Good practices in the rearing and maintenance of zebrafish (Danio rerio) in Brazilian laboratories / Boas práticas na criação e manutenção de zebrafish (Danio rerio) em laboratório no Brasil

Good Laboratory Practice (GLP) is a management quality control system that encompasses the organizational process and conditions under which non-clinical health and environmental studies are carried out. According to the World Health Organization, GLP must contain five topics: resources, characterization, rules, results, and quality control. The aim of this work is to address a review according to WHO standard to the implementation of Good Laboratory Practices in zebrafish (Danio rerio) facility. Considering that the promotion of one health (animal, human, and environmental) associated with an education plan, protocols, and records are fundamental to guarantee the safety and integrity of employees, animals and the environment as well as reliability in the results generated. In a way, Brazil still needs improvements related to the wellfare of aquatic organisms (national laws, international agreements, corporate programs, and others); especially in relation to its use in research and technological development. In this way, the implementation of GLPs provide valuable guidance for improving animal welfare and worker safety, facilitating the standardization of research.

As Boas Práticas de Laboratório (BPL) são um sistema de controle de qualidade gerencial que abrange o processo organizacional e as condições sob as quais os estudos não clínicos de saúde e meio ambiente são desenvolvidos. Conforme a Organização Mundial da Saúde (OMS) as BPL devem conter cinco tópicos: recursos, caracterização, regras, resultados e controle de qualidade. O objetivo deste trabalho foi apresentar uma revisão conforme o padrão da OMS para a implementação das BPL em biotério de zebrafish. Considerando que a promoção da saúde única (animal, humana e ambiental) associada a um plano de educação, protocolos e registros são fundamentais para garantir a segurança e a integridade dos trabalhadores/pesquisadores, animais e meio ambiente assim como confiabilidade nos resultados gerados. De certa forma o Brasil ainda necessita de melhorias relacionadas ao bem-estar de organismos aquáticos (leis nacionais, acordos internacionais, programas corporativos e outros); especialmente em relação à utilização destes na pesquisa e desenvolvimento tecnológico. Desta forma, a implementação de BPL fornece uma orientação valiosa para a melhoria do bem-estar animal, e segurança do trabalhador vindo a facilitar a padronização da pesquisa.

Billings reservoir (brazil): chemical studies on water and chemical and morphological studies on zebrafish gills / Represa billings (brasil): estudos químicos na água e estudos químicos e morfológicos nas brânquias de zebrafish

Previous study of this research group revealed that water from the Billings reservoir (Brazil) intended for human use (water supply and seafood) has microbiological contamination and causes lethality and brain and behavioral impairments in zebrafish. The objective of this study was to understand what have induced these impairments in the animal model. Chemical analyses on water samples from Rio Pequeno (RP), Rio Grande (RG), and Bororé (BO) rivers, as well as chemical and morphological analyses on zebrafish gills exposed to those waters were performed. Waters samples from RP, RG, and BO presented high levels of phosphorus. BO water and fish gills exposed to this water presented high levels of nitrogen. RG water caused potassium contamination in gills. Phosphorus, nitrogen, and potassium are indicators of anthropogenic pollution. RG water and fish gills exposed to this water presented low levels of calcium, which might be an indication of chemical imbalance that could lead to health problems in aquatic animals. RG and BO waters resulted in zirconium contamination in gills. BO water induced respiratory lamellae thickening in the gills, which may be the underlying mechanism for the observed hypoxia. In conclusion, behavioral, brain, and respiratory defects observed previously were induced by chemical and morphological disturbances due to anthropogenic pollution in the Billings reservoir.

Estudos prévios deste grupo de pesquisa revelaram que a água da represa Billings (Brasil) utilizada para consumo humano apresenta contaminação microbiológica e induz danos comportamentais, encefálicos e letalidade em zebrafish. O objetivo deste estudo foi entender o que induziu esses danos no modelo animal. Foram realizadas análises químicas em amostras de água do Rio Pequeno (RP), do Rio Grande (RG) e de Bororé (BO), além de análises químicas e morfológicas nas brânquias de zebrafish expostos a estas águas. Amostras de água do RP, do RG e de BO apresentaram altos níveis de fósforo. Águas de BO e as brânquias dos zebrafish expostos a estas águas apresentaram altos níveis de nitrogênio. Águas do RG resultaram em contaminação por potássio nas brânquias. Fósforo, nitrogênio e potássio são indicadores de poluição antropogênica. Águas do RG e as brânquias dos zebrafish expostos a estas águas apresentaram baixos níveis de cálcio, um indicativo de problemas na saúde animal. Águas do RG e de BO resultaram em contaminação por zircônio nas brânquias. Águas de BO induziram espessamento das lamelas respiratórias das brânquias, que deve ser o mecanismo subjacente para a hipóxia observada. Conclui-se que os danos comportamentais, encefálicos e respiratórios observados anteriormente foram induzidos por distúrbios químicos e morfológicos em decorrência de poluição antropogênica na represa Billings.

Billings reservoir (brazil): chemical studies on water and chemical and morphological studies on zebrafish gills / Represa billings (brasil): estudos químicos na água e estudos químicos e morfológicos nas brânquias de zebrafish

Previous study of this research group revealed that water from the Billings reservoir (Brazil) intended for human use (water supply and seafood) has microbiological contamination and causes lethality and brain and behavioral impairments in zebrafish. The objective of this study was to understand what have induced these impairments in the animal model. Chemical analyses on water samples from Rio Pequeno (RP), Rio Grande (RG), and Bororé (BO) rivers, as well as chemical and morphological analyses on zebrafish gills exposed to those waters were performed. Waters samples from RP, RG, and BO presented high levels of phosphorus. BO water and fish gills exposed to this water presented high levels of nitrogen. RG water caused potassium contamination in gills. Phosphorus, nitrogen, and potassium are indicators of anthropogenic pollution. RG water and fish gills exposed to this water presented low levels of calcium, which might be an indication of chemical imbalance that could lead to health problems in aquatic animals. RG and BO waters resulted in zirconium contamination in gills. BO water induced respiratory lamellae thickening in the gills, which may be the underlying mechanism for the observed hypoxia. In conclusion, behavioral, brain, and respiratory defects observed previously were induced by chemical and morphological disturbances due to anthropogenic pollution in the Billings reservoir.(AU)

Estudos prévios deste grupo de pesquisa revelaram que a água da represa Billings (Brasil) utilizada para consumo humano apresenta contaminação microbiológica e induz danos comportamentais, encefálicos e letalidade em zebrafish. O objetivo deste estudo foi entender o que induziu esses danos no modelo animal. Foram realizadas análises químicas em amostras de água do Rio Pequeno (RP), do Rio Grande (RG) e de Bororé (BO), além de análises químicas e morfológicas nas brânquias de zebrafish expostos a estas águas. Amostras de água do RP, do RG e de BO apresentaram altos níveis de fósforo. Águas de BO e as brânquias dos zebrafish expostos a estas águas apresentaram altos níveis de nitrogênio. Águas do RG resultaram em contaminação por potássio nas brânquias. Fósforo, nitrogênio e potássio são indicadores de poluição antropogênica. Águas do RG e as brânquias dos zebrafish expostos a estas águas apresentaram baixos níveis de cálcio, um indicativo de problemas na saúde animal. Águas do RG e de BO resultaram em contaminação por zircônio nas brânquias. Águas de BO induziram espessamento das lamelas respiratórias das brânquias, que deve ser o mecanismo subjacente para a hipóxia observada. Conclui-se que os danos comportamentais, encefálicos e respiratórios observados anteriormente foram induzidos por distúrbios químicos e morfológicos em decorrência de poluição antropogênica na represa Billings.(AU)

Behavior as an early sign of toxicity and respiratory system injury induced by cadmium in zebrafish / O comportamento como um sinal precoce de toxicidade e lesões no sistema respiratório induzidas por cádmio em zebrafish

The aim of the present study was to determine the validity of behavior as an early sign of toxicity and respiratory injuries induced by acute exposure to cadmium in adult zebrafish (Danio rerio). The effects of three cadmium concentrations (35, 45, and 55 µg/L) on zebrafish behavior (i.e., general activity, exploratory/motor behavior, climbing to the water surface, tremors, and erratic movements) and gill histology after 1 h of exposure was assessed.  Compared with controls, cadmium exposure increased the number of climbs to the water surface and total time spent at the water surface, increased the percentage and intensity of tremors, and increased erratic movements. Cadmium exposure also caused stage I injury to the gills, with the presence of chloride cells in secondary lamellae, dilation of the capillaries, hyperplasia of the gill epithelium, and fusion of the secondary gill lamellae. These effects were observed mainly at concentrations of 45 and 55 µg/L. Our results indicate that 45 and 55 µg/L cadmium induces behavioral dysfunction and 55 µg/L significant gill injury, even with only 1 h exposure, revealing respiratory system impairments. The present model may be an interesting tool for analyzing early toxicity and respiratory injuries  in fish.

