The effect of Cissus quadrangularis Salisb. extract on maturation of rat mesenchymal stem cells / O efeito do extrato de Cissus quadrangularis Salisb. na proliferação e diferenciação de células-tronco mesenquimais de rato

Degenerative diseases, such as osteoporosis, could be treated by stem cells. The aim of this study was to identify the gene expression of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC) derived from Sprague Dawley rats and to assess the effect of Cissus quadrangularis Salisb. extract on their maturation into bone cells. The BM-MSC were divided into three groups: (a) BM-MSCs + osteoblast cell growth basal medium as the positive control; (b) BM-MSCs + Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) + 0.3 mg/mL methanol extract of C. quadrangularis as methanol group; and (c) BM-MSC + DMEM + 0.3 mg/mL ethyl acetate extract of C. quadrangularis as ethyl acetate group. A relative quantification approach using was used to analyze the expression of the alp (alkaline phosphatase) gene, with the beta-actin gene was used to normalize the expression of the alp gene. The intra-assay variation was calculated to validate the RT-qPCR data. Our study found that the intra-assay variation value was acceptable, with most of the coefficients of variability (CV) value <5. Ethyl acetate solvent outperformed methanol solvent in extracting the active compound C. quadrangularis. In the ethyl acetate extract group, the expression of the alp gene increased three times compared to the positive control. In methanol extract group, the expression of alp gene was lower six times compared to positive control. This study suggests that C. quadrangularis extracts using ethyl acetate could induce the maturation of BM-MSCs. However, further studies are warrant to confirm this effect using different indicators.

Doenças degenerativas, como a osteoporose, podem ser tratadas por células-tronco. O objetivo deste estudo foi identificar a expressão gênica de células-tronco mesenquimais da medula óssea (BM-MSCs) derivadas de ratos Sprague Dawley, bem como sua proliferação e diferenciação em células ósseas afetadas pelo extrato de Cissus quadrangularis Salisb. As BM-MSCs foram divididas em três grupos: (1) BM-MSCs + meio basal de crescimento de osteoblastos como controle positivo; (2) BM-MSCs + meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) + extrato de metanol; e (3) BM-MSCs + DMEM + extrato de acetato de etila de C. quadrangularis. Uma abordagem de quantificação relativa foi usada para analisar a expressão do gene alp (fosfatase alcalina), com o gene da beta-actina sendo usado para normalizar a expressão do gene alp em cada tratamento. A variação intraensaio foi calculada para validar os dados de RT-qPCR. Os resultados mostraram que o valor da variação intraensaio é aceitável, com a maioria dos valores dos coeficientes de variabilidade (CV) < 5. Além disso, no tratamento T2, a expressão do gene alp aumentou três vezes em relação ao controle positivo. No tratamento T1, o gene alp apresentou nível de expressão seis vezes menor em comparação com o controle positivo. Além disso, o solvente acetato de etila superou o solvente metanol na extração do composto ativo C. quadrangularis Salisb. Este estudo demonstra que extratos de C. quadrangularis Salisb., particularmente com acetato de etila como solvente, podem induzir a proliferação e diferenciação de BM-MSCs. Com base na expressão do gene alp, C. quadrangularis tem o potencial de corrigir a perda óssea.

Real-time polymerase chain reaction for detection and enumeration of Staphylococcus aureus and Streptococccus agalactiae using different milk samplings

The objective of the present study was to evaluate the qPCR for detection and enumeration of Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae using different milk samplings in comparison to the conventional microbiology. Four dairy herds with a history of subclinical mastitis caused by S. aureus and S. agalactiae were selected. Sampling approach included milk samples from bulk tank (BT), cow level (composite samples, CO), and mammary quarter level (MQ) from 785 lactating cows. Three consecutive monthly milk samplings were carried out, totaling 3347 MQ milk samples, 912 CO, and 12 from BT. All collected milk samples were subjected to conventional microbiology and qPCR for detection and enumeration of S. aureus and S. agalactiae. The qPCR showed 71.5% of diagnostic sensitivity for S. aureus isolated from MQ milk samples, 71.8% for CO, and 50% for BT milk samples compared with conventional microbiology methodology. Taken together, the diagnostic sensitivity for S. agalactiae isolated from MQ milk samples was 90.2, 87.7 for CO, and 90.9% for BT milk samples. In general, the qPCR methodology enabled the detection of S. aureus and S. agalactiae, regardless of the type of milk sampling. The direct use of milk samples to estimate the counting of S. aureus by qPCR demonstrated lower sensitivity than the counting of S. agalactiae, which can be explained by the pathogen infection dynamics and differences in milk sample type.

Dogs naturally infected by Rangelia vitalii, Babesia canis vogeli, and Ehrlichia canis in São Paulo, Brazil / Cães naturalmente infectados por Rangelia vitalii, Babesia canis vogeli, e Ehrlichia canis em São Paulo, Brasil

Several agents can cause hemoparasitic diseases in dogs, and blood-sucking arthropods transmit these diseases. These agents can cause several clinical manifestations and, in some cases, can kill the host. Because these agents are essential in animal health, this study aims to detect the frequency of Ehrlichia canis, Rickettsia rickettsii, Anaplasma platys, and Rangelia vitalii by real-time PCR and Babesia vogeli in dogs in the southern region of the city of São Paulo, São Paulo. Of the 98 dog samples, 18 (18.4%) tested positive with real-time polymerase chain reaction for at least one studied agent. Of these 18 samples, 17 tested positive for a single agent (11.2% for B. canis vogeli, 1.02% for R. vitalii, and 5.1% for E. canis), and one showed co-infection with B. canis vogeli and R. vitalii. The results demonstrate the presence of hemoparasites in the studied animals, which can influence the quality and life expectancy of these animals. The Rangeliadetection warns small animal clinicians to include it as a differential diagnosis for hemoparasitosis.(AU)

