevis apresentou características semelhantes a demais espécies de Prochilodus. O sêmen congelado comglicose e MG apresentou resultados significativamente superiores (P < 0,05) comparado àquele congeladoutilizando DMSO. As diluições 1:3 e 1:6 apresentaram melhores resultados para glicose + MG, enquanto 1:9 foimelhor para glicose + DMSO. Portanto, a associação glicose + MG, numa taxa de diluição de 1:3 ou 1:6, é amais indicada para a criopreservação do sêmen de Prochilodus brevis.

This study aimed to characterize Prochilodus brevis sperm and evaluate the effects of different diluentsand dilution ratios on kinetics and morphology of cryopreserved sperm. Initially, sperm samples of P. brevis(n = 40) were assessed for volume, pH, osmolality, spermatic concentration, motility and morphology. Forcryopreservation, the collected material was distributed in ten pools of semen (n = 10), submitted to sixtreatments composed by a combination of glucose 5% with two cryoprotectants (DMSO or MG) and threedilution ratios (1:3, 1:6 or 1:9 - sperm:diluent). In natura and post-thawed samples were assessed for spermaticmorphology and kinetics using CASA. The sperm of P. brevis showed similar characteristics to otherProchilodus species. Sperm cryopreserved in glucose plus MG presented significantly higher results (P < 0.05)compared to sperm frozen in DMSO. The dilution ratios of 1:3 and 1:6 yielded better results for glucose + MG,while 1:9 was the best dilution for glucose + DMSO. In conclusion, the association of glucose + MG, in adilution ratio of 1:3 or 1:6, is the most indicated for Prochilodus brevis sperm cryopreservation.

FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA COM SÊMEN IN NATURA E CRIOPRESERVADO EM LARVICULTURA DE Prochilodus brevis EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE MANEJO

O Prochilodus brevis é um peixe migratório, de importância ecológica, econômica e social cujas ações antrópicas têm ameaçado sua sobrevivência. Nesse contexto, pesquisadores têm buscado estratégias que auxiliem na conservação e no cultivo dessa espécie em cativeiro. Portanto, os objetivos desse trabalho foram verificar a capacidade fecundante do sêmen criopreservado de P. brevis, definir a densidade de estocagem das pós-larvas, concentração diária de Artemia para cada pós-larva e o período de transição do alimento vivo para ração comercial na larvicultura de P. brevis. Foram realizados dois experimentos. No primeiro, o sêmen de P. brevis foi congelado em diluidor contendo solução de 5% de glicose e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) ou solução de 5% de glicose e 10% de metilglicol (MG). Posteriormente, o sêmen foi descongelado, avaliado e utilizado na fertilização assistida. Ovócitos foram fertilizados utilizando o sêmen descongelado e avaliados quanto à viabilidade embrionária e larval. No segundo experimento, foram testadas as densidades de estocagem de 10, 20 e 30 pós-larvas por litro de água, as concentrações diárias de 400, 600 e 800 náuplios de Artemia por pós-larva de peixe e os períodos para início da transição alimentar de quatro, seis e oito dias. Foi avaliado o desempenho em crescimento e sobrevivência das proles. O sêmen congelado em glicose e DMSO apresentou resultados de qualidade seminal superiores (P<0,001) ao congelado em glicose e MG. Somente o sêmen congelado em glicose e DMSO foi capaz de produzir larvas. As concentrações diárias de 600 e 800 náuplios de Artemia por pós-larva de P. brevis proporcionaram os melhores resultados de crescimento e sobrevivência (P<0,05) quando comparadas à concentração de 400 náuplios. Não houve diferença entre as densidades de estocagem testadas (P>0,05). No teste de transição alimentar não foram observadas diferenças (P>0,05). Conclui-se que a produção de larvas desta espécie utilizando sêmen congelado é viável, indicando-se o diluidor composto por 5% de glicose e 10% de DMSO. Assim como recomenda-se a densidade de estocagem de 30 pós-larvas/L e uma concentração diária de 600 náuplios de Artemia durante os primeiros três dias de alimentação exógena. E a partir do quarto dia deve-se fornecer, gradualmente, ração comercial (45% de proteína bruta).

