Mecanismos epigenéticos nos espermatozoides e o impacto sobre a fertilidade masculina / Epigenetic mechanisms on sperm cells and the impact on male fertility

Por ser uma célula altamente especializada, o espermatozoide apresenta diferentes mecanismos epigenéticos, sendo os principais as metilações do DNA, o código de histonas, os ncRNAs (RNAs não codificadores), e a alta condensação da cromatina pela presença das protaminas. Estes mecanismos interagem entre si, contribuindo para a formação do epigenoma espermático, que modela a carga molecular espermática, que, por sua vez, pode impactar sobre as características do desenvolvimento embrionário e da progênie. Dessa forma, atualmente é consenso que o papel do espermatozoide ultrapassa a entrega de DNA de qualidade para o oócito no momento da fecundação. Pesquisas recentes de diversos grupos, incluindo o nosso, mostram que além da contribuição com DNA de qualidade, o espermatozoide entrega moléculas ao oócito no momento da fecundação que influenciam o desenvolvimento do embrião. Recentemente, essas moléculas de origem espermática (Em inglês: sperm-borne) também são associadas com alterações metabólicas e cognitivas da progênie. Embora ainda pouco se entenda como esses mecanismos podem persistir mesmo com o ciclo de reprogramação celular que ocorre logo após a fecundação, é evidente que estes podem impactar as características da progênie. Nesta revisão abordaremos sobre a modulação do epigenoma espermático e seus efeitos no desenvolvimento embrionário.(AU)

Since it is a highly specialized cell, the spermatozoa display different epigenetic mechanisms; the main ones are DNA methylation, histone code, ncRNAs (non-coding RNAs), and high chromatin condensation by the presence of protamines. These mechanisms act in synergy contributing to forming the sperm epigenome, which modulates the spermatic molecular cargo, and, may impact embryo and offspring development features. Thus, it is currently a consensus that the role of spermatozoa goes beyond delivering quality DNA to the oocyte at fertilization. Relevant findings from several research groups, including ours, have shown that sperm delivers several molecules to the oocyte at fertilization, beyond the contribution to DNA, which influences the development of the embryo. Recently, these sperm-borne molecules have also been associated with metabolic and cognitive changes in the offspring. Although the mechanism by which these changes can persist even after embryo reprogramming is not completely understood, evidence shows that sperm cell molecular content impacts embryo and offspring development. This review will mainly focus on the modulation of the sperm epigenome and its effects on embryo development.(AU)

The dynamics of genome size and GC contents evolution in genus Nicotiana / A dinâmica do tamanho do genoma e a evolução dos conteúdos de GC no gênero Nicotiana

Hybridization and Polyploidization are most common of the phenomenon observed in plants, especially in the genus Nicotiana leading to the duplication of genome. Although genomic changes associated with these events has been studied at various levels but the genome size and GC content variation is less understood because of absence of sufficient genomic data. In this study the flow cytometry technique was used to uncover the genome size and GC contents of 46 Nicotiana species and we compared the genomic changes associated with the hybridization events along evolutionary time scale. The genome size among Nicotiana species varied between 3.28 pg and 11.88 pg whereas GC contents varied between 37.22% and 51.25%. The tetraploid species in genus Nicotiana including section Polydiclae, Repandae, Nicotiana, Rustica and Sauveolentes revealed both up and downsizing in their genome sizes when compared to the sum of genomes of their ancestral species. The genome sizes of three homoploid hybrids were found near their ancestral species. Loss of large genome sequence was observed in the evolutionary more aged species (>10 Myr) as compared to the recently evolved one’s (<0.2 Myr). The GC contents were found homogenous with a mean difference of 2.46% among the Nicotiana species. It is concluded that genome size change appeared in either direction whereas the GC contents were found more homogenous in genus Nicotiana.

A hibridização e a poliploidização são os fenômenos mais comuns observados em plantas, principalmente no gênero Nicotiana, levando à duplicação do genoma. Embora as mudanças genômicas associadas a esses eventos tenham sido estudadas em vários níveis, o tamanho do genoma e a variação do conteúdo de GC são menos compreendidos devido à ausência de dados genômicos suficientes. Neste estudo, a técnica de citometria de fluxo foi usada para descobrir o tamanho do genoma e o conteúdo de GC de 46 espécies de Nicotiana, e comparamos as mudanças genômicas associadas aos eventos de hibridização ao longo da escala de tempo evolutiva. O tamanho do genoma entre as espécies de Nicotiana variou entre 3,28 pg e 11,88 pg, enquanto os conteúdos de GC variaramentre 37,22% e 51,25%. As espécies tetraploides do gênero Nicotiana, incluindo as seções Polydiclae, Repandae, Nicotiana, Rustica e Sauveolentes, revelaram aumento e redução do tamanho do genoma quando comparados à soma dos genomas de suas espécies ancestrais. Os tamanhos do genoma de três híbridos homoploides foram encontrados perto de suas espécies ancestrais. A perda da grande sequência do genoma foi observada nas espécies evolutivas mais velhas (> 10 Myr) em comparação com as que evoluíram recentemente (< 0,2 Myr). Os teores de GC foram homogêneos com diferença média de 2,46% entre as espécies de Nicotiana. Conclui-se que a mudança no tamanho do genoma apareceu em ambas as direções, enquanto os conteúdos de GC foram encontrados mais homogêneos no gênero Nicotiana.

The dynamics of genome size and GC contents evolution in genus Nicotiana

Abstract Hybridization and Polyploidization are most common of the phenomenon observed in plants, especially in the genus Nicotiana leading to the duplication of genome. Although genomic changes associated with these events has been studied at various levels but the genome size and GC content variation is less understood because of absence of sufficient genomic data. In this study the flow cytometry technique was used to uncover the genome size and GC contents of 46 Nicotiana species and we compared the genomic changes associated with the hybridization events along evolutionary time scale. The genome size among Nicotiana species varied between 3.28 pg and 11.88 pg whereas GC contents varied between 37.22% and 51.25%. The tetraploid species in genus Nicotiana including section Polydiclae, Repandae, Nicotiana, Rustica and Sauveolentes revealed both up and downsizing in their genome sizes when compared to the sum of genomes of their ancestral species. The genome sizes of three homoploid hybrids were found near their ancestral species. Loss of large genome sequence was observed in the evolutionary more aged species (>10 Myr) as compared to the recently evolved ones ( 0.2 Myr). The GC contents were found homogenous with a mean difference of 2.46% among the Nicotiana species. It is concluded that genome size change appeared in either direction whereas the GC contents were found more homogenous in genus Nicotiana.

Resumo A hibridização e a poliploidização são os fenômenos mais comuns observados em plantas, principalmente no gênero Nicotiana, levando à duplicação do genoma. Embora as mudanças genômicas associadas a esses eventos tenham sido estudadas em vários níveis, o tamanho do genoma e a variação do conteúdo de GC são menos compreendidos devido à ausência de dados genômicos suficientes. Neste estudo, a técnica de citometria de fluxo foi usada para descobrir o tamanho do genoma e o conteúdo de GC de 46 espécies de Nicotiana, e comparamos as mudanças genômicas associadas aos eventos de hibridização ao longo da escala de tempo evolutiva. O tamanho do genoma entre as espécies de Nicotiana variou entre 3,28 pg e 11,88 pg, enquanto os conteúdos de GC variaram entre 37,22% e 51,25%. As espécies tetraploides do gênero Nicotiana, incluindo as seções Polydiclae, Repandae, Nicotiana, Rustica e Sauveolentes, revelaram aumento e redução do tamanho do genoma quando comparados à soma dos genomas de suas espécies ancestrais. Os tamanhos do genoma de três híbridos homoploides foram encontrados perto de suas espécies ancestrais. A perda da grande sequência do genoma foi observada nas espécies evolutivas mais velhas (> 10 Myr) em comparação com as que evoluíram recentemente ( 0,2 Myr). Os teores de GC foram homogêneos com diferença média de 2,46% entre as espécies de Nicotiana. Conclui-se que a mudança no tamanho do genoma apareceu em ambas as direções, enquanto os conteúdos de GC foram encontrados mais homogêneos no gênero Nicotiana.