As hemoparasitoses em cães podem ser causadas por diversos agentes, sendo essas doenças transmitidas por artrópodes hematófagos. Esses agentes podem causar diversas manifestações clínicas e, em alguns casos, podem matar o hospedeiro. Este estudo teve como objetivo detectar por PCR em tempo real a frequência de Ehrlichia canis, Rickettsia rickettsii, Anaplasma platys, Rangelia vitalii e Babesia canis vogeli em amostras de cães da zona sul da cidade de São Paulo, Brasil. Das 98 amostras de cães, 18 (18,4%) testaram positivo com reação em cadeia da polimerase em tempo real para pelo menos um agente estudado. Destas 18 amostras, 17 testaram positivo para um único agente (11,2% para B. canis vogeli, 1,02% para R. vitalii e 5,1% para E. canis), e uma apresentou coinfecção com B. canis vogeli e R. vitalii. Os resultados demonstram a presença de hemoparasitas nos animais estudados, o que pode influenciar a qualidade e a expectativa de vida desses animais. Além disso, é o primeiro relato da detecção de R. vitalli na zona sul de São Paulo e serve de alerta para os clínicos de pequenos animais incluírem esse agente como diagnóstico diferencial para as hemoparasitoses.(AU)

Association between chronic Anaplasma marginale and Babesia spp. infection and hematological parameters of taurine heifers / Associação entre infecção crônica por Anaplasma marginale e Babesia spp. e parâmetros hematológicos de novilhas taurinas

The aim of this study was to investigate the association between chronic Anaplasma marginale and Babesia spp. infection and hematological parameters of pregnant and non-pregnant taurine heifers. Blood samples from 94 females were collected on the first day (D-10) of timed artificial insemination (TAI) protocol and on pregnancy diagnosis (D+34). Hematological parameters were determined and compared between pregnant (PG) and non-pregnant (NPG) heifers, and within group at different sampling days. Real-time PCR (qPCR) was used to determine A. marginale and Babesia bovis infection, and for absolute quantification of Babesia spp. between PG and NPG groups. Correlation analysis was performed between the number of gDNA copies (CN) of Babesia spp. and hematological parameters. On D-10, mean hemoglobin concentration was higher for NPG, and hematocrit and total plasma protein were higher on D+34 for both groups. There was no difference in Babesia spp. CN between groups. In the first qPCR, all heifers were positive for A. marginale and B. bovis. Significant correlations were found between hemoglobin and erythrocyte and between hemoglobin and hematocrit (r = 0.8082 and r = 0.3009, respectively). Low levels of A. marginale and Babesia spp. did not affect hematological parameters of chronically infected pregnant and non-pregnant taurine heifers.(AU)

O objetivo deste estudo foi investigar a associação entre infecção crônica por Anaplasma marginale e Babesia spp. e parâmetros hematológicos de novilhas taurinas prenhes e não prenhes. Sangue de 94 fêmeas foi coletado no primeiro dia (D-10) do protocolo de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e no diagnóstico de gestação (D+34). Parâmetros hematológicos foram comparados entre novilhas prenhes (PG) e não prenhes (NPG) e dentro dos grupos entre dias de coleta. Usando-se PCR em tempo real (qPCR), determinou-se a infecção por A. marginale e Babesia bovis e quantificação absoluta de Babesia spp. Entre os grupos PG e NPG. A análise de correlação foi realizada entre o número de cópias (CN) de Babesia spp. e parâmetros hematológicos. No D-10, a concentração de hemoglobina foi maior para NPG e hematócrito, e proteína plasmática total foram maiores em D+34 para ambos os grupos. Não houve diferença para CN de Babesia spp. entre os grupos. Na primeira qPCR, todas as novilhas foram positivas para A. marginale e B. bovis. Correlações significativas foram encontradas entre hemoglobina/eritrócito e hemoglobina/hematócrito (r=0,8082 e r=0,3009, respectivamente). Baixos níveis de A. marginale e Babesia spp. não afetaram os parâmetros hematológicos de novilhas taurinas prenhes e não prenhes cronicamente infectadas.(AU)

Canine ringworm caused by Trichophyton mentagrophytes - detection by SYBR-Green real-time PCR

Background: Dermatophytes, fungi of universal distribution, invade semi or fully keratinized structures, such as skin, fur/ hair and nails. The various species of dermatophytes are classified into three genera anamorphic: Microsporum, Trichophyton and Epidermophyton. The genus Epidermophyton includes only E. floccosum, that rarely affects animals. The main species responsible for the disease in dogs and cats are Microsporum canis, M. gypseum and Trichophyton mentagrophytes, which were characterized through conventional mycological methodology (microscopic examination with KOH and culture). Molecular methodologies, such as real-time PCR, can contribute to a rapid laboratory diagnosis, helping clinicians to initiate an early antifungal treatment. This case report describes a case of canine dermatophytosis due to Trichophyton mentagrophytes detected from a clinical sample by SYBR-Green real-time PCR. Case: A 8-year-old dog, rescued from the street, was referred to a private veterinary clinic in the city of Canoas, RS, Brazil, presenting generalized lymphadenomegaly, crusted lesions all over the body, generalized alopecia, signs of excoriation and epistaxis. Initially, were administered prednisone [1 mg/kg every 48 h, BID] and cephalexin [30 mg/kg, BID]. Weekly baths with benzoyl peroxide were also given. The therapy was not clinically successful. Wood's Lamp Test was negative. As a differential diagnosis, PCR for detection of Leishmania was negative. Complete blood count and serum biochemical assay were also performed. For mycological diagnosis, hair specimen was clarified and examined microscopically using 10% potassium hydroxide (KOH) for the visualization of chains of arthroconidia (ectothrix invasion of hair). The infected hair was plated onto MycoselTM Agar, incubated at 28°C for 15 days. Microscopy of hyphae/ conidia and macroscopic colony characteristics (colors and texture) were conducted for the differentiation of the species within the genus Microsporum and Trichophyton. In addition, real-time PCR was applied for direct analysis of the fungal DNA obtained from the hair sample. Microscopic examination was negative. The dermatophyte present in the hair sample was confirmed as Trichophyton mentagrophytes by culture and qPCR (melting-point analysis). The patient was treated with systemic itraconazole [10 mg/ kg SID - 90 days]. Twice-weekly application of 2.5 % miconazole and 2% chlorhexidine shampoo until complete cure. Discussion: Dermatophytosis is often listed as self-limiting infection; however, animal dermatophytosis can spread between pets, as well as a zoonotic transmission to humans. The literature on dermatophytosis indicates that Microsporum canis is the predominant etiological agent, followed by M. gypseum. Trichophyon mentagrophytes that appear in a lower percentage of isolation. The culture of hair, even with specific medium containing chloramphenicol and cyclohexamide, may present contaminating fungi, not related to dermatophytosis, which can inhibit or override the growth of dermatophytes. The use of real-time PCR provided a faster and specific diagnosis of dermatophytosis when compared to the conventional mycological methodology for detection and identification of T. mentagrophytes, which takes around 10 to 15 days for culture. It is possible to use this technique as an alternative diagnosis for dermatophytes associated to clinical hair samples of dogs.

