In vitro toxicity of Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa on bovine embryos / Toxicidade in vitro da Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa em embriões bovinos

Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa, a vine plant found in Brazil, has been correlated to outbreaks of poisoning in cattle and buffaloes, generating economic losses related to the death due to heart failure, miscarriage, abortion, stillbirth, and neonatal mortality. The aim of this study was to examine the embryotoxic potential of the aqueous plant extract on in vitro bovine embryos. In vitro study was performed in five replicates of bovine embryo culture assigned in two groups: control, in vitro embryo culture medium without the aqueous plant extract; treated group, with addition of 2.7mg/mL of aqueous plant extract (10%) to the embryo culture on the sixth day of culture. Cleavage rate was evaluated at day 2 of the cell culture. Viability, hatchability and underdevelopment of blastocysts on the seventh, eighth, and ninth days (D7, D8, and D9, respectively) of culture were assessed under stereoscopic microscope. On day 7, blastocysts were submitted to TUNEL assay to determine apoptotic index. In vitro exposure of bovine embryos to of N. multiglandulosa resulted in reduced embryo development and survival, evaluated by dark cytoplasm indicating poor morphology and poor quality with marked reduction of hatchability. We observed a significant reduction of blastocyst production/number of cleaved embryos (60.6% vs 41.5%); reduction of blastocysts production/total number of matured bovine oocytes (35.1% vs 21.3%); and embryonic hatching rates (38.0% vs 10.0%). However, no effects were observed on the apoptotic rate. In conclusion, aqueous extract of N. multiglandulosa leaves reduces bovine embryo viability in vitro, suggesting possible detrimental effects on embryo development.(AU)

Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa, uma videira encontrada no Brasil, tem sido correlacionada a surtos de intoxicações em bovinos e búfalos, gerando perdas econômicas relacionadas à morte por insuficiência cardíaca, aborto, natimorto e mortalidade neonatal. O objetivo deste estudo foi examinar o potencial embriotóxico do extrato vegetal aquoso em embriões bovinos in vitro. O estudo in vitro foi realizado em cinco repetições de cultura de embriões bovinos distribuídos em dois grupos: controle, meio de cultura de embriões in vitro sem o extrato aquoso da planta; grupo tratado, com adição de 2,7mg / mL de extrato vegetal aquoso (10%) à cultura do embrião no sexto dia de cultivo. A taxa de clivagem foi avaliada no dia 2 da cultura de células. Viabilidade, eclodibilidade e subdesenvolvimento de blastocistos no sétimo, oitavo e nono dia (D7, D8 e D9, respectivamente) de cultura foram avaliados em microscópio estereoscópico. No dia 7, os blastocistos foram submetidos ao ensaio TUNEL para determinar o índice apoptótico. Observamos redução significativa da produção de blastocisto / número de embriões clivados (60,6% vs 41,5%); redução da produção de blastocistos / número total de oócitos bovinos maturados (35,1% vs 21,3%); e taxas de eclosão embrionária (38,0% vs 10,0%). No entanto, nenhum efeito foi observado na taxa de apoptose. Em conclusão, o extrato aquoso das folhas de N. multiglandulosa reduz a viabilidade do embrião bovino in vitro, sugerindo possíveis efeitos prejudiciais no desenvolvimento embrionário.(AU)

Lentivirus vectors fail to deliver transgenes into bovine zygotes after co-incubation with sperm during in vitro fertilization / [Lentivírus falham na entrega de transgenes em zigotos bovinos após coincubação com espermatozoide, durante fertilização in vitro]

As vantagens dos animais transgênicos têm sido demonstradas em diferentes aplicações, entretanto muitas metodologias usadas para gerar animais geneticamente modificados (GM) apresentam baixas taxas de eficiência. O objetivo deste estudo foi avaliar a entrega dos vetores lentivirais (VLs) em zigotos durante a fertilização in vitro (FIV), para gerar embriões GM, com o gene da proteína verde fluorescente (GFP) ou do fator IX de coagulação humana (FIX). Vetores lentivirais com os genes GFP (pLGW-GFP-LV) ou FIX (pLWE2-FIX-LV) foram utilizados na FIV ou na cultura de embriões in vitro (CIV). A coincubação de pLWE2-FIX-LV com espermatozoides e complexos oócitos-células do cumulus (COCs) durante a FIV diminuiu (P<0,05) as taxas de clivagem e de blastocistos, enquanto com pLGW-GFP-LV diminuiu (P<0,05) a taxa de blastocisto quando se comparou ao controle sem VL. A coincubação de pLWE2-FIX-LV e pLGW-GFP-LV com presumíveis zigotos durante a CIV não afetou (P>0,05) o desenvolvimento embrionário. A expressão da proteína GFP não foi detectada em embriões após a coincubação de FIV ou CIV, embora as células do cumulus expressassem a proteína até o dia oito de cultivo in vitro. Reações em cadeia da polimerase (PCR) não detectaram os genes GFP ou FIX em embriões, mas ambos foram detectados em células do cumulus. Assim, a coincubação de VL com espermatozoide bovino e COCs não é eficaz para produzir embriões geneticamente modificados por meio de FIV.(AU)

Maturação in vitro de oócitos de cutias (Dasyprocta prymnolopha, Wagler 1831) seguida de fertilização in vitro e ativação partenogenética / In vitro maturation of agoutis (Dasyprocta prymnolopha) oocytes followed by in vitro fertilization and parthenogenetic activation

O objetivo foi avaliar protocolos de maturação in vitro (MIV) para oócitos de cutias, seguida de fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AP). Os oócitos imaturos (CCOs) foram obtidos por fatiamento do ovário, após OSH, e submetidos a três grupos: MAT - 16 (16 horas de maturação), MAT - 20 (20 horas de maturação) e MAT - 24 (24 horas de maturação), em incubadora de cultivo a 38,8°C, com atmosfera de 5% de CO2 e 95% de umidade relativa. A maturação foi analisada pela presença do primeiro corpúsculo polar. Em seguida, os CCOs maduros foram submetidos à FIV, com período de coincubação dos CCOs e dos espermatozoides de 15h, a 38,8ºC e 5% de CO2, e AP com ionomicina. Os grupos de MIV foram analisados utilizando-se o teste qui-quadrado e, nos experimentos de FIV e AP, foram analisadas a taxa de clivagem e a proporção de desenvolvimento embrionário. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SAS. Houve diferença significativa entre os grupos de maturação, tendo os grupos MAT - 20 e MAT - 24 apresentado maior porcentagem de oócitos maturados in vitro. As taxas de clivagem e de desenvolvimento embrionário foram de 8,6% e 2,9%, respectivamente, na FIV, e de 63,6% e 15,1%, na AP. Entretanto, nos dois casos, o embrião não passou do estágio de mórula.(AU)