The dynamics of genome size and GC contents evolution in genus Nicotiana / A dinâmica do tamanho do genoma e a evolução dos conteúdos de GC no gênero Nicotiana

Abstract Hybridization and Polyploidization are most common of the phenomenon observed in plants, especially in the genus Nicotiana leading to the duplication of genome. Although genomic changes associated with these events has been studied at various levels but the genome size and GC content variation is less understood because of absence of sufficient genomic data. In this study the flow cytometry technique was used to uncover the genome size and GC contents of 46 Nicotiana species and we compared the genomic changes associated with the hybridization events along evolutionary time scale. The genome size among Nicotiana species varied between 3.28 pg and 11.88 pg whereas GC contents varied between 37.22% and 51.25%. The tetraploid species in genus Nicotiana including section Polydiclae, Repandae, Nicotiana, Rustica and Sauveolentes revealed both up and downsizing in their genome sizes when compared to the sum of genomes of their ancestral species. The genome sizes of three homoploid hybrids were found near their ancestral species. Loss of large genome sequence was observed in the evolutionary more aged species (>10 Myr) as compared to the recently evolved one's (<0.2 Myr). The GC contents were found homogenous with a mean difference of 2.46% among the Nicotiana species. It is concluded that genome size change appeared in either direction whereas the GC contents were found more homogenous in genus Nicotiana.

Resumo A hibridização e a poliploidização são os fenômenos mais comuns observados em plantas, principalmente no gênero Nicotiana, levando à duplicação do genoma. Embora as mudanças genômicas associadas a esses eventos tenham sido estudadas em vários níveis, o tamanho do genoma e a variação do conteúdo de GC são menos compreendidos devido à ausência de dados genômicos suficientes. Neste estudo, a técnica de citometria de fluxo foi usada para descobrir o tamanho do genoma e o conteúdo de GC de 46 espécies de Nicotiana, e comparamos as mudanças genômicas associadas aos eventos de hibridização ao longo da escala de tempo evolutiva. O tamanho do genoma entre as espécies de Nicotiana variou entre 3,28 pg e 11,88 pg, enquanto os conteúdos de GC variaram entre 37,22% e 51,25%. As espécies tetraploides do gênero Nicotiana, incluindo as seções Polydiclae, Repandae, Nicotiana, Rustica e Sauveolentes, revelaram aumento e redução do tamanho do genoma quando comparados à soma dos genomas de suas espécies ancestrais. Os tamanhos do genoma de três híbridos homoploides foram encontrados perto de suas espécies ancestrais. A perda da grande sequência do genoma foi observada nas espécies evolutivas mais velhas (> 10 Myr) em comparação com as que evoluíram recentemente (< 0,2 Myr). Os teores de GC foram homogêneos com diferença média de 2,46% entre as espécies de Nicotiana. Conclui-se que a mudança no tamanho do genoma apareceu em ambas as direções, enquanto os conteúdos de GC foram encontrados mais homogêneos no gênero Nicotiana.

The dynamics of genome size and GC contents evolution in genus Nicotiana / A dinâmica do tamanho do genoma e a evolução dos conteúdos de GC no gênero Nicotiana

Hybridization and Polyploidization are most common of the phenomenon observed in plants, especially in the genus Nicotiana leading to the duplication of genome. Although genomic changes associated with these events has been studied at various levels but the genome size and GC content variation is less understood because of absence of sufficient genomic data. In this study the flow cytometry technique was used to uncover the genome size and GC contents of 46 Nicotiana species and we compared the genomic changes associated with the hybridization events along evolutionary time scale. The genome size among Nicotiana species varied between 3.28 pg and 11.88 pg whereas GC contents varied between 37.22% and 51.25%. The tetraploid species in genus Nicotiana including section Polydiclae, Repandae, Nicotiana, Rustica and Sauveolentes revealed both up and downsizing in their genome sizes when compared to the sum of genomes of their ancestral species. The genome sizes of three homoploid hybrids were found near their ancestral species. Loss of large genome sequence was observed in the evolutionary more aged species (>10 Myr) as compared to the recently evolved ones (<0.2 Myr). The GC contents were found homogenous with a mean difference of 2.46% among the Nicotiana species. It is concluded that genome size change appeared in either direction whereas the GC contents were found more homogenous in genus Nicotiana.(AU)

A hibridização e a poliploidização são os fenômenos mais comuns observados em plantas, principalmente no gênero Nicotiana, levando à duplicação do genoma. Embora as mudanças genômicas associadas a esses eventos tenham sido estudadas em vários níveis, o tamanho do genoma e a variação do conteúdo de GC são menos compreendidos devido à ausência de dados genômicos suficientes. Neste estudo, a técnica de citometria de fluxo foi usada para descobrir o tamanho do genoma e o conteúdo de GC de 46 espécies de Nicotiana, e comparamos as mudanças genômicas associadas aos eventos de hibridização ao longo da escala de tempo evolutiva. O tamanho do genoma entre as espécies de Nicotiana variou entre 3,28 pg e 11,88 pg, enquanto os conteúdos de GC variaramentre 37,22% e 51,25%. As espécies tetraploides do gênero Nicotiana, incluindo as seções Polydiclae, Repandae, Nicotiana, Rustica e Sauveolentes, revelaram aumento e redução do tamanho do genoma quando comparados à soma dos genomas de suas espécies ancestrais. Os tamanhos do genoma de três híbridos homoploides foram encontrados perto de suas espécies ancestrais. A perda da grande sequência do genoma foi observada nas espécies evolutivas mais velhas (> 10 Myr) em comparação com as que evoluíram recentemente (< 0,2 Myr). Os teores de GC foram homogêneos com diferença média de 2,46% entre as espécies de Nicotiana. Conclui-se que a mudança no tamanho do genoma apareceu em ambas as direções, enquanto os conteúdos de GC foram encontrados mais homogêneos no gênero Nicotiana.(AU)

Genomic characterization, antimicrobial resistance profiles, enterotoxin, and biofilm production of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from clinical and animal products origins in Eastern Turkey

ABSTRACT: Staphylococcus aureus is an opportunistic and ubiquitous pathogen found in the skin, nares, and mucosal membranes of mammals. Increasing resistance to antimicrobials including methicillin has become an important public concern. One hundred and eight (108) S. aureus strains isolated from a total of 572 clinical and animal products samples, were investigated for their biofilm capability, methicillin resistance, enterotoxin genes, and genetic diversity. Although only one strain isolated from raw retail was found as a strong biofilm producer, the percentage of antimicrobial resistance pattern was relatively higher. 17.59% of S. aureus strains tested in this study were resistant to cefoxitin and identified as methicillin-resistant S. aureus (MRSA) isolates. mecA and mecC harboring S. aureus strains were detected at a rate of 2.79% and 0.93%, respectively. In addition, staphylococcal enterotoxin genes including Sea, Seb, Sec, and Sed genes were found to be 18.5%, 32.4%, 6.5% and 3.7%, respectively. The phylogenetic relationship among the isolates showed relationship between joint calf and cow milk isolates. Multi locus sequence typing (MLST) revealed three different sequence types (STs) including ST84, ST829, and ST6238. These findings highlight the development and spread of MRSA strains with zoonotic potential in animals and the food chain throughout the world.