Prochilodus brevis is a migratory fish of ecological, economic and social importance whose anthropic actions have threatened its survival. In this context, researchers have been looking for strategies that help in the conservation and cultivation of this species in captivity. Therefore, the objectives of this study were to verify the fecundating capacity of P. brevis cryopreserved sperm, to define the post-larvae stocking density, the daily concentration of Artemia for each post-larvae and the transition period from live to commercial feed in P. brevis larviculture. Two experiments were performed. In the first one, P. brevis sperm was frozen in a freezing media containing 5% glucose solution and 10% dimethylsulfoxide (DMSO) or 5% glucose solution and 10% methylglycol (MG). Subsequently, semen was thawed, evaluated and used in assisted fertilization. Oocytes were fertilized using thawed sperm and evaluated for embryonic and larval viability. In the second experiment, the stocking densities of 10, 20 and 30 post-larvae per liter of water, daily concentrations of 400, 600 and 800 Artemia nauplii per fish post-larvae and the periods for the beginning of four, six and eight days the feed transition were tested. The growth and survival performance of the offspring was evaluated. Sperm frozen in glucose and DMSO showed higher seminal quality results (P<0.001) than sperm frozen in glucose and MG. Only sperm frozen in glucose and DMSO was able to produce larvae. Daily concentrations of 600 and 800 Artemia nauplii per P. brevis post-larvae provided the best growth and survival results (P<0.05) when compared to the 400 nauplii concentration. There was no difference between the stocking densities tested (P>0.05). In the feed transition test no differences were observed (P>0.05). It is concluded that the production of this species larvae using frozen sperm is viable, indicating the freezing media composed of 5% glucose and 10% DMSO. As well as the stocking density of 30 post-larvae/L and a daily concentration of 600 Artemia nauplii during the first three days of exogenous feeding is recommended. And from the fourth day on, one should gradually supply commercial feed (45% crude protein).

SPERM CRYOPRESERVATION THROUGHOUT THE SPAWNING SEASON IN Prochilodus lineatus

O objetivo deste trabalho foi determinar a qualidade do sêmen de curimba (Prochilodus lineatus) criopreservado ao longo do período reprodutivo (novembro a março). O sêmen foi coletado mensalmente dos animais (43 machos) após indução hormonal com extrato bruto de hipófise de carpa. O sêmen fresco foi avaliado subjetivamente quanto a sua motilidade, vigor, duração da motilidade e morfologia. O sêmen foi criopreservado em palhetas de 0,5 mL (n=258) utilizando-se metilglicol como crioprotetor e solução de glicose como diluidor. O sêmen descongelado foi avaliado quanto a sua motilidade, velocidades (curvilínea VCL, linear progressiva VSL, média VAP) e frequência de batimento flagelar cruzado (BCF) por meio de um sistema de análise espermática computadorizada (CASA). O sêmen descongelado também foi analisado quanto a sua morfologia, estresse oxidativo (peroxidação lipídica LPO, espécies reativas de oxigênio ROS, superóxido desmutase SOD e catalase CAT) e capacidade de fertilização (taxas de fertilização e eclosão). O plasma seminal foi analisado quanto ao seu pH, osmolalidade e concentração iônica (Na+, K+, Ca2+ e Mg2+). O sêmen fresco de curimba apresentou alta qualidade durante o período reprodutivo, com taxa de motilidade espermática superior a 80%, e a qualidade do sêmen congelado foi afetada ao longo da estação reprodutiva. O sêmen criopreservado apresentou maiores (p<0.05) motilidade e VCL de dezembro a março. Correlações negativas (p<0.01) foram observadas entre a concentração espermática e a motilidade espermática, concentração espermática e a VCL, e concentração de íons Ca2+ no plasma seminal e motilidade espermática. A concentração espermática foi positivamente correlacionada (p<0.01) com a concentração de íons Ca2+ no plasma seminal, CAT e ROS. CAT e fertilidade também se correlacionaram positivamente (p<0.05). O aumento da CAT foi eficiente em reduzir as ROS e a LPO nas amostras criopreservadas em novembro, e manteve a capacidade de fertilização espermática, apesar de a atividade das ROS ter afetado a motilidade e a VCL. Fatores climáticos registrados no período que antecedeu a estação reprodutiva também afetaram a qualidade das amostras criopreservadas no início do período. Apesar de o sêmen fresco e criopreservado terem apresentado baixo percentual de células normais em março, as amostras apresentaram boa qualidade neste mês, com alta motilidade, vigor e VCL. O sêmen de P. lineatus criopreservado de dezembro a março exibe características mais favoráveis para ser submetido ao estresse induzido pela criopreservação.

The aim of this study was to determine the quality of Prochilodus lineatus sperm cryopreserved throughout the reproductive season (November to March). Males (n=43) were monthly handstripped after carp pituitary treatment. Fresh sperm was subjectively analyzed for its motility rate, motility quality score, duration of motility and morphology. Sperm was cryopreserved on 0.5 mL straws (n=258) using methyl glycol as cryoprotectant and glucose solution as extender. Post-thaw sperm was analyzed for its motility rate, velocities (curvilinear VCL; straight-line VSL; average path VAP), and beat cross frequency (BCF) using a Computer-Assisted Sperm Analyzer (CASA). Frozen sperm morphology, oxidative stress (lipid peroxidation LPO; reactive oxygen species ROS; superoxide dismutase SOD; catalase CAT), and fertilization capacity (fertilization and hatching rates) were also evaluated. Seminal plasma was analyzed for pH, osmolality and ion concentration (Na+, K+, Ca2+ and Mg2+). P. lineatus fresh sperm presented good quality during the reproductive season, exhibiting motility rates above 80%, and post-thaw sperm quality was affected throughout the spawning season. Post-thaw sperm yielded higher (p<0.05) motility and VCL on December to March. Negative correlations were observed between sperm concentration and frozen sperm motility, sperm concentration and VCL, and Ca2+ concentration on seminal plasma and frozen sperm motility (p<0.01). Sperm concentration was positively correlated with Ca2+ concentration, CAT and ROS (p<0.01). CAT and fertility correlated positively (p<0.05). Increased CAT was efficient in reducing ROS and LPO in samples frozen in November, and maintained sperm fertilization capacity, although ROS activity affected sperm motility and VCL. Climate factors registered before the reproductive season also affected the quality of samples frozen at the beginning of the season. Although both fresh and post-thaw semen presented lower percentages of normal sperm cells on March, samples yielded good quality parameters such as motility rate, motility quality score, and VCL on this month. P. lineatus sperm cryopreserved from December to March exhibits better characteristics to undergo the stress induced by cryopreservation.