Clinical and parasitological impact of short-term treatment using miltefosine and allopurinol monotherapy or combination therapy in canine visceral leishmaniasis / Impacto clínico e parasitológico do tratamento de curta duração com miltefosina e alopurinol em monoterapia ou terapia combinada na leishmaniose visceral canina

Canine visceral leishmaniasis is an endemic zoonosis in Brazil. Dogs are the main hosts in urban environments. The treatment has gained popularity since the Brazilian government authorized miltefosine for canine treatment. The aim of this study was to investigate the clinical and parasitological impact of short-term treatment with miltefosine and allopurinol, alone and in combination. We evaluated the ability of pharmacotherapy to reduce clinical signs of disease, antibody levels using the indirect fluorescence antibody test (IFAT) and skin parasite load via qPCR after 28 days of treatment. The therapeutic protocols promoted a significant decline in clinical signs and in the skin parasite load in dogs (p < 0.01). We observed a moderate correlation between the skin parasite load and the clinical score in all three treatment groups (r > 0.5) Antibody levels did not decrease in this short period. It was concluded that the treatment with allopurinol reduced the number of parasites in the skin of dogs with visceral leishmaniasis in the short term. However, its efficiency is potentiated when associated with miltefosine.(AU)

A leishmaniose visceral canina é uma zoonose endêmica no Brasil. Os cães são os principais hospedeiros em ambientes urbanos. O tratamento ganhou popularidade desde que o governo brasileiro autorizou a miltefosina para tratamento canino. O objetivo deste estudo foi investigar o impacto clínico e parasitológico do tratamento a curto prazo com miltefosina e alopurinol, isoladamente e/ou em combinação. Foi avaliada a capacidade da farmacoterapia em reduzir os sinais clínicos da doença e também os níveis de anticorpos, usando-se o teste de anticorpos de fluorescência indireta (RIFI) e a carga parasitária na pele, via qPCR, após 28 dias de tratamento. Os protocolos terapêuticos promoveram declínio significativo dos sinais clínicos e da carga parasitária na pele dos cães (p < 0,01). Foi observada uma correlação moderada entre a carga parasitária da pele e o escore clínico em todos os três grupos de tratamento (r > 0,5). Já os níveis de anticorpos não diminuíram nesse curto período. Concluiu-se que o tratamento com alopurinol, em curto prazo, reduziu a quantidade de parasitos na pele dos cães com leishmaniose visceral. No entanto, sua eficiência é potencializada quando associada a miltefosina.(AU)

Reference gene selection for quantitative PCR in liver, skeletal muscle, and jejunum of Bos indicus cattle

The objective of the present study was to evaluate the stability of candidate reference genes and select the genes that can be used for normalizing realtime polymerase chain reaction (PCR) in the liver, skeletal muscle, and jejunum tissues of Nellore or Nellore × Angus steers fed different diets. Fourteen purebred and 14 crossbred steers were used, in which half of the animals of each genetic group received a diet containing whole shelled corn (WSC) and the other half whole shelled corn and sugarcane bagasse (WSCB). Stability was analyzed by the RefFinder program. To validate the selection of candidate reference genes, the expression of target genes was evaluated using the different groups of reference genes. The most stable genes were 18S, ACTB, and CASC3 for skeletal muscle; HMBS, ACTB, and 18S for the liver; and GAPDH, ACTB, and CASC3 for the jejunum, regardless of breed and diet provided. Possible errors caused in data analyses were clarified comparing the more and less stable genes as reference for normalization of the target genes FASN, ACOX, SCD1, MGAM, and SLC2A1. The use of the more stable and less stable sets of reference genes may lead to different conclusions in respect to the expression profile of the target studied gene. The selection of more suitable reference genes for each experiment is of utmost importance to ensure the reliability of gene expression studies so that they can be applied in practice.(AU)

Experimental infection of BALB/c mice with felid alphaherpesvirus 1 / Infecção experimental de camundongos BALB/c com alphaherpesvírus felino tipo 1

Felid alphaherpesvirus type 1 (FHV-1) is an important cause of respiratory and ocular diseases in cats worldwide. Mice have been widely used to study the pathogenesis of several human and animal viruses, especially herpesviruses. This study aimed to verify whether BALB/c mice are susceptible to FHV-1 infection. The animals were intranasally inoculated with FHV-1 and their clinical signs were observed from 3 days postinfection (dpi). At 10 dpi, the animals were euthanized and the lungs, liver, spleen, and kidneys were collected for histopathological examination and quantitative polymerase chain reaction. The results showed that mice were infected with FHV-1 and reproduced several features of the disease observed in its natural host. Histological lesions and viral DNA were found in all sampled tissues, with a higher frequency of FHV-1 DNA copies detected in the lungs. All mice were seroconverted to FHV-1 at 7 dpi. To our knowledge, this is the first report of experimental infection of BALB/c mice with FHV-1. Our findings demonstrate that this murine model can contribute to understanding of FHV-1 pathogenesis and may be useful for trials against this virus.(AU)