RESUMO: Staphylococcus aureus é um patógeno dúctil e ubíquo encontrado na pele, narinas e membranas mucosas de mamíferos. O aumento da resistência aos antimicrobianos, incluindo a meticilina, tornou-se uma importante preocupação pública. Cento e oito (108) cepas de S. aureus isoladas de um total de 572 amostras clínicas e de produtos animais foram investigadas por sua capacidade de biofilme, resistência à meticilina, genes de enterotoxinas e diversidade genética. Embora apenas uma cepa isolada do cru tenha sido encontrada como forte produtora de biofilme, a porcentagem do padrão de resistência antimicrobiana foi relativamente maior. Parte das cepas (17,59%) de S. aureus testadas neste estudo eram resistentes à cefoxitina e identificadas como isolados de MRSA. mecA e mecC abrigando cepas de S. aureus foram detectados a uma taxa de 2,79% e 0,93%, respectivamente. Além disso, verificou-se que os genes da enterotoxina estafilocócica, incluindo os genes Sea, Seb, Sec e Sed, eram 18,5%, 32,4%, 6,5% e 3,7%, respectivamente. A relação filogenética entre os isolados mostrou relação entre os isolados de bezerro e leite de vaca. A tipagem de sequência multiloco (MLST) revelou três tipos de sequência diferentes (STs), incluindo ST84, ST829 e ST6238. Essas descobertas destacam o desenvolvimento e a disseminação de cepas de MRSA com potencial zoonótico em animais e na cadeia alimentar em todo o mundo.

Genomic characterization, antimicrobial resistance profiles, enterotoxin, and biofilm production of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from clinical and animal products origins in Eastern Turkey / Caracterização genômica perfis de resistência antimicrobiana, produção de enterotoxinas e biofilme Staphylococcus aureus resistente à meticilina isolado de origem clínica e de produtos de origem animal no leste da Turquia

Staphylococcus aureus is an opportunistic and ubiquitous pathogen found in the skin, nares, and mucosal membranes of mammals. Increasing resistance to antimicrobials including methicillin has become an important public concern. One hundred and eight (108) S. aureus strains isolated from a total of 572 clinical and animal products samples, were investigated for their biofilm capability, methicillin resistance, enterotoxin genes, and genetic diversity. Although only one strain isolated from raw retail was found as a strong biofilm producer, the percentage of antimicrobial resistance pattern was relatively higher. 17.59% of S. aureus strains tested in this study were resistant to cefoxitin and identified as methicillin-resistant S. aureus (MRSA) isolates. mecA and mecC harboring S. aureus strains were detected at a rate of 2.79% and 0.93%, respectively. In addition, staphylococcal enterotoxin genes including Sea, Seb, Sec, and Sed genes were found to be 18.5%, 32.4%, 6.5% and 3.7%, respectively. The phylogenetic relationship among the isolates showed relationship between joint calf and cow milk isolates. Multi locus sequence typing (MLST) revealed three different sequence types (STs) including ST84, ST829, and ST6238. These findings highlight the development and spread of MRSA strains with zoonotic potential in animals and the food chain throughout the world.

Staphylococcus aureus é um patógeno dúctil e ubíquo encontrado na pele, narinas e membranas mucosas de mamíferos. O aumento da resistência aos antimicrobianos, incluindo a meticilina, tornou-se uma importante preocupação pública. Cento e oito (108) cepas de S. aureus isoladas de um total de 572 amostras clínicas e de produtos animais foram investigadas por sua capacidade de biofilme, resistência à meticilina, genes de enterotoxinas e diversidade genética. Embora apenas uma cepa isolada do cru tenha sido encontrada como forte produtora de biofilme, a porcentagem do padrão de resistência antimicrobiana foi relativamente maior. Parte das cepas (17,59%) de S. aureus testadas neste estudo eram resistentes à cefoxitina e identificadas como isolados de MRSA. mecA e mecC abrigando cepas de S. aureus foram detectados a uma taxa de 2,79% e 0,93%, respectivamente. Além disso, verificou-se que os genes da enterotoxina estafilocócica, incluindo os genes Sea, Seb, Sec e Sed, eram 18,5%, 32,4%, 6,5% e 3,7%, respectivamente. A relação filogenética entre os isolados mostrou relação entre os isolados de bezerro e leite de vaca. A tipagem de sequência multiloco (MLST) revelou três tipos de sequência diferentes (STs), incluindo ST84, ST829 e ST6238. Essas descobertas destacam o desenvolvimento e a disseminação de cepas de MRSA com potencial zoonótico em animais e na cadeia alimentar em todo o mundo.

Genética em gatos: O que eu preciso saber antes de acasalar? / Genetics in Cats: What I need to know before breeding?

O gato doméstico foi o segundo carnívoro a passar pelo processo de domesticação. Este evento foi um marco muito importante para os gatos, mas também houve grande impacto para nossa sociedade, pois os gatos auxiliaram fortemente no controle de roedores. Após uma longa interação entre humanos e gatos, a seleção artificial para formação de raças e fenótipos de interesse gerou um aumento de acasalamentos entre indivíduos aparentados, e consequentemente, aumento de variantes deletérias nos gatos modernos. Atualmente, pesquisa e dados genômicos permitem a avaliação e detecção destas variantes, de modo a auxiliar a reprodução e saúde dos gatos domésticos.

The domestic cat was the second carnivore to go through the domestication process. This event was a very important milestone for cats, but it also had a great impact on our society, as cats strongly helped in rodent control. After a long interaction between humans and cats, artificial selection to form breeds and phenotypes of interest generated an increase in matings among related individuals, and consequently, an increase in deleterious variants in modern cats. Currently, research and genomic data allow the evaluation and detection of these variants, in order to help the reproduction and health of domestic felines.

Sistema CRISPR/Cas9 e perspectivas de aplicações na cadeia produtiva animal / CRISPR/Cas9 system and perspectives for applications in the animal production chain

O melhoramento genético tem papel fundamental no aumento da eficiência da produção pecuária. Entretanto, programas tradicionais de melhoramento podem levar vários anos para atingir um determinado objetivo. Novas abordagens genômicas permitem acelerar esse processo e recentemente a edição gênica surgiu como nova alternativa, além de ter potencial para induzir outras modificações genéticas de interesse comercial e biomédico. A possibilidade de editar o genoma de diferentes espécies, de maneira simples e eficaz, tornou-se possível com a tecnologia do sistema CRISPR/Cas9. Esse sistema biológico foi identificado em bactérias e funciona como um mecanismo natural de defesa desses organismos. Baseando-se nos princípios biológicos, cientistas adaptaram esse sistema para atuar em células de mamíferos, incluindo humanas. Trabalhos científicos demonstraram a aplicabilidade da técnica, que permite novas abordagens na condução de estudos da função gênica, além de permitir diferentes experimentos de alteração específica da sequência do DNA. Do ponto de vista da produção animal, a utilização do sistema CRISPR traz novos conceitos e possibilidades para o melhoramento genético. O objetivo desta revisão é discutir os princípios da metodologia, associando resultados previamente conhecidos à possíveis aplicações com enfoque na cadeia produtiva animal.(AU)

Genetic improvement has a prominent role in increasing the efficiency of livestock production systems. However, traditional breeding programs may take several years to achieve a specific goal. New genomic approaches could accelerate this process and recently gene editing appeared as an alternative and still holds the potential to induce genetic alterations of commercial and biomedical interest. The possibility of editing the genome of different species, in a simple and effective way, became possible with the technology of the CRISPR / Cas9 system. This biological system was identified in bacteria and works as a natural defense mechanism for these organisms. Based on biological principles, scientists adapted this system to act on mammalian cells, including humans. Scientific studies demonstrated the applicability of the technique, which allows new approaches in conducting studies of gene function, in addition to different experiments of targeted modification of the DNA sequence. From the point of view of animal production, the use of the CRISPR brings new concepts and possibilities for genetic improvement. The purpose of this review is to discuss the principles of the methodology, associating previously known results to possible applications focusing on the animal production chain.(AU)

