Expression and antigenic analysis of the recombinant TRP36 protein from Ehrlichia canis São Paulo strain for serologic tests / Expressão e análise antigênica da proteína RTP36 recombinante da amostra São Paulo de Ehrlichia canis para testes sorológicos

Ehrlichia canis is the main etiological agent of canine monocytic ehrlichiosis (CME), a globally canine infectious disease. In Brazil, CME is considered to be endemic, and its prevalence can reach 65% in some states. The diagnosis of ehrlichiosis is important for treatment and epidemiological purposes. The E. canis TRP36 (Tandem Repeat Protein) protein elicits the earliest acute-phase antibody response observed during the course of the disease. This study aimed to generate the recombinant TRP36 protein from E. canis São Paulo strain and to evaluate its potential as a tool for the serologic diagnosis of CME. The E. canis São Paulo isolate was cultivated in DH82 lineage cells, and its genomic DNA was obtained. The bacterial DNA fragment encoding the entire ORF of TRP36 was cloned into the pBAD/Thio-TOPO vector and transformed into Escherichia coli DH10B competent cells with the trp36-bearing plasmid for protein expression. To evaluate the protein antigenicity, 16 canine serum samples were previously tested (by PCR and the commercial SNAP®4Dx® serological test). The results were in accordance with the SNAP®4Dx® test. Experiments using this recombinant protein as an antigen, targeting the development of a serologic test based on ELISA methodology, are the next step to produce a reliable, affordable and useful diagnostic tool for CME in Brazil.(AU)

Ehrlichia canis é o principal agente etiológico da erliquiose monocítica canina (EMC), uma doença infecciosa canina globalmente dispersa. No Brasil, a EMC é considerada endêmica, e a infecção pode atingir 65% em cães em alguns estados. O diagnóstico de erliquiose é importante para fins de tratamento e epidemiológicos. A proteína TRP36 de E. canis leva a uma resposta humoral com produção de anticorpos em fase aguda, encontrada durante o curso da doença. O objetivo deste estudo foi obter a proteína TRP36 recombinante da amostra São Paulo de E. canis e avaliar seu potencial como ferramenta para o diagnóstico sorológico da CME. O isolado de E. canis São Paulo foi cultivado em células da linhagem DH82 e o DNA genômico foi obtido. O fragmento de DNA bacteriano que codifica toda a ORF de TRP36 foi clonado no vetor pBAD / Thio-TOPO e transformado em células competentes Escherichia coli DH10B, com o plasmídeo portador de trp36 para expressão de proteínas. Para avaliar a antigenicidade da proteína, 16 amostras de soro canino foram previamente analisadas (por PCR e teste sorológico comercial SNAP®4Dx®). Os resultados estavam de acordo com o teste SNAP®4Dx®. Os experimentos que utilizam essa proteína recombinante como antígeno, visando ao desenvolvimento de um teste sorológico baseado no ELISA, são o próximo passo para produzir um teste de diagnóstico confiável, acessível e útil para o diagnóstico da EMC no Brasil.(AU)

Frequências dos tipos sanguíneos e títulos dos aloanticorpos em felinos domésticos / Frequency of blood groups and titers of alloantibodies in domestic cats

A área da hemoterapia necessita de testes de compatibilidade sanguínea confiáveis, como a tipagem sanguínea, para se evitarem possíveis reações transfusionais, mas em felinos é também importante para se evitar a isoeritrólise neonatal. Transfusões sanguíneas realizadas entre felinos doadores e receptores que não possuem compatibilidade sanguínea podem refletir em reação transfusional aguda, particularmente severa quando o sangue tipo A é transfundido em um gato tipo B, pois geralmente este último possui altos níveis de aloanticorpos de ocorrência natural. Portanto, o conhecimento da frequência dos tipos sanguíneos da população de gatos de uma região pode auxiliar na determinação dos riscos de reações transfusionais e de ocorrência de isoeritrólise neonatal. Tais riscos podem ser prevenidos com a tipagem sanguínea em casos de transfusão. Foram coletadas 100 amostras sanguíneas de felinos para a realização da tipagem sanguínea com plasmas reagentes anti-A e anti-B conhecidas e titulações de aloanticorpos anti-A e anti-B dos plasmas armazenados. A distribuição das frequências dos grupos sanguíneos foi 96% de felinos com tipo sanguíneo A e 4% de felinos com tipo sanguíneo B, não sendo encontrado na amostra populacional de felino tipo AB. Há um grande risco de reação adversa através da transfusão sanguínea randomizada entre felinos não tipados previamente