O herpesvírus felino tipo 1 (FHV-1) é um importante agente causador de doença respiratória e ocular em gatos em todo o mundo. Camundongos têm sido amplamente utilizados para estudar a patogenia de diversos vírus humanos e animais, especialmente os herpesvírus. O objetivo deste estudo foi verificar se camundongos BALB/c poderiam ser suscetíveis a infecção pelo FHV-1. Os animais foram inoculados com FHV-1 intranasalmente e sinais clínicos foram observados a partir do dia 3 após a infecção (dpi). Após dez dias da inoculação, os animais foram eutanasiados e os pulmões, fígado, baço e rins foram coletados para exame histopatológico e PCR quantitativo (qPCR). Os resultados mostraram que os camundongos foram infectados com o FHV-1 e reproduziram várias características da doença que são observadas em seu hospedeiro natural. Lesões histológicas e DNA viral foram detectadas em todos os tecidos amostrados, com maior frequência de DNA do FHV-1 nos pulmões. Todos os camundongos soroconverteram para FHV-1 aos 7 dpi. Para nosso conhecimento, este estudo é o primeiro relato de infecção experimental de camundongos BALB/c com FHV-1. Nossos resultados demonstraram que esse camundongo pode contribuir para o entendimento da patogenia do FHV-1 e pode ser um modelo útil para ensaios contra esse vírus.(AU)

Reference gene stability in the Longissimus thoracis et lumborum muscle of Colombian Creole sheep / Estabilidade de genes de referência no músculo Longissimus thoracis et lumborum de ovelhas crioulas colombianas

The Colombian Creole sheep breed has a high economic and social importance for Colombia. Both males and females of this breed are multipurpose animals, and evaluating the production and meat quality of both sexes is important for small farmers in Colombia. This requires the use of tools that help to evaluate critical production points, such as Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), which is a widely used molecular tool for the relative quantification of candidate genes in various tissues. For its correct use, the use of housekeeping genes with stable expression, so-called "reference genes", is required. However, recent studies have shown that the expression of these reference genes can vary among tissues and can be modulated by breed, sex, or external stimuli. Likewise, there is little information regarding the expression of these genes in the Longissimus thoracis et lumborum muscle of male and female Colombian Creole sheep. In this study, the stability in the expression of seven reference genes (ACTB, YWHAZ, SDHA, GAPDH, TUBB2A, B2M, and PGK1) in the Longissimus thoracis et lumborum muscle of male and female Colombian Creole sheep was compared since they are used in RT-qPCR studies to determine the most stable ones for this breed. Twelve animals, six males and six females, with a body weight of 26 ± 4 kg and 12 ± 3 months of age, were used under grazing conditions. Biopsies of the Longissimus thoracis et lumborum muscle were taken, from which RNA was extracted and cDNA was synthesized. Expression was determined using RT-qPCR, and its stability was analyzed by computational algorithms using the geNorm, Normfinder, and BestKeeper software packages, which were integrated using the RefFinder software package. The results indicate that GAPDH, ACTB, and SDHA have the highest stability, whereas the most variable expression was found for B2M. These data provide the basis for more precise results in RT-qPCR studies of gene expression in the muscle of Colombian Creole sheep.(AU)

A raça de ovinos Crioula Colombiana tem grande importância econômica e social para a Colômbia. Avaliar a produção e a qualidade da carne de machos e fêmeas é importante para pequenos produtores do país e, assim, faz necessário o uso ferramentas que ajudam a avaliar os pontos críticos de produção, como a reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real-time quantitative polymerase chain reaction [RT-qPCR]). Esta é uma ferramenta molecular amplamente usada para a quantificação relativa de genes candidatos em vários tecidos. Para o seu uso correto, é necessário o uso de genes com expressão estável denominados genes de referência. No entanto, estudos recentes têm mostrado que a expressão desses genes de referência pode variar entre os tecidos e pode ser modulada por raça, sexo ou estímulos externos. Da mesma forma, existem poucas informações sobre a expressão desses genes no músculo Longissimus thoracis et lumborum de ovinos machos e fêmeas da raça Crioula Colombiana. Neste estudo foi comparada a estabilidade na expressão de sete genes de referência (ACTB, YWHAZ, SDHA, GAPDH, TUBB2A, B2M e PGK1) no músculo Longissimus thoracis et lumborum de ovinos Crioulo Colombiano machos e fêmeas, por serem genes utilizados em estudos de RT-qPCR visando determinar os mais estáveis para esta raça. Doze animais com peso corporal de 26 ± 4 kg e 12 ± 3 meses de idade foram utilizados em condições de pastejo. Foram realizadas biópsias do músculo Longissimus thoracis et lumborum, de onde o RNA foi extraído e o cDNA foi sintetizado. A expressão foi determinada usando RT-qPCR e sua estabilidade foi analisada por algoritmos computacionais usando geNorm, Normfinder e BestKeeper pacote de software, os quais foram integrados usando RefFinder pacote de software. Os resultados indicam que GAPDH, ACTB e SDHA apresentam maior estabilidade, enquanto a expressão mais variável foi para B2M. Esses dados fornecem a base para resultados mais precisos em estudos de RT-qPCR de expressão gênica em músculos defeminino ovinos da raça Crioula Colombiana.(AU)

Molecular detection of Leishmania infantum in donkeys and mules under semiarid conditions in Brazil / Detecção molecular de Leishmania infantum em asininos e muares sob condições semiáridas

Abstract Visceral leishmaniasis is a parasitic zoonosis that mainly affects poorest and most vulnerable populations, and domestic dogs are considered to be the main source of infection to the vector and therefore humans. However, several studies have investigated the role of other vertebrate hosts in the disease cycle. In this context, the aim of the present study was to conduct a survey of Leishmania infantum infection in donkeys and mules living in a semiarid region of Brazil. Whole blood sampled from 72 equids (65 donkeys and 7 mules) was used to perform molecular diagnosis using the real-time polymerase chain reaction (qPCR) technique. A total of 25% of the samples (18/72) were positive through qPCR, but there were no significant differences between the species (donkeys or mules), sex (male or female) and abandonment situation of the animals (yes or no). Donkeys and mules living under semiarid conditions have high frequency of L. infantum infection. It is therefore worth assigning importance to these species in the epidemiological cycle of visceral leishmaniasis, either as potential reservoirs or just as an abundant food source for vectors.