O objetivo do presente estudo foi determinar a validade do comportamento como sinal precoce de toxicidade e as  lesões respiratórias induzidas pela exposição aguda de cádmio em peixe-zebra adulto (Danio rerio). Foram avaliados os efeitos de três concentrações de cádmio (35, 45 e 55 g / L) no comportamento do peixe-zebra (atividade geral, comportamento exploratório / motor, subida à superfície da água, tremores e movimentos erráticos) e a histologia das brânquias após 1 h de exposição.  Comparados aos grupos controle, a exposição dos peixes ao cádmio aumentou o número de subidas para a superfície da água, o tempo total gasto na superfície da água, a porcentagem e a intensidade dos tremores e de movimentos erráticos. A exposição ao cádmio também causou lesão de estágio I das brânquias, com presença de células de cloreto em lamelas secundárias, dilatação dos capilares, hiperplasia do epitélio branquial e fusão das lamelas de brânquias secundárias. Esses efeitos foram observados principalmente em concentrações de 45 e 55 g / L. Estes resultados indicam que as concentrações de 45 e 55 g / L de cádmio induzem disfunção comportamental e 55 ug/L lesão branquial, mesmo com apenas 1 hora de exposição, revelando comprometimento do sistema respiratório. O presente modelo pode ser uma ferramenta interessante para analisar toxicidade precoce e lesões respiratórias em peixes.

Behavior as an early sign of toxicity and respiratory system injury induced by cadmium in zebrafish / O comportamento como um sinal precoce de toxicidade e lesões no sistema respiratório induzidas por cádmio em zebrafish

The aim of the present study was to determine the validity of behavior as an early sign of toxicity and respiratory injuries induced by acute exposure to cadmium in adult zebrafish (Danio rerio). The effects of three cadmium concentrations (35, 45, and 55 µg/L) on zebrafish behavior (i.e., general activity, exploratory/motor behavior, climbing to the water surface, tremors, and erratic movements) and gill histology after 1 h of exposure was assessed.  Compared with controls, cadmium exposure increased the number of climbs to the water surface and total time spent at the water surface, increased the percentage and intensity of tremors, and increased erratic movements. Cadmium exposure also caused stage I injury to the gills, with the presence of chloride cells in secondary lamellae, dilation of the capillaries, hyperplasia of the gill epithelium, and fusion of the secondary gill lamellae. These effects were observed mainly at concentrations of 45 and 55 µg/L. Our results indicate that 45 and 55 µg/L cadmium induces behavioral dysfunction and 55 µg/L significant gill injury, even with only 1 h exposure, revealing respiratory system impairments. The present model may be an interesting tool for analyzing early toxicity and respiratory injuries  in fish.(AU)

O objetivo do presente estudo foi determinar a validade do comportamento como sinal precoce de toxicidade e as  lesões respiratórias induzidas pela exposição aguda de cádmio em peixe-zebra adulto (Danio rerio). Foram avaliados os efeitos de três concentrações de cádmio (35, 45 e 55 g / L) no comportamento do peixe-zebra (atividade geral, comportamento exploratório / motor, subida à superfície da água, tremores e movimentos erráticos) e a histologia das brânquias após 1 h de exposição.  Comparados aos grupos controle, a exposição dos peixes ao cádmio aumentou o número de subidas para a superfície da água, o tempo total gasto na superfície da água, a porcentagem e a intensidade dos tremores e de movimentos erráticos. A exposição ao cádmio também causou lesão de estágio I das brânquias, com presença de células de cloreto em lamelas secundárias, dilatação dos capilares, hiperplasia do epitélio branquial e fusão das lamelas de brânquias secundárias. Esses efeitos foram observados principalmente em concentrações de 45 e 55 g / L. Estes resultados indicam que as concentrações de 45 e 55 g / L de cádmio induzem disfunção comportamental e 55 ug/L lesão branquial, mesmo com apenas 1 hora de exposição, revelando comprometimento do sistema respiratório. O presente modelo pode ser uma ferramenta interessante para analisar toxicidade precoce e lesões respiratórias em peixes.(AU)

RESPOSTAS ECOTOXICOLÓGICAS E COMPORTAMENTAIS EM PEIXES SOB INFLUENCIA DE EFLUENTE DE PISCICULTURA

A produção aquícola mundial encontra-se em ampla expansão ano após ano. Este acelerado crescimento deve-se, em parte, ao avanço cientifico que proporcionou a intensificação da atividade, permitindo o cultivo de organismos aquáticos em maiores densidades de estocagem. Com o adensamento populacional, maiores cargas de nutrientes são despejados nos corpos hídricos, carreados pelos efluentes, que saem das fazendas de cultivo. Devido a isso, visando identificar possíveis efeitos tóxicos, realizamos a caracterização física e química do efluente de piscicultura e o utilizamos em ensaios ecotoxicológicos e testes comportamentais de movimentos espontâneos, frequência cardíaca e campo aberto com o organismos teste Danio rerio., Nossos resultados mostraram elevadas cargas de nutrientes no efluente, que podem causar diversos efeitos deletérios nos organismos vivos, os quais foram observados nos testes ecotoxicológicos e comportamentais. Desta forma, fica evidente que técnicas de tratamento de efluente são primordiais para mitigar os efeitos negativos e torna a atividade sustentável

World aquaculture production is expanding widely year after year. This accelerated growth is due, in part, to the scientific advance that provided the intensification of the activity, allowing the cultivation of aquatic organisms in higher stocking densities. With population densification, greater loads of nutrients are dumped into water bodies, carried by effluents, which leave the cultivation farms. Because of this, in order to identify possible toxic effects, we carried out the physical and chemical characterization of fish farm effluent and used it in ecotoxicological tests and behavioral tests of spontaneous movements, heart rate and open field with the test organisms Danio rerio. Our results showed high loads of nutrients in the effluent, which can cause several deleterious effects on living organisms, which were observed in ecotoxicological and behavioral tests. In this way, it is evident that effluent treatment techniques are essential to mitigate the negative effects and make the activity sustainable

Avaliação da embriotoxicidade de águas residuais e sedimento do rio Paraíba do Meio, Viçosa AL

A atividade humana vem modificando o ecossistema aquático ao longo dos anos, deposi-tando contaminantes nos lençóis de água, dentre eles possíveis componentes tóxicos, que podem alcançar as pessoas impactando-as diretamente. Estima-se que no Brasil cerca de 105 milhões de pessoas habitem áreas sob o risco de contrair enfermidades causadas por micro-organismos e derivados tóxicos em água não tratada ou contaminada, assim, po-tencializando possíveis anomalias. O rio Paraíba do Meio, fundamental para o desenvol-vimento agropecuário e subsistência de inúmeras famílias ribeirinhas, zona da mata ala-goana, município de Viçosa Alagoas, exposto, serve de depósito de resíduos não neutra-lizados. Neste sentido, o projeto vislumbrou o uso do teste de toxicidade aguda em em-briões de Danio rerio para avaliar águas residuais (v/v) e sedimento (mg/ml) oriundo do mesmo. Utilizou-se 30 embriões por concentração teste, mantidos em placas/poços com 2 ml em um total de 05 embriões por poços, incluindo-se cinco concentrações decrescen-tes e um controle, avaliados a cada 24 horas durante um período total de 96 horas, teste OECD-236/2013. Revelou-se ao teste de embriotoxicidade que ambos os elementos águas residuais e sedimento apresentaram bioatividade indicando o rio Paraíba do Meio tóxico.

Human activity has been changing the ecosystem over the years, depositing contaminants in water sheets, among them possible toxic components, which can reach people by im-pacting them directly. It is estimated that in Brazil about 105 million people live in areas at risk of contracting diseases caused by microorganisms and toxic derivatives in untrea-ted or contaminated water, thus potentiating possible anomalies. The Paraíba do Meio River, fundamental for agricultural development and subsistence of numerous riverside families, Alagoas forest area, municipality of Viçosa Alagoas, exposed, serves as a depo-sit of unneutralized waste. In this sense, the project envisioned the use of the acute toxicity test in Danio rerio embryos to evaluate wastewater (v/v) and sediment (mg/ml) from it. We used 30 embryos per test concentration, kept in plates/wells with 2 ml in a total of 05 embryos per well, including five decreasing concentrations and one control, evaluated every 24 hours for a total period of 96 hours, Test OECD-236. It was revealed that the embryotoxicity test showed that both elements wastewater and sedimentshowed bioacti-vity indicating the paraíba do meio toxic river.