Hemotherapy requires reliable blood compatibility tests, such as blood typing, to avoid possible transfusion reactions in cats. However, it is also important to avoid neonatal isoerythrolysis. When blood transfusions are performed between incompatible feline donors and recipients, they may develop acute transfusion reactions, especially severe when type A blood is transfused into a type B cat because it has high levels of anti-A alloantibodies. Therefore, knowing on the blood type frequency in feline population of some region can help to determine the transfusion reaction risks and the occurrence of neonatal isoerythrolysis. Addicionally, such risks may be prevented through blood typing, in cases of transfusion. One hundred feline blood samples were collected and anti-A and anti-B blood reagent typing tests were performed, plus titration of alloantibodies of stored plasma. These tests showed a 96% frequency of type A blood and only 4% of type B blood among tested cats. We did not find any AB type blood cat. There is a great risk of adverse reactions after random blood transfusions between non-typed cats

Frequências dos tipos sanguíneos e títulos dos aloanticorpos em felinos domésticos / Frequency of blood groups and titers of alloantibodies in domestic cats

A área da hemoterapia necessita de testes de compatibilidade sanguínea confiáveis, como a tipagem sanguínea, para se evitarem possíveis reações transfusionais, mas em felinos é também importante para se evitar a isoeritrólise neonatal. Transfusões sanguíneas realizadas entre felinos doadores e receptores que não possuem compatibilidade sanguínea podem refletir em reação transfusional aguda, particularmente severa quando o sangue tipo A é transfundido em um gato tipo B, pois geralmente este último possui altos níveis de aloanticorpos de ocorrência natural. Portanto, o conhecimento da frequência dos tipos sanguíneos da população de gatos de uma região pode auxiliar na determinação dos riscos de reações transfusionais e de ocorrência de isoeritrólise neonatal. Tais riscos podem ser prevenidos com a tipagem sanguínea em casos de transfusão. Foram coletadas 100 amostras sanguíneas de felinos para a realização da tipagem sanguínea com plasmas reagentes anti-A e anti-B conhecidas e titulações de aloanticorpos anti-A e anti-B dos plasmas armazenados. A distribuição das frequências dos grupos sanguíneos foi 96% de felinos com tipo sanguíneo A e 4% de felinos com tipo sanguíneo B, não sendo encontrado na amostra populacional de felino tipo AB. Há um grande risco de reação adversa através da transfusão sanguínea randomizada entre felinos não tipados previamente(AU)

Hemotherapy requires reliable blood compatibility tests, such as blood typing, to avoid possible transfusion reactions in cats. However, it is also important to avoid neonatal isoerythrolysis. When blood transfusions are performed between incompatible feline donors and recipients, they may develop acute transfusion reactions, especially severe when type A blood is transfused into a type B cat because it has high levels of anti-A alloantibodies. Therefore, knowing on the blood type frequency in feline population of some region can help to determine the transfusion reaction risks and the occurrence of neonatal isoerythrolysis. Addicionally, such risks may be prevented through blood typing, in cases of transfusion. One hundred feline blood samples were collected and anti-A and anti-B blood reagent typing tests were performed, plus titration of alloantibodies of stored plasma. These tests showed a 96% frequency of type A blood and only 4% of type B blood among tested cats. We did not find any AB type blood cat. There is a great risk of adverse reactions after random blood transfusions between non-typed cats(AU)

FREQUÊNCIAS DOS TIPOS SANGUÍNEOS E TÍTULOS DOS ALOANTICORPOS EM FELINOS DOMÉSTICOS

Abstract Hemotherapy requires reliable blood compatibility tests, such as blood typing, to avoid possible transfusion reactions in cats. However, it is also important to avoid neonatal isoerythrolysis. When blood transfusions are performed between incompatible feline donors and recipients, they may develop acute transfusion reactions, especially severe when type A blood is transfused into a type B cat because it has high levels of anti-A alloantibodies. Therefore, knowing on the blood type frequency in feline population of some region can help to determine the transfusion reaction risks and the occurrence of neonatal isoerythrolysis. Addicionally, such risks may be prevented through blood typing, in cases of transfusion. One hundred feline blood samples were collected and anti-A and anti-B blood reagent typing tests were performed, plus titration of alloantibodies of stored plasma. These tests showed a 96% frequency of type A blood and only 4% of type B blood among tested cats. We did not find any AB type blood cat. There is a great risk of adverse reactions after random blood transfusions between non-typed cats.