Resumo A leishmaniose visceral é uma zoonose parasitária que afeta principalmente populações mais pobres e vulneráveis, e os cães domésticos são considerados as principais fontes de infecção para o vetor e, portanto, para os humanos. Porém diversos estudos têm pesquisado o papel de outros hospedeiros vertebrados no ciclo da doença. Neste contexto, objetivou-se realizar um levantamento da infecção por Leishmania infantum em asininos e muares, vivendo em região semiárida do Brasil. Foi utilizado sangue total de 72 equídeos (65 asininos e 7 muares) para a realização de diagnóstico molecular por meio da técnica de Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR). Um total de 25% das amostras (18/72) resultaram positivas na qPCR, porém não houve diferença significativa entre as espécies (asininos e muares), sexo (macho e fêmea) e situação de abandono dos animais (sim ou não). Asininos e muares, vivendo em condições semiáridas, apresentam alta frequência de infecção por L. infantum, sendo válido atribuir importância a essas espécies no ciclo epidemiológico da leishmaniose visceral, seja como um reservatório em potencial, seja apenas como uma fonte alimentar abundante para os vetores.

In silico and in vitro evaluation of primers for molecular differentiation of Leishmania species / Avaliação in silico e in vitro de iniciadores para a diferenciação molecular de espécies de Leishmania

Leishmaniasis is a zoonotic disease caused by over 20 species of protozoan parasites of the genus Leishmania. Infection is commonly spread by sandflies and produces a wide spectrum of clinical signs and symptoms. Therefore, from an epidemiological and therapeutic standpoint, it is important to detect and differentiate Leishmania spp. The objective of this study was to combinate in silico and in vitro strategies to evaluate the analytical specificity of primers previously described in the literature. According to electronic PCR (e-PCR) analysis, 23 out of 141 pairs of primers selected through literature search matched their previously reported analytical specificity. In vitro evaluation of nine of these primer pairs by quantitative PCR (qPCR) confirmed the analytical specificity of five of them at the level of Leishmania spp., L. mexicana complex or Leishmania and Viannia subgenera. Based on these findings, the combination of e-PCR and qPCR is suggested to be a valuable approach to maximize the specificity of new primer pairs for the laboratory diagnosis of infections with Leishmania spp.(AU)

As leishmanioses são zoonoses causadas por mais de 20 espécies de protozoários do gênero Leishmania. As infecções são comumente disseminadas por flebotomíneos e causam um amplo espectro de manifestações clínicas. Portanto, a detecção e diferenciação de espécies de Leishmania são importantes do ponto de vista epidemiológico e terapêutico. O objetivo deste estudo foi combinar estratégias in silico e in vitro para avaliar a especificidade analítica dos primers descritos anteriormente na literatura. De acordo com a PCR eletrônica (e-PCR), 23 dos 141 pares de primers selecionados por meio de pesquisa da literatura estavam de acordo com a especificidade analítica anteriormente relatada. A avaliação in vitro de nove desses pares de primers, por PCR quantitativa (qPCR), confirmou a especificidade analítica de cinco deles ao nível de espécie de Leishmania, do complexo L. mexicana ou dos subgêneros Leishmania e Viannia. Com base nos resultados, sugere-se que a combinação de e-PCR e qPCR é uma abordagem valiosa para a validação e maximização da especificidade de novos pares de primers para o diagnóstico laboratorial de infecções com Leishmania spp.(AU)

Phenotypic and genotypic approaches for detection of anthelmintic resistant sheep gastrointestinal nematodes from Brazilian northeast / Abordagens fenotípica e genotípica para detecção de resistência anti-helmíntica em nematoides gastrintestinais de ovinos no nordeste do Brasil

Abstract The aim of this study was to characterize the anthelmintic resistance (AR) of a sheep gastrointestinal nematode population, named Caucaia, from northeastern Brazil. Phenotypic tests performed were: egg hatch (EHT), larval development (LDT) and fecal egg count reduction (FECRT). Benzimidazoles (BZs) genotypic evaluation was by frequency of single nucleotide polymorphisms (SNPs) F200Y, F167Y and E198A, and for levamisole (LEV), by frequency of resistance alleles of Hco-acr-8 gene. The primers were designed specifically for Haemonchus contortus. Effective concentrations 50% (EC50) for BZs (EHT), and for macrocyclic lactones (MLs) and LEV (LDT) were 1.02 µg/mL, 1.81 ng/mL and 0.04 µg/mL, respectively. Resistance ratios for MLs and LEV were 0.91 and 3.07, respectively. FECRT efficacies of BZs, MLs, monepantel (MPTL) and LEV were 52.4; 87.0; 94.5 and 99.6%, respectively. qPCR for BZs demonstrated resistance allele frequencies of 0%, 26.24% and 69.08% for SNPs E198A, F200Y and F167Y, respectively. For LEV, 54.37% of resistance alleles were found. There was agreement between EHT, FECRT and qPCR for BZs, and agreement between LDT and qPCR for LEV. Thus, based on higher sensitivity of qPCR, and phenotypic evaluation, the Caucaia population was considered resistant to BZs, MLs, LEV and suspect for MPTL.