EMBRIOTOXICIDADE E ATIVIDADES ANTIOXIDANTES ANTI-INFLAMATÓRIAS DOS EXTRATOS DE Eryngium foetidum EM ZEBRAFISH

Extratos de plantas são uma mistura de vários compostos bioativos, com propriedades químicas e polaridades variáveis, sendo necessário, portanto a utilização de diferentes testes,para avaliar a atividade antioxidante de um extrato e, principalmente, a seleção do método correto. O primeiro trabalho desta tese consiste de uma revisão sistemática de métodos in vitro e in vivo, para avaliar a atividade antioxidante de extratos vegetais, abordando a frequência de uso de diferentes métodos, modelos animais usados e métodos de extração. Scopus e Science Direct foram pesquisados, resultando em 310 artigos, utilizando as palavraschave (extrato vegetal + antioxidante + in vitro + in vivo), sendo aceitos para análise dos artigos publicados no período de janeiro a julho de 2020. De acordo com os resultados, existem 17 métodos in vitro e 13 in vivo, porém os mais utilizados, para as respectivas medidas, DPHH e LPO. Entre os meios de extração, o metanol é o mais utilizado. Além disso, poucos estudos realizaram testes in vitro e in vivo, simultaneamente (25%) e, quando são utilizados testes in vivo (16%), os roedores são os modelos mais empregados. O objetivo do segundo trabalho foi avaliar o efeito e a concentração de diferentes extratos de E. foetidum no desenvolvimento de embriões de zebrafish (Danio rerio). Para investigar o impacto de extrato aquoso (EA), etanólico (EE) e metanólico (EM), os embriões foram expostos a 0,625; 1,25; 2,5; 5 e 10 mg mL-1 até 120 hpf (horas pós-fertilização), para a avaliação da toxicidade no desenvolvimento embrionário e, posteriormente, a 0,039; 0,078; 0,156; 0,312 e 0,625 mg mL1 a respostas antioxidantes das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa-S-transferase (GST) e apoptose celular. Os resultados mostraram que, dependendo do solvente de extração, das concentrações utilizadas e tempos de exposição, os extratos de E. foetidum ocasionam mortalidade, alteram o tempo de eclosão e promovem diferenças nas atividades enzimáticas. Atrasos no desenvolvimento e aumento da atividade da GST foram encontrados em todos os tratamentos. Não foi observada apoptose em nenhum dos tratamentos. As atividades antioxidantes e anti-inflamatórias dos extratos de E. foetidum foram abordadas no terceiro trabalho. Para a determinação da atividade antioxidante, embriões foram expostos ao meio, contendo os extratos (0; 0,039; 0,078; 0,156; 0,312 e 0,625 mg mL-1), acrescidos com peróxido de hidrogênio (H2O2) sendo, logo após, medidas as enzimas SOD, CAT e GST e a apoptose celular. A atividade anti-inflamatória foi analisada pelo número de neutrófilos migrados para o local da ferida, na nadadeira caudal nas larvas de zebrafish, após tratamento com os extratos. Larvas expostas a H2O2 apresentaram atividades elevadas das enzimas SOD e CAT. Entretanto reduções significativas ocorreram na atividade dessas enzimas, quando as larvas foram expostas aos extratos. Para a enzima GST, foi verificado um aumento na atividade para as larvas expostas à EA e EM. A apoptose induzida por H2O2 foi reduzida pelos extratos de maneira dependente da concentração. Em relação à atividade anti-inflamatória, uma redução no número de neutrófilos migrados, para a região lesionada da cauda, foi verificada em larvas tratadas com o extrato etanólico.

Plant extracts are a mixture of several bioactive compounds, with variable chemical properties and polarities, making it necessary, therefore, to use different tests to assess the antioxidant activity of an extract and especially to select the correct method. The first work of this thesis consists of a systematic review of in vitro and in vivo methods to evaluate the antioxidant activity of plant extracts, addressing the frequency of use of different methods, animal models used and extraction methods. Scopus and Science Direct were searched, resulting in 310 articles, using keywords (plant extract + antioxidant + in vitro + in vivo), and articles published from January to July 2020 were accepted for analysis. , there are 17 in vitro and 13 in vivo methods, with the most used for the respective measurements, DPH and LPO. Among the means of extraction, methanol is the most used. Furthermore, few studies performed in vitro and in vivo tests simultaneously (25%) and, when in vivo tests are used (16%), rodents are the most used models. The objective of the second work was to evaluate the effect and concentration of different extracts of E. foetidum on the development of zebrafish (Danio rerio) embryos. To investigate the impact of aqueous extract (EA), ethanolic (EE) and methanolic (EM), embryos were exposed to 0.625; 1.25; 2.5; 5 and 10 mg mL-1 up to 120 hpf (hours after fertilization) for evaluation of toxicity in embryonic development and then to 0.039; 0.078; 0.156; 0.312 and 0.625 mg mL-1 for antioxidant responses of the enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione-S-transferase (GST) and cellular apoptosis. The results showed that, depending on the extraction solvent, concentrations used and exposure times, E. foetidum extracts cause mortality, alter the hatching time and promote differences in enzymatic activities. Delays in the development and increased activity of GST were found in all treatments. Apoptosis was not observed in any of the treatments. The antioxidant and anti-inflammatory activities of E. foetidum extracts were addressed in the third work. To determine the antioxidant activity, embryos were exposed to the medium containing the extracts (0; 0.039; 0.078; 0.156; 0.312 and 0.625 mg mL-1 ) added with hydrogen peroxide (H2O2) and subsequently measured by the enzymes SOD, CAT and GST and cell apoptosis. The anti-inflammatory activity was analyzed through the number of neutrophils migrated to the wound site in the caudal fin in zebrafish larvae after treatment with the extracts. Larvae exposed to H2O2 showed high activities of SOD and CAT enzymes. However, significant reductions occurred in the activity of these enzymes when the larvae were exposed to the extracts. For the GST enzyme, an increase in activity was verified for larvae exposed to EA and EM. Apoptosis induced by H2O2 was reduced by the extracts in a concentration-dependent manner. Regarding the anti-inflammatory activity, a reduction in the number of neutrophils migrating to the injured region of the tail was verified in larvae treated with the ethanol extract.

CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE ZEBRAFISH

O zebrafish apresenta diversas características interessantes, que fazem da espécie um modelo biológico popular para estudos de diversas áreas de pesquisa, resultando em um elevado desenvolvimento de novas linhagens que precisam ser mantidas e preservadas. A criopreservação pode atender essa necessidade de manter os recursos genéticos da espécie, o que torna o desenvolvimento de pesquisas na área de suma importância. Esta tese tem como objetivo principal realizar um levantamento do histórico da pesquisa sobre criopreservação em zebrafish e realizar o desenvolvimento de protocolos de criopreservação de sêmen de zebrafish utilizando diversos tipos de avaliações sobre os danos causados pelo processo criopreservação. O objetivo do primeiro estudo foi realizar uma revisão sistemática sobre a criopreservação de tecidos e células reprodutivas de zebrafish. Na revisão sistemática foi possível identificar e quantificar as principais características dos protocolos de criopreservação já utilizados em diferentes tipos de amostras. Com os resultados obtidos nesse estudo foi possível identificar limitações e tendências para novas pesquisas, além de confirmar que assim como em outras espécies de peixes, a criopreservação de sêmen é o método mais efetivo para preservação do material genético do zebrafish. No segundo estudo objetivou-se avaliar a combinação e interação de diferentes extensores, crioprotetores permeáveis e não permeáveis, analisando os efeitos da criopreservação sobre os espermatozoides através de uma abordagem ampla de variáveis. Nesse estudo foi possível identificar que a utilização do leite em pó na solução crioprotetora promoveu maior proteção aos espermatozoides, especialmente quanto aos danos oxidativos e de DNA. No terceiro estudo o objetivo foi avaliar o estresse oxidativo e os danos no DNA em diferentes etapas do processo de criopreservação. Observou-se que a etapa de congelamento/descongelamento gerou mais danos que a exposição do sêmen aos crioprotetores durante o equilíbrio. Foi possível identificar que a utilização de leite em pó diminuiu a geração de espécies reativas de oxigênio e a fragmentação de DNA, além de promover maior atividade antioxidante. Com todos os resultados obtidos foi possível observar que a criopreservação de sêmen de zebrafish atualmente é a alternativa mais concreta para preservação do material genético da espécie, e que os protocolos de criopreservação de sêmen devem ser otimizados levando em consideração uma abordagem mais ampla das variáveis. Os bons resultados obtidos com a inclusão do leite em pó na solução crioprotetora indicam que a combinação entre crioprotetor permeável e não permeável pode melhorar os resultados obtidos após o processo de criopreservação.

The zebrafish has several interesting characteristics, which make the species a popular biological model for studies in several research areas, resulting in a high development of new strains that need to be maintained and preserved. Cryopreservation can meet the need to maintain the genetic resources of the species, which makes the development of research in the area of extreme importance. The main objective of this thesis is to carry out a survey of the history of research on cryopreservation in zebrafish and to develop protocols for cryopreservation of zebrafish semen using different types of assessments on the damage caused by the cryopreservation process. The aim of the first study was to conduct a systematic review on the cryopreservation of zebrafish reproductive tissues and cells. In the systematic review, it was possible to identify and quantify the main characteristics of the cryopreservation protocols already used in different types of samples. With the results obtained in this study, it was possible to identify limitations and trends for new research, in addition to confirming that as in other fish species, cryopreservation of semen is the most effective method for preserving zebrafish genetic material. In the second study, the objective was to evaluate the combination and interaction of different extenders, permeable and non-permeable cryoprotectants, analyzing the effects of cryopreservation on sperm through a wide approach of variables. In this study, it was possible to identify that the use of powdered milk in the cryoprotective solution promoted greater protection for sperm, especially regarding oxidative and DNA damage. In the third study, the objective was to assess oxidative stress and DNA damage at different stages of the cryopreservation process. It was observed that the freeze/thaw stage generated more damage than the semen exposure to cryoprotectants during equilibrium. It was possible to identify that the use of powdered milk decreased the generation of reactive oxygen species and the fragmentation of DNA, in addition to promoting greater antioxidant activity. With all the results it was observed that the zebrafish sperm cryopreservation is currently the most concrete alternative to preserving the genetic material of the species, and that semen cryopreservation protocols must be optimized considering a broader approach of the variables. The good results obtained with the inclusion of powdered milk in the cryoprotective solution indicate that the combination of permeable and non-permeable cryoprotectants can improve the results obtained after the cryopreservation process.

