Brazilian Theraphosidae: a toxicological point of view

The Theraphosidae family includes the largest number of species of the Mygalomorphae infraorder, with hundreds of species currently catalogued. However, there is a huge lack on physiologic and even ecologic information available, especially in Brazil, which is the most biodiverse country in the world. Over the years, spiders have been presented as a source of multiple biologically active compounds with basic roles, such as primary defense against pathogenic microorganisms or modulation of metabolic pathways and as specialized hunters. Spider venoms also evolved in order to enable the capture of prey by interaction with a diversity of molecular targets of interest, raising their pharmaceutical potential for the development of new drugs. Among the activities found in compounds isolated from venoms and hemocytes of Brazilian Theraphosidae there are antimicrobial, antifungal, antiparasitic and antitumoral, as well as properties related to proteinase action and neuromuscular blockage modulated by ionic voltage-gated channel interaction. These characteristics are present in different species from multiple genera, which is strong evidence of the important role in spider survival. The present review aims to compile the main results of studies from the last decades on Brazilian Theraphosidae with special focus on results obtained with the crude venom or compounds isolated from both venom and hemocytes, and their physiological and chemical characterization.(AU)

Brazilian Theraphosidae: a toxicological point of view

Abstract The Theraphosidae family includes the largest number of species of the Mygalomorphae infraorder, with hundreds of species currently catalogued. However, there is a huge lack on physiologic and even ecologic information available, especially in Brazil, which is the most biodiverse country in the world. Over the years, spiders have been presented as a source of multiple biologically active compounds with basic roles, such as primary defense against pathogenic microorganisms or modulation of metabolic pathways and as specialized hunters. Spider venoms also evolved in order to enable the capture of prey by interaction with a diversity of molecular targets of interest, raising their pharmaceutical potential for the development of new drugs. Among the activities found in compounds isolated from venoms and hemocytes of Brazilian Theraphosidae there are antimicrobial, antifungal, antiparasitic and antitumoral, as well as properties related to proteinase action and neuromuscular blockage modulated by ionic voltage-gated channel interaction. These characteristics are present in different species from multiple genera, which is strong evidence of the important role in spider survival. The present review aims to compile the main results of studies from the last decades on Brazilian Theraphosidae with special focus on results obtained with the crude venom or compounds isolated from both venom and hemocytes, and their physiological and chemical characterization.

Caracterização celular da hemolinfa e avaliação da resposta celular após exposição in vitro ao fluazuron de fêmeas ingurgitadas de Amblyomma sculptum.

Pertencente ao complexo Amblyomma cajennense, o carrapato Ambyomma sculptum pode ser encontrado as várias regiões do Brasil. É conhecido como carrapato estrela ou carrapato do cavalo e parasita animais domésticos, silvestres e humanos, sendo o principal transmissor de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa Brasileira. Possui grande importância na medicina veterinária por causar diversos prejuízos aos seus hospedeiros, além de existir a suspeita de transmitir Theileria equi para equinos. Poucos são os princípios ativos registrados para o controle do carrapato A. sculptum. O fluazuron é um inibidor de crescimento de insetos utilizado no controle de carrapatos que interfere na produção de quitina do artrópode, impedindo a muda de fase. A resistência de população de carrapatos a agentes antiparasitários representa um obstáculo aos programas de controle. Estudos sobre sistema imunológico de carrapatos buscam avaliar alterações na resposta celular hemolinfática que faça entender a imunologia e fisiologia envolvida nos mecanismos de controle e resistência. O objetivo deste trabalho foi caracterizar quantitativamente e morfologicamente os hemócitos presentes na hemolinfa de fêmeas ingurgitadas do carrapato A. sculptum e avaliar a resposta imune celular deste carrapato após a exposição in vitro ao fluazuron. Para caracterização celular hemolinfática de A. sculptum, a hemolinfa foi coletada através de uma perfuração da cutícula na parte dorsal do carrapato. A hemolinfa foi colocada diretamente em lâmina de vidro para confecção dos esfregaços sanguíneos que foram corados por solução de Giemsa. Foi realizada a contagem diferencial de hemócitos com base na morfologia observada em microscópio óptico em aumento de 1000 vezes, através da identificação das 100 primeiras células encontradas no esfregaço corado. A avaliação dos tamanhos celulares e de seus componentes foi realizada através da leitura das lâminas confeccionadas para contagem diferencial dos hemócitos com o auxílio de um Microscópio óptico Olympus modelo BX51 com luz polarizada, acoplado a uma câmera da mesma marca de modelo UC30. A contagem total de hemócitos foi realizada com auxílio de microscópio óptico e Câmara de Neubauer. Para avaliação da resposta celular após a exposição in vitro ao fluazuron foram realizados testes de imersão com as fêmeas ingurgitadas de A. sculptum nos grupos controle (com apenas os diluentes) e tratados (7,81, 250 e 4000ppm). Foi coletada hemolinfa para contagem total e diferencial de hemócitos nos tempos de 24h e 48h após a imersão. A caracterização celular revelou que o carrapato A. sculptum apresenta média de 1024 céls/L e seis tipos celulares: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos, esferulócitos, adipohemócitos e oenocitóides que se distribuem de forma distinta na hemolinfa, onde o granulócito foi o tipo mais frequente. O fluazuron foi capaz de realizar alterações celulares no carrapato A. sculptum promovendo a diminuição dos hemócitos totais na concentração de 4000ppm após 48h, assim como reduzir a frequência de granulócitos e aumentar a frequência de esferulócitos na contagem diferencial.