Sistema CRISPR/Cas9 e perspectivas de aplicações na cadeia produtiva animal / CRISPR/Cas9 system and perspectives for applications in the animal production chain

O melhoramento genético tem papel fundamental no aumento da eficiência da produção pecuária. Entretanto, programas tradicionais de melhoramento podem levar vários anos para atingir um determinado objetivo. Novas abordagens genômicas permitem acelerar esse processo e recentemente a edição gênica surgiu como nova alternativa, além de ter potencial para induzir outras modificações genéticas de interesse comercial e biomédico. A possibilidade de editar o genoma de diferentes espécies, de maneira simples e eficaz, tornou-se possível com a tecnologia do sistema CRISPR/Cas9. Esse sistema biológico foi identificado em bactérias e funciona como um mecanismo natural de defesa desses organismos. Baseando-se nos princípios biológicos, cientistas adaptaram esse sistema para atuar em células de mamíferos, incluindo humanas. Trabalhos científicos demonstraram a aplicabilidade da técnica, que permite novas abordagens na condução de estudos da função gênica, além de permitir diferentes experimentos de alteração específica da sequência do DNA. Do ponto de vista da produção animal, a utilização do sistema CRISPR traz novos conceitos e possibilidades para o melhoramento genético. O objetivo desta revisão é discutir os princípios da metodologia, associando resultados previamente conhecidos à possíveis aplicações com enfoque na cadeia produtiva animal.

Genetic improvement has a prominent role in increasing the efficiency of livestock production systems. However, traditional breeding programs may take several years to achieve a specific goal. New genomic approaches could accelerate this process and recently gene editing appeared as an alternative and still holds the potential to induce genetic alterations of commercial and biomedical interest. The possibility of editing the genome of different species, in a simple and effective way, became possible with the technology of the CRISPR / Cas9 system. This biological system was identified in bacteria and works as a natural defense mechanism for these organisms. Based on biological principles, scientists adapted this system to act on mammalian cells, including humans. Scientific studies demonstrated the applicability of the technique, which allows new approaches in conducting studies of gene function, in addition to different experiments of targeted modification of the DNA sequence. From the point of view of animal production, the use of the CRISPR brings new concepts and possibilities for genetic improvement. The purpose of this review is to discuss the principles of the methodology, associating previously known results to possible applications focusing on the animal production chain.

A real-time quantitative PCR based on molecular beacon for detecting Brucella infection / PCR quantitativo em tempo real, baseado em guia molecular para detecção de infeção por Brucella

O objetivo deste comunicado é desenvolver um método quantitativo PCR em tempo real, baseado em guia molecular (MB) (MB-qPCR) para detecção de infecção por espécies de Brucella, e avaliar seu potencial de utilização clínica. Os primers e as sondas MB foram desenhados para amplificação específica e determinação de sequência conservada do código do gene para os primeiros 58-aa da proteína de membrana externa OMP-2a, que é compartilhada em cinco espécies de Brucella epidêmicas. A avaliação metodológica foi realizada por análise de sensibilidade, especificidade, coeficiente de variação intra e inter, e a linearidade do qPCR. O potencial diagnóstico foi avaliado comparando-se o método qPCR desenvolvido com ensaios de exames bacteriológicos convencionais, incluindo os testes de soroaglutinação convencionais (SATs) e os testes do Rosa Bengala (RBPTs). O método exibiu alta sensibilidade (tão baixo quanto 50 cópias) e grande faixa de linearidade (102-108 cópias). Nenhuma reação cruzada foi encontrada com bactéria clínica comum. A sensibilidade diagnóstica foi superior ao exame bacteriológico, e a especificidade diagnóstica foi superior ao SAT ou ao RBPT. Um método MB-qPCR altamente sensível e específico para DNA de Brucella foi estabelecido com sucesso, provando ser uma ferramenta útil no diagnóstico molecular de brucelose.(AU)

A real-time quantitative PCR based on molecular beacon for detecting Brucella infection / PCR quantitativo em tempo real, baseado em guia molecular para detecção de infeção por Brucella

O objetivo deste comunicado é desenvolver um método quantitativo PCR em tempo real, baseado em guia molecular (MB) (MB-qPCR) para detecção de infecção por espécies de Brucella, e avaliar seu potencial de utilização clínica. Os primers e as sondas MB foram desenhados para amplificação específica e determinação de sequência conservada do código do gene para os primeiros 58-aa da proteína de membrana externa OMP-2a, que é compartilhada em cinco espécies de Brucella epidêmicas. A avaliação metodológica foi realizada por análise de sensibilidade, especificidade, coeficiente de variação intra e inter, e a linearidade do qPCR. O potencial diagnóstico foi avaliado comparando-se o método qPCR desenvolvido com ensaios de exames bacteriológicos convencionais, incluindo os testes de soroaglutinação convencionais (SATs) e os testes do Rosa Bengala (RBPTs). O método exibiu alta sensibilidade (tão baixo quanto 50 cópias) e grande faixa de linearidade (102-108 cópias). Nenhuma reação cruzada foi encontrada com bactéria clínica comum. A sensibilidade diagnóstica foi superior ao exame bacteriológico, e a especificidade diagnóstica foi superior ao SAT ou ao RBPT. Um método MB-qPCR altamente sensível e específico para DNA de Brucella foi estabelecido com sucesso, provando ser uma ferramenta útil no diagnóstico molecular de brucelose.(AU)

Análise epidemiológica da distribuição dos genes de resistência antimicrobiana de Salmonella typhimurium no Brasil / Epidemiological analysis of the antimicrobial resistance genes distribution of Salmonella typhimurium in Brazil

Salmonella é uma das principais enterobactérias causadoras de gastroenterites no Brasil e no mundo, sendo Typhimurium o principal sorotipo. A disseminação desta bactéria causa perdas econômicas e produtivas. Nos países em desenvolvimento ocorre subnotificação dos surtos de salmoneloses prejudicando a vigilância epidemiológica. O uso de antibióticos é o tratamento mais eficiente contra infecções por Salmonella. Porém, seu uso indiscriminado favorece a seleção de linhagens resistentes e dificulta o tratamento das salmoneloses. Foi realizado um estudo da distribuição epidemiológica dos genes de resistência antimicrobiana adquirida em estirpes de Salmonella Typhimurium isoladas no Brasil, no período de 1983 a 2013. A classe de antibióticos que apresentou maior quantidade de genes de resistência foi a dos aminoglicosídeos, sendo o gene com maior prevalência o aac(6')-Iaa. As estirpes estudadas apresentaram resistência a antibióticos pertencentes entre 1 a 7 classes diferentes.

