In-house serological ELISA as a leishmaniosis diagnostic test: development and applications in canines from the western border of Brazil / ELISA "in house" para o diagnóstico de leishmaniose: desenvolvimento e aplicação em caninos da fronteira Oeste do Brasil

ABSTRACT: Leishmaniosis is a great public health problem affecting both humans and animals. The disease is caused by the protozoan Leishmania spp., which has a complex cycle involving a phlebotomine vector. The ELISA test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) along with a chromatographic immunoassay was defined by the Brazil Health Ministry as the confirmatory screening protocol in 2011. Uruguaiana city is 630 km away from Porto Alegre, which makes it difficult to send samples and diagnose leishmaniasis, as well as receive quick results. In view of this, the present study evaluated an in-house indirect ELISA method compared to indirect immunofluorescence assay (IFA) and dual-path platform chromatographic immunoassay (DPP-BioManguinhos®) for the detection of an immune response to Leishmania spp. in canine species. The serological evaluation included 48 canines from the western border of Brazil (Uruguaiana and Barra do Quaraí city). Among the 48 canine samples tested, 18 were positive when using the ELISA technique, 19 were positive with IFA, and 17 were positive with rapid test DPP®. The ELISA technique showed a sensitivity/specificity of 83.3%/86.7% when compared to IFA and 100%/96.8% compared to DPP®. The present study showed a prevalence of 37.5%, demonstrating that the infection circulates in the studied population. It can be concluded that the ELISA technique was valuable for use in field conditions when performing screening tests in endemic areas.

RESUMO: A leishmaniose é um grande problema de saúde pública que afeta tanto humanos quanto animais. A doença é causada pelo protozoário Leishmania spp., que possui um ciclo complexo envolvendo um vetor flebotomíneo. O teste ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), juntamente com um imunoensaio cromatográfico, foi definido pelo Ministério da Saúde do Brasil como protocolo de triagem confirmatória em 2011. A cidade de Uruguaiana fica a 630 km de Porto Alegre, o que dificulta o envio de amostras e o diagnóstico da leishmaniose, além da demora para obter os resultados. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo avaliar um método de ELISA indireto in-house comparado ao ensaio de imunofluorescência indireta (IFA) e imunoensaio cromatográfico de plataforma de dupla via (DPP-BioManguinhos®) para a detecção de uma resposta imune contra Leishmania spp. na espécie canina. A avaliação sorológica incluiu 48 caninos da fronteira oeste do Brasil (cidade de Uruguaiana e Barra do Quaraí). Das 48 amostras caninas testadas, 18 foram positivas na técnica de ELISA, 19 foram positivas com IFA e 17 foram positivas com o teste rápido DPP®. A técnica de ELISA apresentou sensibilidade/especificidade de 83,3%/86,7% quando comparada ao IFA e 100%/96,8% em relação ao DPP®. O presente estudo apresentou prevalência de 37,5%, demonstrando que a infecção circula na população estudada. Pode-se concluir que a técnica de ELISA foi valiosa para uso em condições de campo na realização de testes de triagem em áreas endêmicas.

In-house serological ELISA as a leishmaniosis diagnostic test: development and applications in canines from the western border of Brazil / ELISA "in house" para o diagnóstico de leishmaniose: desenvolvimento e aplicação em caninos da fronteira Oeste do Brasil

Leishmaniosis is a great public health problem affecting both humans and animals. The disease is caused by the protozoan Leishmania spp., which has a complex cycle involving a phlebotomine vector. The ELISA test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) along with a chromatographic immunoassay was defined by the Brazil Health Ministry as the confirmatory screening protocol in 2011. Uruguaiana city is 630 km away from Porto Alegre, which makes it difficult to send samples and diagnose leishmaniasis, as well as receive quick results. In view of this, the present study evaluated an in-house indirect ELISA method compared to indirect immunofluorescence assay (IFA) and dual-path platform chromatographic immunoassay (DPP-BioManguinhos®) for the detection of an immune response to Leishmania spp. in canine species. The serological evaluation included 48 canines from the western border of Brazil (Uruguaiana and Barra do Quaraí city). Among the 48 canine samples tested, 18 were positive when using the ELISA technique, 19 were positive with IFA, and 17 were positive with rapid test DPP®. The ELISA technique showed a sensitivity/specificity of 83.3%/86.7% when compared to IFA and 100%/96.8% compared to DPP®. The present study showed a prevalence of 37.5%, demonstrating that the infection circulates in the studied population. It can be concluded that the ELISA technique was valuable for use in field conditions when performing screening tests in endemic areas.