THE INFLUENCE OF OBESITY INDUCED BY THE DIET ON REPRODUCTIVE PARAMETERS AND OFFSPRING IN ZEBRAFISH

Obesity is a transgenerational epigenetic metabolic disturbance. Animal models of obesity like zebrafish (Danio rerio) are useful to understand the signaling pathways involved on this condition. In this study, we analyzed, on zebrafish, the effect of maternity and paternity obesity on reproduction and offspring (F1). Animals of both genders were used, divided into two groups; the control group (C) which received a balanced diet, and the obesity group induced by overfeeding (DIO). The feeding protocol was contucted for eight weeks and the animals were reproduced weekly. To verify the impact of obesity on the parents, we made histologic assessment through morphometry of adipose tissue (AT) visceral and subcutaneous, and we measured the hepatosomatic (GSI) and gonadosomatic (HSI) indexs. The impact of overfeeding was evaluated on reproduction, spawning, fertility and fertilization rate. On the offspring were analyzed the mortality rate, hatching, lordosis, and tail deformity. Glucose and triglycerides plasma levels were measure in zebrafish adult and offspring. As a result, we identified that the induction of obesity caused hypertrophy on AT and an increase of HSI, in both sexes and an increase of GSI on the females. The obesity not caused infertility of the zebrafish. However, overfeeding caused high mortality rate of offspring, morphologic deformities and high plasmatic levels of glucose and triglycerides, with 100% of mortality at 60 dpf. We concluded that the induction of obesity through overfeeding didnt have any effect on the reproductive capacity of zebrafish, however, it caused negative effects on its offspring with the high occurrence of deformities and mortality.

Obesity is a transgenerational epigenetic metabolic disturbance. Animal models of obesity like zebrafish (Danio rerio) are useful to understand the signaling pathways involved on this condition. In this study, we analyzed, on zebrafish, the effect of maternity and paternity obesity on reproduction and offspring (F1). Animals of both genders were used, divided into two groups; the control group (C) which received a balanced diet, and the obesity group induced by overfeeding (DIO). The feeding protocol was contucted for eight weeks and the animals were reproduced weekly. To verify the impact of obesity on the parents, we made histologic assessment through morphometry of adipose tissue (AT) visceral and subcutaneous, and we measured the hepatosomatic (GSI) and gonadosomatic (HSI) indexs. The impact of overfeeding was evaluated on reproduction, spawning, fertility and fertilization rate. On the offspring were analyzed the mortality rate, hatching, lordosis, and tail deformity. Glucose and triglycerides plasma levels were measure in zebrafish adult and offspring. As a result, we identified that the induction of obesity caused hypertrophy on AT and an increase of HSI, in both sexes and an increase of GSI on the females. The obesity not caused infertility of the zebrafish. However, overfeeding caused high mortality rate of offspring, morphologic deformities and high plasmatic levels of glucose and triglycerides, with 100% of mortality at 60 dpf. We concluded that the induction of obesity through overfeeding didnt have any effect on the reproductive capacity of zebrafish, however, it caused negative effects on its offspring with the high occurrence of deformities and mortality.

Efeito da Metionina e o risco de predação na fisiologia, genética e sobrevivência do Zebrafish (Danio rerio)

A metionina é um aminoácido limitante em dietas comerciais na maioria dos peixes, e sua insuficiência além de causar limitação no crescimento, pode reduzir a eficiência alimentar, e pode afetar o sistema oxidante do organismo. Nesse sentido, os objetivos deste trabalho foram avaliar o efeito da metionina e o risco de predação no desempenho, histologia intestinal, cortisol, expressão gênica e sobrevivência do zebrafish (Danio rerio). No primeiro experimento, 360 animais de um ano de idade foram divididos em três tratamentos relacionados à suplementação de metionina: Sem suplementação de metionina (SM); suplementada com DL-Metionina 99% - aminoácido na sua forma livre (DL) e suplementada com metionina na forma dipeptídeo DL-Metionil-DL-Metionina 95% (MM). Os peixes foram mantidos sem contato com predador no aquário (SO) ou com contato direto com predador no aquário (CO), por 48 horas ou 20 dias, dependendo da fase experimental avaliada. O estresse por risco de predação reduziu o ganho de peso dos animais com 20 dias e os peixes alimentados com suplementação de metionina, independente da fonte utilizada, apresentaram ganho de peso superiores quando comparados aos SM. Não houve diferença estatística nos niveis de cortisol em função do risco de predação e da suplementação de metionina. Não houve efeito significativo da interação entre o risco de predação e a suplementação de metionina, para o gene PEPT1. Os peixes com 48 horas de exposição ao estresse, com risco de predação, apresentaram maior expressão do mRNA dos genes SOD2, CAT e GPX1. Em relação ao consumo prolongado das dietas, observou-se menor expressão desses genes em animais consumindo dietas DL e MM. No segundo experimento, os reprodutores e sua prole, receberam exclusivamente ração formulada com ingredientes convencionais suplementados com metionina: DL, MM e um tratamento controle sem suplementação de metionina (SM). Através do monitoramento continuo dos animais, após eclosão, observou-se que as larvas abriram a boca com 3 dias pós-fertilização (dpf) e a partir desse momento, iniciou-se a alimentação com 3 e 5 dpf para avaliar a sobrevivência das larvas em função das dietas dos pais até 20 dpf. Para realização do experimento, zebrafish proveniente de programa de melhoramento genético, foram utilizados para a obtenção dos ovos. 1200 larvas com 3 dpf foram divididos em três tratamentos relacionados à suplementação de metionina: SM, DL e MM seguindo a mesma dieta que seus pais. Os animais tiveram 2 períodos de início de alimentação com 3 ou 5 dpf. Não se observou diferença significativa na taxa de sobrevivência entre o início da alimentação com 3 ou 5 dpf. Através da literatura consultada essa é a primeira vez que esse fato é relatado em zebrafish consumindo dietas formuladas exclusivamente com ingredientes convencionais. Observou-se também que independente da fonte de metionina utilizada, a sobrevivência foi maior em larvas dos tratamentos DL e MM. Em conclusão, a suplementação com metionina é fundamental para garantir tolerancia celular, fornecendo poder redutor para os sistemas antioxidantes, que é responsável por neutralizar os radicais livre. Além de auxiliar na geração de larvas precoces para capacidade de ingerir alimentos e garantir maior sobrevivência dessas formas jovens.

Methionine is a limiting amino acid in commercial diets in most of fish, and its insufficiency can cause growth restriction, reduce feed efficiency, and can affect the body's antioxidant system. The objective of this study was to evaluate the effect of methionine and the risk of predation on the performance, intestinal histology, cortisol, gene expression and survival of zebrafish (Danio rerio). In the first experiment, 360 one-year-old animals were divided into three treatments related to methionine supplementation: no methionine supplementation (SM); supplemented with DL methionine 99% -amino acid in free form (DL) and supplemented with methionine in the dipeptide form DL-Methionyl-DL-Methionine 95% (MM). Fish were kept without contact with the predator in the aquarium (SO) or with direct contact with predator in the aquarium (CO), for 48 hours or 20 days, depending on the experimental phase evaluated. Stress due to predation risk reduced the weight gain of animals with 20 days and the fish fed with methionine supplementation, regardless of the source used, presented higher weight gain when compared to SM. There was no statistical difference in cortisol levels due to the risk of predation and methionine supplementation. There was no significant effect on the interaction between the risk of predation and methionine supplementation, for PEPT1 gene. Fish with 48 hours of exposure to stress with risk of predation presented higher mRNA expression of the SOD2, CAT and GPX1 genes. In relation to prolonged consumption of the diets, lower expression of these genes in animals consuming diets DL and MM was observed. In the second experiment, breeders and their offspring, received exclusively feed formulated with conventional ingredients supplemented with methionine: DL, MM and a control treatment without methionine supplementation (SM). Through the continuous monitoring of the animals after hatching, it was observed that the larvae opened their mouth 3 days post fertilization (dpf), and from this moment, feeding started with 3 and 5 dpf to evaluate the survival of the larvae, according to the parents' diets, until 20 dpf. For the experiment, zebrafish from a breeding program were used to obtain the eggs. 1200 larvae at 3 dpf were divided into three treatments related to methionine supplementation: SM, DL and MM, following the same diet as their parents. The animals had two periods for the beginning of feeding, with 3 or 5 dpf. No significant difference in the survival rate between the beginning of feeding with 3 or 5 dpf was observed. Through literature consulted, this is the first time that this fact is reported in zebrafish consuming diets formulated exclusively with conventional ingredients. We also observed that, regardless of the source of methionine used, survival was higher in larvae of DL and MM treatments. In conclusion, methionine supplementation is important to ensure cell tolerance, providing reducing power for antioxidant systems, which is responsible for neutralizing free radicals, besides helping in the generation of early larvae ability to ingest food and ensure greater survival of these young forms.