Bacillus cereus group: genetic aspects related to food safety and dairy processing / Grupo do Bacillus cereus: aspectos genéticos relacionados à segurança alimentar e ao processamento de derivados lácteos

Bacillus cereus group includes not pathogenic and high pathogenic species. They are considered as a risk to public health due to foodborne diseases and as an important cause of economic losses to industries due to production of spoilage enzymes. Some researches have been performed in order to assess the possible factors that contribute to put public health into risk because of consumption of food contaminated with viable cells or toxins which have complex mechanisms of production. The control of these bacteria in food is difficult because they are resistant to several processes used in industries. Thus, in this way, this review focused on highlighting the risk due to toxins production by bacteria from B. cereus group in food and the consequences for food safety and dairy industries.(AU)

Diversas espécies fazem parte do grupo de Bacillus cereus, desde algumas apatogênicas até outras com alta patogenicidade. Consistem em risco à saúde pública decorrentes de toxinfecções alimentares, além de causarem importantes perdas econômicas para as indústrias em virtude da produção de enzimas deteriorantes. O controle da contaminação em alimentos por esses micro-organismos é difícil, visto que são resistentes a vários tratamentos utilizados pelas indústrias. Assim, diante do exposto, esta revisão objetivou fornecer informações em relação aos aspectos genéticos desse grupo de bactérias e seus mecanismos de produção de toxinas, além de ressaltar a importância e as novas estratégias de controle para as companhias alimentícias e de laticínios.(AU)

Bacillus cereus group: genetic aspects related to food safety and dairy processing / Grupo do Bacillus cereus: aspectos genéticos relacionados à segurança alimentar e ao processamento de derivados lácteos

Bacillus cereus group includes not pathogenic and high pathogenic species. They are considered as a risk to public health due to foodborne diseases and as an important cause of economic losses to industries due to production of spoilage enzymes. Some researches have been performed in order to assess the possible factors that contribute to put public health into risk because of consumption of food contaminated with viable cells or toxins which have complex mechanisms of production. The control of these bacteria in food is difficult because they are resistant to several processes used in industries. Thus, in this way, this review focused on highlighting the risk due to toxins production by bacteria from B. cereus group in food and the consequences for food safety and dairy industries.(AU)

Diversas espécies fazem parte do grupo de Bacillus cereus, desde algumas apatogênicas até outras com alta patogenicidade. Consistem em risco à saúde pública decorrentes de toxinfecções alimentares, além de causarem importantes perdas econômicas para as indústrias em virtude da produção de enzimas deteriorantes. O controle da contaminação em alimentos por esses micro-organismos é difícil, visto que são resistentes a vários tratamentos utilizados pelas indústrias. Assim, diante do exposto, esta revisão objetivou fornecer informações em relação aos aspectos genéticos desse grupo de bactérias e seus mecanismos de produção de toxinas, além de ressaltar a importância e as novas estratégias de controle para as companhias alimentícias e de laticínios.(AU)

Caracterização molecular e estudo do genoma de Burkholderia mallei isoladas de equídeos nos estados de Pernambuco e Alagoas, Brasil

Mormo é uma doença infectocontagiosa primeiramente relatada entre os séculos II e IV e que causa graves perdas econômicas para a equideocultura. O objetivo desse estudo foi caracterizar geneticamente isolados de Burkholderia mallei obtidos de equídeos com mormo nos estados de Pernambuco e Alagoas. Durante as necropsias dos animais soropositivos foram coletadas amostras das lesões piogranulomatosas. O material foi submetido ao isolamento bacteriano e confirmação pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional e tempo real. No total, seis isolados foram identificados nas propriedades de equinos nos dois estados, sendo cinco isolados do estado Pernambuco e um isolado de Alagoas. Os produtos das amplificações foram sequenciados e comparados ao banco de dados encontrado no National Center for Biotechnology Information (NCBI), onde foi possível observar similaridade com o isolado Turkey 10, relatado primeiramente na Turquia. Os isolados foram submetidos à Reação em Cadeia da Polimerase High Resolution Melting (PCR-HRM) para caracterização genética por meio da variação dos Single Nucleotide polymorphisms (SNPs) e posteriormente ao sequenciamento completo do genoma (WGS). O sequenciamento do genoma revelou uma correlação entre as cepas circulantes nos dois estados, com uma variação genética entre cepas isoladas de animais de Pernambuco. Foram descritos dois genótipos de Burkholderia mallei circulantes no Brasil, sendo o genótipo L3B2, anteriormente descrito para um isolado brasileiro e o genótipo L3B3Sb3Gp1SbGp1, ainda não descrito anteriormente no país. Este é a primeira descrição de um isolado com similaridade genética com outras cepas relatadas na Europa, sugerindo mais de um evento de introdução da doença no Brasil. A caracterização dos isolados de B. mallei circulantes é importante para o desenvolvimento e aprimoramento de técnicas de diagnóstico sorológico e desenvolvimento de marcadores moleculares específicos para detecção de cepas brasileiras, além de ser um meio de adicional no controle da doença, possibilitando estabelecer ligações entre os diversos casos e identificar cadeias de transmissão.

Glanders is an infectious-contagious disease first reported between the 2nd and 4th centuries and that causes serious economic losses for equidae culture. The aim of this study was to genetically characterize Burkholderia mallei isolates obtained from equine glanders in the states of Pernambuco and Alagoas. During necropsies of seropositive animals, samples of pyogranulomatous lesions were collected. The material was subjected to bacterial isolation and bacterial cultures were analyzed by conventional and real time Polymerase Chain Reaction (PCR) for confirmation. In total, six isolates were identified on horse farms in both states, five from Pernambuco state and one from Alagoas. The amplicons were sequenced and compared to the database found at the National Center for Biotechnology Information (NCBI), where it was possible to observe similarity with the Turkey 10 isolate, first reported in Turkey. In order to confirm the result, the isolates were submitted to Polymerase Chain Reaction - High Resolution Melting (PCR-HRM) for genetic characterization through the variation of Single Nucleotide polymorphisms (SNPs) and subsequently to complete genome sequencing (WGS). The complete genome sequencing revealed a correlation between the circulating strains between the two states, but a genetic variation was observed among strains isolated from animals from Pernambuco. Two genotypes of Burkholderia mallei circulating in Brazil have been described, being the L3B2 genotype previously described for a Brazilian isolate and the L3B3Sb3Gp1SbGp1 genotype, never previously described for contemporary strains in Brazil. This is the first current description of an isolate with genetic similarity to other strains reported in Europe, suggesting more than one event of introduction of the disease in Brazil. The characterization of circulating B. mallei isolates is important for the development and improvement of serological diagnostic techniques and the development of specific molecular markers for the detection of Brazilian strains, in addition to being an additional means of controlling the disease, making it possible to establish links between the different cases and identify transmission chains.

Potencial terapêutico das proteínas imunorregulatórias recombinantes: produção heteróloga, caracterização e avaliação da atividade biológica da Cistatina-B da piranha vermelha Pygocentrus nattereri

