Critérios e metodologias para produzir sêmen de caprinos e ovinos em nível de fazenda / The criteria and methodologies used to produce ram and goat semen on the farm

A criopreservação de sêmen é uma importante estratégia para o armazenamento de material genético de reprodutores ovinos e caprinos, considerados superiores do ponto de vista fenotípico, mas especialmente, pelos seus méritos genéticos. Hoje no Brasil apenas uma central regulamentada pelo MAPA está ema atividade, o que significa que existe pouca dose de sêmen comercial à disposição para programas de melhoramento genético. Programas de banco de sêmen podem ser realizado nas fazendas, entretanto, tem seu uso limitado a propriedade onde está o reprodutor. Neste caso, apesar de maiores limitações de estrutura e equipamentos para a execução do serviço, o domínio das variações da técnica de congelação de sêmen e o cuidado com as questões sanitárias dos reprodutores possibilitará ao Médico-Veterinário a execução do serviço com níveis adequados de segurança e qualidade das doses de sêmen produzidas. O objetivo deste estudo é apresentar e discutir critérios e metodologias para congelação de sêmen de pequenos ruminantes em diferentes condições, fruto de diversas experiências e trabalhos desenvolvidos por nosso grupo e outros, nos últimos vinte anos, e que tem possibilitado resultados satisfatórios.(AU

Sperm cryopreservation is an important strategy for the storage of genetic material from ovine and goat breeders, considered superior from the phenotypic point of view, but especially for their genetic merits. Today in Brazil only one center regulated by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply is in operation, which means that there is little dose of commercial semen available for genetic improvement programs. Semen bank programs can be carried out on farms; however, their use is limited to the property where the breeder is located. In this case, despite greater limitations of structure and equipment for the execution of the service, mastering variations in the semen freezing technique and taking care of the health issues of the breeders will enable the Veterinarian to perform the service with adequate levels of safety and quality of semen doses produced. This study aims to present and discuss criteria and methodologies for freezing semen from small ruminants under different conditions, the result of several experiences and works carried out by our group and others, in the last twenty years, which have enabled satisfactory results.(AU))

Sperm-binding to the perivitelline membrane of chicken egg yolk as a functional test for sperm evaluation in dogs / Teste de ligação espermática à membrana perivitelínica da gema de ovo de galinha como avaliação funcional do sêmen de cães

During fertilization, spermatozoa interact with the zona pellucida (ZP) through the binding between the acrosome and proteins 2 and 3 (ZP2 and ZP3). The perivitelline membrane of chicken egg yolk is homologous to the mammalian ZP3, which allows the binding of sperm of several species. The aim of this study was to standardize and evaluate the efficiency of sperm-binding to the perivitelline membrane of chicken eggs as a functional method for canine semen evaluation. For this purpose, nine post-thaw sperm samples were used, which were divided into two aliquots: the first was kept in water bath at 37ºC (live sample) and the second was submitted to cold shock to induce cellular damage (dead sample). The two aliquots were mixed on five proportions, corresponding to 0%, 25%, 50%, 75%, and 100% of viable cells, and the binding test was performed by analyzing the number of spermatozoa bonded to the perivitelline membrane by means of computerized assessment of sperm motility (CASA) or conventional microscopy. Additionally, samples were submitted to sperm motility analysis, evaluation of plasmatic and acrosomal membrane integrity, and sperm mitochondrial activity. The sperm-binding test to the perivitelline membrane of chicken egg yolk was considered a feasible sperm analysis test for both fertilizing capacity and overall sperm attributes evaluation, mainly when the analysis is performed by a conventional microscope, which expands its practicality to the majority of canine reproduction laboratories.(AU)

Durante a fecundação, os espermatozoides interagem com a zona pelúcida (ZP) por meio da ligação entre o acrossomo e as proteínas 2 e 3 (ZP2 e ZP3). A membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas é homóloga à ZP3 de mamíferos, possibilitando a ligação espermática de diversas espécies. Este trabalho padronizou e avaliou a eficiência do teste de ligação espermática à membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas como avaliação funcional do sêmen de cães. Para tal, foram utilizadas nove amostras seminais previamente criopreservadas. Cada amostra foi dividida em duas alíquotas: a primeira foi mantida em banho-maria à 37ºC (vivos) e a segunda submetida a choque térmico com o intuito de induzir dano celular (mortos). As duas alíquotas foram misturadas, correspondendo a 0, 25, 50, 75 e 100% de células viáveis. As amostras foram avaliadas quanto ao número de espermatozoides ligados à membrana perivitelínica por meio da análise computadorizada da motilidade (CASA) ou microscopia convencional. Ademais, as amostras foram avaliadas quanto à motilidade espermática, integridade das membranas acrossomal e plasmática e atividade mitocondrial espermática. O teste de ligação espermática à membrana perivitelínica de ovos de galinha foi considerado um teste de análise seminal exequível tanto para avaliar a capacidade fecundante dos espermatozoides como atributos seminais gerais, especialmente quando realizado em microscopia convencional, expandindo sua praticidade para a maioria dos laboratórios de análise de sêmen canino.(AU)

Plasminogen activator inhibitor 1 and Antipain preserve acrosome integrity of bovine spermatozoa during cryopreservation / Inibidor do ativador do plasminogênio 1 e antipaína preservam a integridade do acrossoma de espermatozoides bovinos durante a criopreservação

Seminal plasma contains serine proteases and serine protease inhibitor, which are involved in mammalian fertilization, and the inhibitors can be applied to prevent cold-induced sperm capacitation. The effects of different concentrations of two serine protease inhibitors were analyzed, Plasminogen activator inhibitor 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg and 210 ƞg) and Antipain (10µg, 50µg and 100µg) as supplementation to bovine semen cryopreservation extender. The effects of the inhibitors on the sperm parameters (sperm kinetics - CASA, acrosome integrity, plasma membrane integrity, mitochondrial membrane potential, sperm defects and acrosome reaction rate) were evaluated in the post-thaw semen. Cryopreservation of sperm with Antipain decreased post-thaw kinetic parameters of MP, VSL, LIN, SRT and the percentage of hyper-activated sperm while PAI-1 (210 ƞg) decreased VSL and LIN. Antipain and PAI-1 had no effect on the integrity parameters of the plasma membrane, mitochondrial membrane potential and sperm defects. Sperm cryopreserved in the presence of Antipain and PAI-1 (70 and 140 ƞg) preserved acrosome integrity, as they were able to complete the in vitro acrosome reaction. In conclusion, the serine protease inhibitors, Antipain and PAI-1 (70 and 140ƞg) are able to preserve the acrosome integrity of cryopreserved bovine sperm.(AU)

A criopreservação é parcialmente prejudicial à fertilidade do sêmen de bovinos e induz mudanças semelhantes à capacitação em espermatozoides. O plasma seminal contém serina-proteases e inibidores de serina-proteases que estão envolvidos na fertilização de mamíferos, e os inibidores podem ser aplicados para evitar uma capacitação espermática induzida pelo frio. Analisaram-se os efeitos de diferentes concentrações de dois inibidores de serina-proteases, inibidor do ativador do plasminogênio 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg e 210ƞg) e antipaína (10µg, 50µg e 100µg) na suplementação ao diluidor de criopreservação de sêmen bovino. Trinta e seis ejaculados de quatro bovinos Curraleiro Pé-Duro foram usados para criopreservação. Os efeitos dos inibidores sobre os parâmetros dos espermatozoides (cinética espermática - CASA, integridade acrossomal, integridade da membrana plasmática, potencial de membrana mitocondrial, defeitos espermáticos e taxa de reação acrossomal) foram avaliados no sêmen pós-descongelamento. A criopreservação de espermatozoides com antipaína diminuiu os parâmetros cinéticos pós-descongelamento de MP, VSL, LIN, SRT e a porcentagem de espermatozoides hiperativados, PAI-1 (210ƞg) diminuiu VSL e LIN. Antipaína e PAI-1 não tiveram efeitos nos parâmetros de integridade da membrana plasmática, no potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos espermáticos. Espermatozoides criopreservados na presença de antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) preservaram a integridade acrossomal, assim como foram capazes de completar a reação acrossômica in vitro. Em conclusão, os inibidores de serina-proteases, antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) são capazes de preservar a integridade acrossomal de espermatozoides criopreservados de bovinos.(AU)

Plasminogen activator inhibitor 1 and Antipain preserve acrosome integrity of bovine spermatozoa during cryopreservation / Inibidor do ativador do plasminogênio 1 e antipaína preservam a integridade do acrossoma de espermatozoides bovinos durante a criopreservação