Biotecnologias aplicadas à reprodução de peixes: a criopreservação e o cultivo monosexo contribuindo para a piscicultura moderna

Espera-se que a população mundial exceda nove bilhões de pessoas até 2050, fato que aumentará a demanda por proteína animal em no mínimo 70 por cento. Neste cenário, a Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura já reconhece a contribuição crescente da piscicultura para a segurança alimentar. Contudo, essa indústria ainda está longe da sofisticação atingida pela avicultura ou bovinocultura, por exemplo, sendo extremamente necessário o desenvolvimento de novas biotecnologias que visem o aumento de seus índices produtivos. O completo domínio da reprodução em ambiente de cultivo e a garantia constante oferta de alevinos é um fator considerado fundamental para o sucesso da produção de peixes. Entre os principais avanços biotecnológicos alcançados recentemente podem ser citados as aplicações da criopreservação de gametas e embriões e a propagação de populações monosexo. O objetivo geral deste trabalho foi produzir conhecimento técnico científico de qualidade acerca do manejo reprodutivo de peixes, buscando o aprimoramento da técnica de vitrificação de embriões e a utilização de indivíduos neomachos para a propagação de populações monosexo. Esses objetivos foram atingidos a partir da realização de duas pesquisas. Na primeira, ao se investigar o efeito da inclusão do hormônio melatonina na solução vitrificante de embriões de zebrafish (Danio rerio), sob os eventos apoptóticos e na formação de crio-lesões após o descongelamento, observou-se que embora a solução crioprotetora utilizada não tenha protegido adequadamente todas as regiões dos embriões, especialmente a camada sincicial vitelínica, em nível molecular, a suplementação de 10-6M de melatonina melhorou significativamente a resposta ao processo apoptótico, principalmente quanto à expressão dos genes envolvidos e a fragmentação do DNA (p<0,05). Esses resultados poderão contribuir para o futuro desenvolvimento de um protocolo eficaz para a criopreservação deste tipo de material. A segunda pesquisa avaliou comparativamente a morfologia e histologia gonadal e a qualidade espermática de machos normais (genótipo XY) e neomachos (genótipo XX) de salmão do Atlântico (Salmo salar). Assim, foi verificado que os testículos de indivíduos neomachos apresentaram formatos irregulares, com túbulos seminíferos pobremente formados e maior proporção de espaço intersticial, células de Sertoli e cistos de hiperplasia epitelial (p<0,05). De maneira geral, essas anormalidades pareceram formar uma barreira física que impediram a coleta de sêmen pela técnica de extrusão convencional e forçaram sua coleta pela fragmentação testicular, prática que reduziu a qualidade do sêmen, principalmente quanto à sua motilidade e duração de motilidade espermática (p<0,05). O ensaio de fragmentação de DNA (Tunel) não indicou sinais de tecidos apoptóticos ou deteriorados, sugerindo que as diferenças histológicas encontradas podem estar relacionadas à maturidade sexual tardia dos neomachos. Essas observações possibilitarão a melhoria do manejo reprodutivo e consequente incremento das taxas de fertilização dos peixes neomachos.

The world population is expected to exceed nine billion people by 2050, fact that has increased the demand for animal protein by no less than 70 percent. Thus, the Food and Agriculture Organization of the United Nations already recognizes the increasing contribution of fish farming to food security, however, this industry is still far from the sophistication reached by the poultry or cattle industry for example, being very necessary the development of new biotechnologies that aim at the increase of its productive indexes. The complete knowledge of the breeding in captivity and the constant fingerlings supply of the important commercial species is a factor considered fundamental for the success of fish production. Recent advances in reproductive biotechnologies for fish, such as the cryopreservation of gametes and embryos, and the propagation of a monosex progeny are cited as key recent advances. The objective of this research was to produce quality technical knowledge about the reproductive management of fish, aiming at the improvement and refinement of embryo vitrification techniques and the use of neo-males for the propagation of monosex populations. More specifically two unpublished researches were carried out, in the first one, was investigated the effect of the inclusion of the hormone melatonin in the vitrification solution of zebrafish embryos (D. rerio) under the apoptotic events and formation of cryo-lesions after thawing, it was observed that although the vitrification solution used did not adequately protect all regions of the embryos, especially the yolk syncytial layer, at the molecular level, 10-6M supplementation of melatonin improved the response to the apoptotic process, mainly regarding the expression of the involved genes and to DNA fragmentation (p<0.05), an important result that may contribute to the future discovery of an efficient protocol for the cryopreservation of this type of material. On the other hand, in the research number two, morphology and gonadal histology and the sperm quality of normal (XY genotype) and neo-males (genotype XX) of Atlantic salmon (S. salar) were evaluated. Morphology and gonadal histology revealed that the testicles of neo-males presented irregular shapes, with poorly formed seminiferous tubules and a greater proportion of interstitial space, Sertoli cells and epithelial hyperplasia cysts (p<0.05). Collectively, these abnormalities appeared to form a physical barrier that prevented the collection of semen by the conventional method and forced its collection by testicular fragmentation, a practice that reduces semen quality, mainly in relation to the motility and duration of sperm motility (p<0.05). Interestingly, the TUNEL test did not indicate signs of apoptotic or deteriorated tissue, suggesting that the histological differences found may be related to the late sexual maturity of the neo-males and, therefore, allow the improvement of the reproductive management and consequent increase of the fertilization rates.

Água da represa Billings usada para o consumo humano apresenta contaminantes microbiológicos e induz prejuízos comportamentais e astrogliose em zebrafish

A represa Billings é o maior reservatório de água da Região Metropolitana de São Paulo, mas somente uma pequena parte é utilizada para o abastecimento de água. Recentemente, a Região Metropolitana de São Paulo enfrentou a maior crise hídrica já documentada. Desse modo, deveríamos considerar a intensificação do uso da represa Billings. O objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade da água de diferentes pontos da represa Billings relacionados ao consumo humano (abastecimento de água e pesca): Rio Pequeno, Rio Grande e Bororé. Foram realizados testes microbiológicos e físicos nas amostras de água. Zebrafish foram expostos a estas águas e seus comportamentos foram avaliados. Estudamos também a expressão de proteína glial fibrilar ácida (GFAP), que está relacionada a processos neuroinflamatórios. As amostras de água do Rio Pequeno, Rio Grande e Bororé apresentaram contaminação por Escherichia coli e bactérias heterotróficas. As águas do Rio Pequeno induziram prejuízos motores/exploratórios e comportamento tipo-ansiogênico nos zebrafish. As águas do Bororé induziram comportamentos nos zebrafish relacionados a prejuízos respiratórios (hipóxia), assim como maior resposta de alarme. Os zebrafish expostos às águas do Bororé também apresentaram astrogliose, que parece ter ocorrido em decorrência da alta contaminação por bactérias heterotróficas. Considerando os presentes resultados de contaminação microbiológica e prejuízos comportamentais e astrogliose em zebrafish, as águas do Rio Pequeno, Rio Grande e Bororé deveriam ser consideradas como inaceitáveis para o uso humano na sua forma não tratada. A companhia de saneamento básico deveria considerar processos rigorosos de tratamento microbiológico das águas. A autorização para a pesca no Bororé deveria ser repensada.

The Billings reservoir is the largest water-storage facility in the São Paulo Metropolitan Region, with only a small part of the reservoir used for water supply. Recently, the São Paulo Metropolitan Region has experienced the greatest water collapse ever recorded. Thus, the intensification of use of the Billings reservoir should be considered. The objective of this study was to evaluate the quality of the water from different areas of the Billings reservoir related to human consumption (water supply and fishing): Rio Pequeno, Rio Grande, and Bororé rivers. We performed microbiological and physical studies on water samples. Zebrafish were exposed to such water samples and their behaviors were evaluated. Finally, we studied central glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression, which is related to neuroinflammatory processes. Water samples from Rio Pequeno, Rio Grande, and Bororé presented microbiological contamination for Escherichia coli and heterotrophic bacteria. Water from the Rio Pequeno river induced both motor/exploratory impairments and anxiogenic-like behavior in zebrafish. Water from the Bororé river induced behaviors in zebrafish related to respiratory impairments (hypoxia) as well as higher alarm reaction. Zebrafish exposed to water from the Bororé also presented astrogliosis, which seems to have happened in detrimental of the high heterotrophic bacterial contamination. Considering the present results of microbiological contaminants and behavior impairments as well as astrogliosis in zebrafish, the water from Rio Pequeno, Rio Grande, and Bororé rivers should be considered unacceptable for human use in their untreated state. Basic Sanitation Company should consider adopting rigorous processes of microbiological water treatment. Authorization for fishing at Bororé river should be reconsidered.

