Characterization of a Coliphage AS1 isolated from sewage effluent in Pakistan / Caracterização de um colifago AS1 isolado de efluente de esgoto no Paquistão

The emergence of multi-drug resistant (MDR) bacterial strains, which are posing a global health threat has developed the interest of scientists to use bacteriophages instead of conventional antibiotics therapy. In light of an increased interest in the use of phage as a bacterial control agent, the study aimed to isolate and characterize lytic phages from sewage effluent. During the current study, bacteriophage AS1 was isolated from sewage effluent against E.coli S2. The lytic activity of phageAS1 was limited to E.coli S2 strain showing monovalent behavior. The calculated phage titer was 3.5×109 pfu/ml. PhageAS1 was stable at a wide range of pH and temperature. The maximum stability was recorded at 37ºC and pH 7.0, while showing its normal lytic activity at temperature 60ºC and from pH 5.0 to 11.0 respectively. At temperature 70ºC, phage activity was somewhat reduced whereas, further increase in temperature and decrease or increase in pH completely inactivated the phage. From the current study, it was concluded that waste water is a best source for finding bacteriophages against multi-drug resistant bacterial strains and can be used as bacterial control agent.

O surgimento de cepas bacterianas multirresistentes (MDR), que representam uma ameaça global à saúde, desenvolveu o interesse dos cientistas em usar bacteriófagos em vez da terapia convencional com antibióticos. Diante do crescente interesse no uso de fago como agente de controle bacteriano, o estudo visou isolar e caracterizar fagos líticos de efluente de esgoto. Durante o estudo atual, o bacteriófago AS1 foi isolado de efluente de esgoto contra E. coli S2. A atividade lítica de phageAS1 foi limitada à cepa E. coli S2, apresentando comportamento monovalente. O título de fago calculado foi de 3,5 x 109 ufp/ml. PhageAS1 foi estável em uma ampla faixa de pH e temperatura. A estabilidade máxima foi registrada a 37ºC e pH 7,0, enquanto mostrou atividade lítica normal em temperatura de 60ºC e pH 5,0 a 11,0, respectivamente. Na temperatura de 70ºC, a atividade do fago foi um pouco reduzida, enquanto o aumento adicional da temperatura e a diminuição ou aumento do pH inativaram completamente o fago. Com base no estudo atual, concluiu-se que a água residual é a melhor fonte para encontrar bacteriófagos contra cepas bacterianas multirresistentes e pode ser usada como agente de controle bacteriano.

Characterization of a Coliphage AS1 isolated from sewage effluent in Pakistan / Caracterização de um colifago AS1 isolado de efluente de esgoto no Paquistão

The emergence of multi-drug resistant (MDR) bacterial strains, which are posing a global health threat has developed the interest of scientists to use bacteriophages instead of conventional antibiotics therapy. In light of an increased interest in the use of phage as a bacterial control agent, the study aimed to isolate and characterize lytic phages from sewage effluent. During the current study, bacteriophage AS1 was isolated from sewage effluent against E.coli S2. The lytic activity of phageAS1 was limited to E.coli S2 strain showing monovalent behavior. The calculated phage titer was 3.5×109 pfu/ml. PhageAS1 was stable at a wide range of pH and temperature. The maximum stability was recorded at 37ºC and pH 7.0, while showing its normal lytic activity at temperature 60ºC and from pH 5.0 to 11.0 respectively. At temperature 70ºC, phage activity was somewhat reduced whereas, further increase in temperature and decrease or increase in pH completely inactivated the phage. From the current study, it was concluded that waste water is a best source for finding bacteriophages against multi-drug resistant bacterial strains and can be used as bacterial control agent.(AU)

O surgimento de cepas bacterianas multirresistentes (MDR), que representam uma ameaça global à saúde, desenvolveu o interesse dos cientistas em usar bacteriófagos em vez da terapia convencional com antibióticos. Diante do crescente interesse no uso de fago como agente de controle bacteriano, o estudo visou isolar e caracterizar fagos líticos de efluente de esgoto. Durante o estudo atual, o bacteriófago AS1 foi isolado de efluente de esgoto contra E. coli S2. A atividade lítica de phageAS1 foi limitada à cepa E. coli S2, apresentando comportamento monovalente. O título de fago calculado foi de 3,5 x 109 ufp/ml. PhageAS1 foi estável em uma ampla faixa de pH e temperatura. A estabilidade máxima foi registrada a 37ºC e pH 7,0, enquanto mostrou atividade lítica normal em temperatura de 60ºC e pH 5,0 a 11,0, respectivamente. Na temperatura de 70ºC, a atividade do fago foi um pouco reduzida, enquanto o aumento adicional da temperatura e a diminuição ou aumento do pH inativaram completamente o fago. Com base no estudo atual, concluiu-se que a água residual é a melhor fonte para encontrar bacteriófagos contra cepas bacterianas multirresistentes e pode ser usada como agente de controle bacteriano.(AU)

