Outbreak of Clostridium perfringens type D enterotoxemia in sheep / Surto de enterotoxemia por Clostridium perfringens tipo D em ovinos

This work describes the first Brazilian laboratory-confirmed outbreak of enterotoxemia caused by Clostridium perfringens type D in sheep, which occurred in the state of Paraná. We address the epidemiological aspects involved, the diagnostic modalities employed, and the clinical signs and pathological findings observed. Eight healthy pregnant female sheep with no history of vaccination for clostridiosis presented with a history of abrupt feeding changes and neurological manifestations that quickly evolved to illness, coma and death. Four other females with clinical neurological signs were referred to the Veterinary Hospital of the Universidade Federal do Paraná, Palotina Sector. These animals presented with lethargy, motor incoordination, opisthotonus, pedal movements, muscle tremors, spastic paralysis, bruxism, mandibular trismus, sialorrhea, hyperexcitability and the inability to stand. They were examined and euthanized due to the seriousness of the clinical picture with an unfavorable prognosis. We performed gross anatomical and microscopic analyses of the organs and intestinal contents. We also performed bacterial isolation with molecular typing. From the intestinal contents, we detected toxins by means of the seroneutralization technique in mice. At necropsy, we noted pulmonary edema (2/4), necrotizing enteritis (4/4) and hyperemia of the leptomeninges (1/4). Microscopically, we observed lymphohistiocytic interstitial pneumonia, necrotic enteritis associated with the presence of rods, and nephrosis with interstitial lymphohistiocytic nephritis. No significant brain lesions were observed. Using serum neutralization, we identified epsilon toxin in the intestinal contents of all four animals. C. perfringens type D was identified. Based on the history, clinical signs, postmortem findings, and laboratory confirmation of the presence of epsilon toxin, we concluded that C. perfringens type D enterotoxemia caused this outbreak of sheep deaths.

Este trabalho descreve o primeiro surto brasileiro com confirmação laboratorial de enterotoxemia em ovinos por Clostridium perfringens tipo D, ocorrido no estado do Paraná, abordando os aspectos epidemiológicos envolvidos, sinais clínicos observados, achados patológicos e diagnóstico empregado. Oito fêmeas ovina, gestantes, em bom estado corporal e com histórico de mudanças bruscas na alimentação, sem histórico de vacinação para clostridioses, apresentaram manifestações clínicas neurológicas que logo evoluíram para decúbito, coma e morte. Outras quatro fêmeas apresentaram os sinais clínicos neurológicos e foram encaminhadas ao Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná, setor Palotina. Os animais foram examinados e submetidos à eutanásia devido à gravidade do quadro clínico e prognóstico desfavorável. Destes quatro animais foram coletados fragmentos de órgãos e do conteúdo intestinal. Foi realizada análise macroscópica e microscópica dos órgãos, bem como isolamento bacteriano, tipificação molecular do agente e a detecção das toxinas por meio da técnica de soroneutralização em camundongos a partir do conteúdo intestinal. Os quatro ovinos examinados apresentaram letargia, incoordenação motora, opistótono, movimentos de pedalagem, tremores musculares, paralisia espástica, bruxismo, trismo mandibular, sialorréia, hiperexcitabilidade e decúbito. Na necropsia, constatou-se edema pulmonar (2/4), enterite necrohemorrágica (4/4) e hiperemia de leptomeninges (1/4). Microscopicamente havia pneumonia intersticial linfohistiocitária, enterite necrótica associada com a presença de bastonetes e nefrose com nefrite intersticial linfohistiocitária. Não foram observadas lesões encefálicas dignas de nota em função do quadro agudo da doença. Por meio da soroneutralização foi possível identificar a presença da toxina épsilon no conteúdo intestinal dos quatro...

Outbreak of Clostridium perfringens type D enterotoxemia in sheep / Surto de enterotoxemia por Clostridium perfringens tipo D em ovinos

This work describes the first Brazilian laboratory-confirmed outbreak of enterotoxemia caused by Clostridium perfringens type D in sheep, which occurred in the state of Paraná. We address the epidemiological aspects involved, the diagnostic modalities employed, and the clinical signs and pathological findings observed. Eight healthy pregnant female sheep with no history of vaccination for clostridiosis presented with a history of abrupt feeding changes and neurological manifestations that quickly evolved to illness, coma and death. Four other females with clinical neurological signs were referred to the Veterinary Hospital of the Universidade Federal do Paraná, Palotina Sector. These animals presented with lethargy, motor incoordination, opisthotonus, pedal movements, muscle tremors, spastic paralysis, bruxism, mandibular trismus, sialorrhea, hyperexcitability and the inability to stand. They were examined and euthanized due to the seriousness of the clinical picture with an unfavorable prognosis. We performed gross anatomical and microscopic analyses of the organs and intestinal contents. We also performed bacterial isolation with molecular typing. From the intestinal contents, we detected toxins by means of the seroneutralization technique in mice. At necropsy, we noted pulmonary edema (2/4), necrotizing enteritis (4/4) and hyperemia of the leptomeninges (1/4). Microscopically, we observed lymphohistiocytic interstitial pneumonia, necrotic enteritis associated with the presence of rods, and nephrosis with interstitial lymphohistiocytic nephritis. No significant brain lesions were observed. Using serum neutralization, we identified epsilon toxin in the intestinal contents of all four animals. C. perfringens type D was identified. Based on the history, clinical signs, postmortem findings, and laboratory confirmation of the presence of epsilon toxin, we concluded that C. perfringens type D enterotoxemia caused this outbreak of sheep deaths.(AU)