Resumo O objetivo deste estudo foi caracterizar a resistência anti-helmíntica (RA) da população de nematoides gastrintestinais de ovinos, denominada Caucaia, do Nordeste brasileiro. Os testes fenotípicos foram: eclosão de ovos (TEO), desenvolvimento larvar (TDL) e redução da contagem de ovos nas fezes (TRCOF). A avaliação genotípica para benzimidazóis (BZs) foi por frequência de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) F200Y, F167Y e E198A; e para levamisol (LEV), pela frequência alélica para resistência no gene Hco-acr-8. Os "primers" foram específicos para Haemonchus contortus. As concentrações efetivas 50% (CE50) para BZs (TEO) e para lactonas macrocíclicas (LMs) e LEV (TDL) foram 1,02 µg/mL, 1,81 ng/mL e 0,04 µg/mL, respectivamente. Os fatores de resistência para LMs e LEV foram 0,91 e 3,07, respectivamente. As eficácias para BZs, LMs, monepantel (MPTL) e LEV no TRCOF foram 52,4; 87,0; 94,5 e 99,6%, respectivamente. A qPCR para BZs demonstrou frequências de 0%, 26,24% e 69,08% para SNPs E198A, F200Y e F167Y, respectivamente. Para LEV foram encontrados 54,37% de alelos resistentes. Houve concordância entre TEO, TRCOF e qPCR para BZs, e entre TDL e qPCR para LEV. Baseada na maior sensibilidade da qPCR e avaliação fenotípica, a população Caucaia foi considerada resistente a BZs, LMs, LEV e suspeita para MPTL.

Development of a qPCR to diagnose the genus Eimeria in bovines / Desenvolvimento de uma qPCR para o diagnóstico do gênero Eimeria em bovinos

Bovine coccidiosis is caused by protozoa of the genus Eimeria. These protozoa mainly affect young animals, causing a decrease in production and consequent economic losses. The routine diagnosis is made through morphological observation of the oocysts, which has several limitations. The objective of the present study was to develop a qPCR technique for the diagnose of Eimeria spp. in cattle. For this purpose, the 18S rRNA region of the DNA of these parasites was selected, since it is a region with low variability among the species. The qPCR was developed using the SYBR Green, resulting in a PCR with a high sensitivity, able to amplify samples containing only one oocyst of Eimeria spp. of bovines. The feasibility of using qPCR in the diagnosis of the Eimeria Genus is demonstrated in this study, once this technique shows to be less laborious and needs less skills for diagnostic training when compared to the technique conventionally used in theroutine (micromorphometry).

A coccidiose em bovinos é causada por protozoários do gênero Eimeria. Estes protozoários acometem principalmente animais jovens, causando diminuição de produção e consequente perdas econômicas. O diagnóstico de rotina é realizado através de observação morfológica dos oocistos, que possui várias limitações. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver uma técnica de qPCR para diagnóstico de Eimeria spp. em bovinos. Para isto foi selecionada a região 18S rRNA do DNA destes parasitas, pois a mesma é uma região com pouca variabilidade entre as espécies. A qPCR foi desenvolvida com a utilização de SYBR Green, tendo como resultado uma PCR com uma alta sensibilidade, capaz de amplificar amostras contendo apenas um oocisto de Eimeria spp de bovinos. Demonstra-se nesse estudo a viabilidade na utilização da qPCR no diagnóstico do gênero Eimeria, sendo esta técnica menos laboriosa e com menos necessidade de treinamento para diagnóstico quando comparada com a técnica convencionalmente utilizada em rotina (micromorfometria).

Development of a qPCR to diagnose the genus Eimeria in bovines / Desenvolvimento de uma qPCR para o diagnóstico do gênero Eimeria em bovinos

Bovine coccidiosis is caused by protozoa of the genus Eimeria. These protozoa mainly affect young animals, causing a decrease in production and consequent economic losses. The routine diagnosis is made through morphological observation of the oocysts, which has several limitations. The objective of the present study was to develop a qPCR technique for the diagnose of Eimeria spp. in cattle. For this purpose, the 18S rRNA region of the DNA of these parasites was selected, since it is a region with low variability among the species. The qPCR was developed using the SYBR Green, resulting in a PCR with a high sensitivity, able to amplify samples containing only one oocyst of Eimeria spp. of bovines. The feasibility of using qPCR in the diagnosis of the Eimeria Genus is demonstrated in this study, once this technique shows to be less laborious and needs less skills for diagnostic training when compared to the technique conventionally used in theroutine (micromorphometry).(AU)

A coccidiose em bovinos é causada por protozoários do gênero Eimeria. Estes protozoários acometem principalmente animais jovens, causando diminuição de produção e consequente perdas econômicas. O diagnóstico de rotina é realizado através de observação morfológica dos oocistos, que possui várias limitações. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver uma técnica de qPCR para diagnóstico de Eimeria spp. em bovinos. Para isto foi selecionada a região 18S rRNA do DNA destes parasitas, pois a mesma é uma região com pouca variabilidade entre as espécies. A qPCR foi desenvolvida com a utilização de SYBR Green, tendo como resultado uma PCR com uma alta sensibilidade, capaz de amplificar amostras contendo apenas um oocisto de Eimeria spp de bovinos. Demonstra-se nesse estudo a viabilidade na utilização da qPCR no diagnóstico do gênero Eimeria, sendo esta técnica menos laboriosa e com menos necessidade de treinamento para diagnóstico quando comparada com a técnica convencionalmente utilizada em rotina (micromorfometria).(AU)

Effect of Bitis gabonica and Dendroaspis angusticeps snake venoms on apoptosis-related genes in human thymic epithelial cells