Caracterização imunoproteômica de Brucella canis para a identificação de proteínas candidatas a antígenos para sorodiagnóstico

A brucelose canina é uma doença zoonótica, causada pela Brucella canis, que é uma das principais causas de abortamentos e infertilidade em cães. O objetivo deste estudo foi investigar um surto de B. canis em um canil, caracterizar os isolados de Brucella obtidos e identificar proteínas de B. canis reagentes especificamente a anticorpos de cães naturalmente infectados. O canil é localizado em São Paulo, SP, Brasil e no momento da amostragem, em 2014, o canil era composto por 17 cães adultos da raça Pug. Amostras de sangue foram utilizadas tanto para isolar as bactérias quanto para detectar o DNA de Brucella spp. pela reação em cadeia pela polimerase. Amostras de soro foram utilizadas para detectar anticorpos contra B. canis nos soros dos cães, utilizando um teste imunocromatográfico, o teste de soroaglutinação rápida em placa com ou sem 2-mercaptoetanol e dois kits de ELISA. Os isolados foram caracterizados pelos métodos bacteriológicos clássicos, espectrometria de massa e pelo sequenciamento do genoma completo. O conteúdo proteico total dos isolados de B. canis foi extraído e as proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de uma e duas dimensões (1D e 2D, respeectivamente), sendo então testadas frente aos soros dos cães infectados (com ou sem bacteremia) e não infectados, utilizando Western Immunoblotting. Os spots proteicos reagentes foram identificados usando espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS). Secreção vaginal, aborto, natimorto, falha na concepção e linfoadenopatia foram os sinais clínicos observados nos cães infectados. Coco-bacilos gram-negativos foram isolados em 24 amostras de sangue. Anticorpos contra B. canis foram observadas em todos os cães, em pelo menos uma amostragem, pelos testes sorológicos empregados. A MS atribuiu todos os isolados ao gênero Brucella. Os dados fenotípicos identificaram claramente B. canis com apenas pequenas diferenças nos padrões de lise por fagos. Os spots de proteínas, separados por 2D, foram identificados por MALDI-TOF MS como 93 diferentes proteínas, dentre elas, 19 foram identificadas em cães infectados (com ou sem bacteremia) e não foram identificadas nos cães não infectados. Tais proteínas são candidatas a serem utilizadas como antígenos para o aprimoramento do sorodiagnóstico, uma vez que a existência de um diagnóstico confiável constitui uma medida essencial para o controle e a prevenção da brucelose canina. A abordagem múltipla utilizada, envolvendo métodos microbiológicos clássicos, espectrometria de massa e sequenciamento completo do genoma bacteriano possibilitou a caracterização dos isolados de B. canis com elevado poder discriminatório, o que pode auxiliar em investigações de surtos.

Canine brucellosis is a zoonotic disease, caused by Brucella canis, which is the main cause of abortion and infertility in dogs. This study had the objective to investigate a B. canis outbreak in a breeding kennel, to describe a multistep approach to characterize the B. canis isolates obtained, and to identify B. canis proteins specifically reacting with antibodies from naturally infected dogs. The kennel was located in São Paulo, SP, Brazil. At the time of sampling, in 2014, the kennel comprised 17 adult Pug dogs. Blood samples were used both to isolate the bacteria and to detect Brucella spp. DNA by the polymerase chain reaction. Serum samples were used to detect antibodies against B. canis using an immunocromatographic test, the rapid slide agglutination test with or without 2-mercaptoethanol and two ELISA kits. The Brucella isolates were characterized through the classical bacteriological tests, mass spectrometry and whole genome sequencing. The total protein content of Brucella isolates was extracted and separated using one and two-dimension polyacrylamide gel electrophoresis (1D and 2D, respectively), and then tested against sera collected from bacteremic, non-bacteremic and non-B. canis infected dogs using western immunoblotting. The reacting protein spots were identified using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Vaginal discharge, abortion, stillbirth, conception failure and general lymphadenopathy were the clinical signs found in the infected dogs. Gram-negative, coccoid rod-shaped bacteria were isolated from 24 blood samples. Antibodies against B. canis were detected in all dogs at least once by the performed serological tests. Mass spectrometry analysis assigned all isolates to the genus Brucella. The phenotypic data clearly identified the isolates as B. canis with only slight differences in phage typing patterns. The 2D separated protein spots were identified by MALDI-TOF MS as 93 different proteins, out of them, 19 were identified in infected dogs (during the bacteremic and non-bacteremic phases of the infection) and were not identified in non-infected dogs. These proteins have the potential to be used as antigens in serological tests in an attempt to improve the diagnosis of the infection, since a reliable diagnosis is an essential measure for the control and prevention of canine brucellosis. The multistep approach using classical microbiological methods, mass spectrometry and whole genome sequencing allowed the characterization of the B. canis with high discriminatory power, which may be useful for outbreak investigations.