Este trabalho descreve o primeiro surto brasileiro com confirmação laboratorial de enterotoxemia em ovinos por Clostridium perfringens tipo D, ocorrido no estado do Paraná, abordando os aspectos epidemiológicos envolvidos, sinais clínicos observados, achados patológicos e diagnóstico empregado. Oito fêmeas ovina, gestantes, em bom estado corporal e com histórico de mudanças bruscas na alimentação, sem histórico de vacinação para clostridioses, apresentaram manifestações clínicas neurológicas que logo evoluíram para decúbito, coma e morte. Outras quatro fêmeas apresentaram os sinais clínicos neurológicos e foram encaminhadas ao Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná, setor Palotina. Os animais foram examinados e submetidos à eutanásia devido à gravidade do quadro clínico e prognóstico desfavorável. Destes quatro animais foram coletados fragmentos de órgãos e do conteúdo intestinal. Foi realizada análise macroscópica e microscópica dos órgãos, bem como isolamento bacteriano, tipificação molecular do agente e a detecção das toxinas por meio da técnica de soroneutralização em camundongos a partir do conteúdo intestinal. Os quatro ovinos examinados apresentaram letargia, incoordenação motora, opistótono, movimentos de pedalagem, tremores musculares, paralisia espástica, bruxismo, trismo mandibular, sialorréia, hiperexcitabilidade e decúbito. Na necropsia, constatou-se edema pulmonar (2/4), enterite necrohemorrágica (4/4) e hiperemia de leptomeninges (1/4). Microscopicamente havia pneumonia intersticial linfohistiocitária, enterite necrótica associada com a presença de bastonetes e nefrose com nefrite intersticial linfohistiocitária. Não foram observadas lesões encefálicas dignas de nota em função do quadro agudo da doença. Por meio da soroneutralização foi possível identificar a presença da toxina épsilon no conteúdo intestinal dos quatro...(AU)

Isolation and genotyping of Clostridium perfringens from goats in Minas Gerais, Brazil / Isolamento e genotipagem de Clostridium perfringens isolados de cabras em Minas Gerais, Brasil

Despite the known importance of Clostridium perfringens as an enteropathogen in small ruminants, little is known about the role of its additional virulence factors or the frequency of the various C. perfringens genotypes in healthy goats; this complicates the laboratory diagnosis of the infections caused by this microorganism. In light of this, the aim of the present study was to isolate and genotype C. perfringens from stool samples from healthy goats in Brazil. Stool samples from 250 apparently healthy adult goats from 17 different herds in Minas Gerais, Brazil were collected, and isolation and genotyping of C. perfringens was performed. C. perfringens type A was isolated from 189 (75.6%) goats, whereas C. perfringens types C and D were each detected in one goat (0.4%). All isolates were negative for enterotoxin-, NetB-, NetE-, and NetF-encoding genes. These results confirmed C. perfringens type A as part of the microbiota in these animals, and they suggested that C. perfringens type C and D are rarely isolated from healthy goats.(AU)

Apesar da reconhecida importância de Clostridium perfringens como enteropatógeno de pequenos ruminantes, pouco se sabe sobre a frequência dos genótipos ou do papel de fatores de virulência adicionais de C. perfringens em cabras saudáveis, dificultando o diagnóstico laboratorial da infecção causada por esse micro-organismo. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo caracterizar C. perfringens de amostras de fezes de cabras adultas saudáveis. Amostras de fezes de 250 cabras saudáveis de 17 rebanhos diferentes em Minas Gerais, Brasil, foram submetidas ao isolamento e genotipagem de C. perfringens. C. perfringens tipo A foi isolado de 189 (75,6%) cabras, enquanto C. perfringens tipos C e D foram detectados em um animal (0.4%) cada. Todos os isolados foram negativos para os genes codificadores das toxinas NetB, NetE, NetF e enterotoxina. Os resultados apresentados confirmam C. perfringens tipo A como parte da microbiota de cabras saudáveis e sugere que C. perfringens tipos C e D são raramente encontrados em caprinos saudáveis.(AU)

Mapping of the continuous epitopes displayed on the Clostridium perfringens type D epsilon-toxin

The epsilon toxin, produced by Clostridium perfringens, is responsible for enterotoxemia in ruminants and is a potential bioterrorism agent. In the present study, 15 regions of the toxin were recognized by antibodies present in the serum, with different immunodominance scales, and may be antigen determinants that can be used to formulate subunit vaccines.(AU)

Mensuração por um ano dos anticorpos neutralizantes de bovinos imunizados com vacinas recombinantes alfa, beta e épsilon de Clostridium Perfringens