Belonging to the Amblyomma cajennense complex, the tick Ambyomma sculptum can be found in the various regions of Brazil. It is known as star tick or horse tick and parasite domestic, wild and human animals, being the main transmitter of Rickettsia rickettsii etiological agent of Brazilian Spotted Fever. It has great importance in veterinary medicine because of several damages to its hosts, in addition to the suspicion of transmitting Theileria equi to horses. There are few active ingredients registered for the control of the A. sculptum tick. Fluazuron is an insect growth inhibitor used in the control of ticks that interferes with the arthropod's chitin production, preventing the phase change. The resistance of the tick population to antiparasitic agents represents an obstacle to control programs. Studies on the tick's immune system seek to assess changes in the hemolymphatic cellular response that make the immunology and physiology involved in the control and resistance mechanisms understand. The aim of this work was to characterize quantitatively and morphologically the hemocytes present in the hemolymph of engorged females of the A. sculptum tick and to evaluate the cellular immune response of this tick after in vitro exposure to fluazuron. For hemolymphatic cell characterization of A. sculptum. hemolymph was collected through a cuticle perforation in the dorsal part of the tick. The hemolymph was placed directly on a glass slide to make blood smears that were stained with Giemsa's solution. Differential hemocyte counting was performed based on the morphology observed in an optical microscope in 1000-fold magnification, by identifying the first 100 cells found in the stained smear. The evaluation of cell sizes and their components was performed by reading the slides made for differential counting of hemocytes with the aid of an Olympus optical microscope model BX51 with polarized light, coupled to a camera of the same brand model UC30. The total hemocyte count was performed with the aid of an optical microscope and a Neubauer Chamber. To evaluate the cellular response after in vitro exposure to fluazuron, immersion tests were performed with the engorged females of A. sculptum in the control (with diluents only) and treated (7.81, 250 and 4000 ppm) groups. Hemolymph was collected for total and differential hemocyte counts at 24h and 48h after immersion. The cellular characterization revealed that the A. sculptum tick has an average of 1024 cells / L and six cell types: prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, spherulocytes, adipohemocytes and oenocytoids that are distributed differently in the hemolymph, where granulocyte was the most frequent type. Fluazuron was able to make cellular changes in the tick A. sculptum promoting a decrease in total hemocytes at a concentration of 4000ppm after 48h as well as reducing the frequency of granulocytes and increasing the frequency of spherulocytes in the differential count.

TOXICIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Illicium verum, Cymbopogon citratus E Azadirachta indica SOBRE Rhipicephalus microplus EM TESTE In vitro

No Brasil, o controle de Rhipicephalus microplus é realizado principalmente por acaricidas químicos. Todavia, devido ao crescente número de populações resistentes aos princípios ativos disponíveis no mercado e também devido à preocupação com a qualidade dos produtos de origem animal, novas tecnologias vêm sendo pesquisadas. Uma alternativa que tem demonstrado potencial é a utilização de óleos essenciais, porém, ainda são escassos os estudos a respeito do mecanismo de ação desses óleos nos carrapatos. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito citotóxico e acaricida de diferentes concentrações dos óleos essenciais das plantas Illicium verum (anis estrelado), Cymbopogon citratus (capim cidreira) e Azadirachta indica (neem), sobre hemócitos e larvas de R. microplus. Para o teste de toxicidade, os óleos essenciais (obtidos comercialmente) foram diluídos em solução de água destilada e Tween 80® a 3% e as concentrações utilizadas foram 1,25; 2,5; 5; 10,0 e 20,0 mg/mL. Para obtenção dos hemócitos foi realizada a coleta de hemolinfa de 400 fêmeas completamente ingurgitadas de R. microplus. Os hemócitos foram plaqueados na concentração de 5 × 104 células em cada poço de uma placa de 96 poços, expostos a 10L da solução de cada óleo. Doze horas após a exposição, 20 L de resazurina na concentração de 0,13 mg/mL foram adicionados em cada poço e as amostras incubadas no escuro por três horas. A intensidade de fluorescência foi avaliada através de um fluorímetro de placa. A viabilidade relativa dos hemócitos foi calculada considerando as células não expostas a nenhum óleo como controles (100% viabilidade). Para avaliar a ação acaricida, foi realizado o teste de pacote de larvas, onde aproximadamente 100 larvas foram expostas às diferentes concentrações dos óleos e o percentual de mortalidade das larvas foi avaliado após 24 horas. Como resultados, verificou-se que na exposição a 20mg/mL dos óleos houve a maior alteração no percentual de viabilidade celular, cujas reduções foram de 23%, 15% e 9,4% para anis estrelado, capim cidreira e neem, respectivamente. No bioensaio com larvas de R. microplus, anis estrelado e capim cidreira causaram 99,3% e 63,2% de mortalidade, respectivamente, na concentração de 20mg/mL, enquanto que o neem não causou mais que 1,0% de mortalidade das larvas em nenhuma das concentrações testadas. Assim, conclui-se que os óleos essenciais de anis estrelado e capim cidreira apresentaram toxicidade sobre hemócitos e ação acaricida para R. microplus, sendo o anis estrelado o mais citotóxico e letal entre eles.