Rapd/pcr and phage typing of salmonella enteritidis isolated from poultry and food poisoning outbreaks

ABSTRACT Salmonella Enteritidis (SE) is an important pathogen, causing both food poisoning outbreaks in humans and economic losses to the poultry industry, being also widely spread in the environment. This work aimed to identify SE phage types and to standardize the Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) for evaluating SE isolates obtained from different origins. To do so, 238 SE strains were selected, of which 104 were isolated from broiler carcasses, 106 from food samples and human biological materials involved in food poisoning outbreaks and 28 from different poultry materials. Among these 238 SE isolates, 111 were phage typed, and 57.7% (64/ 111) corresponded to phage type (PT) 4, 32.4% (36/111) to PT 4a, 3.6% (4/111) to PT 6a and 0.9% (1/111) to PT 7, whereas 5.4% .6/111) of the strains were not typeable (RDNC, reacts but does not conform). After the standardization of amplification conditions, all 238 SE isolates were submitted to RAPD/PCR. Among these, 91.8% (217/238) were classified as pattern A. Twenty-one isolates were differentiated into four patterns and into seven subtypes with the use of primer 1254, and into four patterns and ten subtypes using primer OPB 17. The combination of phage typing and RAPD/PCR proved to be a useful tool in epidemiological investigations. RAPD/PCR can be easily used as a routine laboratory method, thus helping with the monitoring of SE isolates and contributing to the establishment of effective Salmonella Enteritidis control and preventive programs.

RESUMO Salmonella Enteritidis (SE) é um patógeno de importância destacada como causa de toxinfecções alimentares em humanos, prejuízos ao setor produtivo e ampla disseminação no ambiente. Este trabalho objetivou identificar fagotipos e padronizar a RAPD/PCR (DNA polimórfico amplificado ao acaso) para a avaliação de isolados de SE. Foram selecionadas 238 amostras, sendo 104 oriundas de carcaças de frango, 106 de alimentos e material biológico de humanos isolados em episódios de toxinfecções alimentares e 28 de materiais de origem avícola. Foram fagotipadas 111 amostras sendo 57,7% (64/111) do fagotipo 4, 32,4% (36/111) fagotipo 4a, 3,6% (4/111) fagotipo 6a e 0,9% (1/111) fagotipo 7, enquanto 5,4% (6/111) não foram fagotipáveis (RDNC, reagent do not conform). Para a RAPD/PCR foram utilizados 238 isolados de SE. Destes, 91,8% (217/238) foram enquadrados no padrão A e 21 isolados (8,8%) foram diferenciados em quatro padrões e sete subtipos com o primer 1254 e em quatro padrões e dez subtipos com o primer OPB 17. A facilidade de execução da RAPD/PCR, após padronizada, habilita a sua implantação em uma rotina laboratorial, auxiliando na monitoria dos isolados de SE e, conseqüentemente, contribuindo para a elaboração de programas efetivos de controle e prevenção de S. Enteritidis.

Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Enteritidis isolates

In order to study the epidemiology of Salmonella Enteritidis outbreaks and determine the source of contamination so that a recurrence can be avoided, detailed characterization is necessary. Thus, the purpose of this study was to verify whether rep-PCR was able to discriminate among Salmonella Enteritidis isolates. Phage typing, detection of virulence genes and antimicrobial resistance testing were also associated to rep-PCR results. One hundred and two S. Enteritidis isolates from broiler carcasses, food, human, pigs, poultry-related samples, and nine isolates from other countries were genotypically typed by REP-PCR, ERIC-PCR and BOX-PCR, collectively called rep-PCR. Phage typing, detection of virulence genes and antimicrobial resistance testing were also performed. Only three fingerprinting profiles were obtained with each rep-PCR method, with the majority of isolates belonging to the same profile. No relationship was observed between genotypic profile and year, place of isolation or source of infection. However, the less frequent rep-PCR profiles showed single antimicrobial resistance patterns. Although few strains isolated from swine were analyzed, different antimicrobial resistance patterns were observed. Furthermore, phage type 4 was not found in swine isolates. rep-PCR showed a lower discriminatory power as compared with antimicrobial resistance and phage typing, but the combination of genotypic and phenotypic methods was more discriminatory than any method alone, resulting in 48 different types.