A leishmaniose é um grande problema de saúde pública que afeta tanto humanos quanto animais. A doença é causada pelo protozoário Leishmania spp., que possui um ciclo complexo envolvendo um vetor flebotomíneo. O teste ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), juntamente com um imunoensaio cromatográfico, foi definido pelo Ministério da Saúde do Brasil como protocolo de triagem confirmatória em 2011. A cidade de Uruguaiana fica a 630 km de Porto Alegre, o que dificulta o envio de amostras e o diagnóstico da leishmaniose, além da demora para obter os resultados. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo avaliar um método de ELISA indireto in-house comparado ao ensaio de imunofluorescência indireta (IFA) e imunoensaio cromatográfico de plataforma de dupla via (DPP-BioManguinhos®) para a detecção de uma resposta imune contra Leishmania spp. na espécie canina. A avaliação sorológica incluiu 48 caninos da fronteira oeste do Brasil (cidade de Uruguaiana e Barra do Quaraí). Das 48 amostras caninas testadas, 18 foram positivas na técnica de ELISA, 19 foram positivas com IFA e 17 foram positivas com o teste rápido DPP®. A técnica de ELISA apresentou sensibilidade/especificidade de 83,3%/86,7% quando comparada ao IFA e 100%/96,8% em relação ao DPP®. O presente estudo apresentou prevalência de 37,5%, demonstrando que a infecção circula na população estudada. Pode-se concluir que a técnica de ELISA foi valiosa para uso em condições de campo na realização de testes de triagem em áreas endêmicas.

PCR-RLFP characterization of Leishmania spp. in domestic animals from the south-western border of Brazil / Caracterização de Leishmania spp. pela técnica de PCR-RFLP em animais domésticos da fronteira Oeste do Brasil

The aim of this study was to characterize Leishmania spp. from canine and feline samples using Polymerase Chain Reaction (PCR)- Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). It was conducted in the southern region of Brazil, located at border crossings to Argentina and Uruguay. Samples were collected from 116 dogs (Canis lupus familiaris) and 89 cats (Felis catus). The PCR was performed to screen for an LT1 fragment from kinetoplast DNA (kDNA) target gene, and positive samples were subjected to a second PCR for an internal transcribed spacers (ITS1) region from ribosomal DNA (rDNA) target. RFLP was performed using the Haemophilus aegyptius (HAE III) restriction endonuclease (Fermentas ®). Positive samples by PCR ITS1 were sequenced and deposited in NCBI GenBank, and a phylogenetic analysis was developed. We found that 12.9% (15/116) of the samples from dogs were positive. All the 89 cat samples were negative. Positive samples were tested against Leishmania reference strains presenting different patterns in PCR-RFLP, and these samples showed bands denoting similarity to the standard species of Leishmania infantum, proven through sequencing and phylogenetic analysis. The RFLP technique, alone, was shown to be feasible for practical application and confirmation of the involved Leishmania spp.(AU)

O objetivo deste trabalho foi caracterizar espécies de Leishmania em amostras de caninos e felinos, utilizando-se a reação em cadeia da polimerase (PCR)- polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP). O estudo foi realizado na região de fronteira no sul do Brasil, divisa com Argentina e Uruguai. Amostras foram coletadas de 116 cães (Canis lupus familiaris) e 89 gatos (Felis catus). A PCR foi realizada com o gene alvo do fragmento LT1 do DNA do cinetoplasto (kDNA) para triagem e, as amostras positivas foram submetidas a uma segunda PCR com alvo ITS1 no DNA ribossomal (rDNA). O RFLP foi realizado com a endonuclease de restrição Haemophilus aegyptius (HAE III) (Fermentas ®). As sequências positivas no PCR-ITS1 foram depositadas no NCBI GenBank, além disso, a análise filogenética foi realizada. Foram detectadas 12,9% (15/116) amostras positivas em cães. Das 89 amostras de gatos todas foram negativas. Cepas de referência de Leishmania, com padrões diferentes na PCR-RFLP, e amostras positivas apresentaram similaridade das bandas com as espécies padrão de Leishmania infantum, o que foi comprovado no sequenciamento e análise filogenética. A técnica de RFLP, sozinha, demonstrou viabilidade para a aplicação prática e a confirmação das espécies de Leishmania spp. envolvidas.(AU)

Identification of Leishmania spp. in horses and a dog from rural areas of Uruguaiana, Rio Grande do Sul, Brazil / Identificação de Leishmania spp. em equinos e um cão da área rural de Uruguaiana, Rio Grande do Sul, Brasil