Resumo A área da hemoterapia necessita de testes de compatibilidade sanguínea confiáveis, como a tipagem sanguínea, para se evitarem possíveis reações transfusionais, mas em felinos é também importante para se evitar a isoeritrólise neonatal. Transfusões sanguíneas realizadas entre felinos doadores e receptores que não possuem compatibilidade sanguínea podem refletir em reação transfusional aguda, particularmente severa quando o sangue tipo A é transfundido em um gato tipo B, pois geralmente este último possui altos níveis de aloanticorpos de ocorrência natural. Portanto, o conhecimento da frequência dos tipos sanguíneos da população de gatos de uma região pode auxiliar na determinação dos riscos de reações transfusionais e de ocorrência de isoeritrólise neonatal. Tais riscos podem ser prevenidos com a tipagem sanguínea em casos de transfusão. Foram coletadas 100 amostras sanguíneas de felinos para a realização da tipagem sanguínea com plasmas reagentes anti-A e anti-B conhecidas e titulações de aloanticorpos anti-A e anti-B dos plasmas armazenados. A distribuição das frequências dos grupos sanguíneos foi 96% de felinos com tipo sanguíneo A e 4% de felinos com tipo sanguíneo B, não sendo encontrado na amostra populacional de felino tipo AB. Há um grande risco de reação adversa através da transfusão sanguínea randomizada entre felinos não tipados previamente.

Obtenção de antígeno de Ehrlichia canis para desenvolvimento de teste sorológico visando o diagnostico de ehrlichiose canina

A ehrlichiose canina é doença causada por bactérias Gram negativas estritamente intracelular, que pertencem ao gênero Ehrlichia.Diferentes espécies deste gênero podem parasitar leucócitos, eritrócitos e plaquetas e desencadear alterações patológicas em vários órgãos . O principal agente etiológico da ehrichiose canina é a espécie Ehrlichia canis. O diagnostico etiológico da ehrlichiose é importante para o tratamento e monitoramento epidemiológico da doença. O diagnostico laboratorial pode ser realizado através da visualização de mórulas em esfregaços sanguíneos, podendo ser confirmado pela titulação de anticorpos séricos, pelo isolamento do microrganismo ou ainda pela detecção do DNA da Ehrlichia spp pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). Os testes sorológicos são os mais indicados devido ás dificuldades encontradas nos testes de detecção direta do microrganismo. Entretanto, reações cruzadas podem ocorrer devido a antígenos comuns presentes nas diferentes espécies de gênero Ehrlichia. Proteínas antigênicas de superfície, características de E. canis, tem sido pesquisadas com o objetivo de melhorar a especificidade dos testes sorológicos. A identificação dessas moléculas tem possibilitado a obtenção de proteínas recombinantes que podem ser utilizadas como antígenos específicos evitando assim possíveis reações cruzadas. A produção de antígenos pela tecnologia do DNA recombinante permite a obtenção de grande quantidade de proteínas especificas a partir de cultura celular sem a necessidade de utilizar modelos in vivo (animais-infecções experimentais). Os testes comerciais para diagnostico da ehrlichiose canina são importados e onerosos para o clínico veterinário. Desta forma, o objetivo deste estudo foi obter, pela tecnologia do DNA recombinante, uma proteína antigênica de E. canis e avaliar a aplicação desse produto em testes imunológicos visando o diagnostico sorológicos da ehrlichiose canina. Para tanto, um isolado de E. canis (amostra São Paulo)foi cultivado em células DH82 para obtenção do DNA da bactéria. Após amplificação do DNA bacteriano, correspondente à porção antigênica da proteína TRP36, o fragmento foi ligado ao vetor de clonagem pBAD/Thio –TOPO. O plasmidio contendo o gene codificado da TRP36 foi transferido por eletroporação para células E. coli DH-10B para expressão da proteína TRP36. Após isolamento por cromatografia de afinidade, a proteína recombinante foi avaliada por ensaios imunológicos quanto a sua antigenicidade. Os testes de ELISA indireto e Western blot, utilizando a TRP36 como antígeno, revelaram a presença de anticorpos específicos nos soros de animais infectados naturalmente com E. canis. Estes resultados confirmam a antigenidade da proteína recombinante obtida. Os resultados dos testes preliminares de aglutinação do látex sensibilizado com essa proteína como antígeno, indicam a possibilidade de usar essa molécula recombinante no sorodiagnóstico da ehrlichiose canina.

