Three new shuttle vectors for heterologous expression in Zymomonas mobilis

Background: Zymomonas mobilis, as a novel platform for bio-ethanol production, has been attracted more attention and it is very important to construct vectors for the efficient expression of foreign genes in this bacterium. Results: Three shuttle vectors ( pSUZM 1, pSUZM2 and pSUZM3 ) were first constructed with the origins of replication from the chromosome and two native plasmids (pZZM401 and pZZM402) of Z. mobilis ZM4, respectively. The three shuttle vectors were stable in Z. mobilis ZM4 and have 3,32 and 27 copies, respectively. The promoter Ppdc (a), from the pyruvate decarboxylase gene, was clonedinto the shuttle vectors, generatingthe expressionvectors pSUZM1(2, 3)a. The codon-optimized glucoamylase gene from Aspergillus awamori combined with the signal peptide sequence from the alkaline phosphatase gene of Z. mobilis was cloned into pSUZM1(2, 3)a, resulting in the plasmids pSUZM1a-GA, pSUZM2a-GA and pSUZM3a-GA, respectively. After transforming these plasmids into Z. mobilis ZM4, the host was endowed with glucoamylase activity for starch hydrolysis. Both pSUZM2a-GA and pSUZM3a-GA were more efficientatproducingglucoamylase thanpSUZM1a-GA. Conclusions: These results indicated that these expression vectors are useful tools for gene expression in Z. mobilis and this could provide a solid foundation for further studies of heterologous gene expression in Z. mobilis.

Caso familiar com diagnóstico para doença de Fabry / Familiar case with diagnostics for Fabry disease

A doença de Fabry é uma enfermidade genética ligada ao cromossomoX e de caráter progressivo, causada pela deficiênciaparcial ou total da enzima alfa galactosidase A (?-Gal A). Habitualmenteo diagnóstico é tardio em função das complicaçõespatológicas provocadas pela deficiência da enzima. OBJETIVO:Neste estudo, descrevemos os aspectos clínicos de um caso familiaratravés do acompanhamento ao longo de 3 anos, duranteo tratamentopela reposição enzimática. MÉTODOS: O métodoadotado foi indutivo, relacionado ao estudo de caso familiarde pacientes com doença de Fabry. Quanto à natureza das informações,a pesquisafoi qualitativa, utilizando-se, quanto aoseu objetivo, à pesquisa exploratória. Com relação as fonte deinformação e procedimento de coleta, a pesquisa caracteriza-secomo sendo bibliográfica e documental. A amostra foi compostapor três pacientesque realizamacompanhamento quinzenalpara aplicação de terapia de reposição enzimática. O critério deinclusão para a pesquisa partiu do pressuposto de se considerarque a doença de Fabry é uma afecção rara e que a família estudadacontempla com riqueza manifestações clínicas, capazesde caracterizar a doença de Fabry. RESULTADOS: Os principaissintomas clínicos relatados pelos pacientes foram: crisede dor generalizada, fadiga, acroparestesia, febre, mialgia, dorabdominal, hipohidrose, intolerância ao frio, calor e ao exercíciofísico. Esses sintomas segundo os pacientes surgiram nainfância e foram amenizados após o uso da terapia de reposiçãoenzimática, propiciando uma melhor qualidade de vida para osmesmos. Também, se observou sinais específicos desta patologianos pacientes, como córnea verticillata e angioqueratoma. Atravésda genotipagem se verificou a semelhança da mutação entre os pacientes do estudo, demonstrando padrão típico de herançarecessiva ligada ao cromossomo X. CONCLUSÃO: Os pacientesdeste estudo apresentaram quadro clínico semelhante,sendoque a sintomatologia iniciou na infância. Córnea verticillata eangioqueratoma umbilical foram sinais encontrados nos pacientes do sexo masculino e são considerados manifestações clínicas frequentes desta patologia. A herança encontrada nesta amostra tem um padrão típico de herança recessiva ligada ao cromossomo X. Desta forma, apesar de ser uma afecção rara na população em geral, o diagnóstico precoce e a terapia de reposição enzimática permitem a evolução clínica favorável e a melhoria da qualidade de vida do paciente.(AU)