Seminal plasma contains serine proteases and serine protease inhibitor, which are involved in mammalian fertilization, and the inhibitors can be applied to prevent cold-induced sperm capacitation. The effects of different concentrations of two serine protease inhibitors were analyzed, Plasminogen activator inhibitor 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg and 210 ƞg) and Antipain (10µg, 50µg and 100µg) as supplementation to bovine semen cryopreservation extender. The effects of the inhibitors on the sperm parameters (sperm kinetics - CASA, acrosome integrity, plasma membrane integrity, mitochondrial membrane potential, sperm defects and acrosome reaction rate) were evaluated in the post-thaw semen. Cryopreservation of sperm with Antipain decreased post-thaw kinetic parameters of MP, VSL, LIN, SRT and the percentage of hyper-activated sperm while PAI-1 (210 ƞg) decreased VSL and LIN. Antipain and PAI-1 had no effect on the integrity parameters of the plasma membrane, mitochondrial membrane potential and sperm defects. Sperm cryopreserved in the presence of Antipain and PAI-1 (70 and 140 ƞg) preserved acrosome integrity, as they were able to complete the in vitro acrosome reaction. In conclusion, the serine protease inhibitors, Antipain and PAI-1 (70 and 140ƞg) are able to preserve the acrosome integrity of cryopreserved bovine sperm.(AU)

A criopreservação é parcialmente prejudicial à fertilidade do sêmen de bovinos e induz mudanças semelhantes à capacitação em espermatozoides. O plasma seminal contém serina-proteases e inibidores de serina-proteases que estão envolvidos na fertilização de mamíferos, e os inibidores podem ser aplicados para evitar uma capacitação espermática induzida pelo frio. Analisaram-se os efeitos de diferentes concentrações de dois inibidores de serina-proteases, inibidor do ativador do plasminogênio 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg e 210ƞg) e antipaína (10µg, 50µg e 100µg) na suplementação ao diluidor de criopreservação de sêmen bovino. Trinta e seis ejaculados de quatro bovinos Curraleiro Pé-Duro foram usados para criopreservação. Os efeitos dos inibidores sobre os parâmetros dos espermatozoides (cinética espermática - CASA, integridade acrossomal, integridade da membrana plasmática, potencial de membrana mitocondrial, defeitos espermáticos e taxa de reação acrossomal) foram avaliados no sêmen pós-descongelamento. A criopreservação de espermatozoides com antipaína diminuiu os parâmetros cinéticos pós-descongelamento de MP, VSL, LIN, SRT e a porcentagem de espermatozoides hiperativados, PAI-1 (210ƞg) diminuiu VSL e LIN. Antipaína e PAI-1 não tiveram efeitos nos parâmetros de integridade da membrana plasmática, no potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos espermáticos. Espermatozoides criopreservados na presença de antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) preservaram a integridade acrossomal, assim como foram capazes de completar a reação acrossômica in vitro. Em conclusão, os inibidores de serina-proteases, antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) são capazes de preservar a integridade acrossomal de espermatozoides criopreservados de bovinos.(AU)

Sperm-binding to the perivitelline membrane of chicken egg yolk as a functional test for sperm evaluation in dogs / Teste de ligação espermática à membrana perivitelínica da gema de ovo de galinha como avaliação funcional do sêmen de cães

During fertilization, spermatozoa interact with the zona pellucida (ZP) through the binding between the acrosome and proteins 2 and 3 (ZP2 and ZP3). The perivitelline membrane of chicken egg yolk is homologous to the mammalian ZP3, which allows the binding of sperm of several species. The aim of this study was to standardize and evaluate the efficiency of sperm-binding to the perivitelline membrane of chicken eggs as a functional method for canine semen evaluation. For this purpose, nine post-thaw sperm samples were used, which were divided into two aliquots: the first was kept in water bath at 37ºC (live sample) and the second was submitted to cold shock to induce cellular damage (dead sample). The two aliquots were mixed on five proportions, corresponding to 0%, 25%, 50%, 75%, and 100% of viable cells, and the binding test was performed by analyzing the number of spermatozoa bonded to the perivitelline membrane by means of computerized assessment of sperm motility (CASA) or conventional microscopy. Additionally, samples were submitted to sperm motility analysis, evaluation of plasmatic and acrosomal membrane integrity, and sperm mitochondrial activity. The sperm-binding test to the perivitelline membrane of chicken egg yolk was considered a feasible sperm analysis test for both fertilizing capacity and overall sperm attributes evaluation, mainly when the analysis is performed by a conventional microscope, which expands its practicality to the majority of canine reproduction laboratories.(AU)

Durante a fecundação, os espermatozoides interagem com a zona pelúcida (ZP) por meio da ligação entre o acrossomo e as proteínas 2 e 3 (ZP2 e ZP3). A membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas é homóloga à ZP3 de mamíferos, possibilitando a ligação espermática de diversas espécies. Este trabalho padronizou e avaliou a eficiência do teste de ligação espermática à membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas como avaliação funcional do sêmen de cães. Para tal, foram utilizadas nove amostras seminais previamente criopreservadas. Cada amostra foi dividida em duas alíquotas: a primeira foi mantida em banho-maria à 37ºC (vivos) e a segunda submetida a choque térmico com o intuito de induzir dano celular (mortos). As duas alíquotas foram misturadas, correspondendo a 0, 25, 50, 75 e 100% de células viáveis. As amostras foram avaliadas quanto ao número de espermatozoides ligados à membrana perivitelínica por meio da análise computadorizada da motilidade (CASA) ou microscopia convencional. Ademais, as amostras foram avaliadas quanto à motilidade espermática, integridade das membranas acrossomal e plasmática e atividade mitocondrial espermática. O teste de ligação espermática à membrana perivitelínica de ovos de galinha foi considerado um teste de análise seminal exequível tanto para avaliar a capacidade fecundante dos espermatozoides como atributos seminais gerais, especialmente quando realizado em microscopia convencional, expandindo sua praticidade para a maioria dos laboratórios de análise de sêmen canino.(AU)

VITRIFICAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES EJACULADOS DE CARNEIROS COMPARAÇÃO COM A CONGELAÇÃO CLÁSSICA

A criopreservação de sêmen é uma biotécnica de considerável impacto econômico, por ser uma das técnicas base para a implantação de outras biotecnologias de conservação e multiplicação de recursos genéticos, como a inseminação artificial e produção in vitro de embriões. Embora a congelação clássica seja a técnica mais utilizada para criopreservar sêmen de ovinos, ela ainda apresenta algumas limitações nesta espécie. Com isso, surgem novos métodos de criopreservação, sendo a vitrificação um dos mais promissores. A vitrificação de sêmen apresenta diversas vantagens, por ser um método rápido e de baixo custo, mas principalmente a não formação de cristais de gelo. No entanto, existem poucos estudos sobre sua eficiência com sêmen ejaculado de carneiros e o uso da galactose como crioprotetor extracelular, bem como os efeitos que esses crioprotetores e as técnicas de criopreservação exercem aos espermatozoides. O presente estudo foi desenvolvido para avaliar o efeito da galactose (0,01 M), associada ou não ao glicerol (3 e 7%) em meio comercial na vitrificação de espermatozoides de carneiros pelo método de palhetas. Ejaculados de seis carneiros da raça Dorper foram coletados com vagina artificial, diluídos individualmente nos meios testados e as amostras foram envasadas em palhetas de 0,25 ml. Para avaliar efeito das diferentes técnicas sobre a qualidade espermática após a criopreservação, as amostras foram criopreservadas utilizando tanto o método clássico quanto vitrificação, tendo sido analisados posteriormente a cinemática, morfologia, morfometria, viabilidade, integridade física e funcional da membrana espermática. A vitrificação espermática apresentou resultados inferiores (p<0,05) à congelação clássica, pois não apresentou motilidade em nenhum dos extensores, bem como baixos valores de viabilidade, integridade física e funcional da membrana. A vitrificação resultou em maior porcentagem de cauda fortemente enrolada na análise morfológica e menor percentual de células reativas ao teste hiposmótico em todos os extensores quando comparado com a congelação clássica (p<0,05). Além disso, a utilização de extensores adicionados de galactose sem ou com glicerol a 3% e 7% aumentou significativamente o percentual de defeitos maiores. Conclui-se que a galactose e o glicerol nas concentrações utilizadas foram ineficazes para vitrificação de espermatozoides de ovinos pelo método de palhetas.