As toxinas alfa (CPA), beta (CPB) e épsilon (ETX) de Clostridium perfringens são responsáveis por causar enfermidades de difícil erradicação e com potencial letalidade em animais de produção, sendo a vacinação dos rebanhos ainda a melhor estratégia de controle. Atualmente as vacinas recombinantes clostridiais apresentam resultados significativos na indução de títulos de anticorpos neutralizantes e demostram ser uma alternativa viável frente a produção convencional de toxóides clostridiais comerciais. Entretanto são necessários estudos em relação a longevidade da resposta imune humoral induzida pelas proteínas recombinantes nos animais imunizados, preferencialmente nas espécies alvo. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi mensurar a resposta imune humoral de bovinos imunizados com vacinas trivalentes contendo as proteínas recombinantes alfa (rCPA), beta (rCPB) e épsilon (rETX) de C. perfringens, produzidas em Escherichia coli, em três diferentes concentrações (100, 200 e 400 µg) de cada uma das proteínas, durante um período de 12 meses. As vacinas recombinantes contendo 200 µg (VR2) e 400 µg (VR3) foram estatisticamente semelhantes aos 56 dias e obtiveram melhor desempenho ao longo do estudo, pois induziram títulos médios de anticorpos neutralizantes mais elevados e detectáveis por até 150 e 180 dias, respectivamente. Em relação a produção de escala industrial, VR2 seria a formulação mais econômica e viável, pois atingiu resultados similares a VR3 usando metade da concentração de proteínas recombinantes em sua formulação. No entanto, nenhuma das vacinas testadas induziu a produção de títulos de anticorpos detectáveis até os 365 dias de experimento, período este de revacinação normalmente indicado nos protocolos de vacinação, reiterando a necessidade e a importância das pesquisas na área de vacinologia a fim de estabelecer maior longevidade da resposta imune humoral contra essas toxinas clostridiais nos animais, além da necessidade de discussão sobre os calendários e protocolos vacinais adotados na bovinocultura.

The alpha (CPA), beta (CPB) and epsilon (ETX) toxins of Clostridium perfringens are responsible for causing diseases that are difficult to eradicate and have lethal potential in production animals. Vaccination of herds is still the best control strategy. Recombinant clostridial vaccines have shown good success at inducing neutralizing antibody titers and appear to be a viable alternative to the conventional production of commercial clostridial toxoids. Research is still needed on the longevity of the humoral immune response induced by recombinant proteins in immunized animals, preferably in target species. The objective of this study was to measure the humoral immune response of cattle immunized with trivalent vaccines containing the recombinant proteins alpha (rCPA), beta (rCPB) and epsilon (rETX) of C. perfringens produced in Escherichia coli at three different concentrations (100, 200, and 400g) of each protein for 12 months. The recombinant vaccines containing 200 (RV2) and 400g (RV3) yielded statistically similar results at 56 days. They performed better throughout the study period because they induced higher neutralizing antibody titers and were detectable for up to 150 and 180 days, respectively. Regarding industrial-scale production, RV2 would be the most economical and viable formulation as it achieved results similar to RV3 at half the concentration of recombinant proteins in its formulation. However, none of the vaccines tested induced the production of detectable antibody titers on day 365 of the experiment, the time of revaccination typically recommended in vaccination protocols. Thus, reiterating the need for research in the field of vaccinology to achieve greater longevity of the humoral immune response against these clostridial toxins in animals, in addition to the need to discuss the vaccine schedules and protocols adopted in cattle production.

ELISA and modified toxin-binding inhibition test for quality control of the clostridial vaccine processes / ELISA direto e ToBI-test modificado para o controle de qualidade de processos de vacinas clostridiais

This study aimed to assess and standardize the ELISA and modified ToBI test in vitro methods in order to verify the potency of epsilon toxicoid in comparison with the in vivo TCP method. The following epsilon toxoids were used: NIBSC standard from batches 375/07, 532/08, 551/08, 373/07 and 378/07. These were evaluated using a TCP test, ELISA and ToBI tests. The results indicate that the correlation ratio between the dilutions of standard NIBSC toxicoid and absorbance values of 89.44% obtained with the ELISA method support the use of the curve to evaluate epsilon toxoids. However, it was observed that the absorbance values were similar for all toxoids, thus presenting no significant difference between higher and lower concentration toxoids. For the ToBI test, the correlation ratio of 96.76, obtained in the curve pattern, demonstrates the effectiveness of the curve to be used in the epsilon toxoid evaluation. The correlation ratio between the titration degrees of toxoids obtained through TCP and ToBI tests was higher than 90%. It is concluded that the type of ELISA test used does present discriminative power for toxoids with different concentrations, which does not support the use of this technique for such a purpose. The ToBI test can be used as a screening method for it is sensitive and effective to detect epsilon toxicoid produced by C. perfringens type D.(AU)

Teve-se por objetivo avaliar e padronizar as metodologias in vitro, ELISA e ToBI-test modificado, para a análise de toxoide épsilon, em comparação com a metodologia in vivo TCP. Foram utilizados os seguintes toxoides épsilon: padrão NIBSC e os lotes 375/07, 532/08, 551/08, 373/07 e 378/07, os quais foram avaliados por métodos in vivo, TCP, e in vitro, ELISA e ToBI-test. A análise do título de toxoide épsilon por meio dos métodos in vitro foi realizada a partir de uma curva-padrão, estabelecida previamente. Os principais resultados mostram que os valores de absorbância foram semelhantes para todos os toxoides, não apresentando diferença significativa entre os toxoides mais concentrados e menos concentrados. No ToBI-test, o coeficiente de correlação de 96,76%, obtido na curva-padrão, demonstra a eficiência da curva para avaliação do toxoide épsilon. O coeficiente de correlação entre os títulos de toxoide obtidos pelo TCP e ToBI-test foi superior a 90%. Conclui-se que o tipo de ELISA utilizado não apresenta poder discriminativo para toxoides com diferentes concentrações, inviabilizando a técnica para esse fim. O ToBI-test pode ser utilizado como um método de triagem sensível e eficaz para a detecção de toxoide épsilon de C. perfringens tipo D.(AU)