In Brazil, the control of Rhipicephalus microplus is carried out mainly by chemical acaricides. However, due to the growing number of populations resistant to the active ingredients available on the market and also due to the concern with the quality of products of animal origin, new technologies are being researched. An alternative that has demonstrated potential is the use of essential oils, however, studies on the mechanism of action of these oils in ticks are still scarce. Thus, the aim of this study was to evaluate the cytotoxic and acaricidal effect essential oils from the plants Illicium verum (star anise), Cymbopogon citratus (lemongrass) and Azadirachta indica (neem), in different concentrations against R. microplus. For the toxicity test, the essential oils (obtained commercially) were diluted in a solution of distilled water and 3% Tween 80® and the concentrations used were 1.25; 2.5; 5; 10.0 and 20.0 mg ml-1. Harvesting hemolytic, hemolymph was collected from 400 females completely engorged of R. microplus. Hemocytes were plated at a concentration of 5 × 104 cells in each well of a 96-well plate, exposed to 10L of the solution of each oil. Twelve hours after exposure, 20 L of resazurin at a concentration of 0.13 mg / mL was added to each well and the samples incubated in the dark for three hours. The fluorescence intensity was assessed using a plate fluorimeter. The relative viability of the hemocytes was calculated considering the cells not exposed to any oil as controls (100% viability). In order to evaluate the acaricidal action, the larval pack test was performed, where approximately 100 larvae were exposed to different oil concentrations and the mortality percentage of the larvae was assessed after 24 hours. As a result, it was found that in the exposure to (20mg mL-1) of oils there was the greatest change in the percentage of cell viability, whose reductions were of 23%, 15% and 9.4% for star anise, lemongrass and neem, respectively. In the bioassay with R. microplus larvae, star anise and lemongrass caused 99.3% and 63.2% of mortality, respectively, at a concentration of 20mg mL-1, while the neem caused no more than 1.0% mortality larvae in none of the tested concentrations. Thus, it is concluded that the essential oils of star anise and lemongrass showed toxicity on hemocytes and acaricidal action for R. microplus, with star anise being the most cytotoxic and lethal among them.

PERFIL PROTEICO DA HEMOLINFA DE LARVAS DE Musca domestica INFECTADAS COM Metarhizium robertsii IP 146

Os fungos entomopatogênicos infectam artrópodes através de conídios especializados que se fixam para germinar e penetrar a cutícula. Os blastosporos se multiplicam na hemocele do hospedeiro, e a morte deste ocorre geralmente dentro de alguns dias. Pouco se sabe quais são os impactos da infecção para o sistema imunológico de larvas de Musca domestica. Neste sentido, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a resposta imunológica de larvas de terceiro estádio (L3) infectadas com Metarhizium robertsii IP 146. Foram utilizadas 900 L3 divididas em nove potes plásticos, sendo três potes para o grupo controle e seis potes para os grupos tratamento. Nos grupos tratamento foram aplicados em papel filtro 1 ml de suspensão de conídios ou blastosporos ajustadas a 1,0 × 108 propágulos ml-1 de M. robertsii. A coleta da hemolinfa dos grupos controle e tratamento foram realizadas 24, 48 e 72 h após o tratamento. Após a coleta, as amostras de hemolinfa foram centrifugadas à 500 rpm por 3 minutos para a separação do plasma e dos hemócitos. Em placas de Petri contendo meio CTC foram semeados conídios ou blastoporos de IP 146 e colocados discos de papel filtro embebidos com plasma dos diferentes grupos tratamento. Dois dias após a aplicação do fungo sobre o meio CTC, foi avaliada a formação de halo de inibição de crescimento fúngico. Para a quantificação de proteínas totais e a avalição do perfil proteico do plasma da hemolinfa foi utilizado o método Biureto e eletroforese em gel de poliacrilamida, respectivamente. Os hemócitos totais foram contados em hematocitometro. Esfregaços em lâminas de vidro de hemócitos foram corados por Giemsa para a contagem diferencial de células. Os resultados revelaram o aumento na número total de hemócitos no grupo de larvas tratadas com conídios nos tempos de 48 e 72 horas pós-tratamento. Na contagem relativa das populações celulares, houve o aumento de prohemócitos e plasmatócitos em ambos os tratamentos. Nos géis SDSPAGE foram detectadas a presença de diferentes perfis de proteínas para os grupos controle e tratamento. Os grupos controle, blastoporos e conídios que tiveram a coleta realizada 24 horas pós-tratamento foi demonstrada a presença de sete, oito e 10 bandas, respectivamente. No tempo de 48 horas, no grupo controle, foram reveladas sete bandas e nos grupos blastoporos e conídios ambos revelaram oito bandas. Ao contrário dos outros momentos de coleta, no tempo de 72 horas o grupo tratado com blastosporos foi o que demonstrou menor número de bandas com seis bandas no total, e os grupos controle e tratamento com conídios revelaram ambos sete bandas cada. A banda de 68 kDa apresentou maior quantidade de proteínas em todos os grupos e independentemente do tempo de coleta da hemolinfa pós-tratamento, com média de 22 µg. Tanto para a quantificação da concentração média de proteínas presentes na hemolinfa, quanto para o volume calibrado das bandas não apresentaram diferença estatística entre os grupos controle, conídios e blastoporos para os diferentes tempos de coleta. Não houve a formação de halo de inibição no teste de atividade antifúngica do plasma da hemolinfa. Ambas os propágulos de M. robertsii induzem resposta imunológica em M. domestica, porem a infecção por conídios ocasiona maior resposta imune no hospedeiro.