Visceral leishmaniasis (VL) is a zoonosis caused by the protozoan of the genus Leishmania. The disease is transmitted by the bite of a sand fly vector. Although the main reservoirs are dogs, other hosts can be infected and may play this role. Rio Grande do Sul western region, located on the triple border of Brazil-Uruguay-Argentina, represents a VL transmission area. The goal of the present study was to identify Leishmania spp. infection in animals from rural areas of Uruguaiana, Rio Grande do Sul. Nine farms in the Uruguaiana municipality, Rio Grande do Sul state, were included. Peripheral blood samples were collected from 113 animals (canine [n=22], equine [n=91]) for detection of Leishmania spp. DNA was isolated and polymerase chain reaction was performed. Eight (7%) animals with Leishmania spp. infection were detected on two farms in the same geographical area, seven of which were horses and one was canine, all of which were asymptomatic. To investigate the species of Leishmania, one of the positive equine samples was subjected to direct sequencing, which confirmed the presence of L. infantum genetic material. Results of this study confirm the presence of L. infantum-infected animals in rural areas of Uruguaiana, and provide evidence supporting further investigation of risk factors for dissemination in such áreas.(AU)

A leishmaniose visceral é uma zoonose causada por protozoários do gênero Leishmania. A doença é transmitida pela picada de um vetor flebotomíneo. Os principais reservatórios são cães, porém outros mamíferos podem se infectar e desempenhar esse papel. A região oeste do Rio Grande do Sul, localizada na tríplice fronteira Brasil-Uruguai-Argentina, representa uma área de transmissão para a leishmaniose visceral. O objetivo deste estudo foi identificar a infecção por Leishmania spp. em animais de áreas rurais de Uruguaiana, Rio Grande do Sul. Nove fazendas do município de Uruguaiana, no Rio Grande do Sul, and foram incluídas. O sangue periférico foi coletado de 113 animais, caninos (n = 22) e equinos (n = 91), para a pesquisa de DNA de Leishmania spp. por reação em cadeia da polimerase (PCR). Oito animais infectados por Leishmania spp. (7%) foram detectados em duas fazendas na mesma área geográfica, sete equinos e um canino. Todos eles eram assintomáticos. Para investigar as espécies de Leishmania, uma das amostras positivas da espécie equina, também foi submetida ao sequenciamento e a presença de material genético de L. infantum foi confirmada. Este estudo garante a existência de animais infectados por Leishmania infantum nas áreas rurais de Uruguaiana e evidencia a importância de estudos para investigar os fatores de risco de disseminação nestes locais.(AU)

Applications of polymerase chain reaction for the detection of equine Leishmania sp. infection / Aplicação da reação em cadeia da polimerase na detecção da infecção por Leishmania sp. em equinos

Leishmaniasis is a neglected zoonotic disease caused by a variety of pathogenic Leishmania species. In the New World, especially in Brazil, visceral leishmaniasis (VL) is caused by Leishmania infantum. The pathogen can infect several animal species including dogs, foxes, rodents, primates, felines, equines and humans. Dogs act as the primary domestic reservoirs. This study aimed to use polymerase chain reaction (PCR) for detecting Leishmania infection in horses living in a canine visceral leishmaniasis (CVL) endemic region. DNA samples from horse peripheral blood were used to perform PCR. Templates were amplified using primers for the kinetoplast DNA (kDNA) minicircles, which were able to detect different species of Leishmania. In addition, primers for internal transcribed spacer (ITS) of ribosomal DNA were used for detection of Trypanosomatidae sp. Amongst the 75 (39%) positive PCR samples from total 192 samples, 21 samples were positive for kDNA and 63 samples were positive for either ITS, ITS1, or ITS2 gene markers. The kDNA PCR and sequencing allowed the detection of L. infantum in horse blood samples. To our knowledge, this is the first report of equine infection with L. infantum in Southern Brazil. These results proved that L. infantum could also infect horses in addition to humans and dogs, as well as in European countries. This conclusion emphasizes the urgent need to follow up investigation of the infection in these animals.