Uma caracterização detalhada de Salmonella Enteritidis é necessária para que possa ser desenvolvido o estudo da epidemiologia dos surtos causados por este organismo, bem como a determinação da fonte de contaminação, evitando que ocorram novos surtos. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar se a rep-PCR era capaz de diferenciar isolados de S. Enteritidis. A fagotipagem, a detecção de genes de virulência e a determinação de resistência antimicrobiana foram associadas aos resultados da rep-PCR. Cento e duas S. Enteritidis isoladas de carcaças de frango, alimentos prontos para consumo, humanos suínos, amostras relacionadas a aves, e nove isolados de outros países foram genotipicamente tipados por REP-PCR, ERIC-PCR e BOX-PCR, juntamente chamados de rep-PCR. A fagotipagem, a detecção de genes de virulência e a determinação de resistência antimicrobiana também foram realizadas. Somente três padrões de fingerprinting foram obtidos com cada método de rep-PCR, sendo que a maioria dos isolados pertenceu ao mesmo perfil. Nenhuma relação foi observada entre o perfil genotípico e o ano, o local de isolamento e a fonte de infecção. Entretanto, os perfis menos freqüentes de rep-PCR apresentaram padrões de resistência antimicrobiana únicos. Embora poucas amostras de suínos tenham sido analisadas, diferentes padrões de resistência antimicrobiana foram observados. Além disso, o fagotipo 4 não foi encontrado em isolados de suínos. A rep-PCR apresentou um menor poder discriminatório quando comparada com a resistência antimicrobiana e com a fagotipagem, mas a combinação dos métodos genotípicos e fenotípicos foi mais discriminatória do que qualquer método isolado, resultando em 48 tipos diferentes.

Phage typing and Multidrug resistance profile in S. Typhimurium isolated from different sources in Brazil from 1999 to 2004

Salmonella Typhimurium has become a widespread cause of salmonellosis among humans and animals worldwide. In Brazil, Salmonella Typhimurium (STM) is one of the most prevalent serovars isolated from food for human consumption. The uncontrolled sale and use of antimicrobials in agriculture and for treating human patients contributes to increase multidrug resistance of this serovar. In the present study, a total of 278 STM isolates from different sources and regions of Brazil over the period 1999 to 2004 were phage typed and analyzed for their antimicrobial resistance profile at Laboratory of Enterobacteria, Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ. The main STM phage types isolated were DT 193 (64.3%), DT 19 (17.4%) and DT 18 (4%). Others phage types as DT 10 (2%), DT 27 (3.24%), DT 13 (0.36%), DT 22 (0.36%), DT 28 (0.36%), DT 29 (0.36%) and DT 149 (0.36%) were obtained in low percentages. A total of 54% STM strains were resistant to three or more antimicrobial classes, while no resistance to third generation cephalosporin or ciprofloxacin was identified in these strains. Those results show the STM phage types circulating among animals, food for human consumption and humans in Brazil as well as the increasing of multidrug resistance. The surveillance of STM strains based on phage typing and antimicrobial resistance profile are useful for detecting outbreaks, identifying sources of infection and implementing prevention and control measures.

Salmonella Typhimurium é considerada uma das principais bactérias causadoras de salmonelose nos animais e no homem em todo o mundo. No Brasil, Salmonella Typhimurium é um dos mais prevalentes sorovares isolados de alimentos para consumo humano. O uso indiscriminado de antibióticos em produtos agrícolas e no tratamento de pacientes humanos tem contribuído para aumentar a multirresistência desse sorovar a diversos antimicrobianos. No presente estudo, 278 cepas de STM foram selecionadas de diferentes fontes e regiões do Brasil, no período de 1999 a 2004 e realizadas a fagotipagem e análise do perfil de resistência antimicrobiana no Laboratório de Enterobactérias, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ. Os principais fagotipos isolados foram DT 193 (64,3%), DT 19 (17,4%) e DT 18 (4%). Os fagotipos DT 10 (2%), DT 27 (3,24%), DT 13 (0,36%), DT 22 (0,36%), DT 28 (0,36%), DT 29 (0,36%) e DT 149 (0,36%) foram isolados em menores percentuais. Um total de 54% das cepas de STM foi resistente a três ou mais classes de antimicrobianos e não foi observada resistência a cefalosporinas de terceira geração ou ciprofloxacina. Esses resultados indicam os principais lisotipos de Salmonella Typhimurium circulantes entre os animais, alimentos de consumo humano e seres humanos no Brasil, bem como o aumento da multirresistência antimicrobiana. O monitoramento de cepas de Salmonella Typhimurium baseado na fagotipagem e no padrão de resistência antimicrobiana são ferramentas úteis para detectar surtos, identificar a fonte de infecção e implementar programas de prevenção e controle de salmonelose.