The objective was to evaluate IVM protocols for agouti oocytes, followed by in vitro fertilization (IVF) and parthenogenetic activation (PA). The immature oocytes (CCOs) were obtained by slicing the ovary after OSH and submitted to three groups: MAT - 16 (16 hours maturation), MAT - 20 (20 hours maturation) and MAT - (24 hours maturation), in a culture incubator at 38.8°C, with an atmosphere of 5% CO2 and 95% relative humidity. The maturation was analyzed by the presence of the first polar corpuscle. Then, mature CCOs were submitted to IVF, with co-incubation period of CCOs and spermatozoa from 15h to 38.8°C and 5% of CO2, and PA with inomycin. The IVM groups were analyzed using the chi-square test and in the FIV and PA experiment the rate of cleavage and the rate of embryonic development were analyzed. Statistical analysis was performed using the SAS program. There was a significant difference between the maturation groups, and the MAT - 20 and MAT - 24 groups showed a higher percentage of matured oocytes in vitro. The rates of cleavage and embryonic development were 8.6% and 2.9%, respectively in FIV and 63.6% and 15.1% in PA. However, in both cases the embryo did not pass beyond the morula stage.(AU)

Maturação in vitro de oócitos de cutias (Dasyprocta prymnolopha, Wagler 1831) seguida de fertilização in vitro e ativação partenogenética / In vitro maturation of agoutis (Dasyprocta prymnolopha) oocytes followed by in vitro fertilization and parthenogenetic activation

O objetivo foi avaliar protocolos de maturação in vitro (MIV) para oócitos de cutias, seguida de fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AP). Os oócitos imaturos (CCOs) foram obtidos por fatiamento do ovário, após OSH, e submetidos a três grupos: MAT - 16 (16 horas de maturação), MAT - 20 (20 horas de maturação) e MAT - 24 (24 horas de maturação), em incubadora de cultivo a 38,8°C, com atmosfera de 5% de CO2 e 95% de umidade relativa. A maturação foi analisada pela presença do primeiro corpúsculo polar. Em seguida, os CCOs maduros foram submetidos à FIV, com período de coincubação dos CCOs e dos espermatozoides de 15h, a 38,8ºC e 5% de CO2, e AP com ionomicina. Os grupos de MIV foram analisados utilizando-se o teste qui-quadrado e, nos experimentos de FIV e AP, foram analisadas a taxa de clivagem e a proporção de desenvolvimento embrionário. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SAS. Houve diferença significativa entre os grupos de maturação, tendo os grupos MAT - 20 e MAT - 24 apresentado maior porcentagem de oócitos maturados in vitro. As taxas de clivagem e de desenvolvimento embrionário foram de 8,6% e 2,9%, respectivamente, na FIV, e de 63,6% e 15,1%, na AP. Entretanto, nos dois casos, o embrião não passou do estágio de mórula.(AU)

The objective was to evaluate IVM protocols for agouti oocytes, followed by in vitro fertilization (IVF) and parthenogenetic activation (PA). The immature oocytes (CCOs) were obtained by slicing the ovary after OSH and submitted to three groups: MAT - 16 (16 hours maturation), MAT - 20 (20 hours maturation) and MAT - (24 hours maturation), in a culture incubator at 38.8°C, with an atmosphere of 5% CO2 and 95% relative humidity. The maturation was analyzed by the presence of the first polar corpuscle. Then, mature CCOs were submitted to IVF, with co-incubation period of CCOs and spermatozoa from 15h to 38.8°C and 5% of CO2, and PA with inomycin. The IVM groups were analyzed using the chi-square test and in the FIV and PA experiment the rate of cleavage and the rate of embryonic development were analyzed. Statistical analysis was performed using the SAS program. There was a significant difference between the maturation groups, and the MAT - 20 and MAT - 24 groups showed a higher percentage of matured oocytes in vitro. The rates of cleavage and embryonic development were 8.6% and 2.9%, respectively in FIV and 63.6% and 15.1% in PA. However, in both cases the embryo did not pass beyond the morula stage.(AU)

In vitro embryo production in Nelore cows supplemented with calcium salts of long-chain fatty acid / Produção de embriões in vitro em vacas Nelore suplementadas com sais de cálcio e ácidos graxos de cadeia longa

This study was performed to evaluate the effects of supplementation of lactating Nelore cows with calcium salts of long-chain fatty acids (Ca-LCFA) of soybean oil on in vitro oocytes competency, cleavage rate, embryo production rate, pregnancy rate, and sex ratio of transferred embryos. Fifteen multiparous Nelore cows grazed on a Tifton 85 pasture were allotted to two treatments: (1) supplement without fat inclusion (CONT, n = 6) and (2) supplement containing 47.2 g Ca-LCFA /kg (to provide an intake of 0.2 kg Ca-LCFA/day) based on dry matter (n = 9). Animals were subjected to 2.53 ± 1.35 rounds of consecutive ovum pick up at intervals of 27.65 ± 21.72 days. Oocytes were morphologically evaluated, selected, maturated, fertilized, and cultivated for embryo production in vitro and then transferred into recipients who had previously undergone an embryo transfer protocol at a fixed time. The number of aspirated oocytes, the proportion of viable oocytes, cleavage rate, embryo percentage, pregnancy rate, and sex ratio were not affected when Nelore cows were supplemented with Ca-LCFA of soybean oil compared with non-supplemented Nelore cows. In conclusion, our results suggest that feeding a supplement containing 47.2 g Ca-LCFA/kg (to provide an intake of 0.2 kg Ca-LCFA/day) to Nelore cows does not affect in vitro embryo production in lactating Nelore cows. However, further studies...