Entomopathogenic fungi infect arthropods with specialized conidia that germinate and penetrate the cuticle. The penetrating fungus multiplies in host hemocoel and the death of the host usually occurs within a few days. Little is known about how fungal infection effect the immune system of M. domestica larvae. Therefore, this study aims to evaluate the immunological response of L3 larvae infected with Metarhizium robertsii IP 146. Nine hundred L3 larvae were divided into nine plastics pots: three for control group and six for treatment groups. In the treatment group, 1 ml of conidial suspension or blastospores adjusted to 1.0 × 108 ml -1 propagules of M. robertsii were applied in filter paper. Samples of hemolymph were collected 24, 48 and 72 h after treatment. In Petri dishes containing CTC medium, conidia or blastopores of IP 146 were spread out on the medium, and 10 µl of plasma of different treatment groups was inoculated in filter paper dish. Two days after application of the fungus on the medium, the formation of the halo of fungal growth inhibition was evaluated. The Biuret Method and polyacrylamide gel electrophoresis were used for quantification of total proteins and evaluation of the plasma protein profile of hemolymph, respectively. Total hemocytes were counted in a hematocytometre. Glass slides with total hemolymph were stained by Giemsa for the differential cell count by morphological characteristics. The results revealed an increase in the total hemocyte count in the group of conidia treated larvae at 48 and 72 hours after treatment. In SDS-PAGE gel revealed the presence of different protein profiles in the treatment groups. Control groups, and the groups treated with blastopores or conidia that had hemolymph collected 24 h post-treatment had seven, eight and 10 bands, respectively. At the time of 48 h, plasma from the control group revealed seven bands, and in the groups treated with blastopores or conidia both revealed eight bands. In contrast,, at 72 h the group treated with blastospores was the one that presented the lowest number of bands, six bands in total; the control group and the group treated with conidia revealed both seven bands each. The 68 kDa band presented the highest quantity of protein in all groups, and independently of the time of collection of hemolymph, had an average of 22 g. Both quantification of proteins concentration in the hemolymph and the calibrated volume of the bands did not differ statistically among the control groups and the groups treated with conidia or blastopores. No inhibition halo formation was seen in the hemolymph plasma antifungal activity test. Both M. robertsii propagules induce immune response in M. domestica, but conidia infection caused a greater immune response in the host than blastospores.

IDENTIFICAÇÃO DOS PARÂMETROS IMUNOLÓGICOS DO CARAMUJO Pomacea lineata SPIX, 1827 (MOLLUSCA: PULMONATA) EXPOSTOS AO Schistosoma mansoni SAMBON, 1907

O objetivo deste trabalho foi obter dados relacionados à imunidade de caramujos Pomacea lineata quando expostos aos miracídios de Schistosoma mansoni, visto que estes caramujos coabitam no mesmo ambiente com os caramujos hospedeiros intermediários obrigatórios para este parasita e não são vetores. Para isso, a geração F1 P. lineata provenientes de um criadouro comercial foi utilizada neste estudo. Para tanto, coletou-se a hemolinfa de P. lineata sadios e expostos à miracídios de S. mansoni, em diferentes tempos, formando os seguintes grupos experimentais: I- Caramujos não infectados e analisados após 24 horas da exposição luminosa; II - Caramujos expostos aos miracídios de S. mansoni e analisados após 24 horas da exposição luminosa; III - Caramujos não infectados e analisados após 48 horas da exposição luminosa; IV- Caramujos expostos aos miracídios de S. mansoni e analisados após 48 horas da exposição luminosa. A exposição desses animais aos miracídios de S. mansoni demonstrou alterações significativas nas análises da contagem total de hemócitos, fenoloxidase, óxido nítrico e proteínas totais. Houve marcação positiva do TNF alfa nos agranulócitos e granulócitos. Foram descritos três tipos de hemócitos em P. lineata: agranulócitos, hialinócitos e granulócitos. Houve também alteração no tecido fibromuscular do músculo pedal com a presença de vários esporocistos circundados por tecido de granulação. Assim, podemos concluir que quando expostos ao S. mansoni, o sistema imune do P. lineata desencadeia uma série de mecanismos para protegê-lo do parasita e que essa proteção se dá com mais intensidade nas primeiras 24h após a exposição.

The objective of this work is to obtain data related to the immunity of Pomacea lineata snails when exposed to the miracidia of platelets Schistosoma mansoni, since these snails cohabit in the same environment with the host snails obligatory intermediates for this parasite. For this, the F1 generation of P. lineata from a commercial breeding site was used in this study. The hemolymph of these P. lineata snails were collected and exposed to the miracidia of S. mansoni, at different times, forming the following experimental groups: I - Uninfected snails and analyzed after 24 hours of light exposure; II - Snails exposed to S. mansoni miracidia and analyzed after 24 hours of light exposure; III - Uninfected snails and analyzed after 48 hours of light exposure; IV - Snails exposed to S. mansoni miracidia and analyzed after 48 hours of light exposure. The exposure of these animals to S. mansoni miracidia showed significant changes in the analysis of total hemocytes, phenoloxidase, nitric oxide and total proteins. There was positive labeling of TNF alpha in agranulocytes and granulocytes. Three types of hemocytes were described in P. lineata: agranulocytes, hyalinocytes and granulocytes. There was also alteration in the fibromuscular tissue of the pedal muscle with the presence of several sporocysts surrounded by granulation tissue. Thus, we can conclude that when exposed to S. mansoni, the immune system of P. lineata triggers a series of mechanisms to protect it from the parasite and that this protection occurs more intensely in the first 24 hours after exposure.

Caracterização funcional e ultraestrutural dos hemócitos da ostra perlifera Pteria hirundo

A ostra perlífera Pteria hirundo possui um grande potencial para a aquicultura nacional, pois além de apresentar potencialidade para o consumo, essa espécie possui a capacidade de produzir pérolas. Apesar do seu potencial para cultivo, pouco ainda se conhece a respeito da sua fisiologia e sistema imune. O presente estudo teve por objetivo identificar e caracterizar morfológica e ultraestruturalmente os hemócitos de P. hirundo, bem como identificar as populações hemocitárias e avaliar algumas respostas celulares e humorais de defesa frente a uma infecção bacteriana. Três populações de hemócitos foram encontradas: hemócitos hialinos (HH), hemócitos granulares (HG) e células blásticas (CB). A população mais abundante na circulação foi a de HH (88,2%), que se caracterizaram pela presença de poucos a nenhum grânulo em seu citoplasma, seguida pelos HG (9,4%) com muitos grânulos grandes e elétron-lúcidos no citosol, e as CB (2,4%) que foram os menores hemócitos e se caracterizaram por possuir forma esférica e uma alta razão núcleo-citoplasma. Três diferentes subpopulações de HH foram identificadas (HH-1, HH-2 e HH-3), apresentando diferenças quanto ao tamanho celular e à complexidade interna. Os hemócitos apresentaram uma elevada capacidade fagocítica ex vivo de partículas inertes (38,5% dos hemócitos avaliados). Além disso, essas células mostraram-se aptas a produzir moléculas microbicidas como as espécies reativas de oxigênio (ERO), porém esta produção não foi induzida por lipopolissacarídeos (LPS) bacterianos. Os principais produtores deste composto microbicida foram os HH-1, HG e HH-3. A presença de moléculas aglutinantes na hemolinfa de ostras previamente desafiadas com a Vibrio alginolyticus foi demonstrada por meio da aglutinação in vitro de bactérias marinhas Vibrio harveyi e V. alginolyticus (título aglutinante 256× e 1024×, respectivamente). Contudo, as bactérias marinhas Gram-positivas, Mycobacterium maritypicum e Corynebacterium stationis não foram aglutinadas. O número total de hemócitos circulantes (THC) nas ostras sadias foi de 8,53 ± 4,27×106 células/mL, no entanto 24 h após infecção com V. alginolyticus (ou injeção com salina), o hemograma caiu pela metade. A caracterização ultraestrutural e funcional dos hemócitos de P. hirundo abre perspectivas para estudos visando à prevenção e ao controle de enfermidades em pterídeos com interesse aquícola