Certain environmental toxins permanently damage the thymic epithelium, accelerate immune senescence and trigger secondary immune pathologies. However, the exact underlying cellular mechanisms and pathways of permanent immune intoxication remain unknown. The aim of the present study was to demonstrate gene expressional changes of apoptosis-related cellular pathways in human thymic epithelial cells following exposure to snake venom from Bitis gabonica and Dendroaspis angusticeps. Methods: Snake venoms were characterized by analytical methods including reversed phase high-performance liquid chromatography and sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, then applied on human thymic epithelial cells (1889c) for 24 h at 10 μg/mL (as used in previous TaqMan Array study). Gene expressional changes restricted to apoptosis were assayed by TaqMan Array (Human Apoptosis Plate). Results: The most prominent gene expressional changes were shown by CASP5 (≈ 2.5 million-fold, confirmed by dedicated quantitative polymerase chain reaction) and CARD9 (0.016-fold) for B. gabonica, and BIRC7 (6.46-fold) and CASP1 (0.30-fold) for D. angusticeps. Conclusion: The observed apoptotic environment suggests that pyroptosis may be the dominant pathway through which B. gabonica and D. angusticeps snake venoms trigger thymic epithelial apoptosis following envenomation.(AU)

Effect of Bitis gabonica and Dendroaspis angusticeps snake venoms on apoptosis-related genes in human thymic epithelial cells

Certain environmental toxins permanently damage the thymic epithelium, accelerate immune senescence and trigger secondary immune pathologies. However, the exact underlying cellular mechanisms and pathways of permanent immune intoxication remain unknown. The aim of the present study was to demonstrate gene expressional changes of apoptosis-related cellular pathways in human thymic epithelial cells following exposure to snake venom from Bitis gabonica and Dendroaspis angusticeps. Methods: Snake venoms were characterized by analytical methods including reversed phase high-performance liquid chromatography and sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, then applied on human thymic epithelial cells (1889c) for 24 h at 10 μg/mL (as used in previous TaqMan Array study). Gene expressional changes restricted to apoptosis were assayed by TaqMan Array (Human Apoptosis Plate). Results: The most prominent gene expressional changes were shown by CASP5 (≈ 2.5 million-fold, confirmed by dedicated quantitative polymerase chain reaction) and CARD9 (0.016-fold) for B. gabonica, and BIRC7 (6.46-fold) and CASP1 (0.30-fold) for D. angusticeps. Conclusion: The observed apoptotic environment suggests that pyroptosis may be the dominant pathway through which B. gabonica and D. angusticeps snake venoms trigger thymic epithelial apoptosis following envenomation.(AU)

Serological survey of Rickettsia in equids from Vale do Paraíba, São Paulo, Brazil, and their tick identification and molecular investigation of Rickettsia / Levantamento sorológico de Rickettsias em equinos no Vale do Paraíba, São Paulo, Brasil. Identificação e pesquisa molecular de Rickettsias em carrapatos

Brazilian spotted fever is a serious and lethal illness for humans and is caused by the Rickettsia rickettsii bacteria. In the state of São Paulo/SP (Brazil), the etiological agent of this disease is transmitted by the Amblyomma sculptum tick. It was already shown that horses infected with this bacteria produce a strong immune response and could be important sentinels for the detection of the disease in a proper region. The present investigation performed a serological survey in horses from five farms of Vale do Paraíba, São Paulo state, Brazil, searching for antibodies against, Rickettsia rickettsii, Rickettsia parkeri, Rickettsia amblyommatis, Rickettsia rhipicephali, and Rickettsia bellii. In each farm, ticks were also collected that were taxonomically identified and examined by real-time PCR for Rickettsia spp DNA. Blood samples were collected from 206 horses, and 334 ticks were picked up from these animals from January to December 2017. Eighty ticks were A. sculptum and 254 Dermacentor nitens. Of the blood samples, 7.3% seroconverted to Rickettsia spp. Of these, 0.97% had a positive serological response to R. bellii. None of the 80 A. sculptum ticks were positive through real-time PCR for Rickettsia spp. Although there was no detection of ticks infected by Rickettsia spp in five farms of Paraíba Valley, the horses presented serological positive reactions against this agent. Thus, further large studies should be conducted in the area targeting hosts and vectors to generate data for control measures of the transmission of Brazilian spotted fever(AU)

A febre maculosa brasileira é uma doença grave e letal para seres humanos causada pela bactéria Rickettsia rickettsii. No estado de São Paulo, SP, Brasil, o agente etiológico desta enfermidade é transmitido pelo carrapato Amblyomma sculptum. Conforme descrito na literatura científica, os cavalos infectados com esta bactéria produzem uma forte resposta imune e podem ser importantes sentinelas para a detecção da doença. A presente investigação realizou um levantamento sorológico em cavalos de cinco fazendas do Vale do Paraíba, São Paulo, Brasil, à procura de anticorpos contra Rickettsia rickettsii, Rickettsia parkeri, Rickettsia amblyommatis, Rickettsia rhipicephali e Rickettsia bellii. Em cada fazenda, também foram coletados carrapatos identificados taxonomicamente e examinados por PCR em tempo real para o DNA de Rickettsia spp. Foram coletadas amostras de sangue de 206 cavalos e coletados 334 carrapatos desses animais entre os meses de janeiro e dezembro de 2017. Oitenta carrapatos foram identificados como A. sculptum e 254 Dermacentor nitens. Das amostras de sangue, 7,3% soroconverteram para Rickettsia spp., sendo que, 0,97% apresentaram soropositividade homóloga para R. bellii. Nenhum dos 80 carrapatos de A. sculptum foi positivo com o emprego de PCR em tempo real para Rickettsia spp. Embora não tenham sido detectados carrapatos infectados por Rickettsia spp em cinco fazendas do Vale do Paraíba, os animais apresentaram reações sorológicas positivas para este agente. Assim, outros estudos abrangentes deverão ser realizados na área investigando hospedeiros e vetores, gerando dados para medidas de controle da transmissão da febre maculosa brasileira.(AU)

Molecular detection of Mycoplasma suis in extensive pig production systems in the State of Maranhão, northeast Brazil / Detecção molecular de Mycoplasma suis em suínos de criações extensivas no estado do Maranhão, nordeste do Brasil

Mycoplasma suis is a bacterium that causes hemoplasmosis in pigs. This agent is capable of adhering to the surface of porcine erythrocytes, inducing structural changes on these cells. In Brazil, there are few reports about the disease, its causal agent, and the economic impact of this pathogen on pig production systems and farm sanitation. The present study aimed to investigate the occurrence of M. suis in extensive swine farms located in the counties of Itapecuru Mirim, Santa Rita and Rosario, State of Maranhão, northeast Brazil. For such purpose, 64 blood samples of pigs from these facilities were tested for M. suis using a 16S rRNA gene-based quantitative real-time PCR (qPCR); 82.3%, 65.2% and 25% of blood samples of swine from farms in the cities of Itapecuru Mirim, Santa Rita and Rosario were positive for M. suis by qPCR, respectively. This study shows, for the first time, that M. suis circulates in pig populations from the state of Maranhão, Northeast Brazil.