Fabry disease is a genetic disorder linked to the X chromosomeand progressive, caused by partial or total deficiency of alphagalactosidase A (?-Gal A). Usually the diagnosis is delayed dueto the pathological complications caused by deficiency of theenzyme. OBJECTIVE: In this study, we describe the clinicalaspects of a family case by monitoring for over three years,during the treatment by enzyme replacement. METHODS:The method adopted was inductive, related to the study of afamily case with patients with Fabry disease. About the nature ofthe information, the research was qualitative, using, as its goal,the exploratory research. Regarding the source of informationand collection procedure, the research is characterized asbibliographical and documentary. The sample was composed ofthree patients submitted to biweekly monitoring for applicationof enzyme replacement therapy. The inclusion criterion forthe research assumed to consider that Fabry disease is a raredisease and that the studied family contemplates with wealththe clinical manifestations, able to characterize the Fabrydisease. RESULTS: The main clinical symptoms related bypatients were: generalized pain crisis, fatigue, acroparesthesia,fever, myalgia, abdominal pain, hypohidrosis, intolerance tocold, heat and exercise. These symptoms according to patientsemerged in childhood and were alleviated after the use ofenzyme replacement therapy, providing a better quality of lifefor them. Also, we found specific signs of this disease in patients,as verticillata cornea and angiokeratoma. By genotyping, it wasfound the similarity of the mutation among patients in thestudy, showing typical pattern of recessive inheritance linkedto chromosome X. CONCLUSION: The patients in this study showed similar clinical condition, and the symptoms began inchildhood. Verticillata cornea and umbilical angiokeratomasigns were found in male patients and are considered commonclinical manifestations of this pathology. The heritage found inthis sample has a typical pattern of recessive inheritance linkedto chromosome X. Thus, despite being a rare disease in generalpopulation, early diagnosis and enzyme replacement therapyallow favorable clinical evolution and improved patient qualityof life.(AU)

Estudio de cepas nativas amilolíticas / Study of amilolytic native microbial stocks

En el presente trabajo se realiza el estudio de cepas microbianas aisladas de diferentes nichos ecológicos, productoras de las enzimas amilolíticas, así: procesado de maíz, de papa y de yuca. Los criterios utilizados para el aislamiento de las cepas amilolíticas, son el crecimiento sobre los medios modificados con almidón y la positividad frente al Test de Lugol. Los medios empleados fueron CZAPEK, PCA y MRS modificados. Las cepas obtenidas son debidamente purificadas, crío conservadas e identificadas bioquímicamente, obteniendo un total de 103 cepas nativas. De éste total de cepas, se seleccionan debido a la similitud fisiológica entre microorganismos aislados, 9 cepas. Estas últimas son identificadas bioquímicamente y se obtienen los géneros Bacillus sp ,Clostridium sp y Kurthia sp. Las enzimas amilolíticas obtenidas a partir de las cepas nativas presentan pesos moleculares que oscilan entre 30 y 150 kDa aproximadamente