The pearl oyster Pteria hirundo (Pteridae family) has a great potential in national aquaculture due to its gastronomic appeal and to its capacity to produce pearls. Despite of its economic importance, little is known about its physiology and immune system. Thus, the aim of the present study was to identify and characterize at morphological and ultrastructural levels the hemocytes of P. hirundo, as well to identify its hemocyte populations and evaluate some cellular and humoral defenses in response to a bacterial infection. Three main hemocyte populations were recognized, represented by hyaline hemocytes (HH), granular hemocytes (GH) and blast cells (BC). The most abundant population comprised the hyaline hemocytes (88.2%) which were characterized by the presence few or no granules in the cytoplasm, followed by the granular hemocytes (9.4%) which have a great number of large electron lucid granules, and blast cells (2.4%) which were the smallest hemocytes, showing a spherical format and a high nucleus/cytoplasm ratio. Three different subpopulations of HH were identified (HH-1, HH-2 and HH-3), showing differences in terms of cellular volume and internal complexity. The hemocytes showed an elevated phagocytic capacity ex-vivo for inert particles (38.5% of the evaluated hemocytes). Besides, these cells are able to produce microbicidal molecules, such as reactive oxygen species (ROS), but the production of these molecules were not induced by bacterial lipopolysaccharides (LPS). The main ROS-producing cells were the HH-1, GH and HH-3. The presence of agglutinating molecules in the hemolymph of pearl oysters pre-challenged with the Gram-negative Vibrio alginolyticus was demonstrated by the in vitro agglutination of marine Vibrio species, V. harveyi and V. alginolyticus (agglutinating title of 256× and 1024×, respectively). However, the marine Gram-positive bacteria Mycobacterium maritypicum and Corynebacterium stationis were not agglutinated by the oyster hemolymph. The total count of circulating hemocytes in apparently healthy animals was 8.53 ± 4.27×106 cells/mL, but after an experimental injection of a bacterial solution (V. alginolyticus) or saline, the number of hemocytes significantly dropped (2×). In conclusion, the hemolymph of P. hirundo contains the typical hemocyte types found in bivalves and the ultrastructural and functional characterization of these cells represents a pioneering study that opens new perspectives for a better understanding of the immune reactions of this pearl oyster, aiming the prevention and control of infectious diseases in pteridean species of aquaculture importance

RESPOSTAS ANTIOXIDANTES E DANO OXIDATIVO NO CAMARÃO Litopenaeus vannamei: EFEITOS DA SUPLEMENTAÇÃO COM ANTIOXIDANTE E USO DE TECNOLOGIA DE BIOFLOCOS

Em aquicultura o aumento da intensificação está diretamente ligado a aplicação de novas tecnologias que aumente o volume de produção ao mesmo tempo que causa o mínimo de impacto ao meio ambiente que circunda a produção. Deste modo a tecnologia de biofloco desponta como método no qual o tratamento de qualidade de água é efetuado dentro do tanque de criação de modo que organismos fotoautotrofico (microalgas), autotróficos (bactéria nitrificante) e heterotróficos (bactéria heterotrófica) reciclam compostos nitrogenados que podem vir a ser tóxicos para o camarão Litopenaeus vannamei, além de serem capazes de transformar amônia em biomassa bacteriana que servirá como fonte proteica e lipídica para o camarão, podendo reduzir custo com ração. Com aumento da densidade no sistema de criação faz-se necessário aumentar a resistência bioquímica do animal criado, para tanto este trabalho apresenta em três capítulos meios de suplementação com antioxidante ácido lipóico (AL) que auxilia na resposta bioquímica antioxidante como mecanismo de melhorar o bem estar do camarão Litopenaeus vannamei. Primeiramente, através de análises bioquímicas como atividade da glutationa S-transferase (GST), concentração de glutationa reduzida (GSH), capacidade antioxidante total contra radicais peroxil (ACAP) e níveis de peroxidação lipídica (TBARS) em brânquias, hepatopâncreas e músculo de camarão, observando-se que o biofloco induz aumento da atividade da GST em brânquias, aumento da concentração de GSH em músculo, aumenta a capacidade antioxidante total em músculo e reduz níveis de peroxidação lipídica em hepatopâncreas. O segundo trabalho, aplicou-se ácido lipóico nanoencapsulado (NCLA) e cápsula vazia (NC) na ração, em água clara e em água com biofloco no qual foi observado que NCLA induzida aumento da atividade de GST nos hepatopâncreas. A concentração de GSH foi maior no músculo do que em brânquias e hepatopâncreas. A capacidade antioxidante também mostrou um padrão tecido-específico, tendo hepatopâncreas com maior capacidade antioxidante nenhuma ação evidente do desempenho do NCLA contra os radicais peroxil. Níveis de peroxidação lipídica foram menores no músculo, com acentuado efeito do NCLA. Nos grupos com NCLA houve um aumento na porcentagem de hemócitos granulares, células com maiores quantidades de componentes imunocompetentes. No trabalho 3, foi observado que o AL é capaz de aumentar a capacidade antioxidante no biofloco, analisado através da determinação da capacidade antioxidante total contra radicais peroxil (ACAP), principalmente para concentração de 10 µM (2.06 mg de AL in 1 L de água destilada).