Metodologias para criopreservação e mecanismos de avaliação do sêmen de peixes Characiformes / Methodologies for cryopreservation and mechanisms of sperm evaluation in Characiformes fish

A criopreservação de sêmen é uma técnica que permite o armazenamento dos gametas a longo prazo. Existem várias metodologias para obter sucesso na criopreservação de sêmen de peixes, e podem ser variáveis dependendo da espécie. O objetivo deste trabalho foi fazer um levantamento das metodologias mais utilizadas na criopreservação e os mecanismos de avaliação de sêmen de peixes Characiformes. Um dos pontos mais importantes é a utilização do diluidor, composto por diluente e crioprotetor intra e/ou extracelular, com intuito de proteger os espermatozoides contra crioinjúrias. Os principais componentes de um diluidor utilizado para Characiformes são: diluente glicose 5%; crioprotetor interno o dimetilsulfoxido ou metilglicol; e crioprotetor externo a gema de ovo. Em relação aos equipamentos utilizados para redução da temperatura, o mais utilizado é o Dry shipper. As formas de avalição do sêmen mais importantes após a descongelação são: taxa de motilidade e morfologia espermática.(AU)

The sperm cryopreservation is a technique that allows the storage of gametes over a long term. Several methodologies can be employed to reach a successful fish sperm cryopreservation, and they may vary depending on the species. The objective of this study was to survey the most widely used methodologies for cryopreservation of Characiformes fish sperm. One of the most important points is to use a freezing solution which is composed by an extender and an intra/extracellular cryoprotectant in order to protect the sperm against cryodamages. The main components of freezing solutions used to Characiformes are the extender glucose 5%, the internal cryoprotectant dimethylsulfoxide or methylglycol, and egg yolk as an external cryoprotectant. Regarding the equipment used to reduce the temperature, the most used is the dry shipper. The most important forms of sperm quality assessment after thawing are motility rate and sperm morphology.(AU)

Metodologias para criopreservação e mecanismos de avaliação do sêmen de peixes characiformes / Methodologies for cryopreservation and mechanisms of sperm evaluation in characiformes fish

A criopreservação de sêmen é uma técnica que permite o armazenamento dos gametas a longo prazo. Existem várias metodologias para obter sucesso na criopreservação de sêmen de peixes, e podem ser variáveis dependendo da espécie. O objetivo deste trabalho foi fazer um levantamento das metodologias mais utilizadas na criopreservação e os mecanismos de avaliação de sêmen de peixes Characiformes. Um dos pontos mais importantes é a utilização do diluidor, composto por diluente e crioprotetor intra e/ou extracelular, com intuito de proteger os espermatozoides contra crioinjúrias. Os principais componentes de um diluidor utilizado para Characiformes são: diluente glicose 5%; crioprotetor interno o dimetilsulfoxido ou metilglicol; e crioprotetor externo a gema de ovo. Em relação aos equipamentos utilizados para redução da temperatura, o mais utilizado é o Dry shipper. As formas de avalição do sêmen mais importantes após a descongelação são: taxa de motilidade e morfologia espermática.

The sperm cryopreservation is a technique that allows the storage of gametes over a long term. Several methodologies can be employed to reach a successful fish sperm cryopreservation, and they may vary depending on the species. The objective of this study was to survey the most widely used methodologies for cryopreservation of Characiformes fish sperm. One of the most important points is to use a freezing solution which is composed by an extender and an intra/extracellular cryoprotectant in order to protect the sperm against cryodamages. The main components of freezing solutions used to Characiformes are the extender glucose 5%, the internal cryoprotectant dimethylsulfoxide or methylglycol, and egg yolk as an external cryoprotectant. Regarding the equipment used to reduce the temperature, the most used is the dry shipper. The most important forms of sperm quality assessment after thawing are motility rate and sperm morphology.

MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE Brycon orbignyanus (Valenciennes, 1850)

Objetivou-se o aperfeiçoamento do protocolo de congelamento de sêmen para piracanjuba, utilizando diferentes curvas de congelamento e soluções contendo melatonina. Este estudo foi dividido em duas etapas. A primeira consistiu na avaliação da criopreservação do sêmen, em diferentes tempos de permanência, em botijão de vapor de nitrogênio, utilizando diferentes concentrações de melatonina no meio de criocongelamento e na segunda avaliou-se o sêmen diluído nas mesmas concentrações de melatonina das soluções da primeira etapa, porém, criocongeladas em duas curvas, utilizando-se dry shipper e máquina de congelamento. As coletas foram realizadas nas Estações de Piscicultura da Cemig, em Volta Grande e em Itutinga, nos períodos de piracema, em 2016, 2017 e 2018. O sêmen foi caracterizado por meio da observação de volume, aspecto, coloração, vigor e concentração espermática. Os parâmetros utilizados para a avaliação da qualidade das células foram a taxa e a duração da motilidade, a integridade de membrana plasmática, a morfologia da célula espermática, o perfil oxidativo e as taxas de fertilização e eclosão. Na primeira etapa, as características do sêmen in natura encontravam-se de acordo com o encontrado por outros autores. Somente para a taxa de fertilização foi observada diferença estatística significativa na interação entre as soluções e os tempos no dry shipper. A solução M2 apresentou os melhores resultados em relação à solução controle, para os parâmetros de vitalidade, taxa de motilidade, tempos de motilidade e motilidade progressiva (85,2±2,8%, 64,63±8,3%, 84,22±11,4 seg, 17,01±1,2%). Na segunda etapa, observou-se diferença (p<0,05) entre as soluções nos parâmetros de vitalidade, morfologia, motilidade e taxa de fertilização. As soluções com melatonina apresentaram os melhores valores. No estresse oxidativo, apenas a peroxidação lipídica e a atividade de SOD apresentaram diferença (p<0,05) na interação curva e solução, mostrando as soluções com melatonina com os menores valores. Conclui-se que a adição de melatonina na concentração de 2 mM, associada ao crioprotetor metilglicol na solução de criocongelamento, melhorou a qualidade espermática, independentemente das curvas utilizadas.

The objective of this study was to improve the protocol for the freezing of semen for Piracanjuba, using different freezing curves and solutions containing melatonin. This study was divided into two stages. The first consisted of the evaluation of the cryopreservation of semen in different times of stay in a nitrogen vapor canister, using different concentrations of melatonin in the cryoclock and the second evaluated the diluted semen in the same concentrations of melatonin of the solutions of the first stage, in two different curves using the dry shipper and freezing machine. The collections were carried out at the Cemig Fisheries Stations in Volta Grande and Itutinga, during the periods of piracema in 2016, 2017 and 2018. Semen was characterized by the observation of volume, appearance, color, vigor and sperm concentration. The parameters used to evaluate cell quality were the rate and duration of motility, plasma membrane integrity, sperm cell morphology, oxidative profile and rates of fertilization and hatching. In the first stage, the characteristics of the semen in natura are in agreement with the one found by other authors. Only for the fertilization rate was observed a statistically significant difference in the interaction between solutions and times in the dry shipper. The M2 solution presented the best results in relation to the control solution for the parameters of vitality, motility rate, motility times and progressive motility (85.2 ± 2.8%, 64.63 ± 8.3%, 84, 22 ± 11.4 sec, 17.01 ± 1.2%). In the second stage, there was a difference (p <0.05) between the solutions in the parameters of vitality, morphology, motility and fertilization rate. The melatonin solutions presented the best values. In oxidative stress, only lipid peroxidation and SOD activity presented a difference (p <0.05) in the curve and solution interaction, showing the melatonin solutions with the lowest values. It is concluded that the addition of 2mM melatonin, combined with the cryoprotective methylglycol in the cryoclock solution, improved sperm quality, regardless of the curves used.

Osmolalidade das soluções ativadoras com ou sem íons na ativação da motilidade do sêmen criopreservado de piabanha Brycon insignis (Characiformes)

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito de soluções ativadoras com diferentes osmolalidades, com ou sem íons, na qualidade espermática do sêmen criopreservado de Brycon insignis. O sêmen de 8 machos foi coletado após tratamento hormonal com extrato de hipófise de carpa. Após a coleta, o sêmen foi criopreservado utilizando metilglicol como crioprotetor e uma solução de BTS® como diluidor. O sêmen diluído foi envasado em palhetas de 0,5 mL, que foram congeladas em botijão de vapor de nitrogênio (dryshipper) e armazenadas em botijão de nitrogênio líquido. Após cinco anos, as palhetas foram descongeladas em banho-maria a 60°C por 8 segundos. No experimento 1, 11 soluções foram preparadas utilizando água osmose reversa (~ 0 mOsm/Kg) e glicose ou NaCl ajustadas as seguintes osmolalidades: 50, 100, 150, 200 e 250 mOsm/Kg. No experimento 2, 6 soluções foram preparadas utilizando água osmose reversa e NaHCO3, citrato de sódio (Na3C6H5O7), NaCl, KCl, CaCl2 ou glicose (controle não iônico), ajutadas a ~ 98 mOsm/Kg. Os parâmetros de taxa de motilidade, velocidade curvilínea (VCL), velocidade retilínea (VSL), velocidade média de percurso (VAP) e frequência de batimento flagelar cruzado (BCF) do sêmen após o descongelamento foram determinados utilizando o sistema computadorizado de análise de sêmen (CASA). Maiores taxas de motilidade e velocidades foram observadas em amostras ativadas nas soluções de NaCl e glicose em osmolalidades de 0 a 200 mOsm/Kg, se comparadas com as amostras ativadas nas soluções de 250 mOsm/Kg e não foram observadas diferenças estatísticas entre as soluções de NaCl e glicose dentro da mesma osmolalidade. As amostras ativadas em NaHCO3, citrato de sódio, NaCl, KCl e glicose apresentaram as maiores taxas de motilidade, se comparada às amostras ativadas em CaCl2. Maiores velocidades curvilineares foram observadas em amostras ativadas em NaHCO3, citrato de sódio, KCl e glicose, quando comparadas às amostras ativadas em CaCl2. As amostras ativadas em NaCl apresentaram valores intermediários para VCL. O sêmen criopreservado de B. insignis pode ser ativado em soluções iônicas ou não iônicas com osmolalidades de 0 a 200 mOsm/Kg, entretanto a solução de CaCl2 deve ser evitada.