A aquicultura é o setor de maior crescimento entre as indústrias de produção animal. Paralelo a esse importante crescimento ocorre o surgimento de doenças infecciosas, as quais podem causar significativas perdas nos estoques e problemas com o bem-estar animal, sendo o maior obstáculo para avanços na produção aquícola. Para enfrentar essa problemática é necessário associar boas técnicas de manejo ao desenvolvimento de novas tecnologias. Áreas como a biotecnologia e a engenharia genética possibilitam a produção de proteínas recombinantes, as quais podem ser utilizadas tanto na prevenção como no tratamento de doenças, sendo consideradas promissoras para o uso na indústria aquícola. Desta forma, fica evidente a necessidade de reunir toda informação referente ao estado da arte do uso de proteínas recombinantes na aquicultura. Assim, no primeiro capítulo dessa tese foi feita uma revisão do potencial terapêutico das proteínas imunorregulatórias na aquicultura, o que destaca que o uso de proteínas imunorregulatórias tem potencial para serem utilizadas na prevenção e tratamento de doenças de peixes. Dentre as proteínas que apresentam esse potencial, destaca-se as cistatinas. Desta forma, no segundo capítulo foi produzida uma Cistatina-B, oriunda da piranha vermelha Pygocentrus nattereri de forma heteróloga. As cistatinas são conhecidas por formar uma superfamília de inibidores de proteases de cisteína que apresentam um papel chave na degradação de proteínas e estão relacionadas a diferentes processos fisiológicos, como o desenvolvimento e imunidade. Para isso, juvenis de P. nattereri foram capturados no lago Janauacá, município de Manaquiri Amazonas, Brasil. Através da tecnologia do DNA recombinante a proteína Cistatina-B foi produzida e expressada na levedura Pichia pastoris. Foram avaliados a atividade biológica inibitória da protease de cisteína e ação bacteriostática nas bactérias Escherichia coli e Bacillus subtilis. A expressão e purificação da proteína imunorregulatória recombinante rCistatina-B revelou um fragmento de aproximadamente 11.8 kDa. A atividade inibitória atingiu 100% de inibição a uma concentração de 60 µg/µL resposta dependente-concentração do inibidor. Ação bacteriostática em E.coli e B. subtilis, numa concentração de 60 µg/µL de rCistatina-B, apresentou um halo de inibição de 9.66±0.55 mm e 10.50±2.54 mm, respectivamente, inferiores ao observado no controle positivo (espectinomicina) para as duas bactérias (23.93±1.42 e 21.39±1.83 mm) (P<0.05). Na concentração de 80 µg/µL a resposta foi similar, com valores de 8.83±0.72 mm para E.coli e 13.34±5.64 para B. subtilis, menores comparadas com o controle positivo (20±0.04 mm e 24.53±3.91) (P<0.05). Desta forma, o sistema de expressão eucarionte foi hábil em produzir a proteína recombinante rCistatina-B de Pygocentrus nattereri. A partir da confirmação do potencial biológico da Cistatina-B da piranha, análises in silico foram realizadas no genoma do peixe tambaqui Colossoma macropomum. Essas análises, que constituem o capítulo 3 dessa tese, permitiram identificar e analisar a Cistatina-B em todo o genoma do tambaqui. Foram identificados oito genes que codificam para a cistatina-B com base na sequência da piranha. Em geral, o tamanho das Cistatinas-B variaram de 96 a 101 aminoácidos, estão presentes majoritariamente no citoplasma, todas apresentaram motivos e domínios conservados nas cistatinas, além de apresentarem estrutura tridimensional similar a cistatina humana cristalografada. Como conclusão, o conhecimento e desenvolvimento das proteínas imunorregulatórias recombinantes e seu potencial terapêutico na aquicultura permite fornecer um novo bioproduto, o qual poderá ser usado como suplemento para estimulação do sistema imune em peixes.

Aquaculture is the fastest growing sector among animal production industries. Parallel to this important growth is the emergence of infectious diseases, which can cause significant losses in stocks and problems with animal welfare, being the biggest obstacle to advances in aquaculture production. To face this problem, it is necessary to associate good management techniques with the development of new technologies. Areas such as biotechnology and genetic engineering enable the production of recombinant proteins, which can be used both in the prevention and treatment of diseases, being considered promising for use in the aquaculture industry. Thus, it is evident the need to gather all information regarding the state of the art of the use of recombinant proteins in aquaculture. Thus, in the first chapter of this thesis, a review was made of the therapeutic potential of immunoregulatory proteins in aquaculture, which highlights that the use of immunoregulatory proteins has the potential to be used in the prevention and treatment of fish diseases. Among the proteins that have this potential, cystatins stand out. Thus, in the second chapter a Cystatin-B was produced, originating from the red piranha Pygocentrus nattereri in a heterologous way. Cystatins are known to form a superfamily of cysteine protease inhibitors that play a key role in protein degradation and are related to different physiological processes, such as development and immunity. For that, juveniles of P. nattereri were captured in the lake Janauacá, municipality of Manaquiri - Amazonas, Brazil. Through recombinant DNA technology, the protein Cystatin-B was produced and expressed in the yeast Pichia pastoris. The biological activity of cysteine protease and bacteriostatic action in Escherichia coli and Bacillus subtilis were evaluated. The expression and purification of the recombinant immunoregulatory protein rCystatin-B revealed a fragment of approximately 11.8 kDa. The inhibitory activity reached 100% inhibition at a concentration of 60 µg/µL response dependent on the concentration of the inhibitor. Bacteriostatic action in E.coli and B. subtilis, at a concentration of 60 µg /µL of rCystatin-B, showed an inhibition halo of 9.66 ± 0.55 mm and 10.50±2.54 mm, respectively, lower than that observed in the positive control (spectinomycin) for the two bacteria (23.93 ± 1.42 and 21.39 ± 1.83 mm) (P <0.05). At a concentration of 80 µg/µL the response was similar, with values of 8.83 ± 0.72 mm for E.coli and 13.34 ± 5.64 for B. subtilis, lower compared to the positive control (20 ± 0.04 mm and 24.53 ± 3.91) (P <0.05). Thus, the eukaryotic expression system was able to produce the recombinant protein rCystatin-B from Pygocentrus nattereri. From the confirmation of the biological potential of Cystatin-B of the piranha, in silico analyzes were carried out in the genome of the tambaqui fish Colossoma macropomum. These analyzes, which constitute chapter 3 of this thesis, made it possible to identify and analyze Cystatin-B throughout the tambaqui genome. Eight genes that code for Cystatin-B have been identified based on the piranha sequence. In general, the size of Cystatins-B varies from 96 to 101 amino acids, are present mainly in the cytoplasm, all of them presented motifs and domains conserved in cystatines, in addition to presenting a threedimensional structure similar to crystallized human cystatin. In conclusion, the knowledge and development of recombinant immunoregulatory proteins and their therapeutic potential in aquaculture allows us to provide a new bioproduct, which can be used as a supplement to stimulate the immune system in fish.

Clonalidade e perfis de resistência a antibióticos em Yersinia enterocolitica de suínos e humanos no Brasil

Yersinia enterocolitica é um patógeno associado usualmente a produtos derivados de suínos, seu principal reservatório. Esse patógeno é frequentemente isolado em tecidos linfáticos de suínos, em especial tonsilas palatinas e linfonodos mesentéricos. Por estar intimamente associada a cadeia produtiva de suínos, Y. enterocolitica está sujeita a todos os efeitos derivados dos procedimentos de manejo usualmente aplicados aos animais, como o desenvolvimento de resistência devido a aplicação preventiva ou terapêutica de antibióticos. Em um estudo prévio de nosso grupo, Y. enterocolitica foi identificada em uma cadeia produtiva de suínos e os isolados apresentaram alta similaridade de seus perfis de macro-restrição por XbaI. Assim, esse estudo teve como objetivo avaliar a persistência de Y. enterocolitica nessa cadeia produtiva de suínos, além de verificar a similaridade e potencial clonalidade dos isolados do bio-sorotipo 4/O:3 com isolados obtidos de casos de yersiniose humana, além de seus perfis de resistência a antibióticos. Amostras de tonsilas palatinas (n = 100), palatos (n = 30) e carne de cabeça (n = 17) foram obtidas durante o abate de suínos provenientes da mesma cadeia produtiva de suínos em que o estudo prévio de nosso grupo foi conduzido; as amostras foram submetidas a pesquisa de Y. enterocolitica, e os isolados obtidos submetidos a identificação de seus bio-sorotipos, pesquisa de genes de virulência (ail, ystB, virF, myfA, ystA, ystC, fepA, fepD, fes, tccC, ymoA, hreP e sat) e resistência múltipla a antibióticos (emrD, yfhD e marC). Parte desses isolados (n = 24) e isolados obtidos no estudo anterior de nosso grupo (n = 13) foram selecionados e caracterizados quanto aos seus perfis de macro-restrição com XbaI e NotI. Entre as amostras analisadas, 14 (9,5%) foram positivas para Y. enterocolitica, e os isolados obtidos (n = 24) foram identificados como pertencentes ao bio-sorotipo 4/O:3. Todos os isolados apresentaram resultados positivos para os genes de virulência e resistência múltipla a antibióticos pesquisados. Os isolados selecionados apresentaram alta similaridade após análise de seus perfis de macro-restrição, sendo agrupados em dois clusters com 33 (similaridade entre 82,4 e 100,0%) e 4 (similaridade entre 83,3 e 100,0%) isolados. Em seguida, parte desses isolados (n = 24) e isolados de Y. enterocolitica 4/O:3 obtidos de casos de yersiniose humana (n = 3) foram submetidos a sequenciamento completo de seus genomas e análises de similaridade, além de serem caracterizados quanto aos seus perfis de resistência a antibióticos pelo método de difusão em disco (14 antibióticos). Pela análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), os isolados foram agrupados em dois grandes clados, sendo apenas um isolado (R31) no Clado A e os demais no Clado B, e um total de sete grupos clonais. As diferenças marcantes observadas no genoma do isolado R31 foram determinadas pela presença de vários genes associados a fagos, o que determinou a sua identificação como pertencente ao sorotipo O:5. Treze isolados apresentaram resistência a antibióticos de três ou mais classes, sendo caracterizados como multidroga resistentes. A análise dos genomas dos isolados permitiu a identificação de 17 genes associados a resistência a antibióticos. A maioria dos isolados apresentou resistência a cefalosporinas, porém sem a presença de genes correspondentes a esse grupo de antibiótico. O estudo permitiu identificar a persistência de Y. enterocolitica do bio-sorotipo 4/O:3 na cadeia produtiva de suínos analisada, além de uma alta similaridade genética entre isolados obtidos nessa cadeia produtiva com isolados obtidos de casos de yersiniose humana, confirmando a relevância de suínos na manutenção e transmissão desse patógeno.