Serum enzyme pattern and local enzyme gradients in chronic chagasic patients

Histochemical studies of myocardial biopsies from chronic chagasic patients at different evolutive stages showed a pattern primarily characterized by a marked increment in tissue enzymes such as mono-amine oxidase and lysosomal acid phosphatase. This cellular damage can be reflected by changes in certain serum enzymes associated with myocardial metabolism, specially in the coronary sinus, where the blood metabolized by the heart is drained. However, little is known about the possible changes in blood enzyme activity during chronic Chagas disease. In this investigation, the activity of the following enzymes glutamic-oxaloacetic transaminase (GOT), glutamic-pyruvic transaminase (GPT), alkaline phosphatase (ALP), acid maltase (AM), lactate dehydrogenase (LDH), alpha-hydroxybutyric dehydrogenase (alpha-HBDH or LDH1) and creatine phosphokinase (CPK) was measured in blood serum of the superior cava vein (SCV), coronary sinus (CS) and pulmonary (PA) and femoral (FA) arteries of 45 chronic chagasic patients, ages between 20 and 55 yr, at different evolutive stages (groups IA, IB, II and III). The results demonstrate that the average activity of the enzymes studied in chagasic patients, except LDH and CPK, are significantly altered (p < 0.05) in the majority of the arterial and venous blood samples. The finding of released GOT, GPT, ALP, acid maltase and alpha-HBDH in groups IA and IB is an indication of early myocardial damage in chronic chagasic patients without clinical evidence of cardiac disease. In conclusion, it is suggested that the possible evolutive pattern for myocardial damage could be established by the increment in coronary sinus blood of the enzymes GOT, acid maltase and alpha-HBDH

Production of amylases by Aspergillus tamarii

A strain of Aspergillus tamarii, a filamentous fungus isolated from soil, was able to produce both Ó-amylase and glucoamylase activities in mineral media supplemented with 1(per cent) (w/v) starch or maltose as the carbon source. Static cultivation led to significantly higher yields than those obtained using shaking culture. The production of amylases was tolerant to a wide range of initial culture pH values (from 4 to 10) and temperature (from 25 to 42degree C). Two amylases, once Ó-amylase and one glucoamylase, were separated by ion exchange chromatography. Both partially purified enzymes had optimal activities at pH values between 4.5 and 6.0 and were stable under acid conditions (pH 4.0-7.0). The enzymes exhibited optimal activities at temperatures between 50(degree) and 60(degree) C and wete stable for more than ten hours at 55(degree) C.

Enzymatic determination of soluble and insoluble dietary fiber in rice and wheat bran

The information about dietary fiber presents controversies in many research areas such as in nomenclature, related illnesses, recommended quantities and terminology, mainly because of lack of analytical data. Different needs and interests for the dietary fiber composition of foods and forages have led to a proliferation of methods for its analysis. This research, a further adaptation of the enzymatic method of Asp et al. (1983) for its appplication is proposed for rice and wheat bran, byproducts of agroindustries in the southern region of Rio Grande do Sul (Brazil). The inclusion of Amyloglucosidase in the proposed methodology contributed to the decrease in the content of residual starch at the end of the experiment, like Prosky et al (1992). To increase the efficiency of the enzyme system inthis type of samples, other changes were made with respect to incubation time and proteolytic enzyme concentration. In the final adaptation, a decrease of 51.33 per cent of the starch content was observed in rice bran (RB) and of 52.93 per cent in wheat bran (WB). This decrease was also verified in the model system (MS) (52.08 per cent), which demonstrates the adequacy of the proposed adaptation. With respect to the residual protein, it was verified that the measures adopted provoked a reduction of 42.15 per cent (RB), 52.19 per cent (WB) and 42.11 per cent (MS) as compared to the original method. Then the proposed conditions has been shown to be efficient in decreasing the level of interference (indigestible starch and protein) in the quantification of dietary fiber in rice and wheat bran.

Alterations in kidney enzyme pattern in acute hypervitaminosis A

The relation of excessive doses of vitamin A with various kidney pathologies is well known however, information concerning the relation of kidney enzyme activity with acute hypervitaminosis A is rather scarce. In this study we describe the kidney enzymatic alterations observed in rats that received daily intramuscular injectiosn of 10.000, 30.000, 50.000 and 100.000IU of vitamin A palmitate (VA) during seven days (TREATED GROUPS). A comparison is made with the enzyme activity in healthy rats pairfed and treated with sodium palmitte by intramuscular injection (CONTROL GROUP). The treated rats showed a proportional increase (<0.05) in activity of acid maltase, transaminases or aminotransferase (GOT and GPT), alkaline phosphatase (ALP) and acid protease with all doses of VA administered, Amylase, lipase and arginase tend to decrease (p<0.05) in activity only with doses of 50.000 and 100.000 I.U. of VA. Several factors are responsible for these findings, such as kidney necrosis due to release of lysosomal acid hydrolases produced by hypervitaminosis A.