Este estudo foi realizado para avaliar os efeitos da suplementação de vacas Nelores em lactação com sais de cálcio de ácidos graxos de cadeia longa (Ca-SCACL) feitos com óleo de soja sobre a competência in vitro de oócitos, taxa de clivagem, taxa de produção de embriões, taxa de prenhez e proporção de sexo de embriões transferidos. Foram utilizadas 15 vacas Nelore (lactantes, multíparas e mantidas em pastagem de Tifton 85) distribuídas em dois tratamentos: (1) suplemento sem inclusão de lipídios (CONT, n = 6) e (2) suplemento contendo 47,2 g Ca-SCACL/kg (para proporcionar uma ingestão de 0,2 kg Ca-SCACL/ dia) com base na matéria seca (n = 9). Os animais foram submetidos a 2,53 ± 1,35 rodadas consecutivas de aspiração folicular a intervalos de 27,65 ± 21,72 dias. Os oócitos foram avaliados morfologicamente, selecionados, maturados, fertilizados e cultivados para produção de embriões in vitro. Em seguida, os embriões foram transferidos para receptoras previamente submetidas a um protocolo de transferência de embriões em tempo fixo. O número de oócitos aspirados, a proporção de oócitos viáveis, a taxa de clivagem, a porcentagem de embriões, a taxa de prenhez e a proporção de sexo de embriões não foram afetados quando as vacas Nelore foram suplementadas com Ca-SCACL de óleo de soja em comparação com as vacas Nelore não suplementadas. Em conclusão, nossos resultados sugerem que suplemento contendo 47,2 g de Ca-SCACL/kg (para fornecer uma ingestão de 0,2 kg de Ca-SCACL) não afeta a produção in vitro de embriões de vacas Nelore em lactação. No entanto, novos estudos utilizando doses mais altas de gordura na dieta poderiam ser úteis para determinar o seu potencial sobre produção embrionária in vitro.

In vitro embryo production in Nelore cows supplemented with calcium salts of long-chain fatty acid / Produção de embriões in vitro em vacas Nelore suplementadas com sais de cálcio e ácidos graxos de cadeia longa

This study was performed to evaluate the effects of supplementation of lactating Nelore cows with calcium salts of long-chain fatty acids (Ca-LCFA) of soybean oil on in vitro oocytes competency, cleavage rate, embryo production rate, pregnancy rate, and sex ratio of transferred embryos. Fifteen multiparous Nelore cows grazed on a Tifton 85 pasture were allotted to two treatments: (1) supplement without fat inclusion (CONT, n = 6) and (2) supplement containing 47.2 g Ca-LCFA /kg (to provide an intake of 0.2 kg Ca-LCFA/day) based on dry matter (n = 9). Animals were subjected to 2.53 ± 1.35 rounds of consecutive ovum pick up at intervals of 27.65 ± 21.72 days. Oocytes were morphologically evaluated, selected, maturated, fertilized, and cultivated for embryo production in vitro and then transferred into recipients who had previously undergone an embryo transfer protocol at a fixed time. The number of aspirated oocytes, the proportion of viable oocytes, cleavage rate, embryo percentage, pregnancy rate, and sex ratio were not affected when Nelore cows were supplemented with Ca-LCFA of soybean oil compared with non-supplemented Nelore cows. In conclusion, our results suggest that feeding a supplement containing 47.2 g Ca-LCFA/kg (to provide an intake of 0.2 kg Ca-LCFA/day) to Nelore cows does not affect in vitro embryo production in lactating Nelore cows. However, further studies...(AU)

Este estudo foi realizado para avaliar os efeitos da suplementação de vacas Nelores em lactação com sais de cálcio de ácidos graxos de cadeia longa (Ca-SCACL) feitos com óleo de soja sobre a competência in vitro de oócitos, taxa de clivagem, taxa de produção de embriões, taxa de prenhez e proporção de sexo de embriões transferidos. Foram utilizadas 15 vacas Nelore (lactantes, multíparas e mantidas em pastagem de Tifton 85) distribuídas em dois tratamentos: (1) suplemento sem inclusão de lipídios (CONT, n = 6) e (2) suplemento contendo 47,2 g Ca-SCACL/kg (para proporcionar uma ingestão de 0,2 kg Ca-SCACL/ dia) com base na matéria seca (n = 9). Os animais foram submetidos a 2,53 ± 1,35 rodadas consecutivas de aspiração folicular a intervalos de 27,65 ± 21,72 dias. Os oócitos foram avaliados morfologicamente, selecionados, maturados, fertilizados e cultivados para produção de embriões in vitro. Em seguida, os embriões foram transferidos para receptoras previamente submetidas a um protocolo de transferência de embriões em tempo fixo. O número de oócitos aspirados, a proporção de oócitos viáveis, a taxa de clivagem, a porcentagem de embriões, a taxa de prenhez e a proporção de sexo de embriões não foram afetados quando as vacas Nelore foram suplementadas com Ca-SCACL de óleo de soja em comparação com as vacas Nelore não suplementadas. Em conclusão, nossos resultados sugerem que suplemento contendo 47,2 g de Ca-SCACL/kg (para fornecer uma ingestão de 0,2 kg de Ca-SCACL) não afeta a produção in vitro de embriões de vacas Nelore em lactação. No entanto, novos estudos utilizando doses mais altas de gordura na dieta poderiam ser úteis para determinar o seu potencial sobre produção embrionária in vitro.(AU)

Correlation between insemination dose and bovine sperm traits on the in vitro embryo production outcomes / Correlação da dose inseminante e características do sêmen bovino no sucesso da produção in vitro de embriões

In the present study we aimed to test the best insemination dose for in vitro embryo production (IVEP) and to correlate sperm traits in bovine. In vitro matured oocytes were inseminated with three different sperm concentrations of the same bull: G1 (1*106), G2 (2*106) and G3 (4*106) sperm/mL. At 18 h post-insemination (hpi), presumptive zygotes [G1 (n=114), G2 (n=139) and G3 (n=136)] were stained to evaluate the pronuclei numbers, or continued to in vitro culture [G1 (n=102), G2 (n=111) and G3 (n=106)]. Sperm kinetics were analyzed using Computer-Assisted Semen Analysis (CASA). Sperm plasma membrane, acrosome integrity and mitochondrial activity were analyzed using fluorescent probes. In vitro fertilization (IVF) and IVEP data were compared using chi-square (P<0.05) and correlated with CASA and fluorescence data using Person Correlation (P<0.05). The IVF efficiency, cleavage and total blastocyst rates did not show any significant difference (P>0.05) among the groups. In G3, the polyspermy rate was the highest (7.4%; P<0.05) without difference (P>0.05) between G1 (0%) and G2 (0%). In G1, the early blastocyst rate was the highest (7.8%; P<0.05), without significant difference (P>0.05) between G2 (1.8%) and G3 (0.9%). The IVF efficiency and total blastocyst rates were positively correlated with curvilinear velocity (VCL) (r≃+1; P<0.05). We concluded that the reduction of insemination dose may negatively affect embryo development and VCL may be used as a parameter to improve the IVEP outcomes.