Semen cryopreservation is a biotechnique with substantial economic impact, since it is the basic technique to implement further biotechnologies on conservation and multiplication of genetic resources, such as artificial insemination and in vitro embryo production. Although classical freezing is the most common technique to cryopreserve sheep semen, it has some limitations in this specie. Therefore, new methods of cryopreservation have been developed, with vitrification being one of the most promising. Semen vitrification has several advantages, as a fast and low-cost method, but mainly due to avoid ice crystals formation. However, there are few studies evaluating its efficiency with sheep ejaculated semen and the use of galactose as an extracellular cryoprotectant, as well as the effects that these cryoprotectants and cryopreservation techniques have on sperm. The present study was developed to evaluate the effect of galactose (0.01 M), associated or not with glycerol (3 and 7%) in commercial medium on vitrification of sheep sperm using the straw method. Ejaculates from six Dorper rams were collected with artificial vagina, individually diluted in tested media and the samples were packed in 0.25 ml straws. To assess the effect of different techniques on sperm quality after cryopreservation, the samples were cryopreserved using both classical and vitrification methods, and the kinematics, morphology, morphometry, viability, physical and functional integrity of the sperm membrane were analyzed. Sperm vitrification had lower results (p <0.05) than classic freezing, as no motility was detected in any tested extender, as well as lower values of viability, physical and functional integrity of the membrane were observed. The vitrification resulted in a higher percentage of coiled tail on morphological analysis and a lower percentage of cells reactive to hyposmotic test in all extenders when compared to classical freezing (p <0.05). In addition, the use of extenders added with galactose without or with 3% and 7% glycerol significantly increased the percentage of major defects. It was concluded that galactose and glycerol at the concentrations used were ineffective for vitrification of sheep sperm using the straw method.

Low density lipoproteins added to an extender frozen or lyophilized are evenly efficient in cryoprotecting ovine sperm cells than when 16% whole egg yolk was added / Lipoproteínas de baixa densidade em meio diluidor congelado ou liofilizado exerce o mesmo efeito crioprotetor aos espermatozoides ovinos que meio contendo 16% de gema de ovo

The aim of this study was to test different concentrations of low density lipoprotein (LDL) in replacement of whole egg yolk in extenders preserved in the aqueous or lyophilized form, for ram sperm cryopreservation using two cooling curves (-40C/min from 5 to 140C and nitrogen vapor). One ejaculate from six Santa Inês rams was collected. Each ejaculate was divided into nine different diluents as follows: Tris-16% yolk (control), and Tris with 2, 4, 6 and 8% fresh LDL, and criopreserved in the aqueous or lyophilized form. The samples were diluted to a final concentration of 100 x 106 sperm/mL and filled into 0.25 ml straws. After thaw, sperm cells were evaluated for motility and sperm kinetics (CASA), and submitted to the hypoosmotic swelling test and the evaluation of the structural integrity of sperm membranes using fluorescent dyes (CFDA: PI), as well as sperm morphology and longevity. The experimental design was randomized blocks, and results were submitted to ANOVA and the averages were compared using the Scott-Knott test. There were no differences in progressive motility and functional and structural integrity of the membrane evaluated when different concentrations of aqueous or lyophilized low density lipoproteins or egg yolk were added to the extender (P>0.05). As for the velocity of sperm movement, the control medium had some kinetic scores similar to the extender containing LDL, both aqueous and lyophilized (P> 0.05). Results were similar between cooling curves. Therefore, we conclude that the media containing all concentrations of LDL, aqueous or lyophilized, were able to protect the ram sperm cells during the cryopreservation process, as whole egg yolk did.(AU)

O objetivo deste trabalho foi testar para criopreservação de sêmen ovino diferentes concentrações de lipoproteína de baixa densidade (LBD) em substituição à gema de ovo em meios diluidores, armazenados na forma aquosa e liofilizada, utilizando-se duas curvas de congelação (-40C/min de 5 à 140C ou vapor de nitrogênio). Os ejaculados de seis carneiros da raça Santa Inês foram fracionados e distribuídos em nove tratamentos, sendo o primeiro o meio controle (Tris-gema 16%) e os demais meios Tris contendo lipoproteínas de baixa densidade nas concentrações de 2, 4, 6 e 8% (v/v), criopreservados tanto na forma aquosa quanto liofilizada. As amostras foram diluídas para a concentração final de 100 x 106 espermatozoides/mL e envasadas em palhetas de 0,25 mL. Após a descongelação foram avaliadas a motilidade e cinética espermática (CASA), morfologia e longevidade espermáticas, além da integridade funcional (HOST) e estrutural (CFDA/IP) das membranas. O delineamento experimental foi blocos ao acaso e os resultados foram submetidos a ANOVA, sendo as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott. Quanto aos parâmetros de motilidade progressiva e integridade funcional e estrutural da membrana, todos os tratamentos testados foram similares (P>0,05). Quanto às velocidades do movimento espermático, o meio controle obteve alguns valores similares aos meios contendo LBD, tanto na forma aquosa quanto liofilizada (P>0,05). Não houve diferenças entre curvas de congelação. Dessa forma, é possível concluir que os meios contendo todas as concentrações de LBD, aquosa ou liofilizada, foram igualmente capazes de proteger as células espermáticas de ovinos, durante o processo de criopreservação, tanto quanto o meio contendo gema de ovo total.(AU)

Biotécnicas aplicadas a reprodução de ciprinídeos / Biotechs applied the reproduction of cyprinids

Esta revisão relata as variações de cada etapa que abrange o processo de crioprervação seminal e fertilização assistida artificial em ciprinídeos. Os diluidores mais utilizados para a criopreservação do sêmen de carpa são uma combinação de sais e açucares associados aos crioprotetores DMSO ou metanol. Para o armazenamento em nitrogênio líquido as amostras podem ser envasadas em palhetas de diferentes volumes e congeladas em caixas térmicas de poliestireno, refrigeradores programáveis, dry shippers ou botijões criogênicos. Após o descongelamento, uma alíquota do sêmen criopreservado é retirada para o cálculo da dose inseminante e realização da fertilização assistida artificial. Em seguida, os ovos fertilizados são tratados com uréia, NaCl e ácido tânico e transferidos para um sistema de incubação. Diante de uma variedade de protocolos relatados pela literatura, ainda é fundamental o aperfeiçoamento continuado destas biotécnicas para permitir o aprimoramento dos programas de reprodução de ciprinídeos.(AU)

This review reports the variations of each stage which covers the process of sperm cryopreservation and artificial fertilization in cyprinids. The most commonly used extenders for sperm cryopreservation of carp are a combination of salts and sugars associated with DMSO or methanol. The samples can be packaged in straws of different volumes for storage in liquid nitrogen and frozen in styrofoam boxes, computer-controlled freezer, dry shippers or cryogenic vessel. After thawing an aliquot of cryopreserved semen is taken for the calculation of insemination dose and realization of artificial assisted fertilization. Then fertilized eggs are treated with urea, NaCl and tannic acid and transferred to incubation system. Faced with a variety of protocols reported in the literature, it is still essential to continued improvement of these biotechnologies to enable the improvement of breeding programs for cyprinids.(AU)

EFEITO DA OSMOLALIDADE DE DIFERENTES SOLUÇÕES ATIVADORAS SOBRE A CINÉTICA ESPERMÁTICA DO SÊMEN FRESCO, RESFRIADO E DESCONGELADO DE Prochilodus brevis (ACTINOPTERYGII:PROCHILODONTIDAE)

Prochilodus brevis é uma espécie de peixe reofílica de importância econômica e ecológica no nordeste brasileiro. No entanto, ações antrópicas tornaram sua população vulnerável, sendo necessário realizar estudos sobre sua biologia reprodutiva para aperfeiçoar sua reprodução em cativeiro. Sendo assim, objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos das soluções ativadoras ACP-104, Frutose e NaCl em três diferentes osmolalidades (100, 160 e 220 mOsm Kg-1) na cinética espermática e na duração da motilidade em sêmen de P. brevis in natura, resfriado e criopreservado. Os machos receberam duas doses de extrato hipofisário de carpa (0,4 e 4 mg kg-1 peso corporal) com um intervalo de 9 horas entre as aplicações. Após 14 h, os animais foram sedados, tiveram o sêmen coletado e foram formados oito pools de sêmen. Amostras de sêmen in natura foram ativadas e analisadas; posteriormente, foram resfriadas e criopreservadas, com base em metodologia padronizada para esta espécie. ACP-104 e NaCl (P> 0,05) a 100 e 160 mOsm Kg-1 registraram resultados cinéticos satisfatórios para o sêmen fresco, enquanto o ativador NaCl obteve resultados cinéticos satisfatórios para espermatozoides resfriados nas três concentrações de osmolalidade (P <0,05). NaCl a 220 mOsm Kg-1 obteve os melhores resultados para espermatozoides descongelados (P <0,05). O ACP-104 a 100 mOsm Kg-1 manteve durações de motilidade espermática mais longas no sêmen submetido às três condições experimentais adotadas no presente estudo. Sendo assim, é possível concluir que o sêmen fresco de P. brevis ativado com ACP-104 ou Frutose em baixos níveis de osmolalidade permite altas taxas de motilidade espermática. Espermatozoides resfriados e descongelados podem ser ativados com NaCl em níveis mais altos de osmolalidade. Para todas as condições seminais, indica-se ACP-104 a 100 mOsm kg-1, por proporcionar uma maior duração da motilidade.