In aquaculture, the increased intensification is directly linked to application of new technologies to increase the volume of production while causing minimal impact to the environment surrounding the production. Thus, the biofloc blunts as a new technology method in which the treatment water quality is made inside the tank, so that creation of photoautotrophic organisms (microalgae), autotrophs (nitrifying bacteria) and heterotrophic (heterotrophic bacteria) recycle nitrogen compounds that may to be toxic to shrimp Litopenaeus vannamei. These microorganisms are able to turn ammonia into bacterial biomass that will serve as protein and lipid source for shrimp and may reduce feed cost. With increased density in the build system it is necessary to increase the resistance biochemistry of the animal created, therefore this work presents in four chapters how of supplementation with the antioxidant lipoic acid (LA) can be assist in antioxidant biochemical response as a mechanism to improve the wellness of shrimp Litopenaeus vannamei. Firstly, by biochemical analyzes as gluthatione S-transferase (GST) activity, reduced gluthatione (GSH) concentration, total antioxidant capacity against peroxyl radicals (ACAP) and levels of lipid peroxidation (TBARS) in gills, hepatopancreas and shrimp muscle, observing that the biofloc induces increased in GST activity in gills, increased GSH concentration in muscle, increases the total antioxidant capacity in muscle and reduces lipid peroxidation levels in hepatopancreas. The second work was applied nanoencapsulated lipoic acid (NCLA) and empty nanocapsules (CN) in feed in clean water (SW) and biofloc (BFT) in which it was observed that NCLA induced increased GST activity in hepatopancreas. The GSH concentration was higher in muscle than in gills and hepatopancreas. The antioxidant activity also showed a specific pattern of tissue having higher antioxidant capacity in hepatopancreas, without no obvious action of NCLA in performance against peroxyl radicals. Lipid peroxidation levels were lower in the muscle, with marked effect of NCLA. In groups with NCLA there was an increase in the percentage of granular hemocytes, cells with higher amounts of immunocompetents components. In the work 3, it was observed that LA can increase the antioxidant capacity on biofloc, analyzed by determining the total antioxidant capacity against peroxyl radicals (ACAP), especially for concentration 10 µM (2.06 mg AL in 1 L of water distilled).

Caracterização citológica dos hemócitos de Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera, Noctuidae) em larvas resistentes ao vírus AgMNPV

The occurrence of Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1932) larvae resistant to the virus AgMNPV in laboratory led to the study of the hemocytes of this insect, in order to evalue its participation in the mechanisms which enables the resistance to the virus. The resistant larvae with 6 to 11 developmental days old (3rd to 5th instars) were anesthetized by cold and after that were quickly cleaned in 70% alcohol. The hemolymph was collected through abdominal puncturing; the morphological analysis was made in phase contrast and colored smears with Seller solution. The total hemocytes counting (THC), was made in modified Neubauer chamber with not diluted hemolymph. For the differential hemocytes counting (DHC), was used diluted hemolymph in anticoagulant solution for insects. Six hemocytes types were identified: plasmatocytes (38.5%), granulocytes (22.6%), oenocytoids (20.4%), spherulocytes (14.5%), prohemocytes (2.3%) and vermiform (1.5%). The total number of hemocytes showed a significant increase during the studied larval period.

A ocorrência de larvas de Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1932) resistentes ao vírus AgMNPV em laboratório levou ao estudo dos hemócitos deste inseto para avaliar sua participação nos mecanismos que possibilitam a resistência ao vírus. As larvas resistentes com 6 - 11 dias de desenvolvimento (3º a 5º instar) foram anestesiadas por resfriamento e rapidamente limpas em álcool 70%. A hemolinfa foi coletada através de punção abdominal, a análise morfológica foi realizada em contraste de fase e esfregaços corados com solução de Seller. A contagem total de hemócitos (CTH) foi realizada em câmara de Neubauer com hemolinfa não diluída. Para a contagem diferencial de hemócitos (CDH), utilizou-se hemolinfa diluída em solução anticoagulante para insetos. Foram identificados seis tipos de hemócitos: plasmatócitos (38,5%), granulócitos (22,6%), oenocitóides (20,4%), esferulócitos (14,5%), prohemócitos (2,3%) e vermiformes (1,5%). O número total de hemócitos mostrou um aumento significativo durante o período larval estudado.

Caracterização citológica dos hemócitos de Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera, Noctuidae) em larvas resistentes ao vírus AgMNPV

The occurrence of Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1932) larvae resistant to the virus AgMNPV in laboratory led to the study of the hemocytes of this insect, in order to evalue its participation in the mechanisms which enables the resistance to the virus. The resistant larvae with 6 to 11 developmental days old (3rd to 5th instars) were anesthetized by cold and after that were quickly cleaned in 70% alcohol. The hemolymph was collected through abdominal puncturing; the morphological analysis was made in phase contrast and colored smears with Seller solution. The total hemocytes counting (THC), was made in modified Neubauer chamber with not diluted hemolymph. For the differential hemocytes counting (DHC), was used diluted hemolymph in anticoagulant solution for insects. Six hemocytes types were identified: plasmatocytes (38.5%), granulocytes (22.6%), oenocytoids (20.4%), spherulocytes (14.5%), prohemocytes (2.3%) and vermiform (1.5%). The total number of hemocytes showed a significant increase during the studied larval period.