O objetivo deste estudo foi testar a melhor dose inseminante para a produção de embriões in vitro (IVEP) e sua correlação com as características espermáticas na espécie bovina. Oócitos maturados in vitro foram inseminados com três concentrações diferentes de espermatozoides de único touro: G1 (1*106), G2 (2*106) e G3 (4*106) espermatozoides/mL. Às 18h pós-inseminação (hpi), os presumíveis zigotos [G1 (114), G2 (139) e G3 (136)] foram corados para avaliar o número de pronúcleos, ou continuaram para o cultivo in vitro [G1 (102), G2 (111) e G3 (106)]. Os parâmetros da cinética espermática foram analisados usando o Computer-Assisted Semen Analysis (CASA). A integridade de membrana plasmática espermática, acrossomal e a atividade mitocondrial foram analisadas usando sondas fluorescentes. Os dados da fertilização in vitro (FIV) e IVEP foram comparadas com qui-quadrado (P=0,05) e correlacionados com dados de CASA e Fluorescência usando Correlação de Pearson (r=±1; P<0,05). A eficiência da FIV, taxas de clivagem e blastocisto total não mostraram diferença significativa (P>0,05) entre os grupos. Em G3, a taxa de polispermia foi a maior (7,4%; P<0,05), sem diferença (P>0,05) entre G1 (0%) e G2 (0%). Em G1, a taxa de blastocisto inicial foi a maior (7,8%; P<0,05), sem apresentar diferença significativa (P>0,05) com G2 (1,8%) e G3 (0,9%). A eficiência de FIV e a taxa de blastocisto total foram positivamente correlacionadas com velocidade curvilinear (VCL) (P<0,05). Concluímos que a dose inseminante reduzida pode negativamente afetar o desenvolvimento embrionário e VCL pode ser usada como parâmetro para melhorar os resultados da PEIV.

Avaliação dos efeitos da melatonina sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro e transferência nuclear de células somáticas / Evaluation of melatonin effects on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer

Na reprodução assistida, o estresse oxidativo pode provocar efeitos deletérios sobre as taxas de produção de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da suplementação com o antioxidante melatonina (MEL) sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro(FIV) e transferência nuclear de células somáticas (TNCS). Os resultados mostraram que a MEL (10-7 M) no meio de maturação ou de cultivo embrionário in vitro não afetou a taxa de clivagem ou de produção de blastocistos na FIV ou na TNCS, e também não afetou a prenhez, a taxa de nascimento ou o peso dos bezerros na TNCS. O tratamento das células doadoras de núcleo com MEL (10-9M) também não levou a um aumento na produção de embriões, prenhez ou taxa de nascimento na TNCS. Assim, conclui-se que a MEL não foi capaz de aumentar a eficiência da reprodução assistida bovina, nas condições experimentais utilizadas.(AU)

n assisted reproduction, oxidative stress can cause deleterious effects on embryo production rates. The aim of the present study was to evaluate the effect of melatonin supplementation (MEL) on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization (IVF) and somatic cell nuclear transfer (SCNT). The findings of this work demonstrated that melatonin enrichment (10-7 M) of the in vitro maturation (IVM) medium or in the embryo culture medium does not affect both cleavage and blastocyst rates in IVF or SCNT, and does not affect pregnancy, birth rate or weight calf in SCNT either. The treatment of nucleus donor cells with melatonin (10-9M) could not also improve embryo production, pregnancy or birth rate in SCNT. According to these work it is concluded that melatonin is not able toameliorate bovine assisted reproduction efficiency, under experimental conditions used.(AU)

Avaliação dos efeitos da melatonina sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro e transferência nuclear de células somáticas / Evaluation of melatonin effects on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer

Na reprodução assistida, o estresse oxidativo pode provocar efeitos deletérios sobre as taxas de produção de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da suplementação com o antioxidante melatonina (MEL) sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro(FIV) e transferência nuclear de células somáticas (TNCS). Os resultados mostraram que a MEL (10-7 M) no meio de maturação ou de cultivo embrionário in vitro não afetou a taxa de clivagem ou de produção de blastocistos na FIV ou na TNCS, e também não afetou a prenhez, a taxa de nascimento ou o peso dos bezerros na TNCS. O tratamento das células doadoras de núcleo com MEL (10-9M) também não levou a um aumento na produção de embriões, prenhez ou taxa de nascimento na TNCS. Assim, conclui-se que a MEL não foi capaz de aumentar a eficiência da reprodução assistida bovina, nas condições experimentais utilizadas.

n assisted reproduction, oxidative stress can cause deleterious effects on embryo production rates. The aim of the present study was to evaluate the effect of melatonin supplementation (MEL) on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization (IVF) and somatic cell nuclear transfer (SCNT). The findings of this work demonstrated that melatonin enrichment (10-7 M) of the in vitro maturation (IVM) medium or in the embryo culture medium does not affect both cleavage and blastocyst rates in IVF or SCNT, and does not affect pregnancy, birth rate or weight calf in SCNT either. The treatment of nucleus donor cells with melatonin (10-9M) could not also improve embryo production, pregnancy or birth rate in SCNT. According to these work it is concluded that melatonin is not able toameliorate bovine assisted reproduction efficiency, under experimental conditions used.

Effect of Rolipram on in vitro maturation, gene expression and embryonic development in bovines / Efeito de rolipram na maturação in vitro, expressão gênica e desenvolvimento embrionário em bovinos

The aim of this work was to evaluate the effect of the Rolipram during the maturation of bovine oocytes and gene expression of embryos produced in vitro. Bovine ovaries were collected in slaughterhouse. The COCs were selected and divided into 5 groups: Control 0 time; Control: IVM for 24 hours; Rolipram treatments with IVM blocking for 24 hours in maturation medium containing (100, 150 and 200µM). After 24 hours all groups were reseated in IVM for another 24 hours. Subsequently COCs were subjected to the same IVM system and fertilized, being checked for cleavage post fertilization and for blastocyst. In addition, performed expression of the following genes: Mater, BMP15 and Bax. No difference was found in gene expression. Of oocytes evaluated shortly after follicular aspiration, 79.00% were in GV, GVBD, MI, while 13.40%, were in MII and 7.60%, D/NI. Significant difference was observed in different concentrations (T100, T200 and T150µM) in oocytes that have reached the MII phase compared to control treatments (P= 0.003). Differences were observed in cleavage rate (P< 0.05) between T150 and T200 when compared to the C/24 Group. A high difference was observed on blastocyst rate (P< 0.001) among treatments compared to the control group.(AU)