Salmonella Hadar phage types isolated from different sources of foodchain in Brazil

The gastroenteritis incidence caused by Salmonella Hadar has increased over the last decades worldwide. The uncontrolled use of antimicrobials for treating human patients and veterinary field contributes to increase the multidrug resistance of this serovar. In the present investigation, a total of 179 S. Hadar isolates from different sources of foodchain in Brazil were phage typed and analyzed for their antimicrobial resistance profile. The main S. Hadar phage types isolated were PT 38, PT 39, PT 40, PT 11, PT 34, PT 1 and PT 22. Others phage types as PT 13, PT 19, PT 21, PT 23, PT 31, PT 33 and PT 37 were obtained in low percentages. A total of 35,7% S. Hadar strains were resistant to two or more antimicrobials drugs. Furthermore, no resistance to third generation cephalosporin or ciprofloxacin was identified in these strains. Those results appoint to S. Hadar phage types circulating among animals, food and humans, as well as the increasing of multidrug resistance. The surveillance and monitoring of S. Hadar strains based on phage typing and antimicrobial resistance profile are useful for detecting outbreaks, identifying sources of infection and implementing prevention and control measures of salmonellosis.

A incidência de gastrenterite causada por Salmonella Hadar tem aumentado ao longo dos anos em todo o mundo. O uso indiscriminado de antimicrobianos na clínica humana e veterinária tem contribuído para o aumento da multiresistência deste sorovar. No presente estudo, 179 cepas de S. Hadar isoladas de diferentes fontes da cadeia alimentar no Brasil foram fagotipadas e analisadas quanto ao perfil de resistência antimicrobiana. Os principais fagotipos de S. Hadar isolados foram PT 38, PT 39, PT 40, PT 11, PT 34, PT 1 e PT 22. Outros fagotipos como PT 13, PT 19, PT 21, PT 23, PT 31, PT 33 e PT 37 foram obtidos em menores percentagens. Um total de 35,7% das cepas avaliadas foi resistente a dois ou mais antimicrobianos. Por outro lado, não foi observada resistência a cefalosporinas de terceira geração ou ciprofloxacina. Esses resultados apontam para a circulação de fagotipos de S. Hadar entre animais, alimentos e seres humanos, bem como o aumento da multiresistência antimicrobiana. O monitoramento de cepas de S. Hadar baseado na fagotipagem e no padrão de resistência aos antimicrobianos são ferramentas úteis na detecção de surtos, identificação das fontes de infecção, além de auxiliar na implantação de programas de controle e prevenção de salmoneloses.

Salmonella spp. in raw broiler parts: occurrence, antimicrobial resistance profile and phage typing of the Salmonella Enteritidis isolates

The present study was carried out to evaluate the occurrence of Salmonellae in raw broiler parts and to determine the antimicrobial resistance profile of the isolated strains. Twenty-four (39.3%) broiler parts samples were positive for Salmonella and twenty-five Salmonella strains were isolated, since two different serovars were detected in one single positive sample. Salmonella Enteritidis was the most prevalent serovar. Among Salmonella Enteritidis isolates, 95.2% belonged to Phage Type 4 (PT4) (20/21) and 4.8% to PT7 (1/21). Twenty-two (88%) strains of Salmonella were resistant to at least one antimicrobial agent, generating eight different resistance patterns. The S. Typhimurium (n: 1) and S. Hadar (n: 3) isolates presented multiple resistance. Three S. Enteritidis isolates were susceptible to all antimicrobials tested, two were resistant only to tetracycline. The high prevalence of Salmonella in the broiler parts strenghtens the importance of the use of good manufacturing practices (GMP), and HACCP. The results also emphasize the need for the responsible use of antimicrobials in animal production.

Este trabalho foi conduzido para avaliar a ocorrência de Salmonella em cortes de frango e para determinar o perfil de resistência antimicrobiana das cepas isoladas. Vinte e quatro (39,3%) cortes de frango foram positivas para Salmonella, tendo sido isoladas vinte e cinco cepas de Salmonella, uma vez que em uma amostra isolaram-se dois sorovares. Salmonella Enteritidis foi o sorovar prevalente. Entre as Salmonella Enteritidis isoladas, 95,2% pertencem ao Fagotipo 4 (PT4) (20/21) e 4,8% ao PT7 (1/21). Vinte e duas (88%) cepas de Salmonella foram resistentes a pelo menos um agente antimicrobiano e oito diferentes padrões de resistência foram observados. S. Typhimurium (n:1) e S. Hadar (n: 3), apresentaram múltipla resistência. Três cepas de S. Enteritidis foram sensíveis a todos os antimicrobianos e duas resistentes somente a tetraciclina. A elevada ocorrência de Salmonella nos cortes de frango utilizados no presente estudo reforça a importância das normas de boas práticas de fabricação, bem como dos controles de perigos e pontos críticos de controle. No tocante aos níveis de resistência a antimicrobianos, os resultados enfatizam a necessidade do uso responsável dos mesmos na produção animal.