A leishmaniose é uma doença zoonótica negligenciada, causada por uma diversidade de espécies patogênicas de Leishmania. No Novo Mundo, especialmente no Brasil, a leishmaniose visceral é causada pelo protozoário Leishmania infantum. A infecção acomete várias espécies animais (cães, raposas, roedores, primatas, felinos, equinos) e humanos e o cão é o principal reservatório doméstico. Este estudo teve como objetivo utilizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) para detectar a infecção por Leishmania sp. em cavalos que vivem em uma região endêmica para leishmaniose visceral canina (LVC). Amostras de DNA do sangue periférico de equinos foram utilizadas para extração de DNA e PCR. As amplificações foram realizadas utilizando-se marcadores para a região do DNA do cinetoplasto (kDNA), que são capazes de detectar diferentes espécies de Leishmania sp. e a região dos espaçadores internos transcritos (ITS) do DNA ribossomal para detecção da família Trypanosomatidae. Dentre os 192 animais testados, 75 (39%) amostras foram positivas no PCR, 21 amostras foram positivas para PCR kDNA e 63 para os genes ITS, ITS1 e ITS2. O sequenciamento dos amplicons permitiu detectar L. infantum em amostras de sangue periférico de equinos. Este foi o primeiro relato de infecção por L. infantum no sul do Brasil na espécie equina. Os resultados demonstram que, assim como nos países europeus, a infecção foi detectada em equinos após ter sido identificada em seres humanos e cães, o que indica a urgência em acompanhar a investigação da infecção nessa espécie animal.

Applications of polymerase chain reaction for the detection of equine Leishmania sp. infection / Aplicação da reação em cadeia da polimerase na detecção da infecção por Leishmania sp. em equinos

Leishmaniasis is a neglected zoonotic disease caused by a variety of pathogenic Leishmania species. In the New World, especially in Brazil, visceral leishmaniasis (VL) is caused by Leishmania infantum. The pathogen can infect several animal species including dogs, foxes, rodents, primates, felines, equines and humans. Dogs act as the primary domestic reservoirs. This study aimed to use polymerase chain reaction (PCR) for detecting Leishmania infection in horses living in a canine visceral leishmaniasis (CVL) endemic region. DNA samples from horse peripheral blood were used to perform PCR. Templates were amplified using primers for the kinetoplast DNA (kDNA) minicircles, which were able to detect different species of Leishmania. In addition, primers for internal transcribed spacer (ITS) of ribosomal DNA were used for detection of Trypanosomatidae sp. Amongst the 75 (39%) positive PCR samples from total 192 samples, 21 samples were positive for kDNA and 63 samples were positive for either ITS, ITS1, or ITS2 gene markers. The kDNA PCR and sequencing allowed the detection of L. infantum in horse blood samples. To our knowledge, this is the first report of equine infection with L. infantum in Southern Brazil. These results proved that L. infantum could also infect horses in addition to humans and dogs, as well as in European countries. This conclusion emphasizes the urgent need to follow up investigation of the infection in these animals.(AU)

A leishmaniose é uma doença zoonótica negligenciada, causada por uma diversidade de espécies patogênicas de Leishmania. No Novo Mundo, especialmente no Brasil, a leishmaniose visceral é causada pelo protozoário Leishmania infantum. A infecção acomete várias espécies animais (cães, raposas, roedores, primatas, felinos, equinos) e humanos e o cão é o principal reservatório doméstico. Este estudo teve como objetivo utilizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) para detectar a infecção por Leishmania sp. em cavalos que vivem em uma região endêmica para leishmaniose visceral canina (LVC). Amostras de DNA do sangue periférico de equinos foram utilizadas para extração de DNA e PCR. As amplificações foram realizadas utilizando-se marcadores para a região do DNA do cinetoplasto (kDNA), que são capazes de detectar diferentes espécies de Leishmania sp. e a região dos espaçadores internos transcritos (ITS) do DNA ribossomal para detecção da família Trypanosomatidae. Dentre os 192 animais testados, 75 (39%) amostras foram positivas no PCR, 21 amostras foram positivas para PCR kDNA e 63 para os genes ITS, ITS1 e ITS2. O sequenciamento dos amplicons permitiu detectar L. infantum em amostras de sangue periférico de equinos. Este foi o primeiro relato de infecção por L. infantum no sul do Brasil na espécie equina. Os resultados demonstram que, assim como nos países europeus, a infecção foi detectada em equinos após ter sido identificada em seres humanos e cães, o que indica a urgência em acompanhar a investigação da infecção nessa espécie animal.(AU)

Risk factors associated to canine visceral leishmaniasis in Uruguaiana city, Brazil / Fatores de risco associados à leishmaniose visceral canina no município de Uruguaiana-RS

The present study aimed to evaluate factors associated with canine visceral leishmaniasis (CVL) in areas with higher seroprevalence of it in Uruguaiana city, Rio Grande do Sul state, Brazil, during the year of 2012. A semi-structured questionnaire with socioeconomic and environmental questions was applied in Leishmania endemic regions of the city. The survey data were analyzed by multivariate statistics and the associations between them were presented as odds ratio within a 95% confidence limit. The relationships between the studied variables showed no statistically significant difference between the dwellings with positive and negative dogs. However, when analyzing the odds ratio, the presence of green areas larger than 10m² turned the house into an area of potential risk for CVL (OR= 2.53). There was no difference among the socioeconomic variables education and income, though the groups with lower education and income showed a higher seroprevalence of CVL. The city of Uruguaiana is already located within the CVL broadcasting area and is taken as an endemic region of the disease, with seropositive dogs in all neighborhoods. Thus, the determinants for an increased Leishmania sp. infection could not be indicated, even so, the maintenance of green areas around the households represented a risk factor for being a potential vector shelter.