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do rolipram durante a maturação de oócitos bovinos, expressão gênica e embriões produzidos in vitro. Os ovários bovinos foram coletados no matadouro. Os COCs foram selecionados e divididos em cinco grupos: controle 0 tempo; controle: MIV por 24 horas; tratamentos rolipram com bloqueio MIV por 24 horas em meio de maturação contendo 100, 150 e 200µM. Após 24 horas, todos os grupos foram recolocados em MIV por mais 24 horas. Subsequentemente COCs foram submetidos ao mesmo sistema MIV e fertilizados, sendo avaliada a taxa de clivagem e de blastocisto, além da expressão dos seguintes genes: Mater, BMP15 e Bax. Nenhuma diferença foi observada na expressão gênica. Dos oócitos avaliados logo após a aspiração folicular, 79,0% estavam em GV, GVBD, MI, enquanto 13,40% estavam em MII, e 7,60% em D/NI. A diferença significativa foi observada em diferentes concentrações (T100, T200 e T150µM) em oócitos que atingiram a fase MII em comparação aos tratamentos de controle (P=0,3). Diferenças foram observadas nas taxas de clivagem (P<0,5) entre T150 e T200 quando comparadas com as taxas do grupo C/24. Uma grande diferença foi observada na taxa de blastocisto (P<0,1) entre os tratamentos em relação ao grupo controle.(AU)

Effect of Rolipram on in vitro maturation, gene expression and embryonic development in bovines / Efeito de rolipram na maturação in vitro, expressão gênica e desenvolvimento embrionário em bovinos

The aim of this work was to evaluate the effect of the Rolipram during the maturation of bovine oocytes and gene expression of embryos produced in vitro. Bovine ovaries were collected in slaughterhouse. The COCs were selected and divided into 5 groups: Control 0 time; Control: IVM for 24 hours; Rolipram treatments with IVM blocking for 24 hours in maturation medium containing (100, 150 and 200µM). After 24 hours all groups were reseated in IVM for another 24 hours. Subsequently COCs were subjected to the same IVM system and fertilized, being checked for cleavage post fertilization and for blastocyst. In addition, performed expression of the following genes: Mater, BMP15 and Bax. No difference was found in gene expression. Of oocytes evaluated shortly after follicular aspiration, 79.00% were in GV, GVBD, MI, while 13.40%, were in MII and 7.60%, D/NI. Significant difference was observed in different concentrations (T100, T200 and T150µM) in oocytes that have reached the MII phase compared to control treatments (P= 0.003). Differences were observed in cleavage rate (P< 0.05) between T150 and T200 when compared to the C/24 Group. A high difference was observed on blastocyst rate (P< 0.001) among treatments compared to the control group.(AU)

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do rolipram durante a maturação de oócitos bovinos, expressão gênica e embriões produzidos in vitro. Os ovários bovinos foram coletados no matadouro. Os COCs foram selecionados e divididos em cinco grupos: controle 0 tempo; controle: MIV por 24 horas; tratamentos rolipram com bloqueio MIV por 24 horas em meio de maturação contendo 100, 150 e 200µM. Após 24 horas, todos os grupos foram recolocados em MIV por mais 24 horas. Subsequentemente COCs foram submetidos ao mesmo sistema MIV e fertilizados, sendo avaliada a taxa de clivagem e de blastocisto, além da expressão dos seguintes genes: Mater, BMP15 e Bax. Nenhuma diferença foi observada na expressão gênica. Dos oócitos avaliados logo após a aspiração folicular, 79,0% estavam em GV, GVBD, MI, enquanto 13,40% estavam em MII, e 7,60% em D/NI. A diferença significativa foi observada em diferentes concentrações (T100, T200 e T150µM) em oócitos que atingiram a fase MII em comparação aos tratamentos de controle (P=0,3). Diferenças foram observadas nas taxas de clivagem (P<0,5) entre T150 e T200 quando comparadas com as taxas do grupo C/24. Uma grande diferença foi observada na taxa de blastocisto (P<0,1) entre os tratamentos em relação ao grupo controle.(AU)

Use of a colloid to optimize centrifugation in the selection of bovine sperm for IVF / Uso de um coloide para otimizar a centrifugação na seleção de espermatozoides bovinos para FIV

This study aimed to evaluate the effect of the force and duration of centrifugation and the impact of cushioned centrifugation on sperm selection by Percoll gradient, on sperm quality and development kinetics of in vitro produced bovine embryos. Two experiments were performed. In Experiment I, a pool of semen was selected by Percoll gradients and the pellet was divided into four groups and distributed in a 2 × 2 factorial, with two forces (2200 × g or 9000 × g) and two durations (1 min or 3 min) of centrifugation. In Experiment II, semen was divided into two groups and selected by Percoll gradient with Cushion Fluid (CF) or without CF (Control) in the second centrifugation. The morphofunctionality, biochemical characteristics and fertilizing capacity of the selected sperms were evaluated. In addition, the development of the resulting bovine embryos was monitored for 48 h post-insemination. Duncan and Chi-square tests (P < 0.05) were used to compare the means. In Experiment I, there was a significant increase in sperm vigor (P < 0.05) after sperm selection in all treatments. The force and duration of centrifugation did not have any effect on sperm motility, vigor, and recovery rate among the different treatments (P > 0.05). In Experiment II, the recovery rate and reactive oxygen species (ROS) production in semen were similar among treatments (P > 0.05) although a higher ROS production was observed in the CF fertilization medium. Total fertilization rate was superior in the CF group (65.4 ± 5.3%) compared to that in Control (39.6 ± 4.9%). However, the normal fertilization and cleavage rate did not differ between the Control (94 ± 6.3% and 58.3 ± 8.3%) and CF (89 ± 7.1% and 75.0 ± 7.3%) groups. The reduction in the force and duration of centrifugation did not decrease the sperm recovery during selection by the Percoll gradient and the use of CF in the second centrifugation did not affect the normal fertilization and development of bovine IVF embryos up to 48 h.(AU)