Kinetics of epsilon antitoxin antibodies in different strategies for active immunization of lambs against enterotoxaemia / Cinética dos anticorpos antitoxina epsilon em diferentes estratégias de imunização ativa em cordeiros contra a enterotoxemia

Enterotoxaemia, a common disease that affects domestic small ruminants, is mainly caused by the epsilon toxin of Clostridium perfringens type D. The present study tested four distinct immunization protocols to evaluate humoral response in lambs, a progeny of non-vaccinated sheep during gestation. Twenty-four lambs were randomly allocated into four groups according to age (7, 15, 30 and 45 days), receiving the first dose of epsilon toxoid commercial vaccine against clostridiosis with booster after 30 days post vaccination. Indirect ELISA was performed after the first vaccine dose and booster to evaluate the immune response of the lambs. Results showed that for the four protocols tested all lambs presented serum title considered protective (≥0.2UI/ml epsilon antitoxin antibodies) and also showed that the anticipation of primovaccination of lambs against enterotoxaemia conferred serum title considered protective allowing the optimization of mass vaccination of lambs.(AU)

Enterotoxemia, uma das mais comuns enfermidades que acomete os pequenos ruminantes domésticos, é causada principalmente pela toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D. O presente estudo avaliou a resposta humoral conferida por quatro protocolos distintos de primovacinação na progênie de ovelhas não vacinadas durante a gestação. Vinte e quatro cordeiros foram aleatoriamente divididos em quatro grupos de acordo com a idade (dias) que receberam a primeira dose da vacina comercial contra clostridiose contendo toxóide epsilon na sua formulação. Todos os cordeiros foram vacinados aos 7, 15, 30 ou 45 dias de idade e receberam um reforço da dose 30 dias após a vacinação. A avaliação sorológica dos cordeiros pelo teste de ELISA indireto foi realizada por ocasião da administração da primeira dose da vacina. Os resultados elucidaram não haver comprometimento da resposta imune de cordeiros vacinados tanto aos 7, 15, 30 ou 45 dias de idade associada ao reforço da dose 30 dias após, demonstrando assim que a antecipação da primeira vacinação conferiu proteção aos cordeiros contra a enterotoxemia, permitindo otimizar o planejamento da vacinação em massa dos cordeiros.(AU)

Avaliação sorológica de vacinas comerciais polivalentes contra a enterotoxemia em caprinos / Serological evaluation of polyvalent commercial vaccines against enterotoxemia in goats

Foram avaliadas as respostas sorológicas a cinco vacinas comerciais polivalentes que continham o toxóide épsilon do Clostridium perfringens tipo D na sua formulação. Para isso, foram utilizados 84 caprinos jovens, divididos aleatoriamente em seis grupos experimentais com 14 animais em cada grupo. Os caprinos do Grupo Controle não receberam nenhuma dose de vacina e os dos Grupos 1 ao 5 receberam duas doses de vacina com intervalo de quatro semanas entre elas. A primeira dose de vacina foi aplicada aos 45 (± 3) dias de vida dos animais (início do experimento - dia zero) e a segunda aos 75 (± 3 – dia 30). As amostras de sangue para a realização dos testes sorológicos foram colhidas antes (dia zero), e nos dias 30, 60, 90, 120 e 150 após o início do experimento. Utilizou-se a técnica de ELISA Indireto para quantificação dos anticorpos antitoxina épsilon do C. perfringens tipo D. De maneira geral ocorreu um aumento nos valores médios do título de anticorpos séricos dos caprinos no dia 60 em resposta às duas doses de vacina recebidas nos dias zero e 30, sendo que o maior número de animais considerados protegidos também foi detectado neste dia. Apenas cinco caprinos jovens do Grupo 1 e um do Grupo 3 permaneceram com títulos de anticorpos considerados protetores até o dia 150. Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que as vacinas avaliadas apresentaram baixa capacidade de estimular uma resposta imune protetora nos caprinos avaliados.

We evaluated the serological response of five commercial polyvalent vaccines containing epsilon toxoid of Clostridium perfringens type D. For this, 84 young goats were randomly divided into six groups, with 14 animals in each group. The goats in the Control Group were not vaccinated, while goats of Groups 1 to 5 received two vaccine shots four weeks apart. The first shot was administered when the goats were 45 (± 3) days old and the second at 75 (± 3). Blood samples for serological tests were collected on days zero, and 30, 60, 90, 120 and 150 after the start of the experiment. The Indirect ELISA technique was used to quantify the epsilon antitoxin antibodies for Clostridium perfringens type D. In general, the mean serum antibody titers of goats on day 60 increased as a response to the two vaccine shots received on days zero and 30. The largest number of animals considered protected was also detected on day 60, in response to the two vaccine shots. Only five animals from Group 1 and one goat from Group 3 displayed antibody titers that are considered protective up to 150 days after vaccination. Based on these results, we concluded that the evaluated vaccines showed poor ability of stimulate a protective immune response in the assessed goats.