Prochilodus brevis is a rheophilic fish species of economic and ecological importance. However, anthropic actions have made its population vulnerable; therefore, it is necessary conducting studies about its reproductive biology to help improving its reproduction in captivity. The aim of the current study is to evaluate osmolality effects (100, 160 and 220 mOsm Kg-1) of activated solutions such as ACP-104, Fructose and NaCl on sperm kinetics and motility duration in fresh, cooled and thawed P. brevis semen. Fresh sperm samples were analyzed; subsequently, they were cooled and cryopreserved, based on standardized methodology for this species. ACP-104 and NaCl (P >0.05) at 100 and 160 mOsm Kg-1 recorded satisfactory kinetic results for fresh semen, whereas NaCl recorded satisfactory kinetic results for cooled sperm at all three osmolality levels (P <0, 05). NaCl at 220 mOsm Kg-1 recorded the best results for thawed sperm (P <0.05). ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 maintained longer sperm motility durations in semen subjected to the three experimental conditions adopted in the current study. It is possible concluding that fresh P. brevis semen activated with ACP-104 or Fructose at low osmolality levels enables high sperm mobility rates. Cooled and thawed sperm can be activated with NaCl at higher osmolality levels. In addition, ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 enables longer sperm mobility duration in fresh, cooled and cryopreserved semen.

TESTE HIPOSMÓTICO, RESFRIAMENTO DE SÊMEN E TERMOGRAFIA DIGITAL POR INFRAVERMELHO DO ESCROTO DO QUEIXADA (Tayassu pecari)

O Queixada (Tayassu pecari) é um mamífero neotropical classificado como vulnerável devido à caça e destruição de seu habitat. Devido às dificuldades na reprodução em cativeiro, técnicas de reprodução assistida podem ser aplicadas em programas de repovoamento da espécie. Dessa forma, o primeiro capítulo objetivou identificar o melhor protocolo de teste hiposmótico (HOST) para avaliar a integridade funcional dos espermatozoides de queixada. O sêmen de quatro machos adultos foi coletado com auxílio de eletroejaculador após contenção física e protocolo de sedação e anestesia. O sêmen foi avaliado quanto às características macro e microscópicas e diluído nas seguintes soluções hiposmóticas: água destilada (0 mOsmol/L), sacarose (50, 100, 150 mOsm/L) e frutose (50, 100, 150 mOsm/L). Cada amostra foi incubada em duplicata e uma sofreu fixação em solução de citrato de sódio formolizado a 4%. Duzentos espermatozoides foram avaliados por amostra e classificados em reativos ou não ao HOST. Todas as soluções testadas foram semelhantes em identificar o percentual de espermatozoides reativos, independente da amostra ser ou não fixada (P>0,05). Não foram encontradas correlações significativas entre o HOST e os parâmetros seminais avaliados. Dessa forma, pode-se usar água destilada como HOST por apresentar resultados similares e por ser um teste mais barato. No segundo estudo, visando auxiliar na conservação da espécie e permitir o uso racional do queixada em cativeiro e dentro de cadeias produtivas é de grande importância o conhecimento sobre a reprodução da espécie. Objetivou-se avaliar o efeito dos diluidores de sêmen ACP-103®, ACP-116® e BTS na viabilidade espermática durante a refrigeração do sêmen do Tayassu pecari. Foram refrigerados cinco ejaculados provenientes de quatro machos adultos. Os animais foram contidos com auxílio de puçá e submetidos ao protocolo de sedação e anestesia para realização da coleta de sêmen pelo método da eletroejaculação. Depois da coleta, o sêmen foi avaliado macro e microscopicamente e diluído para atingir 35x10 6 espermatozoides/mL em cada um dos três diferentes diluidores testados. O sêmen diluído foi acondicionado em caixa térmica BotuFLEX ® para manter as amostras a 15 º C por um período de 24 horas. Depois da refrigeração, os espermatozoides foram avaliados quanto aos parâmetros de movimento espermático, integridade funcional e estrutural das membranas espermáticas, atividade mitoc ondrial, condensação da cromatina e teste de termorresistência. Os diluidores testados preservaram as características cinéticas, a integridade estrutural e funcional das membranas espermáticas, a atividade mitocondrial e a condensação da cromatina semelhante ao sêmen in natura (P>0,05). O único parâmetro que reduziu com o processo de refrigeração independente do diluidor utilizado foi a VCL (P<0,05). Foi observado aumento do percentual de espermatozoides morfologicamente normais nas amostras refrigeradas em BTS IX (P<0,05). Os diluidores ACP-103®, ACP-116® e BTS podem refrigerar e conservar o sêmen de queixada a 15°C por 24 horas. Objetivou-se no terceiro estudo avaliar o uso da termografia infravermelha na avaliação da temperatura do superficial do escroto de queixadas e comparar com os parâmetros seminais e ambientais. Foram utilizados doze queixadas machos, adultos, com peso médio de 36,4 Kg. A contenção física e química dos animais usou os mesmos procedimentos dos experimentos anteriores. Inicialmente foi realizada a aferição da temperatura superficial do escroto dos queixadas por meio da termografia digital por infravermelho - Termovisor FLIR E60bx®, sendo o foco emissor do aparelho direcionado para o escroto de cada animal e orientado, perpendicularmente, a 1m de distância e emissividade de 0,98. A temperatura abdominal superficial (°C) também foi aferida com o mesmo aparelho para comparação. Foram aferidos dados climáticos de todo o período experimental. Os parâmetros seminais e termográficos foram correlacionados em um segundo momento, para isso a coleta de semen foi realizada com auxílio de um eletroejaculador. A temperatura superficial total do testículo (TSTT) obtida foi de 33,7 °C, o que representou 4,05°C abaixo da temperatura abdominal superficial. As correlações não foram significativas entre a TSTT e parâmetros seminais (P>0,05), mas entre a TSTT e o parâmetro ambiental umidade relativa foi encontrado significância (P<0,05). A termografia infravermelha pode ser usada para avaliar a temperatura superficial total do testículo dos queixadas de forma eficiente, rápida e segura.