Esse estudo objetivou avaliar o efeito da força e duração da centrifugação, e o impacto da centrifugação amortecida na seleção espermática por gradientes de Percoll, na qualidade espermática e cinética do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro. Dois experimentos foram realizados. No experimento I, um pool de sêmen foi selecionado por gradientes de Percoll e o pellet dividido em quatro grupos e distribuído em um fatorial 2 x 2, com duas forças (2200 e 9000 X g) e dois tempos (1 e 3 min) de centrifugação. No Experimento II, o sêmen foi dividido em dois grupos e selecionado com (CF) ou sem CushionFluid (Controle) na segunda centrifugação. A morfofuncionalidade, características bioquímicas e capacidade fecundante dos espermatozoides selecionados foram avaliadas. Além disso, o desenvolvimento dos embriões bovinos resultantes foi monitorado por 48 horas pós-inseminação. Os testes Duncan e Qui-quadrado (P<0,05) foram usados para comparar as médias. No Experimento I, houve um aumento significativo no vigor após a seleção espermática para todos os tratamentos. A força e a duração da centrifugação não tiveram nenhum efeito na motilidade, vigor e recuperação espermática entre os diferentes tratamentos (P > 0.05). No Experimento II, a taxa de recuperação e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) no sêmen foram similares entre os tratamentos (P>0,05), embora a maior produção de EROs foi observada no meio de fecundação do grupo CF. A taxa de fecundação total, foi superior no grupo CF (65.4±5.3%) comparada com o Controle (39.6±4.9%). Entretanto a fecundação normal e a taxa de clivagem não diferiram entre os grupos Controle (94±6.3% e 58.3±8.3%) e CF (89±7.1% and 75.0±7.3%). A redução na força e duração da centrifugação não diminuiu a recuperação espermática durante a seleção por gradientes de Percoll e o uso de CF na segunda centrifugação não influenciou a fecundação normal e o desenvolvimento de embriões bovinos PIV até 48 horas.(AU)

Effective individual culture system for in vitro production of bovine embryos / Sistema eficaz de cultivo individual de embriões bovinos produzidos in vitro

A new and effective protocol to culture bovine embryos without coculture and with individualized culture media has been established, which would allow the study of a single embryo's metabolism. For this purpose, bovine embryos were produced in vitro by standard protocols in three different types of media: KSOM, SOFaa, and KSOM followed by SOFaa at day 2. Presumptive zygotes were divided into six groups: control, cultured in groups (C-KSOM, C-SOFaa, and C-KS), and individual well system (W-KSOM, W-SOFaa, and W-KS). Cleavage and blastocyst rates were assessed on days 2 and 7 respectively. Relative quantification of transcripts related to important metabolic processes (GLUT1, GLUT3, GSK3, SOD1, HSPD1, G6PD) were assessed in C-KS and W-KS blastocysts. Results show that cleavage was significantly higher only in W-KSOM when compared to C-KSOM, while blastocyst rates differ only between C-SOF and W-SOF. All the other comparisons did not present statistical difference. Moreover, gene expression analysis revealed that blastocysts cultured in groups and in the individual well system present similar transcription patterns. Thus, the obtained conclusion was that the individual well system performed could be used as an effective alternative protocol for individual culture of bovine embryos, since the rates are similar to routine group culture.(AU)

Estabeleceu-se um protocolo novo e eficaz de cultivo individual de embriões bovinos sem o uso de cocultivo e sem compartilhamento de meio visando à análise do metabolismo individual do embrião. Para isso, embriões foram produzidos in vitro por protocolos convencionais em três diferentes tipos de meio: KSOM, SOFaa e KSOM seguido por SOFaa no dia 2. Os zigotos presumíveis foram divididos em seis grupos: controles (cultivo em grupo ­ C-KSOM, C-SOFaa e C-KS) e sistema de poços individuais (W-KSOM, W-SOFaa e W-KS). As taxas de clivagem foram avaliadas nos dias 2 e 7, respectivamente. Além disso, a quantificação relativa de transcritos relacionados a importantes processos metabólicos (GLUT1, GLUT3, GSK3, SOD1, HSPD1 e G6PD) foi avaliada nos blastocistos dos grupos C-KS e W-KS. Os resultados mostram que as taxas de clivagem foram maiores apenas no grupo W-KSOM quando comparado ao grupo C-KSOM, enquanto a taxa de blastocistos diferiu apenas entre os grupos C e W-SOF. Além disso, a análise da expressão gênica mostrou que blastocistos cultivados em grupo ou em sistema de poços individuais são semelhantes quanto à expressão gênica. Assim, a conclusão obtida foi que o sistema individual proposto pode ser utilizado como um protocolo alternativo eficiente para o cultivo individual de embriões de bovino, uma vez que suas características permanecem semelhantes àquelas do sistema convencional de produção de embriões.(AU)

Effective individual culture system for in vitro production of bovine embryos / Sistema eficaz de cultivo individual de embriões bovinos produzidos in vitro

A new and effective protocol to culture bovine embryos without coculture and with individualized culture media has been established, which would allow the study of a single embryo's metabolism. For this purpose, bovine embryos were produced in vitro by standard protocols in three different types of media: KSOM, SOFaa, and KSOM followed by SOFaa at day 2. Presumptive zygotes were divided into six groups: control, cultured in groups (C-KSOM, C-SOFaa, and C-KS), and individual well system (W-KSOM, W-SOFaa, and W-KS). Cleavage and blastocyst rates were assessed on days 2 and 7 respectively. Relative quantification of transcripts related to important metabolic processes (GLUT1, GLUT3, GSK3, SOD1, HSPD1, G6PD) were assessed in C-KS and W-KS blastocysts. Results show that cleavage was significantly higher only in W-KSOM when compared to C-KSOM, while blastocyst rates differ only between C-SOF and W-SOF. All the other comparisons did not present statistical difference. Moreover, gene expression analysis revealed that blastocysts cultured in groups and in the individual well system present similar transcription patterns. Thus, the obtained conclusion was that the individual well system performed could be used as an effective alternative protocol for individual culture of bovine embryos, since the rates are similar to routine group culture.(AU)

Estabeleceu-se um protocolo novo e eficaz de cultivo individual de embriões bovinos sem o uso de cocultivo e sem compartilhamento de meio visando à análise do metabolismo individual do embrião. Para isso, embriões foram produzidos in vitro por protocolos convencionais em três diferentes tipos de meio: KSOM, SOFaa e KSOM seguido por SOFaa no dia 2. Os zigotos presumíveis foram divididos em seis grupos: controles (cultivo em grupo ­ C-KSOM, C-SOFaa e C-KS) e sistema de poços individuais (W-KSOM, W-SOFaa e W-KS). As taxas de clivagem foram avaliadas nos dias 2 e 7, respectivamente. Além disso, a quantificação relativa de transcritos relacionados a importantes processos metabólicos (GLUT1, GLUT3, GSK3, SOD1, HSPD1 e G6PD) foi avaliada nos blastocistos dos grupos C-KS e W-KS. Os resultados mostram que as taxas de clivagem foram maiores apenas no grupo W-KSOM quando comparado ao grupo C-KSOM, enquanto a taxa de blastocistos diferiu apenas entre os grupos C e W-SOF. Além disso, a análise da expressão gênica mostrou que blastocistos cultivados em grupo ou em sistema de poços individuais são semelhantes quanto à expressão gênica. Assim, a conclusão obtida foi que o sistema individual proposto pode ser utilizado como um protocolo alternativo eficiente para o cultivo individual de embriões de bovino, uma vez que suas características permanecem semelhantes àquelas do sistema convencional de produção de embriões.(AU)

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação

ABSTRACT The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P 0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P 0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.