Yersinia enterocolitica is a foodborne pathogen usually associated to pork products, once pigs are their main reservoirs. This pathogen is often isolated from swine lymphatic tissues, especially tonsils and mesenteric lymph-nodes. Once it is close related to swine production, Y. enterocolitica is subjected to all effects resulted from the usual handling of pigs, such as the developing of antibiotic resistance as a consequence of preventive or therapeutic use of antimicrobials. Y. enterocolitica was previously identified by our group in a swine production chain and the obtained isolates presented high matching of band profiles after macro-restriction with XbaI. Thus, this study we aimed to evaluate the persistence of Y. enterocolitica in this swine production chain, the genetic similarity and potential clonality of the bio-serotype 4/O:3 isolates from this production chain with human yersiniosis isolates and their antibiotic resistance profiles. Samples of palatine tonsils (n = 100), palates (n = 30) and head meat (n = 17) were obtained from slaughtered pigs from the same production chain included in our previous study; samples were subjected to isolation of Y. enterocolitica and the isolates subjected to identification of their bio-serotypes, research of virulence genes (ail, ystB, virF, myfA, ystA, ystC, fepA, fepD, fes, tccC, ymoA, hreP and sat) and multidrug resistance related genes (emrD, yfhD and marC). A subset of these isolates (n = 24) and isolates obtained in our previous study (n = 13) were selected and characterized based on their band profiles after macro-restriction with XbaI and NotI. Y. enterocolitica was isolated in 14 (9.5%) of the analyzed samples, and the obtained isolates (n = 24) were identified as bio-serotype 4/O:3. All isolates presented the researched virulence and multidrug resistance related genes. The selected isolates presented high band matching after macro-restriction analysis, being grouped in two clusters with 33 (82.4 to 100.0% of band matching) and 4 (83.3 to 100.0% band matching) isolates. Then, a subset of these isolates (n = 24) and Y. enterocolitica 4/O:3 isolates obtained from human yersiniosis (n = 3) were subjected to whole genome sequencing, checked for genetic similarity and antibiotic resistance through the disk diffusion assay (14 antibiotics). Based on Single Nucleotide Polymorphism (SNP) analysis, isolates were grouped in two major clades: a single isolate (R31) was included in Clade A and other in Clade B, with a total of seven clonal groups. R31 presented several phage related genes, explaining its genetic differences when compared to other isolates. Thirteen isolates were characterized as multidrug resistant, once they presented resistance to three or more antibiotic classes. Genome analysis revealed the presence of 17 antibiotic resistance related genes among Y. enterocolitica isolates, and most of the isolates presented resistance to cephalosporins, despite the absence of the related genes. We were able to demonstrate the persistence of Y. enterocolitica 4/O:3 in the studied swine production chain, despite a high genetic similarity among the obtained isolates and human yersiniosis isolates, confirming the relevance of the swine in the maintenance and transmission of this pathogen.

CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA, CITOGENÉTICA E MOLECULAR DE Mazama sarae E Mazama chunyi (CETARTIODACTYLA; CERVIDAE) A PARTIR DE TOPÓTIPOS ATUAIS

O gênero Mazama está cercado de incertezas taxônomicas devido à alta diversidade cariotípica inter e intra-específica, origem polifilética e convergência morfológica, sendo que o número de espécies descritas em diferentes revisões varia entre quatro e dezoito. Dentro da espécie Mazama americana é sugerida a existência de novas espécies, já que além das diferenças moleculares e citogenéticas, existem evidências de isolamento reprodutivo pós-zigótico entre populações de veado-mateiro. Na Bolívia, até o momento foram descritas duas formas do gênero Mazama. A primeira delas é M. sarae Thomas, 1925; uma forma de veado vermelho descrito na região sul da Bolívia. Atualmente é considerado sinônimo de M. americana, com base nas características morfológicas daquele único exemplar descrito por Thomas (1925), sem nenhum tipo de abordagem genética. A segunda é M. chunyi Hershkovitz, 1959; uma forma de veado marrom de tamanho pequeno, que habita gradientes altitudinais de Puna-Yungas, no noroeste da Bolívia. Apesar de ser aceita como espécie única, as análises moleculares tem sido escassas e ainda não foi descrita cromossomicamente. Portanto, o presente estudo objetivou a caracterização de um topótipo de Mazama sarae e um topotipo de Mazama chunyi, sob aspectos morfológicos (biometria corporal, padrões de coloração da pele, craniometria), citogenéticos (coloração convencional Giemsa, biometria cromossômica, bandamento C, bandamento G, coloração Ag-NOR), e moleculares (análises filogenéticas do genoma mitocondrial, no caso de M. sarae, e de 3 genes mitocondriais para M. chunyi). Os resultados morfológicos posicionam ambas as espécies no clado dos pequenos Mazama (M. temama, M. nana, M. nemorivaga e M. gouazoubira). Segundo os padrões citogenéticos, os topótipos de ambas as espécies não se enquadram em nenhuma variante das espécies de Mazama atualmente conhecidas. As árvores filogenéticas geradas para o topótipo de M. sarae, permite evidenciar a espécie dentro da subtribo Odocoileina, mostrando uma distância considerável em relação ao M. americana e ao resto das espécies incluídas na subtribo. Por sua vez, o topótipo de M. chunyi, posiciona-se dentro da subtribo Blastocerina, próximo ao haplogrupo monofilético formado pelos espécimes de M. gouazoubira. Assim, propõe-se a caracterização de um topótipo para cada espécie estudada, o qual é o ponto de partida para a descrição de novas espécies e possível mudança completa na nomenclatura do gênero Mazama.