White lipped peccary Tayassu pecari ) is a n eotropical mammal classified as vulnerable due to hunting and destruction of its habitat. Due to the difficulties in captive breeding, assisted reproduction techniques can be applied in repopulation programs of the species. In this way, the first chapter aimed to identify the best hyposmotic test protocol (HOST) to evaluate the functional integrity of the peccary spermatozoa. The semen of four adult males was collected with the aid of an electro ejaculator after physical restraint and protocol of sedation and anesthesia. The semen was evaluated for macro and microscopic characteristics and diluted in the following hyposmotic solutions: distilled water (0 mOsmol / L), sucr ose (50, 100, 150 mOsm / L) and fructose (50, 100, 150 mOsm / L). Each sample was incubated in duplicate and one was fixed in 4% formolized sodium citrate solution. Two hundred spermatozoa were evaluated by sample and classified as reactive or not to HOST. All tested solutions were similar in identifying the percentage of reactive spermatozoa, regardless of whether or not the sample was fixed (P> 0.05). No significant correlations were found between HOST and seminal parameters evaluated. In this way, distil led water can be used as HOST because it presents similar results and because it is a cheaper test. In the second study, in order to assist in the conservation of the species and to allow the rational use of the jaw in captivity and within productive chain s, knowledge about the reproduction of the species is of great importance. The objective of this study was to evaluate the effect of ACP 103 ® , ACP 116 ® and BTS semen diluents on sperm viability during cooling of Tayassu pecari semen. Five ejaculates from f our adult males were refrigerated. The animals were submitted to the protocol of sedation and anesthesia for the collection of semen by the electroejaculation method. After collection, the semen was evaluated macro and microscopically and diluted to reach 35x10 6 sperm / mL in each of the three different diluents tested. The diluted semen was packed in a BotuFLEX® thermal box to keep samples at 15º C for a period of 24 hours. After cooling, spermatozoa were evaluated for sperm movement, functional and struct ural integrity of sperm membranes, mitochondrial activity, chromatin condensation and thermoresistance test. The diluents tested preserved the kinetic characteristics, structural and functional integrity of spermatic membranes, mitochondrial activity and c hromatin condensation similar to in natura semen (P> 0.05). The only parameter that reduced with the cooling process independent of the diluent used was VCL (P <0.05). It was observed an increase in the percentage of morphologically normal spermatozoa in t he samples refrigerated in BTS (P <0.05). The ACP 103 ® , ACP 116 ® and BTS diluents can cool and preserve the XI wwhitehite--lipped peccarylipped peccary semen at 15 °semen at 15 °C for 24 hours. The objective of the third C for 24 hours. The objective of the third study was to evaluate the use of infrared thermography in the evaluatiostudy was to evaluate the use of infrared thermography in the evaluation of the n of the superficial temperature of the peccary scrotum and to compare it with the superficial temperature of the peccary scrotum and to compare it with the seminal and environmental parameters. Twelve adult male seminal and environmental parameters. Twelve adult male wwhitehite--lipped peccarylipped peccary with an average weight of 36.4 kg were used. Physical and chemical restraint of with an average weight of 36.4 kg were used. Physical and chemical restraint of the animals usedthe animals used the same procedures as the previous experiments. Initially, it the same procedures as the previous experiments. Initially, it was carried out the calibration of the superficial temperature of the was carried out the calibration of the superficial temperature of the WhiteWhite--lipped lipped peccarypeccary scrotum by means of infrared digital thermography scrotum by means of infrared digital thermography -- FLIR E60bxFLIR E60bx®® thermal imager, being the emitter focthermal imager, being the emitter focus of the device directed to the scrotum of us of the device directed to the scrotum of each animal and oriented, perpendicularly, to 1m distance and emissivity of 0.98. each animal and oriented, perpendicularly, to 1m distance and emissivity of 0.98. The sThe surface abdominal temperature (°urface abdominal temperature (°C) was also measured with the same C) was also measured with the same apparatus for comparison. Climatic data were measured throuapparatus for comparison. Climatic data were measured throughout the ghout the experimental period. The seminal and thermographic parameters were correlated experimental period. The seminal and thermographic parameters were correlated in a second moment, for that the collection of semen was performed with the aid in a second moment, for that the collection of semen was performed with the aid of an electroejaculator. Total testicular surface temperature (TSTT) obtainof an electroejaculator. Total testicular surface temperature (TSTT) obtained was ed was 33.7 °33.7 °C, which was 4.05C, which was 4.05 °°C below the surface abdominal temperature. The C below the surface abdominal temperature. The correlations were not significant between the TSTT and seminal parameters (P> correlations were not significant between the TSTT and seminal parameters (P> 0.05), but between the TSTT and the environmental parameter relative humidity 0.05), but between the TSTT and the environmental parameter relative humidity significance was found (P <0.05). significance was found (P <0.05). Infrared thermography can be used to evaluate Infrared thermography can be used to evaluate the total surface temperature of the the total surface temperature of the wwhitehite--lipped peccarylipped peccary testicles efficiently, testicles efficiently, quickly and safely.quickly and safely.

Equine seminal plasma on preserving the viability of frozen-thawed ram sperm

Re-suspension of frozen-thawed ram sperm with ovine and bovine whole seminal plasma (SP) is beneficial for its post-thawing viability. However, neither the influence of SP incubation duration nor the re-suspension with equine SP has been tested. In the first experiment, frozen-thawed ram sperm were incubated with SP from bovine (BSP), equine (ESP) or ovine (OSP) or without SP (-SP) for short (5 min) or long (6 h) periods. Viability parameters such as sperm progressive motility, percentage of live cells and membrane functionality were assessed every 2 h for 6 h. All SP treatments showed higher spermatozoa viability than the -SP treatment in most evaluations. Incubation time did not affect sperm viability for BSP treatment, however, ESP and OSP induced a transitory benefic effect in the short incubation period and detrimental effect in the longer period. In the second experiment, frozen-thawed sperm, with or without short incubation with SP, were selected by swim-up, and their DNA fragmentation rate was assessed using comet assay immediately after swim-up completion and after 5 h of incubation. BSP, ESP and OSP protein profiles were determined by SDS-PAGE. Only ESP was associated with sperm DNA stabilization capacity and SP from rams and bulls showed protein profiles different from that of stallions. These experiments indicate that equine or ovine, but not bovine whole SP supplementation to post-thawing incubation medium of frozen-thawed ram sperm affects its viability in a time dependent manner. The beneficial effect of ESP on stabilizing DNA integrity, even after sperm washing with swim-up method and incubation for 5 h, can be determined by SPP or by antioxidant components from SP.

Equine seminal plasma on preserving the viability of frozen-thawed ram sperm

Re-suspension of frozen-thawed ram sperm with ovine and bovine whole seminal plasma (SP) is beneficial for its post-thawing viability. However, neither the influence of SP incubation duration nor the re-suspension with equine SP has been tested. In the first experiment, frozen-thawed ram sperm were incubated with SP from bovine (BSP), equine (ESP) or ovine (OSP) or without SP (-SP) for short (5 min) or long (6 h) periods. Viability parameters such as sperm progressive motility, percentage of live cells and membrane functionality were assessed every 2 h for 6 h. All SP treatments showed higher spermatozoa viability than the -SP treatment in most evaluations. Incubation time did not affect sperm viability for BSP treatment, however, ESP and OSP induced a transitory benefic effect in the short incubation period and detrimental effect in the longer period. In the second experiment, frozen-thawed sperm, with or without short incubation with SP, were selected by swim-up, and their DNA fragmentation rate was assessed using comet assay immediately after swim-up completion and after 5 h of incubation. BSP, ESP and OSP protein profiles were determined by SDS-PAGE. Only ESP was associated with sperm DNA stabilization capacity and SP from rams and bulls showed protein profiles different from that of stallions. These experiments indicate that equine or ovine, but not bovine whole SP supplementation to post-thawing incubation medium of frozen-thawed ram sperm affects its viability in a time dependent manner. The beneficial effect of ESP on stabilizing DNA integrity, even after sperm washing with swim-up method and incubation for 5 h, can be determined by SPP or by antioxidant components from SP.(AU)

Sperm cryopreservation of freshwater fish bocachico ( Prochilodus magdalenae ) in DMSO and glucose and its effects on fertilization and hatching efficiency

Internal cryoprotectants (dimethyl sulfoxide - DMSO), as well as exter nal ones (glucose) have been of great importance for sperm cryopreservation in freshwater fish. The aim of this study was to evaluate both the fertilization and hatching rates of eggs fertilized with bocachico ( Prochilodus magdalenae ) spermatozoa cryoprese rved in different combinations of DMSO and glucose. Nine treatments were evaluated by a combination of three concentrations of DMSO: 5% (701 mM), 10% (1402 mM), 15% (v /v ; 2103 mM) and three concentr ations of glucose: 5.5% (305 mM), 6% (333 mM), 6.5% (w /v ; 361 mM) . Semen from males obtained by abdominal stripping 6 h after hormonal induction with carp pituitary extract was submitted to each treatment. The semen was frozen in 0.5 m l straws in a nitrogen vapor dry shipper for 30 m in and then in liquid nitrogen ( - 1 96°C). Five days later they were placed in water with a temperature of 60 °C for 8 sec and analyzed. A high total motility (71 .0 ± 7.0%) was observed when DMSO concentration was 10% and glucose was 6%, and a high linearity displacement (62.8 ± 6. 3 %) was observed when DMSO concentration was 5% and glucose was 5.5%. In conclusion, we found that for the purposes of cryopreservation of bocachico spermatozoa, the combination s of 10% DMSO + 5.5 or 6% glucose and 5% DMSO + 5.5 or 6% glucose produced the best re sults in terms of fertilization and hatching rates. This becomes the first report to successfully demonstrate the fertilizing capacity and larvae obtaining capabilities of cryopreserved bocachico semen.