RESUMO Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P 0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P 0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação / Effect of conjugated linoleic acid addition in in vitro culture medium in F1 Holstein X Zebu embryo survival post vitrification

Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P<0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P<0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.(AU)

The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P <0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P<0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.(AU)

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação / Effect of conjugated linoleic acid addition in in vitro culture medium in F1 Holstein X Zebu embryo survival post vitrification

Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P<0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P<0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.(AU)

The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P <0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P<0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.(AU)

Effect of follicular diameter, time of first cleavage and H3K4 methylation on embryo production rates of Bos indicus cattle / Efeito do diâmetro folicular, momento da primeira clivagem e metilação da H3K4 na produção embrionária de vacas Bos indicus

This study aimed investigate the relationship between epigenetics, follicular diameter and cleavage speed, by evaluating the developmental potential and occurence of H3K4 monomethylation of early-, intermediate- and late-cleaving Bos indicus embryos from in vitro fertilized oocytes originating from follicles up to 2 mm in diameter or between 4 and 8 mm in diameter. Oocytes (n = 699) from small follicles (? 2 mm) and 639 oocytes from large follicles (4-8 mm) were punched from 1,982 Bos indicus slaughterhouse ovaries. After maturation and in vitro fertilization (IVF), the cultured embryos were separated into early (? 28 h post-IVF), intermediate (> 28 h and ? 34 h post-IVF) and late (> 34 h and ? 54 h post-IVF) cleavage groups. Blastocysts were subjected to an immunofluorescence assessment for H3K4me investigation. The blastocyst rate for large follicles (36.3%) was higher than that for small follicles (22.9%, P 0.05). In addition, blastocyst rates for early and intermediate cleavage groups (45.3% and 33.8%, respectively) were higher than that for late cleavage group (13.5%, P 0.05). The blastocysts from all groups displayed H3K4me staining by immunofluorescence, particularly intense in what seemed to be trophectoderm cells and weak or absent in cells seemingly from the inner cell mass. For the first time for indicus embryos, data from this study demonstrate that higher blastocyst embryorates are obtained from embryos that cleave within 34 h after fertilization and from those produced fromfollicles of 4-8 mm in diameter, indicating a greater ability of these embryos to develop to the stage ofembryonic preimplantation. This is the first article demonstrating the occurrence of H3K4me in cattleembryos; its presence in all the evaluated blastocysts suggests that this histone modification plays a keyrole in maintaining embryo viability at preimplantation stage.

Este estudo teve como objetivo investigar a relação entre a epigenética, o diâmetro folicular e a velocidade de clivagem, avaliando o potencial de desenvolvimento e a ocorrência de monometilação da H3K4 em embriões Bos indicus de clivagem precoce, intermediária e tardia produzidos a partir de oócitos fertilizados in vitro oriundos de folículos de até 2 mm de diâmetro ou entre 4 e 8 mm de diâmetro. Oócitos (n = 699) de folículos pequenos (? 2 mm) e 639 oócitos de folículos grandes (4-8 mm) foram puncionados de 1982 ovários de vacas Bos indicus de abatedouro. Após a maturação e fertilização in vitro (FIV), os embriões cultivados foram separados nos grupos de clivagem precoce (? 28 h pós-FIV), intermediária (> 28 h e ? 34 h pós-FIV) e tardia (> 34 h e ? 54 h pós-FIV). Os blastocistos foram submetidos à imunofluorescência para investigação de H3K4me. A taxa de blastocisto para embriões provenientes de folículos grandes (36,3%) foi maior que de folículos pequenos (22,9%; p 0,05). Ainda, as taxas de blastocisto para os grupos de clivagem precoce e intermediária (45,3% e 33,8%, respectivamente) foram maiores que para o grupo de clivagem tardia (13,5%; p 0,05). Blastocistos de todos os grupos mostraram marcação para H3K4me à imunofluorescência, particularmente intensa no que pareciam ser células do trofectoderma e fraca ou ausente em células semelhantes às da massa massa celular interna. Pela primeira vez em embriões indicus, os dados deste estudo demonstram que maiores taxas deblastocisto são obtidas de embriões que clivam em até 34 h pós-fertilização e dos oriundos de folículos de 4 a 8 mm de diâmetro, indicando uma maior habilidade desses embriões de se desenvolverem até o estágio de pré-implantação embrionária.

Effect of follicular diameter, time of first cleavage and H3K4 methylation on embryo production rates of Bos indicus cattle / Efeito do diâmetro folicular, momento da primeira clivagem e metilação da H3K4 na produção embrionária de vacas Bos indicus

This study aimed investigate the relationship between epigenetics, follicular diameter and cleavage speed, by evaluating the developmental potential and occurence of H3K4 monomethylation of early-, intermediate- and late-cleaving Bos indicus embryos from in vitro fertilized oocytes originating from follicles up to 2 mm in diameter or between 4 and 8 mm in diameter. Oocytes (n = 699) from small follicles (? 2 mm) and 639 oocytes from large follicles (4-8 mm) were punched from 1,982 Bos indicus slaughterhouse ovaries. After maturation and in vitro fertilization (IVF), the cultured embryos were separated into early (? 28 h post-IVF), intermediate (> 28 h and ? 34 h post-IVF) and late (> 34 h and ? 54 h post-IVF) cleavage groups. Blastocysts were subjected to an immunofluorescence assessment for H3K4me investigation. The blastocyst rate for large follicles (36.3%) was higher than that for small follicles (22.9%, P 0.05). In addition, blastocyst rates for early and intermediate cleavage groups (45.3% and 33.8%, respectively) were higher than that for late cleavage group (13.5%, P 0.05). The blastocysts from all groups displayed H3K4me staining by immunofluorescence, particularly intense in what seemed to be trophectoderm cells and weak or absent in cells seemingly from the inner cell mass. For the first time for indicus embryos, data from this study demonstrate that higher blastocyst embryorates are obtained from embryos that cleave within 34 h after fertilization and from those produced fromfollicles of 4-8 mm in diameter, indicating a greater ability of these embryos to develop to the stage ofembryonic preimplantation. This is the first article demonstrating the occurrence of H3K4me in cattleembryos; its presence in all the evaluated blastocysts suggests that this histone modification plays a keyrole in maintaining embryo viability at preimplantation stage.(AU)