ERITROPOIETINA E DEXAMETASONA EM DANIO RERIO DURANTE AEROCISTITE INDUZIDA POR AEROMONAS HYDROPHILA

O zebrafish representa um importante candidato, apresentando alta homologia genética com seres humanos e respostas, porém, são poucas as informações sobre seus mecanismos eritropoiéticos frente ao e leucopoiéticos. Assim o presente estudo buscou investigar o efeito da administração exógena de eritropoietina e da dexametasona sobre a resposta hematopoiética e leucocitária durante estímulo inflamatório através da indução de aerocistite infecciosa. Para isto, realizou-se indução de aerosciste através de inóculo de A. hydrophila, seguida da aplicação por via subcutânea de dexametasona (DEX) na dose de 25µg por unidade animal e 2UI de eritropoietina recombinante humana (EPO), constituindo os seguintes tratamentos: CC+ = não tratada com EPO e não tratado com DEX (n=10); DEX+= não tratada com EPO e tratada com DEX (n=10); EPO+ = tratada com EPO e não tratada com DEX (n=10); EPO/DEX+= tratada com EPO e tratada com DEX (n=10) e PF= (padrão fisiológico) onde os animais não receberam nenhuma medicação e não foi induzido a aeroscistite (n=10). para posterior coleta sanguínea e do exsudato inflamatório da bexiga natatória no período de 2 e 4 dias após inoculação (2DPI e 4DPI) e contagem eritrocitária total, contagem de reticulócitos, leucocitária total, diferencial leucocitário e contagem total e diferencial celular do exsudato da bexiga natatória. Na análise dos dados obtidos, observou-se um aumento geral dos parâmetros eritrocitários e de reticulócitos nos grupos EPO+ e DEX+, bem como leucocitários no grupo EPO+, o que indica possível resposta eritropoiética e leucopoiética positiva proveniente do uso da EPO. Na análise leucocitária foi possível observar também significante redução de valor total, granulócitos, monócitos e linfócitos nos grupos de tratamento com uso de DEX, indicando um presente efeito imunossupressor derivado do uso do glicocorticoide na espécie, demonstrando efeitos similares à mamíferos da EPO e da DEX.

Zebrafish represents an important candidate, presenting high genetic homology with humans and answers, however, there is little information about its erythropoietic mechanisms against leukopoietic. Thus the present study sought to investigate the effect of exogenous administration of erythropoietin and dexamethasone on the hematopoietic and leukocyte response during inflammatory stimulation through the induction of infectious aerocystitis. For this, an aerosol induction was performed through A. hydrophila inoculum, followed by subcutaneous application of dexamethasone (DEX) at the dose of 25 g per animal and 2UI of recombinant human erythropoietin (EPO), constituting the following treatments: CC + = untreated with EPO and not treated with DEX (n = 10); DEX + = untreated with EPO and treated with DEX (n = 10); EPO + = treated with EPO and not treated with DEX (n = 10); EPO / DEX + treated with EPO and treated with DEX (n = 10) E And PF = (physiological standard) where the animals received no medication and were not induced to aerosctitis (n = 10), for subsequent blood collection and inflammatory exudate of the swimming bladder at 2 and 4 days after inoculation (2DPI and 4DPI) and total erythrocyte count, reticulocyte count , Total leukocytes, differential leukocytes, and total and differential cell count of the swim bladder exudate. In the analysis of the obtained data, a general increase of erythrocyte and reticulocyte parameters in the EPO + and DEX + groups was observed, as well as leukocytes in the EPO + group, indicating a positive erythropoietic and leukopoietic response from EPO use. In the leukocyte analysis, it was also possible to observe a significant reduction of total value, granulocytes, monocytes and lymphocytes in the treatment groups with DEX, indicating a present immunosuppressive effect derived from glucocorticoid use in the species, demonstrating similar effects to the EPO and DEX mammals .

Óleo de linhaça e óleo essencial da folha de cravo na alimentação de zebrafish

O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos do óleo de linhaça (OL) e do óleo essencial da folha de cravo (OEFC) na alimentação de zebrafish, sobre atividade antioxidante das dietas, o crescimento dos animais, incorporação de ácidos graxos no músculo, marcadores de antioxidantes in vivo, peroxidação lipídica e expressão dos genes relacionados com a biossíntese do colesterol e -oxidação dos ácidos graxos. Foram elaboradas seis dietas extrusadas isoprotéicas (45% proteína) e isocalóricas (3.969 kcal kg-1), contendo a combinação de três níveis de OL (3, 6 e 9%) com dois níveis do OEFC (0,5 e 1%), além de uma dieta controle (ausente do OL e OEFC). Foram utilizados 420 zebrafish (Danio rerio) com idade de 40 dias após a eclosão e peso médio de 0,29 ± 0,04 g e 30,67 ± 0,71 mm de comprimento total. Os animais foram distribuídos em tanques de vidro com capacidade de 50 litros. O delineamento experimental foi interamente casualizado com três repetições em esquema fatorial 3x2 com um tratamento adicional. As dietas contendo 1% do OEFC apresentaram maiores atividades antioxidantes (p<0,05), com um aumento médio de 270% em relação à dieta controle. Não houve mortalidade durante o período experimental. O peso final e ganho em peso aumentaram com a inclusão do OL (efeito isolado, p<0,05). A taxa de crescimento específico e comprimento final mostraram efeito de interação, com melhores resultados com a combinação de 0,5% do OEFC com 6 ou 9% do OL. A respeito do perfil de ácidos graxos no músculo, não houve diferença na somatória dos ácidos graxos saturados. No entanto, a somatória dos ácidos graxos monoinsaturados aumentou com os níveis do OL (efeito isolado p<0,05) e os ácidos graxos poliinsaturados da série n-3 aumentaram com os níveis do OL e OEFC (efeito de interação p<0,05). A atividade do superóxido desmutase (SOD) e catalase (CAT) reduziram com efeito isolado para OL e para ambos os fatores, respectivamente. O conteúdo da glutationa foi menor no tratamento com 0,5% do OEFC em combinação com OL. A peroxidação lipídica foi menor no tratamento com 0,5% do OEFC (efeito isolado, p<0,05). Os genes PPAR- e SREBP-2 mostraram efeito de interação (p<0,05) e ambos apontaram o mesmo comportamento. Os tratamentos com 9 e 0,5% de OL e OEFC foram superiores aos demais. Recomenda-se uso combinado de 9% do OL com 0,5% do OEFC para zebrafish.

Objective the present study was to evaluate the effects of linseed oil (LO) and clove leaf essential oil (CLEO) on zebrafish diet, on dietary antioxidant activity, growth, incorporation, in vivo antioxidant markers and gene expression. Six extruded diets were prepared, isonitrogenous (45% protein) e isocaloric (3969 kcal kg-1), containing the combination of three levels of linseed oil (3, 6 e 9%) with two levels (0.5 e 1%), beyond control diet (without OL and CLEO). A total of 420 zebrafish were used at the age of 40 days post hatching, with an average weight of 0.29 ± 0.04 g. and 30.67 ± 0.71 mm total length. Animals were distributed in glass tanks with a capacity of 50 liters. The experimental design was completely randomized with three replicates in a 3x2 factorial scheme with an additional treatment. Diets containing 1% of CLEO had higher antioxidant activity (p<0.05) with an average increase of 270% compared to control diet. There was no mortality during the experimental period. The final weight and weight gain increased with OL inclusion (isolated effect, p <0.05). Regarding the fatty acid profile in muscle, there was no difference in the sum of saturated fatty acids. Monounsaturated fatty acids increased with OL levels (isolated effect, p <0.05) and polyunsaturated fatty acids of the n-3 series increased with OL and OEFC levels (interaction effect p <0.05). Activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) reduced with isolated effect for OL and for both factors, respectively. The content of glutathione was lower in the 0.5% OEFC treatment in combination with OL. Lipid peroxidation was lower in the 0.5% OEFC treatment (isolated effect, p <0.05). PPAR- and SREBP-2 genes showed interaction between the factors (p <0.05) and both showed the same behavior. The treatments with 9 and 0.5% of OL and OEFC were superior to the others. It is recommended to use combined 9% of OL with 0.5% of OEFC for zebrafish.

MELATONINA NA CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO DE ZEBRAFISH

A criopreservação de tecido ovariano de peixes é uma pratica emergente, surgindo da necessidade de êxito na criopreservação de genoma materno, uma vez que, a criopreservação de oócitos de peixes permanece sem sucesso. Durante a criopreservação o (formação) de espécies reativas de oxigênio pode desencadear estresse oxidativo celular, causando ruptura da camada lipídica da membrana, peroxidação lipídica, desnaturação de proteínas, fragmentação de DNA, apoptose, e morte celular. Com o objetivo de reduzir os danos causados pelo estresse oxidativo durante a criopreservação, a adição de antioxidantes à solução crioprotetora e a solução de aquecimento tem sido sugerida. A hipótese do estudo é de que a adição de melatonina à solução de aquecimento pode atuar como antioxidante atenuador de danos. Ovários de treze fêmeas zebrafish (Danio rerio) adultas foram coletados após eutanásia por meio de imersão em dose letal (0,6 mg/mL) de tricaína metano sulfonato. Os pares de ovários foram removidos e colocados diretamente em placas de Petri contendo meio Leibovitz (L-15) 90% com pH ajustado para 9,0, onde os ovários foram dissecados em fragmentos de 2x10mm contendo predominantemente folículos em estágio vitelogênico. Os fragmentos foram expostos por 15 minutos à solução de equilíbrio (1,5 M metanol + 2,25 M propilenoglicol). Logo após, a solução de equilíbrio foi removida, e os folículos ovarianos foram expostos à solução de vitrificação (1,5 M metanol + 4,5 M propilenoglicol) por 90 segundos. Os tubos criogênicos contendo os fragmentos foram fechados e imediatamente mergulhados e armazenados em nitrogênio líquido. Os fragmentos ovarianos foram aquecidos a 28°C em banho maria e expostos a três concentrações de melatonina (10-11 M, 10-9 M e 10-7 M) durante o procedimento de aquecimento e remoção do crioprotetor. Esse procedimento foi realizado em três etapas de cinco minutos cada. Na primeira etapa a solução de aquecimento foi composta por 0,5 M de sacarose + o tratamento, na segunda etapa, de 0,25 M de sacarose + tratamento, e na terceira etapa os fragmentos foram expostos somente ao tratamento sem a adição de sacarose. O grupo controle foi exposto ao mesmo procedimento, porém sem adição de melatonina. Nove fragmentos de cada grupo foram utilizados para as análises bioquímicas: Níveis de espécies Reativas de Oxigênio (ROS), Potencial antioxidante de redução férrica (FRAP) e Peroxidação Lipídica (TBARS); e três fragmentos de cada grupo experimental foram utilizados para avaliar a integridade de membrana por meio do corante azul de trypan. Não houve diferença significativa (P<0,005) entre os tratamentos nas análises bioquímicas (FRAP, ER e TBARS), nem na avaliação da integridade de membrana. Até o momento, nenhum estudo avaliou o efeito da adição de melatonina durante a criopreservação de tecido ovariano em vertebrados. Apesar de a melatonina possuir alta lipolicidade, permitindo uma rápida passagem da substância para órgãos e fluidos, o tempo de exposição utilizado neste estudo (15 min) pode não ter sido suficiente para que o seu mecanismo de ação. Folículos vitelogênicos apresentam maior teor de lipídio intracitoplasmático em relação às fases imaturas, podendo causar uma maior produção de ROS mesmo quando submetido a adição da melatonina durante o procedimento de aquecimento.