Sperm cryopreservation of freshwater fish bocachico ( Prochilodus magdalenae ) in DMSO and glucose and its effects on fertilization and hatching efficiency

Internal cryoprotectants (dimethyl sulfoxide - DMSO), as well as exter nal ones (glucose) have been of great importance for sperm cryopreservation in freshwater fish. The aim of this study was to evaluate both the fertilization and hatching rates of eggs fertilized with bocachico ( Prochilodus magdalenae ) spermatozoa cryoprese rved in different combinations of DMSO and glucose. Nine treatments were evaluated by a combination of three concentrations of DMSO: 5% (701 mM), 10% (1402 mM), 15% (v /v ; 2103 mM) and three concentr ations of glucose: 5.5% (305 mM), 6% (333 mM), 6.5% (w /v ; 361 mM) . Semen from males obtained by abdominal stripping 6 h after hormonal induction with carp pituitary extract was submitted to each treatment. The semen was frozen in 0.5 m l straws in a nitrogen vapor dry shipper for 30 m in and then in liquid nitrogen ( - 1 96°C). Five days later they were placed in water with a temperature of 60 °C for 8 sec and analyzed. A high total motility (71 .0 ± 7.0%) was observed when DMSO concentration was 10% and glucose was 6%, and a high linearity displacement (62.8 ± 6. 3 %) was observed when DMSO concentration was 5% and glucose was 5.5%. In conclusion, we found that for the purposes of cryopreservation of bocachico spermatozoa, the combination s of 10% DMSO + 5.5 or 6% glucose and 5% DMSO + 5.5 or 6% glucose produced the best re sults in terms of fertilization and hatching rates. This becomes the first report to successfully demonstrate the fertilizing capacity and larvae obtaining capabilities of cryopreserved bocachico semen.(AU)

Efeito da carnosina na prevenção de crioinjúrias no sêmen de garanhões bons e maus congeladores

As espécies reativas de oxigênio são fundamentais na fisiologia espermática. No entanto, um desequilíbrio entre a produção e a capacidade antioxidante caracteriza o estresse oxidativo (EO). O espermatozoide é extremamente suscetível ao EO, dependendo fortemente de compostos presentes no plasma seminal (PS) para a proteção desta célula contra esse evento. No entanto, durante a criopreservação do sêmen equino é necessário retirar o PS. Em estudo recente, verificamos que esta remoção, torna os espermatozoides sensíveis ao subproduto extremamente deletério da peroxidação lipídica, o malondialdeído (MDA). Dessa forma, a carnosina, dipeptídeo presente no PS pode ser uma das responsáveis pela proteção contra o acúmulo do MDA. Assim, foram desenvolvidos 2 experimentos sequenciais visando a melhora da qualidade do sêmen criopreservado com adição de carnosina. Amostras de sêmen de sete garanhões foram tratadas com concentrações crescentes de carnosina adicionadas ao diluidor (1mM, 50mM e 100mM). Após a descongelação, as amostras foram divididas retrospectivamente em grupos de alta congelabilidade (BC: motilidade maior que 30%) e baixa congelabilidade (MC: motilidade menor que 30%). Amostras tratadas com 50mM apresentaram menor porcentagem de células com lesão de membrana plasmática e, quando tratadas com 100mM, células com maior amplitude do deslocamento lateral de cabeça. Amostras controle MC apresentaram menor porcentagem de células com DNA íntegro em relação às amostras BC. No entanto, houve um leve aumento na porcentagem de células com DNA íntegro em amostras MC com 100mM, não diferindo das amostras BC. Por outro lado, amostras MC criopreservadas com 50mM apresentaram maiores porcentagens de células com escore calculado de potencial de membrana mitocondrial e mais suscetíveis ao EO em relação ao controle. Apesar da proteção parcial, a maior susceptibilidade à peroxidação lipídica torna-se um problema, especialmente pela maior susceptibilidade dos espermatozoides equinos ao MDA. Um motivo para este efeito seria a afinidade da carnosina em reagir com açúcares, o que poderia influenciar negativamente a atividade mitocondrial e o status oxidativo, ao diminuir a produção de piruvato. Desta forma, no experimento 2, amostras MC foram tratadas com a combinação de carnosina (0 e 50mM) e piruvato (0 e 5mM) em arranjo fatorial 2x2. Verificou-se que o tratamento com piruvato (5mM) proporcionou menos células com baixa atividade mitocondrial. Por outro lado, a carnosina (50mM), promoveu maior motilidade total, progressiva e células rápidas. Houve uma tendência de aumento nas células com velocidade progressiva e atividade mitocondrial na combinação de tratamentos. Não houve diferença entre os grupos na suscetibilidade ao EO que, no entanto, correlacionou-se negativamente com células móveis, rápidas e integridade de membrana plasmática e acrossomal. Estes resultados indicam que subprodutos da peroxidação lipídica, sendo o principal deles o MDA, podem causar danos ao DNA, às mitocôndrias e à cinética espermática. Neste contexto, a carnosina (100mM) parece ter um leve efeito protetor ao DNA contra o acúmulo de MDA. Além disto, 50mM de carnosina parece auxiliar na manutenção da velocidade progressiva e atividade mitocondrial quando associada ao piruvato (5mM). Assim, a carnosina e o piruvato podem ser utilizados na prevenção de crioinjúrias em amostras de baixa congelabilidade.

Reactive oxygen species (ROS) are important to sperm physiology. However, an imbalance between ROS production and antioxidant capacity characterize the oxidative stress (OE). Spermatozoa are extremely susceptible to OE, being highly dependent on compounds present in the seminal plasma (SP) to protect them against this event. Nevertheless, during the cryopreservation process, SP is removed. In a recent study, we observed that seminal plasma removal led to an increased susceptibility of equine spermatozoa to extremely deleterious product of lipid peroxidation, malondialdehyde (MDA). Thus, carnosine, a dipeptide present in SP of stallions, may be a key factor on the protection against MDA accumulation. Consequently, two sequential experiments were developed aiming to improve the quality of stallion cryopreserved semen by means of carnosine therapy. Samples from seven stallions were treated with increasing concentrations of carnosine added to the extender (1mM, 50mM and 100mM) and submitted to cryopreservation. After thawing, samples were classified as high freezeability (HF: total motility greater than 30%) and low freezeability (LF: total motility lower than 30%). Samples treated with 50mM presented lower percentage of sperm showing plasma membrane damage and, when treated with 100mM, a greater amplitude of the lateral head displacement was observed. Untreated LF samples showed a lower percentage of cells showing intact DNA in relation to HF samples. By contrast, when LF samples were treated with 100mM, there was an increase in the percentage of cells with intact DNA, which was similar to the HF samples. On the other hand, LF samples cryopreserved with 50mM had a higher percentage of cells showing high calculated mitochondrial membrane potential score and increased susceptibility to OE in relation to the control. Despite the partial protection, the increased susceptibility to lipid peroxidation is a concern since equine spermatozoa is highly vulnerable to the MDA. Those results could be due to the affinity of carnosine to react with sugars, which could negatively influence mitochondrial activity and an oxidative state by decreasing pyruvate production. Hence, in experiment 2, LF samples were treated with a combination of carnosine (0 and 50mM) and pyruvate (0 and 5mM) in a 2x2 factorial arrangement. We observed that samples treated with pyruvate (5mM) had decreased percentage of cells with low mitochondrial activity. On the other hand, carnosine (50mM) increased total motility, progressive motility and fast cells. We also observed a tendency to increased progressive velocity and mitochondrial activity in the combination of treatments. There was no difference on sperm susceptibility to OE between treatments. However, this variable correlated negatively with the percentage of motile and rapid cells as well as those showing intact membrane and acrosome. These results indicate that the byproduct of lipid peroxidation (MDA) may cause damage to DNA, mitochondria and sperm kinetics. In this context, carnosine (100mM) appears to have a mild protective effect on DNA against the accumulation of MDA. Furthermore, 50mM of carnosine seems to improve progressive velocity and mitochondrial activity when associated with pyruvate (5mM). Thus, carnosine and pyruvate can be used on cryoinjuries prevention in low freezeability samples.

Efeito de diferentes taxas de diluição e protocolos de congelação sobre a cinética e morfologia de espermatozoides de carpa comum (Cyprinus carpio) criopreservados em água de coco em pó (ACP 104) / Effect of different rates of dilution and freezing protocols on the kinetics and morphology of sperm of common carp (Cyprinus carpio) cryopreserved in powdered coconut water (ACP - 104)