The objective of this study was to determine the effect of activating solutions with different osmolalities, with or without ions, on the sperm quality of the cryopreserved sperm of Brycon insignis. The semen of 8 males was collected after hormonal treatment with carp pituitary extract. After collection, the semen was cryopreserved using methyl glycol as a cryoprotectant and a BTS solution was used as extender. The diluted sperm loaded into 0.5 mL straws, which were frozen in a nitrogen vapor vessel (dry shipper) and stored in a liquid nitrogen vessel. After five years the straws were thawed in a water bath at 60 °C for 8 seconds. In experiment 1, 11 solutions were prepared with reverse osmosis water (0 mOsm kg-1) and glucose or NaCl adjusted to an osmolality of 50, 100, 150, 200 and 250 mOsm kg-1. In experiment 2, 6 solutions were prepared with reverse osmosis water e NaHCO3, sodium citrate ((Na3C6H5O7), NaCl, KCl, CaCl2 or glicose (as an ion-free control), adjusted to ~98 mOsm Kg-1. The parameters of motility rate, curvilinear velocity (VCL), straight line (VSL), average path (VAP) and beat-cross frequency (BCF) of the post-thaw were determined using a Computer-Assisted Sperm Analyzer (CASA). Higher motility rates and velocities were observed in activated samples in NaCl and glucose solutions at osmolalities of 0 to 200 mOsm Kg-1, when compared to the activated samples in the solutions of 250 mOsm Kg-1 and was no statistical difference on motility rate and velocities between samples activated in NaCl or in glucose solutions within the same osmolality. The samples activated in NaHCO3, sodium citrate, NaCl, KCl or glucose presented the higher rates of motility, when compared to samples activated in CaCl2. Higher curvilinear velocities were observed in samples activated in NaHCO3, sodium citrate, KCl and glucose, when compared to samples activated in CaCl2. Samples activated in NaCl presented intermediate VCL values. The post-thaw sperm in B. insignis can be activated in ionic or non-ionic solutions with osmolalities of 0 to 200 mOsm/kg, however the CaCl2 solution should be avoided.

Meios de congelação para conservação de sêmen de peixes da família characidae / Cryopreservation extenders for fishes sperm of Characidae family

Os peixes caracídeos possuem grande diversidade de espécies, considerável importância ecológica e expressivo valor comercial. A criopreservação de sêmen é uma técnica utilizada para contribuir na operacionalização dos programas de reprodução dessas espécies cultivadas ou em vias de extinção. Para garantir a sobrevivências dos espermatozóides durante a criopreservação é necessário adicionar soluções diluidoras e crioprotetoras, que reagem com o sêmen de forma peculiar dependendo da espécie animal. Portanto, o objetivo dessa revisão foi buscar identificar diluentes adotados para criopreservação de sêmen de alguns peixes caracídeos. Os diluidores mais utilizados são glicose, BTS e, mais recentemente, a água de coco em pó (ACP®) associados aos crioprotetores DMSO, glicerol ou metilglicol. Diante da grande variedade de protocolos, conclui-se que é de grande importância incentivar o estudo das particularidades do sêmen de caracídeos e dos meios de congelação, para padronizar a técnica de criopreservação de sêmen de peixes deste grupo.

family has a great diversity of species, an enormous ecological importance and commercial value. The sperm cryopreservation is a technique used to assist reproductive programs of cultivated or endangered species. To ensure the sperm survival during cryopreservation, it is necessary to add extenders and cryoprotective solutions, which react with the sperm in a peculiar way, depending on the animal specie. Thus, the objective of this review was to identify extenders used in the cryopreservation technique for Characid fishes. The sperm cryopreservation review in Characid fishes report that the most commonly used extenders are glucose, BTS and powder coconut water (PCW®) associated with glycerol, DMSO and methyl glycol. Due to the wide range of protocols, it can be concluded that is very important to encourage the study of the particularities of Characid fish semen and freezing substances to standardization of cryopreservation techniques of semen in this particular fish group.