Antimicrobial resistance profile, phage typing and molecular characterization of Salmonella Enteritidis strains from poultry origin / Perfil de resistência a antimicrobianos, fagotipagem e caracterização molecular de cepas de Salmonella Enteritidis de origem avícola

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (SE) is currently responsible for significant losses in the poultry industry with consequences on public health. In the present study, 38 SE isolates from biological material of chicken breeders were characterized using phage typing, antimicrobial resistance profile and pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The phage type (PT) 7 and 9 were predominant and 26.3% of the isolates were resistance to nalidixic acid (NAL). The phage typing and analysis of antimicrobial resistance profile showed high discriminatory power (0.85). The PFGE profile of 13 strains with XbaI and SpeI discriminated the SE phage types, as well characterized strains from the same serovar. The results showed the importance to associate different methods for the characterization of SE and suggest that poultry products may have been source of human salmonellosis in the Parana State during the period of study.

Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Enteritidis (SE) é responsável por prejuízos significativos à avicultura, com conseqüências importantes para saúde pública. No presente estudo foi realizada a caracterização de 38 isolados de SE provenientes de material biológico de reprodutoras destinadas à produção de frangos de corte através de fagotipagem, perfil de resistência antimicrobiana e de eletrofose de campo pulsado (PFGE). Os fagotipos (PT) predominantes foram PT7 e PT9 e 26,3% dos isolados apresentaram resistência ao ácido nalidíxico (NAL). A fagotipagem e a análise do perfil de resistência antimicrobiana juntos mostraram elevado poder discriminatório (0,85). Os perfis de PFGE de 13 cepas, com as endonucleases XbaI e SpeI permitiram discriminar os fagotipos de SE, bem como associar perfis de um mesmo fagotipo. Os resultados mostram a importância da associação de métodos para a caracterização de SE e sugerem que produtos da avicultura de corte podem ser fonte de salmonelose humana.

Antimicrobial resistance profile, phage typing and molecular characterization of Salmonella Enteritidis strains from poultry origin / Perfil de resistência a antimicrobianos, fagotipagem e caracterização molecular de cepas de Salmonella Enteritidis de origem avícola

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (SE) is currently responsible for significant losses in the poultry industry with consequences on public health. In the present study, 38 SE isolates from biological material of chicken breeders were characterized using phage typing, antimicrobial resistance profile and pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The phage type (PT) 7 and 9 were predominant and 26.3% of the isolates were resistance to nalidixic acid (NAL). The phage typing and analysis of antimicrobial resistance profile showed high discriminatory power (0.85). The PFGE profile of 13 strains with XbaI and SpeI discriminated the SE phage types, as well characterized strains from the same serovar. The results showed the importance to associate different methods for the characterization of SE and suggest that poultry products may have been source of human salmonellosis in the Parana State during the period of study. 

Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Enteritidis (SE) é responsável por prejuízos significativos à avicultura, com conseqüências importantes para saúde pública. No presente estudo foi realizada a caracterização de 38 isolados de SE provenientes de material biológico de reprodutoras destinadas à produção de frangos de corte através de fagotipagem, perfil de resistência antimicrobiana e de eletrofose de campo pulsado (PFGE). Os fagotipos (PT) predominantes foram PT7 e PT9 e 26,3% dos isolados apresentaram resistência ao ácido nalidíxico (NAL). A fagotipagem e a análise do perfil de resistência antimicrobiana juntos mostraram elevado poder discriminatório (0,85). Os perfis de PFGE de 13 cepas, com as endonucleases XbaI e SpeI permitiram discriminar os fagotipos de SE, bem como associar perfis de um mesmo fagotipo. Os resultados mostram a importância da associação de métodos para a caracterização de SE e sugerem que produtos da avicultura de corte podem ser fonte de salmonelose humana.

Phage typing strains of Staphylococcus aureus resistant to antibiotics, isolated from milk / Fagotipagem de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a antibióticos, isoladas de leite

In this study, 201 strains of S. aureus were isolated from crude milk and submitted to antibiotic resistance by the disc diffusion method using impregnated paper discs with the following antibiotics: amikacin, ampicillin, cephalotin, cephoxitin, chloramphenicol, clindamycin, oxacylin, penicillin, tetracycline, tobramycin and vancomycin. With the exception of 88 (43.8%), 90 (44.8%), 24 (11.9%) e 40 (19.9%) resistant strains to penicillin, ampicillin, chloramphenicol and tetracycline, respectively, it was verified that most of the 201 strains (95% or more) showed sensitivity to the others tested antibiotics. The strains resistant to these four antibiotics were phage-typified with the basic international set of phages for S. aureus of human and bovine origin and showed predominant sensitivity to the phage of the groups III and III/No Classified from the human basic set and to the phage groups III, IV and to the association III/IV from the bovine set.