Production of glucoamylase by fed-batch culture of Aspergillus awamori NRRL3112

A produçäo de amiloglicosidase por Aspergillus awamori NRRL3112 em processo descontínuo alimentado é 92 por cento superior em relaçäo ao processo descontínuo em cultivos com 20g/l de concentraçäo total de fonte de carbono oriunda de farinha de mandioca. Uma análise da velocidade específica de produçäo mostra ser este resultado decorrente da reduçäo do efeito repressivo causado pela glicose, já que o efeito indutivo, relacionado à concentraçäo de polissacarídeo, também foi reduzido

Miopatía por déficit de maltasa ácida en el adulto / Myopathy due to acid maltase deficiency in an adult patient

We report a 46 years old male presenting with tetraparesis and severe respiratory involvement. He had moderately elevated serum creatine phosphokinase values and the electromyography showed myopathic alterations and irritative signs. In the muscle biopsy a vacuolar myopathy with increased collagen deposits was found. Circulating lymphocytes presented abnormal PAS positive granules in their cytoplasm

Isolation and genetic analysis of Aspergillus niger mutants with reduced extracellular glucoamylase

Mutantes com reduçäo na produçäo de glicoamilase extracelular foram isolados com frequência (2%) de uma linhagem de Aspergillus niger. Estes foram designados de baixa produçäo de glicoamilase (Igp) quando produziram até 30% do valor observado nas parentais e, média produçäo de glicoamilase (mgp), quando mostraram reduçäo de 35 a 50%. Todos os mutantes estudados foram recessivos e a linhagem Igp73 segregou 2 genes näo ligados. Testes de complementaçäo e segregaçäo de diploides heterozigotos indicaram 3 a 4 genes em diferentes grupos de ligaçäo que afetam consideravelmente a produçäo da enzima. Considerando a evidência de uma única cópia do gene estrutural nesta espécie e que, produçäo de enzimas extracelulares como é o caso, é normalmente o resultado final de vários passos a nível intracelular e de membrana incluindo regulaçäo, parece razoavel sugerir que haja interaçäo gênica no acúmulo desta enzima e que, mutaçäo em qualquer um destes genes, deve resultar em diminuiçäo da produçäo

Influência do pH na síntese e liberaçäo de glicoamilase por Aspergillus awamori NRRL 3112 e Aspergillus niger NRRL 337 / Influence of pH on glucoamylase synthesis and secretion by Aspergillus awamori NRRL 3112 and Aspergillus niger NRRL 337

Estudou-se a influência do pH na síntese e liberação da glicoamilase produzida por Aspergillus awamori NRRL 3112 e Aspergillus niger NRRL 337, em meio de cultura à base de farinha de mandioca. Verificou-se que, em valores crescentes de pH, de 3.0 a 6.0, obteve-se uma maior atividade de enzima intracelular, tendo se observado que o fenômeno de retenção de glicoamilase associada às células foi mais acentuado nas cepas com menor capacidade de produção da enzima. Com relação ao Aspergillus niger NRRL 337, verificou-se ainda, a influência da estocagem por longos períodos de tempo na diminuição da produção de glicoamilase.