O objetivo da presente pesquisa foi avaliar potenciais fatores de risco associados à ocorrência de leishmaniose visceral canina (LVC) em áreas de maior prevalência no município de Uruguaiana/RS, no ano de 2012. Foram aplicados questionários semiestruturados com questões socioeconômicas e ambientais em bairros endêmicos para LVC no município de Uruguaiana. Os dados foram analisados por meio de análise multivariada e as associações entre as variáveis foram expressas em odds ratio com intervalos de confiança de 95%. As relações entre as variáveis estudadas não apresentaram diferença estatística significativa quando se comparou residências com cães positivos àquelas com cães negativos. Entretanto, a presença de área verde maior que 10m² apresentou-se como um potencial fator de risco (OR = 2,53) para LVC. Não houve diferença significativa entre as variáveis socioeconômicas, escolaridade e renda embora, nos grupos de menor escolaridade e de menor renda familiar, tenha havido maior soro prevalência para LVC. O município de Uruguaiana-RS já pertence à área de transmissão de LVC tornando-se uma região endêmica da doença, com presença de cães soropositivos em todos os bairros. Desta forma, não foi possível apontar os determinantes para o aumento da infecção por Leishmania sp, embora a manutenção de áreas verdes peridomiciliares tenha representado um fator de risco devido à conservação do vetor nesses locais.

Risk factors associated to canine visceral leishmaniasis in Uruguaiana city, Brazil / Fatores de risco associados à leishmaniose visceral canina no município de Uruguaiana-RS

The present study aimed to evaluate factors associated with canine visceral leishmaniasis (CVL) in areas with higher seroprevalence of it in Uruguaiana city, Rio Grande do Sul state, Brazil, during the year of 2012. A semi-structured questionnaire with socioeconomic and environmental questions was applied in Leishmania endemic regions of the city. The survey data were analyzed by multivariate statistics and the associations between them were presented as odds ratio within a 95% confidence limit. The relationships between the studied variables showed no statistically significant difference between the dwellings with positive and negative dogs. However, when analyzing the odds ratio, the presence of green areas larger than 10m² turned the house into an area of potential risk for CVL (OR= 2.53). There was no difference among the socioeconomic variables education and income, though the groups with lower education and income showed a higher seroprevalence of CVL. The city of Uruguaiana is already located within the CVL broadcasting area and is taken as an endemic region of the disease, with seropositive dogs in all neighborhoods. Thus, the determinants for an increased Leishmania sp. infection could not be indicated, even so, the maintenance of green areas around the households represented a risk factor for being a potential vector shelter.(AU)

O objetivo da presente pesquisa foi avaliar potenciais fatores de risco associados à ocorrência de leishmaniose visceral canina (LVC) em áreas de maior prevalência no município de Uruguaiana/RS, no ano de 2012. Foram aplicados questionários semiestruturados com questões socioeconômicas e ambientais em bairros endêmicos para LVC no município de Uruguaiana. Os dados foram analisados por meio de análise multivariada e as associações entre as variáveis foram expressas em odds ratio com intervalos de confiança de 95%. As relações entre as variáveis estudadas não apresentaram diferença estatística significativa quando se comparou residências com cães positivos àquelas com cães negativos. Entretanto, a presença de área verde maior que 10m² apresentou-se como um potencial fator de risco (OR = 2,53) para LVC. Não houve diferença significativa entre as variáveis socioeconômicas, escolaridade e renda embora, nos grupos de menor escolaridade e de menor renda familiar, tenha havido maior soro prevalência para LVC. O município de Uruguaiana-RS já pertence à área de transmissão de LVC tornando-se uma região endêmica da doença, com presença de cães soropositivos em todos os bairros. Desta forma, não foi possível apontar os determinantes para o aumento da infecção por Leishmania sp, embora a manutenção de áreas verdes peridomiciliares tenha representado um fator de risco devido à conservação do vetor nesses locais.(AU)