A partir de amostras de leite cru foram isoladas 201 cepas de S. aureus, as quais foram submetidas a provas de resistência a antibióticos pelo método dos discos impregnados com os seguintes antibacterianos: amicacina, ampicilina, cefalotina, cefoxitina, cloranfenicol, clindamicina, oxacilina, penicilina, tetraciclina, tobramicina e vancomicina. Com exceção de 88 (43,8%), 90 (44,8%), 24 (11,9%) e 40 (19,9%) cepas resistentes à penicilina, ampicilina, cloranfenicol e tetraciclina, respectivamente, a maioria das 201 cepas (95% ou mais) foi sensível aos antibióticos utilizados. As cepas resistentes a estes quatro antibióticos foram fagotipadas, empregando-se os Conjuntos Básicos Internacionais de bacteriófagos para cepas de origem humana e bovina, verificando-se que houve predomínio de cepas sensíveis a fagos dos grupos III e III/NC do conjunto básico humano e a fagos dos grupos III, IV e da associação III/IV do conjunto bovino.

Staphylococcus aureus in raw milk. Bacterial counts, enterotoxin production and phage-typing of the isolates / Staphylococcus aureus em leite cru. I. Contagem, verificação da enterotoxigenicidade e fagotipagem das cepas isoladas

The presence of S. aureus and its enterotoxin was investigated in 100 samples of raw milk, collected at the reception platform of a milk pasteurization plant located in Pirassununga, São Paulo, Brazil. All samples were submetted to Baird-Parker agar and positive samples were counted and tested for catalase, fermentation and oxidation of glucose, coagulase in rabbit plasma and for thermonuclease activity. A total of 201 S. aureus isolates were isolated from 50/100 (50.0%) of the samples studied, the counts varied from 30 to 110.000 bacteria per ml of milk. The enteretoxigenic capacity of the isolates was verified according to the celophane sac culture method and the detection of the enterotoxins A, B, C, D and E was by means of the double gel immunodifusion slide test, using the supernatant fluid extract obtained from the staphylococcal growths. Production of enterotoxin was demonstrated in one strain isolated from a sample that showed a count of 860 bacteria/ml and its enterotoxin belonged to type B. The enterotoxigenic strain was susceptible to the phage 53, a phage type common to human and bovine set.

Foram analisadas 100 amostras de leite cru, obtidas na plataforma de recepção da Usina de Pasteurização do Centro Intraunidade de Zootecnia e Indústrias Pecuárias (CIZIP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, localizado no Município de Pirassununga, SP. A partir de cada amostra realizou-se a contagem de S. aureus, em ágar Baird-Parker a 37 0C por 24-48 horas, sendo as cepas isoladas identificadas através da verificação microscópica da morfologia e das provas de produção de catalase, de fermentação/oxidação de glicose e da produção de coagulase e termonuclease. Das amostras analisadas, 50 revelaram-se positivas para S. aureus, com contagens que variaram de 30 a 110.000/ml de leite. Das amostras positivas foram isoladas 201 cepas, as quais foram submetidas e verificação da capacidade produtora de enterotoxina estafilococica, empregando-se um método de cultura em saco de celofane. Para a constatação da presença de enterotoxina nos extratos obtidos, usou-se o processo da dupla imunodifusão em gel, em laminas. Do total de cepas examinado, apenas uma, isolada de una amostra com 860 S. aureus por ml de leite, mostrou-se produtora de enterotoxina do tipo B. A fagotipagem esta cepa foi lisada unicamente pelo fago 53, pertencente ao Grupo III do Conjunto Básico Internacional Humano e ao Grupo III do Conjunto Básico Bovino.

Staphylococcus aureus in raw milk. Bacterial counts, enterotoxin production and phage-typing of the isolates / Staphylococcus aureus em leite cru. I. Contagem, verificação da enterotoxigenicidade e fagotipagem das cepas isoladas

The presence of S. aureus and its enterotoxin was investigated in 100 samples of raw milk, collected at the reception platform of a milk pasteurization plant located in Pirassununga, São Paulo, Brazil. All samples were submetted to Baird-Parker agar and positive samples were counted and tested for catalase, fermentation and oxidation of glucose, coagulase in rabbit plasma and for thermonuclease activity. A total of 201 S. aureus isolates were isolated from 50/100 (50.0%) of the samples studied, the counts varied from 30 to 110.000 bacteria per ml of milk. The enteretoxigenic capacity of the isolates was verified according to the celophane sac culture method and the detection of the enterotoxins A, B, C, D and E was by means of the double gel immunodifusion slide test, using the supernatant fluid extract obtained from the staphylococcal growths. Production of enterotoxin was demonstrated in one strain isolated from a sample that showed a count of 860 bacteria/ml and its enterotoxin belonged to type B. The enterotoxigenic strain was susceptible to the phage 53, a phage type common to human and bovine set.