Cryopreservation of ovarian fish tissue is an emerging practice, arising from the need for success in cryopreservation of the maternal genome, since; the cryopreservation of fish oocytes remains unsuccessful. During cryopreservation the reactive oxygen species unbalance may trigger cellular oxidative stress, causing membrane lipid rupture, lipid peroxidation, protein denaturation, DNA fragmentation, apoptosis, and cell death. In order to reduce the damage caused by oxidative stress during cryopreservation, the addition of antioxidants to the cryoprotectant solution and the warming solution has been suggested. The hypothesis of the present study is that the addition of melatonin to the warming solution can act as a damage repairing antioxidant. Ovaries from thirteen adult Zebrafish (Danio rerio) females were collected after euthanasia by immersion in lethal dose (0.6 mg / mL) of tricaine methane sulfonate. Ovarian pairs were removed and placed directly into Petri dishes containing 90% Leibovitz (L-15) medium with pH adjusted to 9.0, where the ovaries were dissected into 2x10mm fragments containing predominantly vitellogenic follicles. The fragments were exposed for 15 min to the equilibration solution (1.5 M methanol + 2.25 M propylene glycol), after, the equilibrium solution was removed and the ovarian follicles were exposed to the vitrification solution (1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol) for 90 seconds. Cryogenic tubes containing the fragments were closed and immediately dipped and stored in liquid nitrogen. The ovarian fragments were heated to 28°C in a water bath and exposed to three concentrations of melatonin (10-11 M, 10-9 M and 10-7 M) during the warming and cryoprotectant removal procedure. This procedure was performed in three steps of five minutes each. In the first stage the warming solution was composed of 0.5 M sucrose + the treatment, in the second stage warming solution was composed by 0.25 M sucrose + treatment, and in the third stage the fragments were exposed only to the treatment without the addition of sucrose. Control group was exposed to the same procedure, but without melatonin addition. Nine fragments from each group were used for biochemical analyzes: Levels of Reactive Oxygen Species (ROS), Ferric Reduction Antioxidant Potential (FRAP) and Lipid Peroxidation (TBARS); and three fragments from each experimental group were used to evaluate membrane integrity by trypan blue dye. There was no significant difference (P <0.005) between the treatments in the biochemical analyzes (FRAP, ER and TBARS) nor in the evaluation of membrane integrity. To date, no study has evaluated the effect of melatonin addition during cryopreservation of ovarian tissue in vertebrates. Although melatonin has high lipophilicity, allowing a rapid passage of the substance into organs and fluids, the exposure time used in this study (15 min) may not have been sufficient for its mechanism of action. Vitellogenic follicles present a higher intracytoplasmic lipid content in relation to the immature phases, which may cause a higher production of ROS even when submitted to melatonin addition during the warming procedure.

Aerobic and anaerobic metabolism for the zebrafish, Danio rerio, reared under normoxic and hypoxic conditions and exposed to acute hypoxia during development / Metabolismo aeróbico e anaeróbico do paulistinha Danio rerio, mantidos sob normóxia e hipóxia moderada e expostos a hipóxia aguda durante diferentes estágios de desenvolvimento

In order to verify the influence of chronic and acute ambient oxygen levels from egg to adult stage of the zebrafish, in vivo oxygen consumption (MO2), critical tensions of oxygen (Pcrit), heart rate (fH) and total body lactate concentration (Lc) were determined for Danio rerio (Hamilton, 1822) raised at 28 ºC under normoxic (7.5 mgO2.L-1 or 80 mm.Hg-1) and hypoxic conditions (4.3 mgO2.L-1) and exposed to acute hypoxia during different developmental stages. Our findings confirmed that very early stages do not respond effectively to ambient acute hypoxia. However, after the stage corresponding to the age of 30 days, D. rerio was able to respond to acute hypoxia through effective physiological mechanisms involving aerobic and anaerobic metabolism. Such responses were more efficient for the fishes reared under hypoxia which showed that D. rerio survival capability increased during acclimation to mild hypoxia. Measurements of body mass and length showed that moderate hypoxia did not affect growth significantly until the fish reached the stage of 60 days. Moreover, a growth delay was verified for the hypoxic-reared animals. Also, the D. rerio eggs-to-larvae survival varied from 87.7 to 62.4 percent in animals reared under normoxia and mild hypoxia, respectively. However, the surviving animals raised under moderated hypoxia showed a better aptitude to regulate aerobic and anaerobic capacities when exposed to acute hypoxia.(AU)

A influência de diferentes níveis de oxigênio no desenvolvimento (ovos a adulto) do peixe paulistinha Danio rerio (Hamilton, 1822) foi verificada por meio de medidas experimentais de consumo de oxigênio (MO2), tensões críticas de oxigênio (Pcrit), taxa de batimentos cardíacos (fH) e concentração total de lactato nos tecidos (Lc), para os animais mantidos a 28 ºC sob níveis normóxicos de oxigênio (7.5 mgO2.L-1 ou 80 mmHg) e hipóxicos (4.3 mgO2.L-1) e submetidos a hipóxia ambiental aguda, em diferentes estágios de desenvolvimento. Os resultados obtidos indicam que os peixes em estágios iniciais do desenvolvimento não variam suas respostas fisiológicas em função das oscilações ambientais nos níveis de oxigênio, visto que tais respostas iniciaram-se somente no estágio de 30 dias de vida. A partir deste estágio D. rerio apresentou capacidade em responder à hipóxia aguda por meio de mecanismos fisiológicos efetivos envolvendo metabolismo aeróbico e anaeróbico. Tais respostas foram mais efetivas para os peixes mantidos sob hipóxia, o que mostrou que a capacidade de sobrevivência de D. rerio aumentou durante o período de aclimatação à hipóxia moderada. As medidas de massa e comprimento corpóreos mostraram que a permanência dos peixes em hipóxia durante o desenvolvimento não afetou esses parâmetro até os peixes atingirem o estágio de 60 dias. A partir deste estágio foi observado ligeiro atraso no crescimento dos espécimes mantidos sob hipóxia. A taxa de sobrevivência de D.rerio variou de 87,7 a 62,4 por cento para os animais mantidos respectivamente sob níveis normóxicos e hipóxicos. No entanto, os animais mantidos sob hipóxia moderada, que sobreviveram, mostraram maior capacidade em regular seu metabolismo aeróbico e anaeróbico quando expostos à hipóxia ambiental aguda.(AU)