Mazama genus' taxonomic uncertainties are due to high inter and intraspecific karyotypic diversity, polyphyletic origin, and morphological convergence. The number of species described in different reviews ranges from four to eighteen. Within the Mazama americana species, new species' existence is suggested since, in addition to molecular and cytogenetic differences, there is evidence of post-zygotic reproductive isolation between red brocket deer populations. In Bolivia, two forms of the genus Mazama have been described to date. The first of these is M. sarae Thomas, 1925; a form of red deer described in the southern region of Bolivia. It is currently considered a synonym of M. americana, based on the morphological characteristics of that single specimen described by Thomas (1925), without having any genetic approach. The second is M. chunyi Hershkovitz, 1959, a small-sized brown deer that inhabits altitudinal gradients of Puna-Yungas in northwestern Bolivia. Although accepted as a unique species, molecular analyses have been scarce and have not yet been described chromosomally.Therefore, the present study aimed at the characterization of a topotype of Mazama sarae and of a topotype of Mazama chunyi, under morphological aspects (body biometrics, skin color patterns, craniometry), cytogenetic (Giemsa conventional coloration, chromosomal biometry, C banding, G banding, Ag-NOR coloration) and molecular (phylogenetic analyses of the mitochondrial genome, in the case of M. sarae, and of 3 mitochondrial genes for M. chunyi). The morphological results position both species in the clade of the small Mazama (M. temama, M. nana, M. nemorivaga e M. gouazoubira). According to cytogenetic patterns, both species' topotypes do not fit any variant of the Mazama species known until now. The phylogenetic trees generated for the topotype of M. sarae, allow us to evidence the species within the subtribe Odocoileina, showing a considerable distance from M. americana and the rest of the species subtribe. In this way, M. chunyi topotype is positioned within subtribe Blastocerina, close to the monophyletic haplogroup formed by specimens of M. gouazoubira. Thus, we propose the characterization of a topotype for each species studied, which is the starting point for the description of new species and possible complete change in the nomenclature of the genus Mazama.

TRANSFERÊNCIA DE GENOMA EM OVÓCITOS BOVINOS FRESCOS E VITRIFICADOS: PRODUÇÃO DE EMBRIÕES.

A transferência de genoma (TG), o qual permite substituir um citoplasma danificado por um integro, pode ser uma alternativa para melhorar a eficiência da criopreservação de ovócitos bovinos. Neste trabalho objetivou-se estabelecer a técnica de TG utilizando a placa metafásica (PM) e corpúsculo polar (CP) de ovócitos bovinos como fontes do material genético. Para isso foram realizados quatro experimentos. No primeiro foi estabelecida a TG utilizando a PM (TG-PM) avaliando a concentração espermática a ser utilizada, a taxa de fecundação, a de polispermia e a de embriões. Na avaliação da concentração espermática, a taxa de fecundação foi maior (P<0,05) no grupo controle (76,1%) do que no TG-PM fecundados com 1x106 sptz/ml (46,9%) e com 0,5x106 sptz/ml (46%), que não diferiram entre si. Com relação à produção de embriões o grupo TG-PM apresentou taxas de clivagem (50%) e blastocisto (13,6%) inferiores ao grupo controle (80,2% e 32,6%,). No segundo experimento foram avaliados os mesmos parâmetros do primeiro, porém com estruturas submetidas à transferência de corpúsculo polar (TG-CP). Os resultados mostraram que o grupo TG-CP apresentou taxa de fecundação (82,3% x 96,2%) e de blastocisto (7,7% x 36,8%) inferiores, mas a taxa de clivagem (88,5% x 85,3%) semelhante ao grupo controle. No terceiro experimento foi avaliado o efeito da TG-PM e TG-CPna quantidade e distribuição de Grânulos Corticais (GC), Mitocôndrias (MT) e numero de cópias de DNA mitocondrial (mtDNA). A quantificação do GC foi semelhante (p> 0,05) entre as estruturas reconstruídas GT-PM (n = 22) e GT-CP (n = 20). No entanto, ambos os grupos apresentaram menos GC (p <0,05) que os grupos controle (n = 22) e enucleados (n = 20). Para distribuição do GC, o grupo GT-PM apresentou menos estruturas com distribuição periférica, diferente dos grupos controle e enucleado (p<0,05), mas não apresentou diferença significativa em relação ao grupo GT-CP (p> 0,05). Não foi observado diferença entre os grupos quanto a quantidade e distribuição de MT e quantidade de mtDNA. No quarto experimento foi realizada a TG-PM utilizando ovócitos vitrificados (TG-PMV) como fonte de material genético. Para isso, forma utilizados 3 grupos, TG-PMV, controle vitrificado (VIT) e controle PIVE. A taxa de clivagem do grupo TG-PMV (70,34%) foi semelhante ao grupo controle PIVE e superior (p<0,05) ao grupo controle VIT (60%). Já a taxa de blastocisto não se diferiu do grupo controle VIT (9,1% e 5%) porem foram menores que o grupo controle PIVE (33%). Os resultados obtidos sugerem que as estruturas reconstruídas pela técnica de TG-PM e TG-CP são capazes de se desenvolver em embrião, e podem ser fecundados usando o mesmo protocolo utilizado na PIVE, sem aumento na taxa de polispermia. Além disso, os resultados mostraram que é possível produzir embriões por TG a partir de ovócitos vitrificados, possibilitando o uso de material genético armazenado em banco de germoplasma.

A genome transfer (GT), which allows replacing this damaged cytoplasm with an integer, is presented as an alternative for the use of these structures in PIVE. Therefore, this work aims to define the GT technique using the metaphasic plate (MP) and the polar body (PB) of bovine oocytes as sources of genetic material. For this, four experiments were carried out. In the first experiment, GT was established using MP (GT-MP). In the evaluation of sperm concentration, the fertilization rate in the control group (76.1%) was higher (p <0.05) than that of GT-MP fertilized with 1x106 sptz/ml (46.9%) and GT-MP fertilized with 0.5x106 sptz/ml (46%), which did not differ between them. However, the rate of polyspermia was similar (p> 0.05) between groups. Regarding the production of embryos, the GT-MP group showed cleavage rates (50%) and blastocyst (13.6%) lower than the PIVE control group (80.2% and 32.6%, respectively). In the second experiment, the same parameters as the first were evaluated, but with structures submitted to polar body transfer (GT-PB). The results showed that the GT-PB group had a lower fertilization rate (82.3% x 96.2%) and a blastocyst (7.7% x 36.8%), but the cleavage rate (88.5% x 85.3%) similar to the control group. In the third experiment, the effect of micromanipulation on the amount and distribution of Cortical Granules (CG), Mitochondria (MT) and number of copies of mitochondrial DNA (mtDNA) was evaluated. CG quantification was similar (p> 0.05) between the reconstructed structures GT-MP (n = 22) and GT-PB (n = 20). However, both groups had less CG (p<0.05) than the control (n = 22) and enucleated (n = 20) groups. For CG distribution, the GT-MP group had fewer structures with peripheral distribution, different from the control and enucleated groups (p<0.05), but there was no significant difference in relation to the GT-PB group (p> 0.05). The GT-PB was the only group that did not differ from the others (p> 0.05). There was no difference between groups regarding the amount and distribution of MT and the amount of mtDNA. In the fourth experiment, GT-MP was performed using vitrified oocytes (GT-VMP) as a source of genetic material. The cleavage rate of the TG-PMV group (70.34%) was similar to the IVP control group and higher (p<0.05) than the control VIT group (60%). The blastocyst rate did not differ from the control VIT group (9,1% and 5%) but were lower than the control group PIVE (33%). The results obtained so far suggest that the structures reconstructed by the TG-PM and TG-CP technique are capable of developing in embryo, and can be fertilized using the same protocol used in IVEP, without increasing the rate of polyspermia. In addition, the results showed that it is possible to produce embryos by TG from vitrified oocytes, enabling the use of genetic material stored in a germplasm bank.