Meios de congelação para conservação de sêmen de peixes da família characidae / Cryopreservation extenders for fishes sperm of Characidae family

Os peixes caracídeos possuem grande diversidade de espécies, considerável importância ecológica e expressivo valor comercial. A criopreservação de sêmen é uma técnica utilizada para contribuir na operacionalização dos programas de reprodução dessas espécies cultivadas ou em vias de extinção. Para garantir a sobrevivências dos espermatozóides durante a criopreservação é necessário adicionar soluções diluidoras e crioprotetoras, que reagem com o sêmen de forma peculiar dependendo da espécie animal. Portanto, o objetivo dessa revisão foi buscar identificar diluentes adotados para criopreservação de sêmen de alguns peixes caracídeos. Os diluidores mais utilizados são glicose, BTS e, mais recentemente, a água de coco em pó (ACP®) associados aos crioprotetores DMSO, glicerol ou metilglicol. Diante da grande variedade de protocolos, conclui-se que é de grande importância incentivar o estudo das particularidades do sêmen de caracídeos e dos meios de congelação, para padronizar a técnica de criopreservação de sêmen de peixes deste grupo.(AU)

family has a great diversity of species, an enormous ecological importance and commercial value. The sperm cryopreservation is a technique used to assist reproductive programs of cultivated or endangered species. To ensure the sperm survival during cryopreservation, it is necessary to add extenders and cryoprotective solutions, which react with the sperm in a peculiar way, depending on the animal specie. Thus, the objective of this review was to identify extenders used in the cryopreservation technique for Characid fishes. The sperm cryopreservation review in Characid fishes report that the most commonly used extenders are glucose, BTS and powder coconut water (PCW®) associated with glycerol, DMSO and methyl glycol. Due to the wide range of protocols, it can be concluded that is very important to encourage the study of the particularities of Characid fish semen and freezing substances to standardization of cryopreservation techniques of semen in this particular fish group.(AU)

EFEITO DAS VITAMINAS C E E ASSOCIADAS AO DMSO E METILGLICOL SOBRE A CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL DE Prochilodus brevis (ACTINOPTERYGII)

O Prochilodus brevis é um peixe reofílico, e as ações antrópicas têm ameaçado sua sobrevivência. Assim, é necessário o desenvolvimento de biotecnologias de conservação dessa espécie, como a criopreservação de gametas. Contudo, esta técnica causa estresse às células, podendo estimular a formação de espécies reativas de oxigênio, reduzindo a integridade estrutural e funcional dos espermatozoides. Portanto, é necessário utilizar substâncias com poder antioxidante para combater os radicais livres. Dessa forma, objetivou-se avaliar o efeito das vitaminas C e E e dos crioprotetores DMSO e metilglicol sobre a qualidade do sêmen criopreservado de P. brevis. Os machos receberam dose única de extrato hipofisário de carpa (3 mg.Kg-1 peso corporal) e, após 14h, foram sedados e o sêmen coletado. Para a criopreservação, o experimento foi realizado em duas etapas. Na primeira, o sêmen de 10 animais foi submetido a seis diferentes meios de congelação, oriundos da combinação de glicose 5%, dois crioprotetores (DMSO ou metilglicol) e duas vitaminas (C ou E a 0,0001 mg). Na segunda etapa, amostras seminais de oito animais foram diluídas em glicose 5% e DMSO, associados a três diferentes concentrações das vitaminas C ou E (0,01; 0,001 e 0,0001 mg). Após diluição, as amostras foram envasadas em palhetas de 0,25 mL, congeladas em Dry shipper (-176 ºC/15 min), armazenadas em botijão criogênico por, aproximadamente, 15 dias e descongeladas em banho-maria (30 °C/16 s). Em ambas as etapas, as amostras in natura e pós-descongeladas foram submetidas às análises de cinética (CASA/SCA), morfologia e integridade de membrana espermática. O sêmen criopreservado com DMSO apresentou resultados significativamente superiores (p<0,05) comparado ao congelado com metilglicol, independente da vitamina utilizada. A taxa de espermatozoides morfologicamente normais foi superior (p<0,05) nas amostras contendo vitamina, contudo a vitamina E reduziu as taxas de motilidade espermática, independente do crioprotetor utilizado. Quanto às concentrações das vitaminas, obteve-se maiores taxas de motilidade (p<0,05) quando se criopreservou sêmen com 0,01 e 0,0001 mg de qualquer uma das vitaminas. Entretanto, a maior concentração teve efeito deletério sobre a morfologia espermática de P. brevis. Portanto, a glicose associada ao DMSO e à menor concentração de vitamina C proporciona boa qualidade ao sêmen pós-descongelado de P. brevis.