Foram analisadas 100 amostras de leite cru, obtidas na plataforma de recepção da Usina de Pasteurização do Centro Intraunidade de Zootecnia e Indústrias Pecuárias (CIZIP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, localizado no Município de Pirassununga, SP. A partir de cada amostra realizou-se a contagem de S. aureus, em ágar Baird-Parker a 37 0C por 24-48 horas, sendo as cepas isoladas identificadas através da verificação microscópica da morfologia e das provas de produção de catalase, de fermentação/oxidação de glicose e da produção de coagulase e termonuclease. Das amostras analisadas, 50 revelaram-se positivas para S. aureus, com contagens que variaram de 30 a 110.000/ml de leite. Das amostras positivas foram isoladas 201 cepas, as quais foram submetidas e verificação da capacidade produtora de enterotoxina estafilococica, empregando-se um método de cultura em saco de celofane. Para a constatação da presença de enterotoxina nos extratos obtidos, usou-se o processo da dupla imunodifusão em gel, em laminas. Do total de cepas examinado, apenas uma, isolada de una amostra com 860 S. aureus por ml de leite, mostrou-se produtora de enterotoxina do tipo B. A fagotipagem esta cepa foi lisada unicamente pelo fago 53, pertencente ao Grupo III do Conjunto Básico Internacional Humano e ao Grupo III do Conjunto Básico Bovino.

Identificação de Salmonella enteritidis fagotipo 6A em amostras de alimentos, humanos e materiais de origem avícola / Identification of Salmonella enteritidis fagotipo 6A in samples of sustenances, human and materials of origin poultry

A Salmonella Enteritidis (SE) é um patógeno de importância destacada como causa de toxinfecções alimentares em humanos e prejuízos ao setor produtivo, além de ser um microrganismo de ampla disseminação no ambiente. A caracterização precisa do agente é imprescindível para o sucesso de investigações epidemiológicas e implantação de medidas de prevenção e controle do mesmo. Neste trabalho foram selecionados 238 isolados de SE, dos quais 104 oriundos de carcaças de frango, 106 de alimentos e material biológico de humanos envolvidos em episódios de toxinfecções alimentares e 28 de diferentes materiais de origem avícola. Dentre estes isolados, 111 foram submetidos a fagotipagem. O PT 6ª representou 3,6 por cento (4/111) dos fagotipos de SE deste trabalho, no qual foram identificados também os fagotipos 4 (57,7 por cento; 64/111), 4ª (32,4 por cento; 36/111), 7 (0,90 por cento; 1/111) e RDNC (reagent do not conform 5,4 por cento; 6/111). A identificação do PT 6ª em dois isolados de origem aviária (swab de arrasto e figado de pinto de um dia) e em dois casos de toxinfecção alimentar em humanos (maionese e caso avulso - fezes) indica que este fagotipo poderia estar desenvolvendo uma estratégia semelhante à atribuída ao PT4, ou seja, adaptar-se a um determinado ambiente e apresentar um potencial diferenciado de patogenicidade para humanos. Verificou-se que a fagotipagem é uma ferramenta útil para análise epidemiológica de isolados de SE, estando habilitada para monitorar a manutenção de determinados fagotipos, bem como o aparecimento de novos fagotipos com potencial de patogenicidade.(AU)

Salmonella Enteritidis (SE) is an important pathogen, causing both food poisoning outbreaks in humans and economic losses to the poultry industry, being also widely spread in the environment. A precise characterization of this agent is then utterly important in allowing successful epidemiological investigations and also the establishment of preventive and control measures for reducing its occurrence. ln this work, 238 SE isolates were selected, from which 104 were isolated from broiler carcasses, 106 from food samples and human biological materials involved in food poisoning outbreaks and 28 from different poultry materials. Among these, 111 isolates wen selected to phage typing. The PT 6a represented 3,6% (4/111) while 57,7% (64/ 111) corresponded to phage type (PI); 32,4% (36/111) to PT 4,0,9% (l/111)k PT 7 and 5,4% (6/111) of the samples were not typable (RDNC, reagent do not conform). The PT 6a identification in isolates from poultry materials (drag swaband one day chick - lioer) and in food poisoning outbreaks (mayonnaise and avulse case - stool cultures) shows that this phage type could be adapted in a given environment and has a pathogenic potential to humans. It could be verified that phage typing is an useful tool in analysing epidemiologically SE isolates, being able to monitor the presence of some phage types, while detecting the rise of other new, potentially pathogenic ones. (AU)