UTILIZAÇÃO DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE CONVENCIONAL, MULTIPLEX E EM TEMPO REAL (qPCR) NA AUTENTICAÇÃO DE CARNE MOÍDA BOVINA E NA PESQUISA DE Salmonella spp. EM PRODUTOS CÁRNEOS

OLIVEIRA, Andrey. UTILIZAÇÃO DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE CONVENCIONAL, MULTIPLEX E EM TEMPO REAL (qPCR) NA AUTENTICAÇÃO DE CARNE MOÍDA BOVINA E NA PESQUISA DE Salmonella spp. EM PRODUTOS CÁRNEOS. 2017. 118f. Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal na Amazônia. Universidade Federal do Pará, Castanhal. O presente trabalho teve por objetivo utilizar a Reação em Cadeia da Polimerase convencional, multiplex e em tempo real (qPCR) na autenticação de carne moída bovina e na pesquisa de Salmonella spp. em produtos cárneos. Os resultados da presente Tese de Doutorado estão apresentados por meio de quatro artigos científicos que, em conjunto, validaram de forma comparativa a eficiência da PCR quantitativa em tempo real (qPCR) e da PCR multiplex para autenticação de carne moída bovina e, simultaneamente, evidenciaram a capacidade de detecção de fraude pela identificação espécie-específica de Bubalus bubalis, Equus caballus e Equus asinus africanus e muares. Adicionalmente, foi avaliada a capacidade dessas técnicas na pesquisa de Salmonella spp. e na correlação entre a presença de fraude e uma possível contaminação microbiológica por esse gênero bacteriano. Concluímos que os diferentes métodos, apresentados aqui nos quatro artigos científicos, foram validados para autenticação de produtos de origem bovina, ao mesmo tempo em que se mostraram eficientes para detectar a presença de fraude e na pesquisa de Salmonella spp. Adicionalmente foi incluído um Relatório de Atividades Complementares relacionados às experiências vivenciadas junto ao Programa de Doutorado Sanduíche no Exterior na Universidade de Pisa, Itália. Finalmente concluímos que embora os protocolos demonstrados sejam de extrema relevância, com elevada sensibilidade e especificidade, ainda se faz necessário que tais metodologias sejam aplicadas em alimentos comercialmente disponíveis, podendo vir a ser uma alternativa na rotina de fiscalização oficial desses produtos.

OLIVEIRA, Andrey. USE OF THE CONVENTIONAL, MULTIPLEX AND REAL-TIME POLYMER CHAIN REACTION (qPCR) IN THE AUTHENTICATION OF BOVINE MOIST MEAT AND IN THE RESEARCH OF Salmonella spp. IN MEAT PRODUCTS. 2017. 118f. Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal na Amazônia. Universidade Federal do Pará, Castanhal. The objective of the present work was to use the conventional Multiplex and Real-time Polymerase Chain Reaction (qPCR) in bovine ground beef and Salmonella spp. in meat products. The results of the present PhD thesis are presented through four scientific articles that, together, validated in a comparative way the efficiency of quantitative real-time PCR (qPCR) and the multiplex PCR for bovine ground meat authentication and, at the same time, evidenced the ability to detect fraud by species-specific identification of Bubalus bubalis, Equus caballus and Equus asinus africanus and mules. In addition, the ability of these techniques to evaluate Salmonella spp. and the correlation between the presence of fraud and possible microbiological contamination by this bacterial genus. We conclude that the different methods, presented here in the four scientific articles, were validated for the authentication of products of bovine origin, at the same time that they were efficient to detect the presence of fraud and in the research of Salmonella spp. In addition, a Report on Complementary Activities related to the experiences of the Sandwich Program Abroad at the University of Pisa, Italy, was included. Finally, we conclude that although the protocols shown are extremely relevant, with high sensitivity and specificity, it is still necessary that such methodologies be applied in commercially available foods, and may become an alternative in the routine inspection of these products.

Avaliação e aplicação de uma PCR multiplex para detecção de fraude por adição de carne bubalina em carne moída bovina.

O presente trabalho buscou avaliar a sensibilidade de uma PCR multiplex para detecção de fraude por adição intencional de carne moída bubalina em carne moída bovina e sua aplicação em amostras comercialmente disponíveis nos municípios de Belém e Santarém, estado do Pará e Macapá, estado do Amapá. Para tal, carnes moídas de bovinos contendo 0,01%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 99%, 99,9%, 99,99% de carne moída bubalina foram produzidas em triplicata com cinco réplicas, bem como carnes moídas exclusivamente de cada uma das espécies foram utilizadas como controle e Reação em Cadeia da Polimerase multiplex foi realizada, para cada tratamento. A fim de auxiliar a análise da sensibilidade do teste, percentagens conhecidas de DNA (0,01%, 0,1%, 1%, 5%,10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 99%, 99,9%, 99,99%) das espécies Bos taurus e Bubalus bubalis foram diluídas e misturadas em um volume final de 10 L e também foram testadas pela metodologia proposta. Adicionalmente, testou-se a hipótese da existência de fraudes pela venda indevida de carne moída bubalina em adição e/ou substituição à carne moída bovina em 91 amostras de carne moída comercializadas como sendo de origem bovina, em diferentes estabelecimentos na região norte do Brasil e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) multiplex proposta foi realizada. Os resultados demonstraram que a PCR multiplex proposta mostrou-se eficaz para a detecção simultânea de DNA de bovinos e bubalinos, com um limiar de 2,05ng de DNA bubalino e 0,41ng de DNA bovino, sendo capaz de identificar incrementos de 10% a 100% de carne bubalina em carnes moídas bovinas e incrementos de 0,1% a 100% de carne bovina em carnes moídas bubalinas, e demonstraram também que 17,5% das amostras coletadas continham carne bubalina. Concluiu-se que a PCR multiplex é uma de elevada precisão, capaz de detectar fraude por adição de carne bubalina em carne moída bovina.

This study evaluated the sensitivity of a multiplex PCR for deliberate addition to fraud detection in bovine buffalo ground beef ground beef and your application in commercially available samples in the cities of Belém and Santarém, Pará state and Macapá, Amapá state. To this end, ground beef meat containing 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 99.99% ground meat buffalo were made in triplicates with five replicates as well as ground meat exclusively from each species were used as control and Reaction Polymerase Chain multiplex was conducted for each treatment. To assist the analysis of the sensitivity of the assay, known percentages of DNA (0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 99.99%) of the species Bos taurus and Bubalus bubalis were diluted and mixed in a final volume of 10 uL and were also tested by the proposed method. In addition, we tested the hypothesis of fraud for the improper sale of ground beef buffalo in addition and / or replacement to bovine ground beef in 91 samples of ground beef marketed as being of bovine origin, in different establishments in northern Brazil and Polymerase Chain Reaction (PCR) was carried multiplex proposed. The results showed that multiplex PCR proposal proved to be effective for the simultaneous detection of DNA cattle and buffalo, with a threshold 2.05ng of DNA and buffalo 0.41ng bovine DNA, being able to identify increments of 10% to 100% buffalo meat beef ground meat and increments of 0.1% to 100% beef in ground buffalo meat, and also showed that 17.5% of the samples contained buffalo meat. It was concluded that the multiplex PCR is a high precision, able to detect fraud by adding buffalo meat beef ground beef.