Avaliação sorológica de vacinas comerciais polivalentes contra a enterotoxemia em caprinos / Serological evaluation of polyvalent commercial vaccines against enterotoxemia in goats

Foram avaliadas as respostas sorológicas a cinco vacinas comerciais polivalentes que continham o toxóide épsilon do Clostridium perfringens tipo D na sua formulação. Para isso, foram utilizados 84 caprinos jovens, divididos aleatoriamente em seis grupos experimentais com 14 animais em cada grupo. Os caprinos do Grupo Controle não receberam nenhuma dose de vacina e os dos Grupos 1 ao 5 receberam duas doses de vacina com intervalo de quatro semanas entre elas. A primeira dose de vacina foi aplicada aos 45 (± 3) dias de vida dos animais (início do experimento - dia zero) e a segunda aos 75 (± 3 dia 30). As amostras de sangue para a realização dos testes sorológicos foram colhidas antes (dia zero), e nos dias 30, 60, 90, 120 e 150 após o início do experimento. Utilizou-se a técnica de ELISA Indireto para quantificação dos anticorpos antitoxina épsilon do C. perfringens tipo D. De maneira geral ocorreu um aumento nos valores médios do título de anticorpos séricos dos caprinos no dia 60 em resposta às duas doses de vacina recebidas nos dias zero e 30, sendo que o maior número de animais considerados protegidos também foi detectado neste dia. Apenas cinco caprinos jovens do Grupo 1 e um do Grupo 3 permaneceram com títulos de anticorpos considerados protetores até o dia 150. Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que as vacinas avaliadas apresentaram baixa capacidade de estimular uma resposta imune protetora nos caprinos avaliados.(AU)

We evaluated the serological response of five commercial polyvalent vaccines containing epsilon toxoid of Clostridium perfringens type D. For this, 84 young goats were randomly divided into six groups, with 14 animals in each group. The goats in the Control Group were not vaccinated, while goats of Groups 1 to 5 received two vaccine shots four weeks apart. The first shot was administered when the goats were 45 (± 3) days old and the second at 75 (± 3). Blood samples for serological tests were collected on days zero, and 30, 60, 90, 120 and 150 after the start of the experiment. The Indirect ELISA technique was used to quantify the epsilon antitoxin antibodies for Clostridium perfringens type D. In general, the mean serum antibody titers of goats on day 60 increased as a response to the two vaccine shots received on days zero and 30. The largest number of animals considered protected was also detected on day 60, in response to the two vaccine shots. Only five animals from Group 1 and one goat from Group 3 displayed antibody titers that are considered protective up to 150 days after vaccination. Based on these results, we concluded that the evaluated vaccines showed poor ability of stimulate a protective immune response in the assessed goats.(AU)

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE DO TOXOIDE ÉPSILON DE Clostridium perfringens TIPO D COM DIFERENTES ADJUVANTES

Clostridium perfringens tipo é um bacilo anaeróbio, de ampla distribuição geográfica, podendo ser encontrado no solo, pastagens, água doce e salgada e como habitante normal do trato digestivo dos animais e do homem. É o principal micro-organismo produtor da toxina épsilon. Essa toxina tem ação necrótica e letal, provocando aumento da permeabilidade da mucosa intestinal, edema em vários órgãos, hidropericárdio e lesões renais. A enterotoxemia é a principal doença causada pelo Clostridium perfringens tipo D em ovinos, caprinos e bovinos, submetidos a fatores predisponentes, como mudança brusca na alimentação e alteração na microbiota intestinal. Trata-se de uma doença altamente letal, ocorrendo, na maioria dos casos, morte dos animais durante as primeiras 6 a 18 horas de infecção. Por sua rápida evolução e gravidade, o controle da doença baseia-se em medidas de manejo e em vacinações sistemáticas dos rebanhos. As vacinas comerciais possuem o toxoide adsorvido em hidróxido de alumínio, porém, em muitos casos, a eficiência destas vacinas não é boa, promovendo apenas uma proteção parcial, níveis de anticorpos protetores de curta duração e/ou estímulo de resposta celular deficiente (LOBATO, 2000). O interesse de estudar novos adjuvantes para uso em vacinas é antigo e de grande importância na medicina veterinária. Associado ao aumento de vacinas desenvolvidas com subunidades purificadas (que são mais seguras, porém menos imunogênicas), pesquisadores buscam o desenvolvimento de sistemas de liberação que promovam a estimulação eficiente do sistema imunológico. De modo geral espera-se que o adjuvante promova uma elevada e prolongada resposta imune, além de direcionar essa resposta imune para uma resposta protetora, evitando a doença (MOTA, 2006). O objetivo desse trabalho é o desenvolvimento de novas formulações de vacinas com diferentes candidatos a adjuvantes, utilizando o toxoide épsilon como modelo. Foram desenvolvidas vacinas contendo microemulsão e micropartículas de quitosana, como adjuvantes. As formulações de micropartícula de quitosana foram caracterizas quanto ao tamanho, potencial zeta e morfologia. A potência das vacinas foi avaliada por imunização em coelhos, seguida de titulação dos soros em células MDCK. O hidróxido de alumínio foi utilizado como adjuvante padrão, por ser o mais utilizado comercialmente em vacinas contra a toxina épsilon.