Genetic study of auxotrophic and resistant mutants of Aspergillus niger and their glucoamylase production

Mutantes auxotróficos resistentes foram isolados de uma linhagem de A. niger produtora de glucoamilase. Somente um mutante resitente, mgrA2 (verde malaquita) e os auxotróficos, metA1 (metionina) e myA1 (metionina ou cisteína) näo mostraram diminuiçäo significativa de produçäo comparados com a linhagem parental. A produçäo dos diplóides heterozigotos indicou que a baixa produçäo observada nos outros mutantes poderia ser devido a efeito pleiotrópico. Quatro grupos de ligaçäo foram identificados através de segregaçäo de diplóides heterozigotos. O gene mgrA2 se mostrou recessivo e o etbA5 (resistência a brometo de etídio), semi-diminante. O segundo poderia ser usado para determinaçäo da ordem dos genes no grupo de ligaçäo I

Proceso descontínuo de síntese de amiloglicosidade por Aspergilus awamori: influência do pH e da concentraçäo inicial de polissacarídeo

Estudou-se a influência da concentraçäo inicial de polissacarídeo (So) e do pH na produçäo de amiloglicosidase por Aspergillus awaamori NRRL 3112. Foram efetuados ensaios descontínuos, a pH 4,0 e 5,0 em fermentador de 10 litros, empregando-se meio de cultura a base de farinha de mandioca. Através do estudo cinético do processo, verificou-se a partir de So = 20g/l, para ambos os valores de pH, um comportamento acentuadamente crescente da atividade enzimática final no caldo, até se atingir um valor máximo para um determinado So. Verificou-se que esta atividade máxima é significativamente maior a pH 5,0, chegando-se a aproximadamente 7000U/1 para So = 93g/1, enquanto que a pH 4,0, obteve-se 2500U/1

Produçäo e propriedades da amilase de Trichoderma pseudokoningüi / Production and proprieties of amylases of Trichoderma pseudokoningüi

Trichoderma pseudokoningii. Rifai foi isolado como contaminante em experimentos realizados sob nitrogênio líquido. Apresentou atividade amilolítica superior a de outros fungos isolados do solo ou do ambiente. Verificou-se que exuste relaçäo direta entre o crescimento do fundo e a produçäo de amilase. A maior produçäo de amilase ocorreu quando meio mineral mínimo foi suplementado com amido a 2%, farelo de trigo a 1% e líquido resultante do processamento do milho (corn steep liquor) a 1%. A amilase foi parcialmente purificada (4,9 vêzes) através de precipitaçäo com sulfato de amônio e cromatografia em Sephacryl S-200. Apresentou somente uma banda no gel corado para atividade, mas o gel para proteínas mostrou várias bandas, indicando que a preparaçäo näo está totalmente pura. A análise cromatográfica dos produtos de hidrólise, mostrou unicamente a presença de glucose, confirmando que a amilase em estudo é uma glicoamilase. O pH ótimo de atividade foi determinado ser entre 4,0 a 5,0 com máximo em 4,2. A enzima é estável na faixa de pH de 4,0 a 6,0. A temperatura ótima encontrada foi 60ªC, retendo 90% de atividade por um periodo de duas horas de pré incubaçäo a esta temperatura a esta temperatura. Ensaios de especificidade mostraram atividade superior sobre amido de milho que de batata ou amido solúvel, e que a preparaçäo atuava com menor velocidade, mas significativamente sobre amido cru. Mostrou açäo sobre o pululano, e näo sobre o ciclo dextrina ou maltose, indicando, neste caso a ausência de atividade de transglicosilase. O Km para o amido foi da ordem de 2,7 g/l

Influência da glicose na determinaçäo da atividade da amiloglicosidase / Influence of glucose on the determination of amyloglucosidase activity

Há inibiçäo da amiloglicosidase, quando se atinge 2g glicose/1 no volume de reaçäo. Este valor, além de sua importância no fenômeno de hidrólise, indica o cuidado a ser tomado na determinaçäo da atividade. Para permitir uma estimativa mais real, foi proposta a correçäo de valores, caso o limite de 2g glicose/1 seja ultrapassado