A ocorrência de larvas de Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1932) resistentes ao vírus AgMNPV em laboratório levou ao estudo dos hemócitos deste inseto para avaliar sua participação nos mecanismos que possibilitam a resistência ao vírus. As larvas resistentes com 6 - 11 dias de desenvolvimento (3º a 5º instar) foram anestesiadas por resfriamento e rapidamente limpas em álcool 70%. A hemolinfa foi coletada através de punção abdominal, a análise morfológica foi realizada em contraste de fase e esfregaços corados com solução de Seller. A contagem total de hemócitos (CTH) foi realizada em câmara de Neubauer com hemolinfa não diluída. Para a contagem diferencial de hemócitos (CDH), utilizou-se hemolinfa diluída em solução anticoagulante para insetos. Foram identificados seis tipos de hemócitos: plasmatócitos (38,5%), granulócitos (22,6%), oenocitóides (20,4%), esferulócitos (14,5%), prohemócitos (2,3%) e vermiformes (1,5%). O número total de hemócitos mostrou um aumento significativo durante o período larval estudado.

Dinâmica hemocitária em diatraea saccharalis f. (lepidoptera: crambidae) desafiada imunologicamente pelos fungos beauveria bassiana (bals.) vuill. e metarhizium anisopliae (metsch.) sorok

ABSTRACT This study was aimed to morphologically and quantitatively analyze the types of hemocytes in Diatraea saccharalis F. thirdinstar caterpillar immunologicaly challenged by Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. and Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. in concentrations of 103, 105 and 107 conidia mL-1, compared to nontreated specimens. A 10µL-sample of hemolymphs from five caterpillars for each treatment, in the intervals of 24, 36, 48 and 60h; 300 cells were counted in random fields of the lamina, using the immersion objective (100X). The most frequent hemocytes were the spherulocytes (34.8%), plasmatocytes (29.7%) and granulocytes (22.2%), while the least frequent were the prohemocytes (8.3%), the adipohemocytes (2.6%) and the oenocytoids (2.4%). B. bassiana promoted effective interference in the population of granulocytes at the concentration of 107 conidia mL-1 (24 and 36h) and of plasmatocytes at the concentrations of 103 conidia mL-1 (60h) and 107 conidia mL-1 (24 and 36h); there occurred an increase of the number of the granulocytes and a decrease of the number of plasmotocytes at the highest concentration, and an increase in the number of plasmatocytes at the concentration of 103 conidia mL-1. M. anisopliae do not interfere quantitatively in the granulocytes and plasmatocytes. Regarding the spherulocytes, there was observed a higher tendency of reduction in the number of these cells in the interval of 24 and 36h for both fungi, but a meaningful difference only occurred at the concentration of 105 conidia mL-1 in the 60h interval, presenting the smallest average. It was possible to conclude that B. bassiana has a more effective action over the populational dynamics of the granulocytes and plasmatocytes of D. saccharalis caterpillars in association with M. anisopliae.

RESUMO A pesquisa objetivou analisar, morfológica e quantitativamente, os tipos de hemócitos em lagartas do terceiro ínstar de Diatraea saccharalis F., desafiadas imunologicamente por Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. e Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., nas concentrações 103, 105 e 107 conídios mL-1, em comparação a lagartas não tratadas. Foram coletados 10 µL de hemolinfa de cinco lagartas por tratamento, nos intervalos de 24, 36, 48, e 60 horas pós-inoculação, sendo contadas 300 células em campos aleatórios da lâmina, utilizando-se a objetiva de imersão (100X). Os hemócitos mais freqüentes foram os esferulócitos (34,8%), plasmatócitos (29,7%) e granulócitos (22,2%), enquanto os menos freqüentes foram os prohemócitos (8,3%), adipohemócitos (2,6%) e oenocitóides (2,4%). B. bassiana promoveu interferência efetiva na população de granulócitos na concentração de 107 conídios mL-1 (24 e 36h) e plasmatócitos nas concentrações 103 conídios mL-1 (60h) e 107 conídios mL-1 (24 e 36h), onde ocorreu aumento do número de granulócitos e redução do número de plasmatócitos na maior concentração e, ainda, o aumento do número de plasmatócitos na concentração 103 conídios mL-1. M. anisopliae não interferiu quantitativamente nos granulócitos e plasmatócitos. No que se refere aos esferulócitos, verificou-se maior tendência de redução do número dessas células no intervalo de 36h para ambos os fungos, porém, diferença significativa só ocorreu na concentração de 105 conídios mL-1 no intervalo de 60h, apresentando a menor média. Conclui-se que B. bassiana tem ação mais efetiva sobre a dinâmica populacional dos granulócitos e plasmatócitos em lagartas de D. saccharalis em relação ao M. anisopliae.

Immunology defense system in insects: an approach in velvetbean catterpillar, Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae), AgMNPV-resistant / Sistema imunológico de defesa em insetos: uma abordagem em lagartas da soja, Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae), resistentes ao AgMNPV

The insects occupy almost all ecological niches and are constantly exposed to the attack of innumerable natural enemies, many of which are potentially pathogenic. To survive to these attacks, the insects had developed efficient defense systems, represented by outer cuticle, the digestory system and hemolymph cells, the hemocytes, that promote cellular defense. The velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis, as soybean pest crop, demand 60% of the insecticide applications in the national soybean crops. With the more and more use of the nucleopolihedrovirus Baculovirus anticarsia aiming at its control, studies involving the foreing body recognition and its destruction by the defense systems together with the appearance of resistant strains caterpillar are supports for methodologies that become the control of this more efficient, until as prevention for the appearing of caterpillar naturally resistant in the field.