Obtenção de antígeno de Ehrlichia canis para desenvolvimento de teste sorológico visando o diagnostico de ehrlichiose canina

A ehrlichiose canina é doença causada por bactérias Gram negativas estritamente intracelular, que pertencem ao gênero Ehrlichia.Diferentes espécies deste gênero podem parasitar leucócitos, eritrócitos e plaquetas e desencadear alterações patológicas em vários órgãos . O principal agente etiológico da ehrichiose canina é a espécie Ehrlichia canis. O diagnostico etiológico da ehrlichiose é importante para o tratamento e monitoramento epidemiológico da doença. O diagnostico laboratorial pode ser realizado através da visualização de mórulas em esfregaços sanguíneos, podendo ser confirmado pela titulação de anticorpos séricos, pelo isolamento do microrganismo ou ainda pela detecção do DNA da Ehrlichia spp pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). Os testes sorológicos são os mais indicados devido ás dificuldades encontradas nos testes de detecção direta do microrganismo. Entretanto, reações cruzadas podem ocorrer devido a antígenos comuns presentes nas diferentes espécies de gênero Ehrlichia. Proteínas antigênicas de superfície, características de E. canis, tem sido pesquisadas com o objetivo de melhorar a especificidade dos testes sorológicos. A identificação dessas moléculas tem possibilitado a obtenção de proteínas recombinantes que podem ser utilizadas como antígenos específicos evitando assim possíveis reações cruzadas. A produção de antígenos pela tecnologia do DNA recombinante permite a obtenção de grande quantidade de proteínas especificas a partir de cultura celular sem a necessidade de utilizar modelos in vivo (animais-infecções experimentais). Os testes comerciais para diagnostico da ehrlichiose canina são importados e onerosos para o clínico veterinário. Desta forma, o objetivo deste estudo foi obter, pela tecnologia do DNA recombinante, uma proteína antigênica de E. canis e avaliar a aplicação desse produto em testes imunológicos visando o diagnostico sorológicos da ehrlichiose canina. Para tanto, um isolado de E. canis (amostra São Paulo)foi cultivado em células DH82 para obtenção do DNA da bactéria. Após amplificação do DNA bacteriano, correspondente à porção antigênica da proteína TRP36, o fragmento foi ligado ao vetor de clonagem pBAD/Thio –TOPO. O plasmidio contendo o gene codificado da TRP36 foi transferido por eletroporação para células E. coli DH-10B para expressão da proteína TRP36. Após isolamento por cromatografia de afinidade, a proteína recombinante foi avaliada por ensaios imunológicos quanto a sua antigenicidade. Os testes de ELISA indireto e Western blot, utilizando a TRP36 como antígeno, revelaram a presença de anticorpos específicos nos soros de animais infectados naturalmente com E. canis. Estes resultados confirmam a antigenidade da proteína recombinante obtida. Os resultados dos testes preliminares de aglutinação do látex sensibilizado com essa proteína como antígeno, indicam a possibilidade de usar essa molécula recombinante no sorodiagnóstico da ehrlichiose canina.(AU)

Grupo sangüíneo de gato doméstico pelo curto: um estudo no municipio do rio de janeiro

A transfusão sangüínea em cães e gatos é um procedimento terapêutico que começou a ser utilizado pela Medicina Veterinária há poucas décadas. Para que os procedimentos hemoterápicos tenham o êxito esperado é necessário levar em conta a existência dos grupos sangüíneos conhecidos e a freqüência em que aparecem na população de animais doadores e receptores de sangue, além da possível existência de aloanticorpos naturais contra antígenos de grupos sanguíneos distintos. No caso dos felinos, identificam-se os grupos sanguíneos A, B e AB e os anticorpos para seus aloantígenos. Esses anticorpos podem desencadear reações imunológicas de caráter imediato em procedimentos transfusionais, levando o receptor de sangue ao óbito caso não seja tipado corretamente. Com o objetivo de estabelecer as técnicas laboratoriais necessárias para a classificação, em grupos sanguíneos, de gatos do município do Rio de Janeiro foram efetuadas análises de sangue de felinos, machos e fêmeas, de idade variável, pela reação de hemaglutinação com aloantissoros e a lectina de germe de trigo. Pelos resultados obtidos, verificou-se que a maioria dos animais tipados (94,77% de 172 gatos Domésticos de PELO curto) pertence ao grupo sanguíneo A. Os animais restantes foram classificados nos grupos sanguíneos B (2,91%) e AB (2,33%). A titulação dos soros desses animais mostrou diferenças significantes quanto à presença dos aloanticorpos anti-A e anti-B. Nos animais do tipo A verificou-se desde a ausência de anticorpos até o título hemaglutinante de 1:256 quando testados com hemácias dos animais classificados no grupo B. Todos os animais do tipo B apresentaram anticorpos naturais anti-A no soro, com títulos hemaglutinantes entre 1:16 a 1:128. Os animais do tipo AB não apresentaram aloanticorpos anti-A e anti-B. Concluiu-se que a metodologia utilizada neste estudo pode ser aplicada para a identificação dos tipos sanguíneos de animais doadores e receptores de sangue, submetidos a procedimentos hemoterápicos no município do Rio de Janeiro