Clostridium perfringens is an anaerobic bacillus widely distributed and can be found in soil, pastures, water and as normal inhabitant of the digestive tract of animals and mans. It is the major microorganism producer of epsilon toxin. This toxin have lethal and necrotizing action, causing increased permeability of the intestinal mucosa, edema, hydropericardium and renal lesions. The enterotoxemia is the main disease caused by Clostridium perfringens type D in sheep, goats and cattle, submitted to predisposing factors, such as sudden change in diet and changes in intestinal microbiota. This is a highly lethal disease, occurring in most cases death of the animals, during the first 6 to 18 hours of infection. For being a rapid disease progression and severity, its control is based on management measures and in systematic vaccination of flocks. The commercial vaccines have toxoid adsorbed in aluminum hydroxide, but in many cases the effectiveness of these vaccines is not good, promoting only partial protection, protective antibody levels of short duration (LOBATO, 2000). The interest in studying new adjuvants for use in vaccines is old and of great importance in the veterinary medicine. Associated with increased of vaccines developed with purified subunits (which are safer, but less immunogenic), researchers seek to develop delivery systems that promote the efficient stimulation of the immune system. In general it is expected that the adjuvant promotes a high and prolonged immune response and direct this immune response to a protective response, avoiding the disease (MOTA, 2006). The aim of this work is the development of new formulations of vaccines with different candidates the adjuvants, using the epsilon toxoid as a model. Vaccines have been developed containing microemulsion and chitosan microparticles as adjuvants. The chitosan microparticle formulations was characterized s by size, zeta potential and morphology. The potency of the vaccines was evaluated by immunization of rabbits, followed by titration of the sera in MDCK cells. Aluminum hydroxide was used as standard adjuvant, for being the most used commercially in vaccines against epsilon toxin.

Focal symmetrical encephalomalacia in sheep / Encefalomalacia focal simétrica em ovino

Focal symmetrical encephalomalacia (FSE) is the most prominent lesion seen in the chronic form of enterotoxemia by Clostridium perfringens type D. This paper reports FSE in sheep in Brazil. Six deaths occurred within a seven days period in a flock of 70, four to 30-month-old Santa Inês sheep in the state of Paraíba in the Brazilian semiarid. The flock was grazing a paddock of irrigated sprouting Cynodon dactylon (Tifton grass), and supplemented, ad libitum, with a concentrate of soybean, corn and wheat. Nervous signs included blindness and recumbence. A 19 month-old sheep was examined clinically and necropsied after a clinical course of three days. Gross lesions were herniation of the cerebellar vermis and multifocal, bilateral, symmetric brownish areas in the internal capsule, thalamus and cerebellar peduncles. Histologic lesions were multifocal, bilateral malacia with some neutrophils, swelling of blood vessels endothelium, perivascular edema, and hemorrhages. The flock was vaccinated, before the outbreak, with only one dose of Clostridium perfringens type D vaccine. Two factors are suggested to be important for the occurrence of the disease: insufficient immunity due to the incorrect vaccination; and high nutritional levels by the supplementation with highly fermentable carbohydrates.(AU)

Encefalomalacia focal simétrica (EFS) é a lesão mais proeminente vista nas formas subaguda ou crônica da enterotoxemia por Clostridium perfringens tipo D. Este trabalho relata EFS em ovinos no semiárido do estado da Paraíba. Seis ovinos morreram, em um período de sete dias, dentro de um rebanho de 70 animais, da raça Santa Inês, entre 4-30 meses de idade, que pastavam em piquete de Cynodon dactylon (capim Tifton), que estava rebrotando. Os ovinos eram suplementados com um concentrado de soja, trigo e milho. Os sinais nervosos incluíam cegueira e decúbito lateral. Um ovino de 19 meses de idade foi examinado clinicamente e necropsiado, depois de um curso clínico de 3 dias. Macroscopicamente foram observadas herniação do cerebelo e áreas acastanhadas, multifocais, simétricas e bilaterais na cápsula interna, tálamo e pedúnculo cerebelar. Histologicamente observou-se malacia, bilateral e simétrica, com alguns neutrófilos, tumefação das células endoteliais dos vasos sanguíneos, edema perivascular e hemorragia. O rebanho foi vacinado, antes do surto, com umaúnica dose de vacina para Clostridium perfringens tipo D. Dois fatores são sugestivos quanto a importância da ocorrência da enfermidade: imunidade insuficiente devida à vacinação incorreta; e altos níveis nutricionais da suplementação com carboidratos altamente fermentáveis.(AU)

Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra toxina épsilon de Clostridium perfringens Tipo D / Production and characterization of monoclonal antibodies against Clostridium perfringens Type D epsilon toxin

Clostridium perfringens tipo D é o agente etiológico da enterotoxemia em ruminantes, causada pela toxina épsilon e caracterizada por edema cardíaco, pulmonar, renal e cerebral. Anticorpos monoclonais contra toxina épsilon de C. perfringens tipo D foram produzidos a partir da fusão da linhagen de mieloma P3-X63-Ag8 653 com células do baço de camundongos Balb/c imunizados com o toxóide épsilon. Seis linhagens de híbridos secretores de anticorpos monoclonais das classes e IgM e IgG foram estabelecidas.(AU)

Clostridium perfringens type D is the aetiological agent of enterotoxemia in ruminants. The disease is caused by epsilon toxin characterized by cardiac, pulmonary, kidney and brain edema. Monoclonal antibodies were produced by using myeloma cell line P3-X63-Ag8 653 fused with spleen cells from Balb/c mice, immunized with epsilon toxoid of C. perfringens type D. Six hybrids were established secreting monoclonal antibodies of the IgM class and IgG3 subclass.(AU)

Stability and toxicity of Clostridium perfringens type D epsilon prototoxin treated by iodine / Estabilidade e toxicidade da protoxina epsilon de Clostridium perfringens tipo D