A carpa comum, Cyprinus carpio, é considerada uma das espécies domesticadas com grande tolerância e resistência a uma ampla variedade de habitats aquáticos, tendo sida introduzida no nordeste do Brasil pelo Departamento Nacional de Obras Contras às Secas (DNOCS) no ano de 1977. A carpa comum é uma espécie de alto valor comercial, forte apelo culinário e esportivo, sendo uma das espécies mais cultivadas em todo o mundo. O objetivo desse trabalho foi avaliar um protocolo de criopreservação de sêmen de carpa comum em ACP-104 e CCSE2 (NaCl e sacarose) utilizando dois métodos de congelação. A partir do sêmen coletado de 30 machos maduros foram determinadas as características seminais. Para a avaliação da concentração espermática, o sêmen fresco foi diluído na proporção de 1:4000 em solução de citrato-formol 4%. Para verificar o efeito dos diluentes e métodos de congelação foram formados onze pools e diluídos em ACP-104 + DMSO 10% ou CCSE2 + DMSO 10%, na taxa de diluição de 1:3 e envasados em palhetas de 0,25 mL. Para cada tratamento resultante foram congeladas quatro palhetas em vapores de nitrogênio líquido em dry shipper ou caixa térmica de poliestireno, sendo depois transferidas e armazenadas em botijões criogênicos. Para verificar o efeito das taxas de diluição os pools também foram diluídos em ACP-104 + DMSO 10% e submetido às diluições de 1:1 e 1:3. As amostras foram envasadas em palhetas de mesmo volume e número de replicatas, sendo congeladas em vapores de nitrogênio líquido em caixa térmica de poliestireno e depois transferidas e armazenadas em botijões criogênicos. O sêmen foi descongelado em banho Maria a 25C por 30 segundos e os parâmetros de motilidade e velocidade seminal foram avaliados com uso do Sperm Class Analyser (SCA). A análise das patologias espermáticas do sêmen fresco, diluído em 1:500, e pós-descongelado, diluído em 1:250 em citrato- formol 4%, foram realizados utilizando o corante azul de bromofenol. Os dados foram agrupados como média desvio padrão e comparados utilizando ANOVA e teste de Games-Howell, adotando um nível de significância de 0,05. Não houve diferença significativa (p<0,05) entre os diluentes, os métodos de congelação e as taxas de diluição empregadas sobre os parâmetros espermáticos e morfológicos de sêmen pós-descongelação de carpa comum. Embora todos os parâmetros espermáticos e morfológicos analisados entre os tratamentos tenham apresentado diferença significativa (p<0,05) em relação ao sêmen fresco (controle), os resultados foram favoráveis para a criopreservação do sêmen de Cyprinus carpio.

The common carp, Cyprinus carpio, is considered one of domesticated species with high tolerance and resistance to a wide variety of aquatic habitats, being introduced in northeastern Brazil by the National Department of Works Cons Drought (DNOCS) in 1977. The common carp is a species of high commercial value, strong appeal culinary and sports, one of the most cultivated species in the world. The aim of this study was to evaluate a protocol for semen cryopreservation of common carp in ACP-104 and CCSE2 using two freezing methods. The semen collected from 30 sexually mature males were analysed seminal characteristics.The fresh semen was diluted 1:4000 in solution in the proportion of citrate-formaldehyde 4% for the evaluation of sperm concentration. Eleven pools were diluted in 10% DMSO combined with ACP-104 or CCSE2 the dilution rate of 1:3 using 0.25 ml straws to determine the effect of diluent and freezing methods. For each treatment resulting four straws were frozen in liquid nitrogen vapors in dry shipper or styrofoam cooler, and later transferred to cryogenic cylinders. The pools were also diluted in 10% DMSO and ACP-104 at dilutions of 1:1 and 1:3 to check the effect of dilution rates. These samples were packaged into straws same volume and number of replicates, and frozen in liquid nitrogen vapors in styrofoam cooler and then transferred to cryogenic cylinders. The semen was thawed in a water bath at 25 C for 30 seconds and evaluated parameters of motility and velocity through the seminal program computerized semen analysis (SCA). The analysis of sperm pathologies of fresh semen, diluted 1:500, and post-thawed, diluted 1:250 in citrate-formaldehyde 4%, were performed using the bromophenol blue dye. All data were expressed as mean standard deviation and compared using ANOVA and Games-Howell test, considered at 5% of significance level. No significant difference (p<0.05) between the two extenders, two freezing methods and the two dilution rates on sperm and morphological parameters post-thawed semen of common carp. Although all sperm and morphological parameters analyzed between treatments showed significant differences (p<0.05) compared to fresh semen (control), they were favorable results for the cryopreservation of semen of Cyprinus carpio.

Efeito de diferentes taxas de diluição e protocolos de congelação sobre a cinética e morfologia de espermatozoides de carpa comum (Cyprinus carpio) criopreservados em água de coco em pó (ACP 104) / Effect of different rates of dilution and freezing protocols on the kinetics and morphology of sperm of common carp (Cyprinus carpio) cryopreserved in powdered coconut water (ACP - 104)

A carpa comum, Cyprinus carpio, é considerada uma das espécies domesticadas com grande tolerância e resistência a uma ampla variedade de habitats aquáticos, tendo sida introduzida no nordeste do Brasil pelo Departamento Nacional de Obras Contras às Secas (DNOCS) no ano de 1977. A carpa comum é uma espécie de alto valor comercial, forte apelo culinário e esportivo, sendo uma das espécies mais cultivadas em todo o mundo. O objetivo desse trabalho foi avaliar um protocolo de criopreservação de sêmen de carpa comum em ACP-104 e CCSE2 (NaCl e sacarose) utilizando dois métodos de congelação. A partir do sêmen coletado de 30 machos maduros foram determinadas as características seminais. Para a avaliação da concentração espermática, o sêmen fresco foi diluído na proporção de 1:4000 em solução de citrato-formol 4%. Para verificar o efeito dos diluentes e métodos de congelação foram formados onze pools e diluídos em ACP-104 + DMSO 10% ou CCSE2 + DMSO 10%, na taxa de diluição de 1:3 e envasados em palhetas de 0,25 mL. Para cada tratamento resultante foram congeladas quatro palhetas em vapores de nitrogênio líquido em dry shipper ou caixa térmica de poliestireno, sendo depois transferidas e armazenadas em botijões criogênicos. Para verificar o efeito das taxas de diluição os pools também foram diluídos em ACP-104 + DMSO 10% e submetido às diluições de 1:1 e 1:3. As amostras foram envasadas em palhetas de mesmo volume e número de replicatas, sendo congeladas em vapores de nitrogênio líquido em caixa térmica de poliestireno e depois transferidas e armazenadas em botijões criogênicos. O sêmen foi descongelado em banho Maria a 25C por 30 segundos e os parâmetros de motilidade e velocidade seminal foram avaliados com uso do Sperm Class Analyser (SCA). A análise das patologias espermáticas do sêmen fresco, diluído em 1:500, e pós-descongelado, diluído em 1:250 em citrato- formol 4%, foram realizados utilizando o corante azul de bromofenol. Os dados foram agrupados como média desvio padrão e comparados utilizando ANOVA e teste de Games-Howell, adotando um nível de significância de 0,05. Não houve diferença significativa (p<0,05) entre os diluentes, os métodos de congelação e as taxas de diluição empregadas sobre os parâmetros espermáticos e morfológicos de sêmen pós-descongelação de carpa comum. Embora todos os parâmetros espermáticos e morfológicos analisados entre os tratamentos tenham apresentado diferença significativa (p<0,05) em relação ao sêmen fresco (controle), os resultados foram favoráveis para a criopreservação do sêmen de Cyprinus carpio.(AU)

The common carp, Cyprinus carpio, is considered one of domesticated species with high tolerance and resistance to a wide variety of aquatic habitats, being introduced in northeastern Brazil by the National Department of Works Cons Drought (DNOCS) in 1977. The common carp is a species of high commercial value, strong appeal culinary and sports, one of the most cultivated species in the world. The aim of this study was to evaluate a protocol for semen cryopreservation of common carp in ACP-104 and CCSE2 using two freezing methods. The semen collected from 30 sexually mature males were analysed seminal characteristics.The fresh semen was diluted 1:4000 in solution in the proportion of citrate-formaldehyde 4% for the evaluation of sperm concentration. Eleven pools were diluted in 10% DMSO combined with ACP-104 or CCSE2 the dilution rate of 1:3 using 0.25 ml straws to determine the effect of diluent and freezing methods. For each treatment resulting four straws were frozen in liquid nitrogen vapors in dry shipper or styrofoam cooler, and later transferred to cryogenic cylinders. The pools were also diluted in 10% DMSO and ACP-104 at dilutions of 1:1 and 1:3 to check the effect of dilution rates. These samples were packaged into straws same volume and number of replicates, and frozen in liquid nitrogen vapors in styrofoam cooler and then transferred to cryogenic cylinders. The semen was thawed in a water bath at 25 C for 30 seconds and evaluated parameters of motility and velocity through the seminal program computerized semen analysis (SCA). The analysis of sperm pathologies of fresh semen, diluted 1:500, and post-thawed, diluted 1:250 in citrate-formaldehyde 4%, were performed using the bromophenol blue dye. All data were expressed as mean standard deviation and compared using ANOVA and Games-Howell test, considered at 5% of significance level. No significant difference (p<0.05) between the two extenders, two freezing methods and the two dilution rates on sperm and morphological parameters post-thawed semen of common carp. Although all sperm and morphological parameters analyzed between treatments showed significant differences (p<0.05) compared to fresh semen (control), they were favorable results for the cryopreservation of semen of Cyprinus carpio.(AU)

Frozen Jaguar (Panthera onca) sperm capacitation and ability to penetrate zona free hamster oocytes / Capacitação espermática de sêmem congelado de onça pintada (Panthera onca) e ensaio de penetração em oócitos de hamster livres de zona pelúcida