Mycoplasma suis é uma bactéria que causa a hemoplasmose em suínos. Este agente é capaz de se aderir à superfície dos eritrócitos de suínos, ocasionando deformações estruturais nestas células. No Brasil, poucos são os relatos acerca do parasita, da infecção e de seus impactos econômicos nas esferas produtiva e sanitária. O objetivo deste estudo foi investigar, por meio da PCR em tempo real quantitativa (qPCR) baseada no gene 16S rRNA, a ocorrência de M. suis em 64 amostras de sangue de suínos de criações extensivas dos municípios de Itapecuru Mirim, Santa Rita e Rosário, localizados no estado do Maranhão. Foram obtidos um percentual de 82,3%, 65,2% e 25% de amostras positivas na qPCR para M. suis nos municípios de Itapecuru Mirim, Santa Rita e Rosário, respectivamente. Este estudo mostra que M. suis circula entre os suínos de criações extensivas no estado do Maranhão.

Occurrence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in coalho cheese in the State of Pernambuco, Brazil / Ocorrência de Mycobaterium avium subsp. paratuberculosis em queijo coalho do Estado de Pernambuco, Brasil

Paratuberculosis is a chronic and incurable disease that affects ruminants and other domestic animals. It is caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) that may also be involved in some human diseases such as Crohn's disease, type 1 diabetes, sarcoidosis, multiple sclerosis, and Hashimoto's thyroiditis. The objective of this study was to investigate the occurrence of MAP DNA in samples of artisanal coalho cheese purchased in the State of Pernambuco. Forty samples of coalho cheese submitted to the Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) technique were analyzed for the detection of the MAP region IS900. 11 (27.5%) were positive with a mean of 195.9 MAP colony forming unit (CFU) per gram of each sample, with a minimum of 30.3 CFU/g and a maximum of 324.2 CFU/g. Thus, this type of cheese that is one of the most consumed in this region of Brazil constitutes a source of human exposure to MAP. Further research in this area should be performed to evaluate the viability of the bacteria in this cheese type.(AU)

Paratuberculose é uma enfermidade crônica e incurável que acomete ruminantes e outras espécies de animais domésticos. É causada pelo Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) e ainda há a suspeita do seu envolvimento em enfermidades nos humanos como a doença de Crohn, diabetes tipo 1, sarcoidose, esclerose múltipla e tireoidite de Hashimoto. Objetivou-se com esta pesquisa investigar a ocorrência do DNA de MAP em amostras de queijo coalho artesanal adquiridas em estabelecimentos comerciais do Estado de Pernambuco. 40 amostras de queijo coalho artesanal foram submetidas a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) para detecção da região IS900 do MAP. 11 (27,5%) foram positivas com uma média de 195,9 unidades formadoras de colônia (UFC) de MAP por grama de queijo, com detecção mínima de 30,3UFC/g e máxima de 324,2UFC/g. Sendo assim, esse tipo de queijo que é um dos mais consumidos nesta região do Brasil constitui uma fonte de exposição humana ao MAP. Mais pesquisas nessa área devem ser realizadas para avaliar a viabilidade dessa bactéria no queijo coalho.(AU)

Occurrence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in coalho cheese in the State of Pernambuco, Brazil / Ocorrência de Mycobaterium avium subsp. paratuberculosis em queijo coalho do Estado de Pernambuco, Brasil

Paratuberculosis is a chronic and incurable disease that affects ruminants and other domestic animals. It is caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) that may also be involved in some human diseases such as Crohn's disease, type 1 diabetes, sarcoidosis, multiple sclerosis, and Hashimoto's thyroiditis. The objective of this study was to investigate the occurrence of MAP DNA in samples of artisanal coalho cheese purchased in the State of Pernambuco. Forty samples of coalho cheese submitted to the Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) technique were analyzed for the detection of the MAP region IS900. 11 (27.5%) were positive with a mean of 195.9 MAP colony forming unit (CFU) per gram of each sample, with a minimum of 30.3 CFU/g and a maximum of 324.2 CFU/g. Thus, this type of cheese that is one of the most consumed in this region of Brazil constitutes a source of human exposure to MAP. Further research in this area should be performed to evaluate the viability of the bacteria in this cheese type.(AU)

Paratuberculose é uma enfermidade crônica e incurável que acomete ruminantes e outras espécies de animais domésticos. É causada pelo Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) e ainda há a suspeita do seu envolvimento em enfermidades nos humanos como a doença de Crohn, diabetes tipo 1, sarcoidose, esclerose múltipla e tireoidite de Hashimoto. Objetivou-se com esta pesquisa investigar a ocorrência do DNA de MAP em amostras de queijo coalho artesanal adquiridas em estabelecimentos comerciais do Estado de Pernambuco. 40 amostras de queijo coalho artesanal foram submetidas a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) para detecção da região IS900 do MAP. 11 (27,5%) foram positivas com uma média de 195,9 unidades formadoras de colônia (UFC) de MAP por grama de queijo, com detecção mínima de 30,3UFC/g e máxima de 324,2UFC/g. Sendo assim, esse tipo de queijo que é um dos mais consumidos nesta região do Brasil constitui uma fonte de exposição humana ao MAP. Mais pesquisas nessa área devem ser realizadas para avaliar a viabilidade dessa bactéria no queijo coalho.(AU)