Purified epsilon prototoxin of Clostridium perfringens type D was produced, purified, and detoxified by the stoiechiometric method of non-radioactive iodine incorporation. Different degrees of iodination were perfomed and the toxicity of the derivatives were analysed by in vivo studies. Toxicity decreased inversely to the iodine incorporation. Eletrophoretic analysis showed different levels of stability of samples kept under different temperatures 4ºC, - 20ºC, and -80 ºC. The iodinated prototoxins were stocked for a period of four months.(AU)

A prototoxina epsílon de Clostridium perfringens tipo D foi produzida, purificada e destoxificada por estoiquiometria. Diferentes quantidades de iodo foram incorporadas à estrutura protéica da prototoxina e a toxicidade dos derivados foi analisada em estudos in vivo. Verificou-se que a toxicidade diminuiu à medida que os átomos de iodo foram incorporados à prototoxina. A análise eletroforética demonstrou a estabilidade das amostras quando armazenadas a 4ºC, -20ºC e -80ºC. A prototoxina iodada foi estocada por um período de quatro meses.(AU)

TRAUMA EXPERIMENTAL DE MEDULA ESPINHAL EM CÃO: ESTUDO COMPARATIVO ENTRE TRATAMENTOS CLÍNICO E NEUROCIRÚRGICO

Twenty nine adult mongrel dogs were distributed into 5 groups, all were submitted to dorsal laminectomy and acute trauma with 500GCF to the spinal cord segments L1 and L2 through the Allen's modified method. In the dogs of the control group and in those medicated with epsilon aminocaproic acid and by myelotomy, there was not significant improvement. Dogs of medicated group with methylprednisolone sodium succinate, four animals had normal voluntary motor function with absent or severe proprioceptive deficit. It was concluded that glucocorticoid resulted in the best treatment employed in this experiment.

Vinte e nove cães, sem raça definida, foram distribuídos em 5 grupos, todos submetidos a laminectomia dorsal e contusão por trauma agudo com 500GCF aos segmentos medulares de L1 e L2, através do método de Allen modificado. No grupo controle e nos grupos tratados com ácido épsilon-aminocapróico e através de mielotomia parcial longitudinal dorsal, não ocorreu melhora significativa. Dos 6 cães medicados com succinato sódico de metilprednisolona, 4 apresentaram funções motoras voluntárias normais com ausência ou deficiência severa da propriocepção, resultando no melhor tratamento empregado neste experimento.

Trauma experimental de medula espinhal em cão: estudo comparativo entre tratamentos clínico e neurocirúrgico

Twenty nine adult mongrel dogs were distributed into 5 groups, all were submitted to dorsal laminectomy and acute trauma with 500GCF to the spinal cord segments L1 and L2 through the Allen's modified method. In the dogs of the control group and in those medicated with epsilon aminocaproic acid and by myelotomy, there was not significant improvement. Dogs of medicated group with methylprednisolone sodium succinate, four animals had normal voluntary motor function with absent or severe proprioceptive deficit. It was concluded that glucocorticoid resulted in the best treatment employed in this experiment.

Vinte e nove cães, sem raça definida, foram distribuídos em 5 grupos, todos submetidos a laminectomia dorsal e contusão por trauma agudo com 500GCF aos segmentos medulares de L1 e L2, através do método de Allen modificado. No grupo controle e nos grupos tratados com ácido épsilon-aminocapróico e através de mielotomia parcial longitudinal dorsal, não ocorreu melhora significativa. Dos 6 cães medicados com succinato sódico de metilprednisolona, 4 apresentaram funções motoras voluntárias normais com ausência ou deficiência severa da propriocepção, resultando no melhor tratamento empregado neste experimento.

Production and purification of epsilon prototoxin produced by Clostridium perfringens type D / Produção e purificação de prototoxina epsilon produzida pelo Clostridiumperfringens tipo D

A prototoxina epsilon foi obtida a partir de cultivo líquido, rico em carboidratos, a partir de amostra de C. perfringens tipo D (INTA Argentina), incubado em condições de anarobiose à 37ºC por oito horas. O sobrenadante da cultura foi concentrado utilizando-se o sistema Amicon com membrana de "cut off" de 10 kDa. O concentrado foi precipitado com sulfato de amônio (350 g/ml) e dissolvido em tampão fosfato 0,01 M (pH 7,2). A prototoxina purificada por cromatografia de troca iônica (DEAE-Sepharose CL 6B) e isolada no primeiro pico, mostrou uma banda única de aproximadamente 34kDa de peso molecular em SDS-PAGE, além de ser tóxica em camundongos.(AU)

Produção e caracterização de anticorpos monoclonais anti épsilon toxina de Clostridiun perfrigens tipo D

Foram produzidos anticorpos monoclonais contra épsilon toxina de Clostridium perfringens tipo D, a partir da fusão das linhagens de mieloma Sp2/0. Ag14 e P3-X63-Ag8. 653 com células do baço de camundongos BALB/c imunizado com o toxóide épsilon. Os números de wells positivos foram 59 para linhagem Sp2/0. Ag14 e 19 para P3-X63-Ag8. 653, representando 6,68 e 6,59% de positividade respectivamente. Seis linhagens de híbridos secretores de AcMo das classes e IgM () e IgG subclasse IgG3 () foram estabelecidas. A partir do sobrenadante da cultura dos híbridos foi possível obter-se uma média de 21,52 g/mL de IgM e 15 g/mL de IgG3 anti épsilon toxina de Clostridium perfringens tipo D