Prochilodus brevis is a rheophilic fish whose human actions have threatened its survival. Thus, the development of conservation biotechnologies of this species, such as cryopreservation, is necessary. However, this technique causes stress to the cells and may stimulate the formation of reactive oxygen species, reducing the structural and functional integrity of spermatozoa. Therefore, it is necessary to use substances with antioxidant power to combat free radicals. The objective of this study was to evaluate the effect of vitamins C and E and cryoprotectants DMSO and methylglycol on the quality of the cryopreserved semen of P. brevis. Males were given a single dose of pituitary carp extract (3 mg.Kg-1 weight body) and after 14 h, they were sedated and the semen collected. For cryopreservation, the experiment was carried out in two stages. In the first one, the semen of 10 animals was submitted to six different freezing means, coming from the combination of 5% glucose, two cryoprotectants (DMSO or methylglycol) and two vitamins (C or E to 0.0001 mg). In the second step, sperms samples of eight animals were diluted in 5% glucose and DMSO, associated to three different concentrations of vitamins C or E (0.01, 0.001 and 0.0001 mg). After dilution, the samples were packed in 0.25 mL vats, frozen in Dry shipper (-176 ºC / 15 min), stored in a cryogenic bottle for about 15 days and thawed in a 30 ° C / 16 s). In both steps, the in natura and post-thawed samples were submitted to kinetic analysis (CASA / SCA), morphology and sperm membrane integrity. The cryopreserved semen with DMSO presented significantly higher results (p <0.05) compared to frozen with methylglycol, regardless of the vitamin used. The morphologically normal spermatozoa rate was higher (p <0.05) in the vitamin-containing samples, however vitamin E reduced sperm motility rates, independent of the cryoprotectant used. As for vitamin concentrations, higher motility rates were obtained when cryopreserved semen with 0.01 and 0.0001 mg of any of the vitamins. In addition, the highest concentration had a deleterious effect on the spermatic morphology of P. brevis. Therefore, the glucose associated with DMSO and the lower concentration of vitamin C provides good quality to the post-thawed semen of P. brevis.

Qualidade do sêmen e sua congelabilidade ao longo da estação reprodutiva em Prochilodus lineatus e Brycon orbignyanus

Este estudo foi realizado com o objetivo de determinar a qualidade do sêmen fresco e congelado avaliado ao longo de duas piracemas (2013-2014; 2014-2015) em Prochiloduslineatus e Bryconorbignyanus. Cada uma das piracemas foi dividida em dois períodos: de novembro até dezembro e de janeiro até fevereiro. O sêmen dos machos foi coletado após tratamento com extrato de hipófise de carpa. A taxa de motilidade, velocidades (curvilinear = VCL; linear progressiva = VSL; média = VAP) e frequência do batimento flagelar (BCF) do sêmen fresco foram determinadas utilizando o sistema computadorizado de análise de sêmen (CASA). O sêmen de cada espécie foi congelado utilizando metilglicol como crioprotetor e uma solução de glicose para P. lineatus, e uma solução de NaCl para B. orbignyanus como diluidores. O sêmen diluído foi envasado em palhetas de 0,25 mL, congelado em botijão de vapor de nitrogênio (dryshipper) e armazenado em botijão de nitrogênio líquido. Após seis meses, as palhetas foram descongeladas em banho-maria a 60°C por 3 segundos e a qualidade espermática foi determinada como descrito para o sêmen fresco. Não foram observadas diferenças significativas em todos os parâmetros do sêmen fresco e congelado entre as duas piracemas e ao longo de cada piracema em P. lineatus e em B. orbignyanus. A taxa de motilidade e velocidades, mas não o BCF, foram sempre maiores no sêmen fresco quando comparado ao congelado.Comparando as duas espécies, uma maior motilidade no sêmen congelado e uma maior VCL e VAP no sêmen fresco e congelado foram observadas em P. lineatus, enquanto uma maior VSL no sêmen fresco e um maior BCF no sêmen fresco e congelado foram observados em B. orbignyanus. A qualidade espermática e a congelabilidade do sêmen em ambas as espécies foram sustentadas ao longo dos períodos reprodutivos e, dessa forma, produtores de peixes podem reproduzir essas espécies e congelar o sêmen em qualquer momento ao longo do período reprodutivo. O sêmen de P. lineatusé mais resistente ao processo de criopreservação que o de B. orbignyanus.