NÍVEIS DE FÓSFORO EM DIETAS PARA ZEBRAFISH Danio rerio

EXIGÊNCIA DIETÁRIA DE FÓSFORO PARA ZEBRAFISH (Danio rerio) RESUMO: O ensaio de crescimento foi realizado para estimar a disponibilidade de fósforo (P) do fosfato bicálcico, a exigência de fósforo e os sinais externos de deficiência em dietas para zebrafish (Danio rerio) em aquários de 15 L. Foram utilizadas seis dietas semipurificadas para conterem os níveis graduais de (0,35, 0,65, 0,95, 1,25, 1,55 e 1,85%) de fósforo total por 8 semanas. A dieta basal (T1), contendo 0,35% de fósforo total, não foi suplementada com fonte mineral de fósforo, e as cinco dietas experimentais foram formuladas com inclusão crescente de fosfato bicálcico. O delineamento foi inteiramente casualizado com seis tratamentos e cinco repetições, utilizando 450 alevinos (peso médio inicial de 0,0079 ± 0,0003g e idade de 31 dias pós eclosão). Os peixes foram alimentados 6 vezes ao dia, e mantidos em temperatura constante de 28±1 ¿C, o pH e as concentrações de amônia e oxigênio dissolvido foram de 6,8 ± 0,32 mg L-1, 0,06 ± 0,01 mg L-1 e 6,5 ± 0,3, respectivamente. A disponibilidade de fósforo do fosfato bicálcico foi de 53,84%. A conversão alimentar (FC), a taxa de crescimento específico (SGR), o crecimento (G) e o comprimento final (L) tiveram correlação positiva com o nível de fósforo na dieta (p>0,01). A eficiência na retenção de fósforo foi maior nos peixes alimentados com as dietas com 0,35 e 0,65% de fósforo. As análises de composição corporal dos peixes mostraram que o fósforo, cálcio, magnésio, matéria seca e lipídeos foram significativamente afetados pela concentração de fósforo nas dietas (p<0,01), porém, não significativo para a concentração corporal de manganês, zinco e cobre entre os tratamentos. Sinais da deficiência de fósforo foram caracterizados pelo menor crescimento, baixa apetite, aumento da concentração corporal de lipídeos, aparecimento de sinais externos de deformidades esqueléticas (cranial, lordose e escoliose), redução da mineralização óssea (espessura do tecido ósseo). Pode-se concluir que o melhor nível de fósforo foi de 1,55 % para os parâmetros avaliados. ANOMALIAS ESQUELÉTICAS EM ZEBRAFISH ALIMENTADOS COM NÍVEIS DE FÓSFORO RESUMO: Este estudo teve como objetivo descrever as anomalias esqueléticas em zebrafish (Danio rerio) alimentados com dietas suplementadas com níveis de fósforo. Foram utilizados 450 alevinos de zebrafish (peso médio inicial de 0,0079 ± 0,0003g e idade de 31 dias pós-eclosão), distribuídos em delineamento inteiramente casualizado com cinco repetições. Os peixes foram alimentados 6 vezes ao dia à temperatura de 28±1 ¿C, o pH e as concentrações de amônia e oxigênio dissolvido foram de 6,8 ± 0,32, 0,06 ± 0,01 mg L-1 e 6,5 ± 0,3 mg L-1, respectivamente. Após o período experimental de 8 semanas, os peixes foram diafanizados para possibilitar avaliar internamente as deformidades ósseas (craniais e vertebrais). A ocorrência de fusão parcial das espinhas neurais e hemais, ausência de fusão nas espinhas, ausência de paralelismo entre as espinhas neurais e hemais, normalidade do espaçamento intervertebral, compressão vertebral, intensidade das deformidades: escoliose, lordose, anquilose e inserção da nadadeira caudal, e as deformidades craniofaciais foram inversamente proporcionais ao aumento do P dietético. Não foi observada influência na mortalidade pelas dietas avaliadas. A concentração de P dietético é fator crítico na ocorrência de anomalias esqueléticas em zebrafish, e a concentração de 1,55% de P total na dieta reduziu significativamente a ocorrência de deformidades esqueléticas. Pode-se concluir que a inclusão de 1,55% de fósforo total nas dietas reduz a incidência de anomalias esqueléticas e está intimamente ligada à mineralização óssea, influenciada pela expressão do gene da ostecalcina.

ABSTRACT: The growth assay was performed to estimate the dicalcium phosphate phosphorus (P) availability, the phosphorus requirement and external deficiency signs in diet of zebrafish (Danio rerio) allocated in 15 L aquarium . Six semipurified diets were used with graded total phosphorus levels (0.35, 0.65, 0.95, 1.25, 1.55 and 1.85%) for 8 weeks. The basal diet (T1), with 0.35% total phosphorus was not supplemented with phosphorous mineral source, and all diets were formulated with inorganic phosphate inclusion increasing. For the experiment 450 zebrafish fingerlings were used (0.0079 ± 0,0003g average weight with 31 days post-hatching), distributed in a completely randomized design experiment with five replications. The fish were fed six times a day at 28 ± 1 ¿C, 6.8 ± 0, 32 pH, 0.06 ± 0.01 mg L-1 ammonia concentration and 6.5 ± 0.3 mg L-1dissolved oxygen. Dicalcium phosphate phosphorus availability was 53.84%. Feed Conversion (FC), Specific Growth Rate (SGR), Growth (G) and the final Length (L) had a positive correlation with phosphorus diet levels (p> 0.01). The phosphorus retention efficiency was higher in fish fed 0.35 and 0.65% phosphorus diets. The fish body composition analyzes showed that phosphorus, calcium, magnesium, dry matter and lipids were significantly affected by phosphorus diets concentration (p> 0.01), however, not significant for body manganese, zinc and copper concentration among treatments. Phosphorus deficiency signs were characterized by lower growth, low appetite, increased body lipid contents, external appearance of skeletal deformity (cranial, lordosis and scoliosis), mineralization bone reduction (bone tissue thickness). It can be concluded that the better phosphorus level was 1.55% for all parameters evaluated. ABSTRACT: The aims of this study were to describe skeletal abnormalities in zebrafish (Danio rerio) fed by different phosphorus diets levels. For the experiment 450 zebrafish fingerlings were used (0.0079 ± 0,0003g average weight with 31 days after hatching), distributed in a completely randomized design experiment with five replications. The fish were fed six times a day at 28 ± 1 ¿C , 6.8 ± 0, 32 pH, 0.06 ± 0.01 mg L-1 ammonia concentration and 6.5 ± 0.3 mg L-1dissolved oxygen. After 8-week experiment, fish were diaphanized to evaluate bone deformities (cranial and spinal). The partial neural and hemal fusion spines occurrence, spines fusions absence, parallelism absence between neural and hemal spines, intervertebral normal spacing, vertebral compression, deformities intensity: scoliosis, lordosis, ankylosis and fin caudal insertion, and craniofacial deformities were proportional inversely to P dietary increase. There was no fish mortality in all treatments. It was found that the dietary phosphorus concentration is critical factor in the zebrafish skeletal abnormalities occurrence, and 1.55% of P concentration in the diet reduces significantly skeletal deformities occurrence. It can be concluded that 1.55% total phosphorus inclusion in the diet reduces skeletal abnormalities incidence and is closely related with bone mineralization, influenced by ostecalcin gene expression.

AVALIAÇÃO DE EFEITOS REPRODUTIVOS DE DOSES SUBLETAIS DE DELTAMETRINA EM PEIXE-ZEBRA (Danio rerio)

Um grande número de substâncias químicas têm sido usado no ambiente, como também algumas substâncias naturais, que podem alterar o sistema endócrino de humanos e animais. São substâncias persistentes, bioacumulativas que incluem os pesticidas (fungicidas, herbicidas e inseticidas), substâncias químicas industriais, outros produtos sintéticos e alguns metais. Entre outros pesticidas, a deltametrina está listada pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA) como possível desregulador endócrino, podendo, portanto, interferir no sistema reprodutivo. Essa substância é um piretróide sintético, com potente ação inseticida, toxicidade relativamente baixa para mamíferos e persistência limitada no meio ambiente, mas de alta toxicidade para organismos aquáticos. Além disso, é empregada nas medicinas humana e veterinária para tratamento e profilaxia de doenças parasitárias. O presente estudo teve como objetivo avaliar possíveis alterações endócrinas na reprodução do peixe zebra (Danio rerio) seguindo o protocolo da USEPA (2002) “Teste da reprodução de peixes de curta duração” (Short-term (14-day) Fish Reproductive Screen). Após determinação das concentrações subletais, o experimento foi realizado utilizando-se 16 aquários com 4 replicatas para cada concentração (6 mg/l e 10 mg/l da deltametrina técnica, com 98,8% de pureza), um grupo controle e um grupo acetona. Parâmetros como número de ovos, eclosão, tamanho e histologia de gônadas foram avaliados. O experimento durou 14 dias consecutivos e a cada 24 horas foram sifonados 4 litros de água de cada aquário, coletando-se os ovos. Após contagem do número de ovos, estes, foram colocados na maternidade. Após 96 horas contou-se o número de alevinos eclodidos dentro da maternidade . No 14º dia, depois da coleta e contagem dos ovos, uma fêmea e um macho de cada aquário foram pesados, sacrificados e as gônadas coletadas, pesadas e fixadas em solução de Alfac para avaliação histológica. A média e o erro padrão do número de ovos das quatro replicatas do controle foi de 2195 ± 381, da acetona 2895 ± 189, da concentração de 6 mg/l 1727 ± 214 e da concentração de 10 mg/l 1562 ± 306, enquanto a média e erro padrão de ovos eclodidos do controle foi de 1077 ± 144, da acetona 783 ± 45, da concentração de 6 mg/l de 827 ± 201 e da concentração de 10 mg/l de 840 ± 253. Não foi possível observar nenhuma diferença significativa dos parâmetros avaliados entre os grupos. Com este protocolo utilizado, a deltametrina não alterou a reprodução da espécie estudada. Porém, as substâncias desreguladoras endócrinas podem atuar afetando o sistema nervoso central e/ou o sistema endócrino e estas alterações podem apresentar-se tanto nos progenitores como na progênie em diferentes etapas do desenvolvimento. De acordo com o protocolo utilizado, somente efeitos nos progenitores são avaliados, porém vemos a necessidade de utilização de mais de um protocolo proposto pelas agências de proteção ambiental para avaliar as substâncias com potencial de desregular o sistema endócrino. Palavra-chave: Deltametrina, Danio rerio, desregulador endócrino, reprodução