Este estudo teve como objetivo investigar a relação entre a epigenética, o diâmetro folicular e a velocidade de clivagem, avaliando o potencial de desenvolvimento e a ocorrência de monometilação da H3K4 em embriões Bos indicus de clivagem precoce, intermediária e tardia produzidos a partir de oócitos fertilizados in vitro oriundos de folículos de até 2 mm de diâmetro ou entre 4 e 8 mm de diâmetro. Oócitos (n = 699) de folículos pequenos (? 2 mm) e 639 oócitos de folículos grandes (4-8 mm) foram puncionados de 1982 ovários de vacas Bos indicus de abatedouro. Após a maturação e fertilização in vitro (FIV), os embriões cultivados foram separados nos grupos de clivagem precoce (? 28 h pós-FIV), intermediária (> 28 h e ? 34 h pós-FIV) e tardia (> 34 h e ? 54 h pós-FIV). Os blastocistos foram submetidos à imunofluorescência para investigação de H3K4me. A taxa de blastocisto para embriões provenientes de folículos grandes (36,3%) foi maior que de folículos pequenos (22,9%; p 0,05). Ainda, as taxas de blastocisto para os grupos de clivagem precoce e intermediária (45,3% e 33,8%, respectivamente) foram maiores que para o grupo de clivagem tardia (13,5%; p 0,05). Blastocistos de todos os grupos mostraram marcação para H3K4me à imunofluorescência, particularmente intensa no que pareciam ser células do trofectoderma e fraca ou ausente em células semelhantes às da massa massa celular interna. Pela primeira vez em embriões indicus, os dados deste estudo demonstram que maiores taxas deblastocisto são obtidas de embriões que clivam em até 34 h pós-fertilização e dos oriundos de folículos de 4 a 8 mm de diâmetro, indicando uma maior habilidade desses embriões de se desenvolverem até o estágio de pré-implantação embrionária. (AU)

EFEITO DO SULFORAFANO NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

A produção in vitro de embriões bovinos apresenta papel de destaque dentre as biotecnologias reprodutivas, tendo em vista sua vasta contribuição para o melhoramento genético dos rebanhos, uma vez que possibilita a seleção tanto de machos quanto de fêmeas. Apesar da técnica ser praticada em escala comercial, ainda existem algumas limitações, como a baixa taxa de eclosão de blastocisto, produção de embriões com pouca tolerância à criopreservação, e consequente, taxa de prenhez reduzida, resultante de entraves inerentes ao processo de produção, a exemplo, o estresse oxidativo. Assim, várias pesquisas vêm sendo desenvolvidas para avaliar o efeito da adição de antioxidantes aos meios in vitro, com intuito de reduzir os danos causados pelo estresse oxidativo. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito antioxidante do sulforafano na produção in vitro de embriões bovinos. Para isso, foram coletados ovários de abatedouros para obtenção de oócitos viáveis, os quais foram selecionados e postos em maturação por 24 horas em incubadora com atmosfera controlada. Posteriormente, os oócitos maturados foram fertilizados e incubados por nove horas. Passado esse período, foi adicionado 5 M de Sulforafano no terço final da etapa de fertilização in vitro (últimas três horas). Em seguida, realizou-se o cultivo dos prováveis zigotos e foi avaliado o desenvolvimento embrionário nas fases de clivagem, mórula, blastocisto e eclosão dos embriões. Os dados obtidos no experimento foram analisados pelo teste de Qui-quadrado, a 5% de significância. Avaliando a produção embrionária, observou-se diferença estatística entre os grupos Controle e SFN, quando as taxas de clivagem (81,6 % vs 74,5 %), mórula (52,7 % vs 48,6 %) e blastocisto (23,4 % vs 19,6 %) foram comparadas, respectivamente. Para a taxa de eclosão (14,0 % vs 11,3 %) não foi verificada diferença significativa entre os grupos, respectivamente. Evidenciou-se que a adição de Sulforafano no estágio final da fertilização in vitro não foi capaz de promover melhora significativa nas taxas de produção embrionária para a espécie bovina, sendo necessários mais estudos que busquem melhor elucidar os efeitos desse antioxidante em sistemas de cultivo in vitro de células embrionárias.

The in vitro production of bovine embryos has a prominent role among reproductive biotechnologies, in view of its vast contribution to the genetic improvement of herds, as it enables the selection of both males and females. Although the technique is practiced on a commercial scale, there are still some limitations, such as the low blastocyst hatch rate, production of embryos with little tolerance to cryopreservation, and consequent reduced pregnancy rate, resulting from barriers inherent in the production process, the example, oxidative stress. Thus, several studies have been developed to evaluate the effect of adding antioxidants to in vitro media, with the aim of reducing the damage caused by oxidative stress. In this sense, the objective of this work was to evaluate the antioxidant effect of Sulforaphane on the in vitro production of bovine embryos. For this purpose, ovaries from slaughterhouses were collected to obtain viable oocytes, which were selected and matured for 24 hours in an incubator with a controlled atmosphere. Afterwards, the matured oocytes were fertilized and incubated for nine hours. After this period, 5 M of Sulforaphane was added in the final third of the in vitro fertilization step (last three hours). Afterwards, the probable zygotes were cultured and the embryonic development was evaluated in the cleavage, morula, blastocyst and hatching stages of the embryos. The data obtained in the experiment were analyzed by the Chi-square test, at 5% significance. Assessing embryo production, there was a statistical difference between the Control and SFN groups, when the rates of cleavage (81.6% vs 74.5%), morula (52.7% vs 48.6%) and blastocyst (23 .4% vs 19.6 %) were compared, respectively. For the hatching rate (14.0% vs 11.3%) there was no significant difference between groups, respectively. It was evidenced that the addition of Sulforaphane in the final stage of in vitro fertilization was not able to promote a significant improvement in embryo production rates for the bovine species, and further studies are needed to better elucidate the effects of this antioxidant in in vitro culture systems of embryonic cells.