The aim of this study was to determine fresh and frozen sperm quality over two spawning seasons (2013-2014; 2014-2015) in Prochiloduslineatus and Bryconorbignyanus. The spawning seasons were divided into two periods: November to December and January to February. Males were hand-stripped after carp pituitary treatment.Fresh sperm motility rate, velocities (curvilinear = VCL; straight-line = VSL; average path = VAP), and beat cross frequency (BCF) were determined using a Computer-Assisted Sperm Analyzer (CASA). Sperm of each species was frozen using methyl glycol as cryoprotectant and a glucose solution for P. lineatus and a NaCl solution for B. orbignyanuswere used as extenders. Diluted sperm was loaded into 0.25 mL straws, then frozen in a nitrogen vapor vessel (dry shipper) and stored in a liquid nitrogen vessel. Six months later, straws were thawed in a water bath at 60°C for 3 s and sperm quality was determined, as described for fresh sperm. No significant difference was observed for any of the fresh and frozen sperm features between or over the two spawning seasons forP. lineatus and B. orbignyanus. Motility rate and velocities, but not BCF, were always higher in fresh sperm when compared with frozen sperm. Comparing both species, higher motility in frozen sperm and higher VCL and VAP in both fresh and frozen sperm were observed in P. lineatus, while higher VSL in fresh sperm and higher BCF in fresh and frozen sperm were observed in B. orbignyanus. Sperm quality and its freezing ability remained over the spawning season for both species and thus fish farmers can reproduce these species and freeze their sperm at any time throughout the spawning season. P. lineatussperm is more resistant to the cryopreservation process than B. orbignyanus.

CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE TAMBAQUI Colossoma macropomum EM MACROPALHETAS

A criopreservação de sêmen de peixes é uma ferramenta para a otimização do manejo reprodutivo, a formação de bancos de germoplasma e o desenvolvimento de programas de melhoramento genético. O sucesso dessa técnica depende do domínio e o equilíbrio de vários fatores que envolvem os processos de coleta, diluição, envase, congelamento e descongelamento. Protocolos de criopreservação sêmen de tambaqui já foram desenvolvidos utilizando palhetas de 0,5mL no envase, no entanto, o elevado volume de sêmen produzido e alta fecundidade da espécie sugere o armazenamento em recipientes de maior volume para a aplicação na produção em larga escala. Com isso, o objetivo do presente estudo foi estabelecer um protocolo de criopreservação seminal do tambaqui em macropalhetas de 4,0mL, a partir da definição de um meio diluidor, tempo de equilíbrio e a melhor relação entre temperatura e o tempo de descongelamento do sêmen. O sêmen coletado foi diluído, envasado em macropalhetas, congelado em vapor de nitrogênio líquido no botijão dryshipper e armazenadas em botijão criogênico a -196°C. No primeiro experimento, foram testadas diferentes composições do meio diluidor (M1 - 5% de metilglicol; M2 - 5% de metilglicol + 5% de gema de ovo; M3 - 10% de metilglicol; M4 - 10% de metilglicol + 5% de gema de ovo; M5 - 15% de metilglicol; M6 - 15% de metilglicol + 5% de gema de ovo) e três tempos de equilíbrio (4, 20 e 40 minutos). No segundo experimento, foram avaliadas diferentes velocidades de descongelamento do sêmen em banho-maria, sobre a qualidade espermática (30ºC por 50s - T1; 30ºC por 80s - T2; 60ºC por 25s - T3 e 60ºC por 40s - T4). Ao final do estudo concluiu-se, que o protocolo ideal para a criopreservação do sêmen do tambaqui em macropalhetas de 4,0mL consiste na diluição do sêmen na proporção de 1:9 (v:v) em um meio composto por 5% de metilglicol e 5% de gema de ovo, os quais devem permanecer em contato por 4 minutos até que sejam submetidos ao processo de congelamento em botijão dry-shipper. O descongelamento das amostras deve ser realizado em banho-maria a 60°C por 25s.

Cryopreservation of fish semen is a key to optimization of reproductive management, the formation of germplasm bank and the development of genetic improvement programs. The success of this technique depends on the management and balance of several factors such as the collection, dilution, packaging, freezing and thawing. Tambaqui semen cryopreservation protocols have been developed using 0.5 mL straws on packaging. However, the high volumes of semen produced and the elevated taxes of fecundity are presented by this specie, it is necessary to use larger volume storage containers for application to large-scale production. The objective of this study was to establish a tambaqui semen cryopreservation protocol in large straw 4,0mL, from the definition of cryosolution, equilibration time and the best ratio between temperature and time semen thawing. The semen collected was diluted, packaged in large straws, frozen in liquid nitrogen which was conditioned in dry-shipper and stored in cryogenic cylinder at -196 °C. In the first experiment, different cryosolutions (M1 - 5% 5% methylglycol; M2 - 5% 5% methylglycol+ 5% egg yolk; M3 - 10% 5% methylglycol; M4 - 10% 5% methylglycol + 5% egg yolk; M5 - 15% 5% methylglycol; M6 - 15% de 5% methylglycol + 5% egg yolk) and three equilibration times (4, 20 and 40 minutes) were tested. In the second experiment, different relation between temperature and time thawing on sperm quality (30ºC for 50s T1; 30ºC for 80s - T2; 60ºC for 25s - T3 e 60ºC for 40s - T4) were evaluated. In conclusion, this study showed that the ideal protocol for cryopreservation of tambaqui semen in large straw 4,0mL is made by diluting semen at a ratio of 1: 9 (v: v) in a medium composed of 5% methylglycol and 5% egg yolk. Both of them must have remained in contact with each other for 4 minutes until both were subjected to freezing in dry-shipper. The thawing of samples required to be performed in a water bath at 60 ° C for 25s.