Monoclonal antibodies reactive against épsilon toxin from Clostridium perfringens type D were produced. Myeloma cell lines Sp2/0. Ag14 and P3-X63-Ag8.653 were fused with spleen cells from mice BALB/c immunized with epsilon toxoid. After fusion 59 wells were positive for the Sp2/0. Ag14 cell line and 19 for the P3-X63-Ag8.653, representing 6.68 and 6.59% respectively. Six hybrids were established secreting MoAb of the IgM (k) class and IgG3 (k) subclass. An average of 21.52 g/ml of IgM and 15 g/ml of IgG3 anti-epsilon toxin MoAb were obtained from the hybrids culture supernatant

Seleção de colônias de Clostridium perfringens tipo D produtoras de toxina épsilon por "dot blot"

Para seleção de amostras de Clostridium perfringens tipo D produtoras de toxina épsilon, padronizou-se o teste de dot blot com toxina épsilon adsorvida em membrana de nitrocelulose, anti-toxina épsilon, produzida em carneiro e anti-imunoglobulina de carneiro,produzida em coelho, marcada com peroxidase. A reação foi revelada utilizando-se Kit Substrato DAB 3,3 diaminobenzidina, e a leitura foi feita visualmente de acordo com a intensidade de cor obtida em cada poço. Foram selecionados clones produtores de toxina épsilon obtidos de unidades formadoras de colônias e, após três passagens, obteve-se títulos em dose mínima mortal (DMM) determinado em camundongos, 1000 vezes superiores aos obtidos com a amostra original. A presença do gene etx que codifica a síntese da toxina épsilon foi verificada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e todos os clones foram positivos, mesmo aqueles negativos ao dot blot. O teste de dot blot mostrou-se eficiente para selecionar colônias toxigênicas de C. perfringens tipo D

In order to select strains of Clostridium perfringens type D producers for epsilon toxin, a dot blot was standardized test using epsilon toxin adsorbed in nitrocellulose membrane, anti-epsilon toxin produced in sheep and anti-immunoglobulin of sheep produced in rabbit conjugated with peroxidase. The reaction was visualized using DAB Substrate Kit 3,3 diaminobenzidine and the reading was made according to the intensity of color obtained in each well. Clones producing epsilon toxin were selected by limiting dilution and after three passages, mortal minimum dose (MMD) titres were determined in mice. Selected clones produced epsilon toxin 1000 times more concentrated those the original strain. The presence of the gene etx that encodes the synthesis of the epsilon toxin was verified by the polymerase chain reaction, and all clones were positive, including those negative at the dot blot. It was concluded that the dot blot test was efficient for selecting toxigenic colonies of C. perfringens type D

Detecção dos genes das toxinas alfa, beta e épsilon de Clostridium perfringens isolados a partir de amostras clínicas de bovinos pela reação em cadeia da polimerase / Detection of alpha, beta and epsilon toxin genes of Clostridium perfringens isolated from cattle?s clinical samples by polimerase chain reaction

O Clostridium perfringens é um microrganismo anaeróbio que está presente no solo e no trato intestinal dos mamíferos. Provoca intoxicação alimentar nos seres humanos, doenças enterotoxêmicas nos animais domésticos e gangrena gasosa em ambos os grupos. O C. perfringens é classificado em cinco tipos (A, B, C, D e E) mediante a produção de quatro toxinas principais (alfa, beta, épsilon e iota). Neste trabalho foi possível padronizar a técnica de PCR para detectar a presença dos genes cpa, cpb e etx a partir de culturas de C. perfringens. A sensibilidade analítica da técnica de PCR a partir de culturas de C. perfringens foi de 2,27 ng/µL para o gene cpa, 22,7 pg/µL para o gene cpb e 22,7 pg/µL para o gene etx. A pesquisa dos genes cpa, cpb e etx partir de 35 amostras de C. perfringens isoladas de bovinos revelou que 16 (45,7%) eram do tipo A; 18 (51,4%) eram do tipo C e 1 (2,9%) era do tipo B. Não foi observada nenhuma amostra do tipo D. A metodologia de PCR revelou-se útil na tipificação de amostras de C. perfringens isoladas de bovinos, contribuindo para o diagnóstico dessa bacteriose neste país, eliminando as dificuldades de tipificação oriundas do alto custo e da indisponibilidade de anti-soros para a tipificação pela reação de soroneutralização e evitando a utilização de animais de laboratório

Clostridium perfringens is an anaerobic micro-organism that is present in the soil and gastrointestinal tract of mammals. It causes food poisoning in humans, enterotoxemic diseases in domestic animals and gas gangrene in both. C. perfringens is classified into five types (A, B, C, D and E) according to the production of four major toxins (alpha, beta, epsilon and iota). In this trial was possible to standardize the PCR?s technique to detect cpa, cpb and etx genes from cultures of C. perfringens. PCR?s analythical sensibility was 2.27 ng/µL for cpa gene, 22.7 pg/µL for cpb gene and 22.7 pg/µL for etx gene. The research of cpa, cpb and etx genes from 35 samples of C. perfringens isolated from cattle reveals that 16 (45.7%) were classified as type A, 18 (51.4%) as type C and 1 (2.9%) as type B. No sample of type D was observed. PCR?s technique reveals to be usefull to typify samples of C. perfringens isolated from cattle, contributing to diagnose of this bacterial disease in this country and solving typifing problems represented by the high costs of the process and by the lack of antiserum that is required to typify the micro-organism by seroneutralization. PCR?s technique avoid the use of laboratory animals, too