Os insetos ocupam quase todos os nichos ecológicos e estão constantemente expostos ao ataque de inúmeros inimigos naturais, muitos dos quais são potencialmente patogênicos. Para sobreviver a esses ataques, os insetos desenvolveram eficiente sistema de defesa, representado pela espessa cutícula que os recobre, pelo sistema digestório e por células da hemolinfa, os hemócitos, que promovem a defesa celular. A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, como praga desta cultura, demanda 60% das aplicações de inseticidas nas lavouras de soja nacionais. Com a utilização cada vez mais ampla do nucleopoliedrovirus Baculovirus anticarsia visando seu controle, estudos envolvendo o reconhecimento de corpos estranhos pelo sistema de defesa e sua destruição juntamente com o aparecimento de linhagens de lagartas resistentes, são suportes para metodologias que tornam o controle deste inseto-praga mais eficaz, até como prevenção para o surgimento de lagartas naturalmente resistentes no campo.

Immunology defense system in insects: an approach in velvetbean catterpillar, Anticarsia gemmatalis Hûbner (Lepidoptera: Noctuidae), AgMNPV-resistant / Sistema imunológico de defesa em insetos: uma abordagem em lagartas da soja, Anticarsia gemmatalis Hûbner (Lepidoptera: Noctuidae), resistentes ao AgMNPV

The insects occupy almost all ecological niches and are constantly exposed to the attack of innumerable natural enemies, many of which are potentially pathogenic. To survive to these attacks, the insects had developed efficient defense systems, represented by outer cuticle, the digestory system and hemolymph cells, the hemocytes, that promote cellular defense. The velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis, as soybean pest crop, demand 60% of the insecticide applications in the national soybean crops. With the more and more use of the nucleopolihedrovirus Baculovirus anticarsia aiming at its control, studies involving the foreing body recognition and its destruction by the defense systems together with the appearance of resistant strains caterpillar are supports for methodologies that become the control of this more efficient, until as prevention for the appearing of caterpillar naturally resistant in the field.

Os insetos ocupam quase todos os nichos ecológicos e estão constantemente expostos ao ataque de inúmeros inimigos naturais, muitos dos quais são potencialmente patogênicos. Para sobreviver a esses ataques, os insetos desenvolveram eficiente sistema de defesa, representado pela espessa cutícula que os recobre, pelo sistema digestório e por células da hemolinfa, os hemócitos, que promovem a defesa celular. A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, como praga desta cultura, demanda 60% das aplicações de inseticidas nas lavouras de soja nacionais. Com a utilização cada vez mais ampla do nucleopoliedrovirus Baculovirus anticarsia visando seu controle, estudos envolvendo o reconhecimento de corpos estranhos pelo sistema de defesa e sua destruição juntamente com o aparecimento de linhagens de lagartas resistentes, são suportes para metodologias que tornam o controle deste inseto-praga mais eficaz, até como prevenção para o surgimento de lagartas naturalmente resistentes no campo.

Hemocyte types and total and differential counts in unparasitized and parasitized Anastrepha obliqua (Diptera, Tephritidae) larvae

The hemocyte types, in addition to total and differential hemocyte counts were studied in parasitized and unparasitized Anastrepha obliqua larvae at the beginning and at the end of the third instar. In both developmental phases, in parasitized and unparasitized larvae, prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, adipohemocytes, spherulocytes and oenocytoids cells were observed. Mitotic figures indicate prohemocytes as stem cells. Prohemocytes, plasmatocytes and granulocytes are the most numerous cells in the hemolymph of A. obliqua. Difference in the total number of hemocytes was observed between unparasitized and parasitized larvae at the end of the third instar, but not at the beginning.

Os tipos de hemócitos e as contagens total e diferencial foram estudados em larvas parasitadas e não parasitadas de Anastrepha obliqua pertencentes ao início e ao final da terceira fase. Em ambas as fases do desenvolvimento, tanto em larvas parasitadas quanto nas não parasitadas, foram observados pró-hemócitos, plasmatócitos, granulócitos, adipo-hemócitos, esferulócitos e oenocitóides. A presença de divisões mitóticas indica os pró-hemócitos como células-tronco. Pró-hemócitos, plasmatócitos e granulócitos são as células mais numerosas na hemolinfa de A. obliqua. Foi observada diferença no número total de hemócitos entre larvas parasitadas e não parasitadas apenas no final da terceira fase.

Hemocyte types and total and differential counts in unparasitized and parasitized Anastrepha obliqua (Diptera, Tephritidae) larvae

The hemocyte types, in addition to total and differential hemocyte counts were studied in parasitized and unparasitized Anastrepha obliqua larvae at the beginning and at the end of the third instar. In both developmental phases, in parasitized and unparasitized larvae, prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, adipohemocytes, spherulocytes and oenocytoids cells were observed. Mitotic figures indicate prohemocytes as stem cells. Prohemocytes, plasmatocytes and granulocytes are the most numerous cells in the hemolymph of A. obliqua. Difference in the total number of hemocytes was observed between unparasitized and parasitized larvae at the end of the third instar, but not at the beginning.

Os tipos de hemócitos e as contagens total e diferencial foram estudados em larvas parasitadas e não parasitadas de Anastrepha obliqua pertencentes ao início e ao final da terceira fase. Em ambas as fases do desenvolvimento, tanto em larvas parasitadas quanto nas não parasitadas, foram observados pró-hemócitos, plasmatócitos, granulócitos, adipo-hemócitos, esferulócitos e oenocitóides. A presença de divisões mitóticas indica os pró-hemócitos como células-tronco. Pró-hemócitos, plasmatócitos e granulócitos são as células mais numerosas na hemolinfa de A. obliqua. Foi observada diferença no número total de hemócitos entre larvas parasitadas e não parasitadas apenas no final da terceira fase.