Assisted reproductive technologies in endangered species, such as artificial insemination, in vitro fertilization and embryo transfer, can be viewed as one potential approach for safeguarding species. Toward this aim, the objective of this study was to evaluate the fertility of frozen jaguar (Panthera onca) sperm and Tyrod's Talp PVA capacitation medium using the hamster zona free oocyte penetration assay. Ejaculates were collected from nine animals using electroejaculation and cryopreserved. Sperm capacitation was performed by swim-up technique using Tyrod's Talp PVA medium at room temperature. Penetration was considered when the spermatozoa head decondensation was visualized within the oocyte. This assay showed 15.4 % penetrations (350/2275 oocytes). Results of this study showed high sperm abnormalities, low sperm quality after cryopreservation, and low percentage of penetrations. However, the penetration results showed lhat the cryopreserved jaguar's semen can be used for artificial insemination, in vitro fertilization and intra cytoplasmatic sperm injection, supporting the semen bank creation for this specie.(AU)

Biotecnologias reprodutivas aplicadas a espécies selvagens, como inseminação artificial, fertilização in vitro e transferência de embriões, são vistas como um potencial caminho para proteção das espécies ameaçadas de extinção. Devido a isso, o objetivo deste estudo foi avaliar a fertilidade do sêmen congelado de onças pintadas (Panthera onca) e o meio de capacitação espermática usando o ensaio de penetração em oócitos de hamster livres de zona pelúcida. Ejaculados de nove animais foram coletados por eletroejaculação e criopreservados. Para determinar a capacitação espermática foi utilizada a técnica swin-up com meio Tyrods Talp PVA a temperatura ambiente. No ensaio de penetração em oócitos de hamster livres de zona pelúcida foram considerados como oócitos penetrados aqueles que apresentaram em seu interior a cabeça do espermatozóide descondensada. O ensaio foi realizado em um total de 2275 oócitos, dos quais 350 apresentaram em seu interior a cabeça do espermatozóide descondensada, perfazendo um total de 15.4% de penetração. Os resultados deste estudo demonstraram alto índice de anormalidades espermáticas, baixa qualidade do sêmen e baixa porcentagem de penetrações. Entretanto, os resultados de penetração espermática demonstraram que sêmen congelado de onça pintada poderá ser utilizado para inseminação artificial, fertilização in vitro e injeção intracitoplasmática dando suporte para a criação de um banco de sêmen para esta espécie.(AU)

Low density lipoproteins added to an extender frozen or lyophilized are evenly efficient in cryoprotecting ovine sperm cells than when 16% whole egg yolk was added / Lipoproteínas de baixa densidade em meio diluidor congelado ou liofilizado exerce o mesmo efeito crioprotetor aos espermatozoides ovinos que meio contendo 16% de gema de ovo

The aim of this study was to test different concentrations of low density lipoprotein (LDL) in replacement of whole egg yolk in extenders preserved in the aqueous or lyophilized form, for ram sperm cryopreservation using two cooling curves (-40C/min from 5 to 140C and nitrogen vapor). One ejaculate from six Santa Inês rams was collected. Each ejaculate was divided into nine different diluents as follows: Tris-16% yolk (control), and Tris with 2, 4, 6 and 8% fresh LDL, and criopreserved in the aqueous or lyophilized form. The samples were diluted to a final concentration of 100 x 106 sperm/mL and filled into 0.25 ml straws. After thaw, sperm cells were evaluated for motility and sperm kinetics (CASA), and submitted to the hypoosmotic swelling test and the evaluation of the structural integrity of sperm membranes using fluorescent dyes (CFDA: PI), as well as sperm morphology and longevity. The experimental design was randomized blocks, and results were submitted to ANOVA and the averages were compared using the Scott-Knott test. There were no differences in progressive motility and functional and structural integrity of the membrane evaluated when different concentrations of aqueous or lyophilized low density lipoproteins or egg yolk were added to the extender (P>0.05). As for the velocity of sperm movement, the control medium had some kinetic scores similar to the extender containing LDL, both aqueous and lyophilized (P> 0.05). Results were similar between cooling curves. Therefore, we conclude that the media containing all concentrations of LDL, aqueous or lyophilized, were able to protect the ram sperm cells during the cryopreservation process, as whole egg yolk did.

O objetivo deste trabalho foi testar para criopreservação de sêmen ovino diferentes concentrações de lipoproteína de baixa densidade (LBD) em substituição à gema de ovo em meios diluidores, armazenados na forma aquosa e liofilizada, utilizando-se duas curvas de congelação (-40C/min de 5 à 140C ou vapor de nitrogênio). Os ejaculados de seis carneiros da raça Santa Inês foram fracionados e distribuídos em nove tratamentos, sendo o primeiro o meio controle (Tris-gema 16%) e os demais meios Tris contendo lipoproteínas de baixa densidade nas concentrações de 2, 4, 6 e 8% (v/v), criopreservados tanto na forma aquosa quanto liofilizada. As amostras foram diluídas para a concentração final de 100 x 106 espermatozoides/mL e envasadas em palhetas de 0,25 mL. Após a descongelação foram avaliadas a motilidade e cinética espermática (CASA), morfologia e longevidade espermáticas, além da integridade funcional (HOST) e estrutural (CFDA/IP) das membranas. O delineamento experimental foi blocos ao acaso e os resultados foram submetidos a ANOVA, sendo as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott. Quanto aos parâmetros de motilidade progressiva e integridade funcional e estrutural da membrana, todos os tratamentos testados foram similares (P>0,05). Quanto às velocidades do movimento espermático, o meio controle obteve alguns valores similares aos meios contendo LBD, tanto na forma aquosa quanto liofilizada (P>0,05). Não houve diferenças entre curvas de congelação. Dessa forma, é possível concluir que os meios contendo todas as concentrações de LBD, aquosa ou liofilizada, foram igualmente capazes de proteger as células espermáticas de ovinos, durante o processo de criopreservação, tanto quanto o meio contendo gema de ovo total.

Criopreservação do sêmen testicular do teleósteo piau-açu Leporimus macrocephalus / Testicular sperm cryopreservation of the teleost 'piau-açu' Leporinus macrocephalus

Avaliaram-se metodologias de criopreservação para o sêmen do piau-açu Leporinus macrocephalus (Teleostei, Anostomidae). O volume de sêmen coletado diretamente dos testículos de seis peixes (446,7±165,1g de peso corporal) foi de 0,4±0,2 ml. Testou-se a toxicidade dos crioprotetores dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida, propilenoglicol, etilenoglicol e metanol nas concentrações de 5 por cento, 10 por cento e 15 por cento. DMSO, dimetilacetamida e propilenoglicol foram os menos tóxicos e, por isso, utilizados na criopreservação do sêmen. Para este teste, o sêmen foi diluído 1:8 (v:v) em soluções de cada crioprotetor(8,9 por cento, concentração final) às quais adicionaram-se gema de ovo de galinha (8,9 por cento, concentração final), glicose (5 por cento) e água destilada (75 por cento). A mistura foi então envasada em palhetas de 5ml de capacidade e imediatamente colocada em botijão de vapor de nitrogênio líquido. A taxa de motilidade espermática pós-descongelamento mais alta (40,8±13,6 por cento) foi obtida com sêmen criopreservado em diluente contendo DMSO e ativado em solução de NaHCO3 119mM. A taxa de fertilização, correspondente a 84,3±9,4 por cento do controle, foi obtida com ovócitos de piau-açu fertilizados com sêmen congelado em solução de DMSO (8 por cento, concentração final).(AU)

Methods for cryopreservation of 'piau-açu' Leporinus macrocephalus (Teleostei, Anostomidae) sperm were evaluated. Sperm collected directly from the testes of six fish (446.7±165.1g of body weight) yielded 0.4±0.2 ml. The toxicity of the cryoprotectants dimethyl sulphoxide (DMSO), dimethyl acetamide, propylene glycol, ethylene glycol and methanol, at concentrations of 5%, 10% and 15%, was tested. DMSO, dimethyl acetamide and propylene glycol were the least toxic and were used to freeze the sperm. Sperm was diluted 1:8 (v:v) in solutions made of 8.9% (final concentration) of one of those crioprotectants to which 8.9% (final concentration) of chicken yolk egg, 5% glucose and 75% distilled water were added. The mixture was then poured into 0.5-ml capacity straws and immediately deepened into a cryogenic shipper containing only liquid nitrogen vapor. The highest frozen/thawed sperm motility rate (40.8±13.6 %) was obtained with sperm cryopreserved in the DMSO containing diluent and activated in 119 mM NaHCO3. Piau-açu eggs fertilized with sperm previously cryopreserved in solution containing 8% (final concentration) DMSO yielded a rate of fertilization of 84.3 ±9.4% of the control.(AU)