Genetic characterization of the haemagglutinin gene in canine distemper virus strains from naturally infected dogs in Brazil / Caracterização genética do gene da hemaglutinina em vírus da cinomose canina de cães naturalmente infectados no Brasil

Canine distemper is one of the major infectious diseases in dogs and wild animals, resulting in high morbidity and mortality. The H gene has the greatest genetic variability among the genes encoded by the canine distemper virus (CDV) genome, and it has been used to characterise field samples, allowing the identification of specific lineages. Variation in the H gene can allow the virus to evade recognition by vaccine-induced antibodies, resulting in vaccine failure. The purpose of this study was to characterise H gene in CDV strains from naturally infected dogs in the state of São Paulo. The phylogenetic analysis revealed that Brazilian CDV strains were genetically related to the circulating CDV strains in Uruguay, Argentina, and Europe. We found no evidence of South America 2 and 3 CDV lineages circulating in Brazilian dogs. The degree of genetic divergence between wild Brazilian CDV strains and vaccine strains may suggest the possibility of vaccine failures and consequently the occurrence of canine distemper outbreaks.(AU)

A cinomose canina é uma das principais doenças infecciosas em cães e animais selvagens, resultando em alta morbidade e mortalidade. O gene H tem uma das maiores variabilidades genéticas entre os genes codificados pelo vírus da cinomose canina (CDV), e tem sido utilizado para caracterizar as estirpes de CDV, permitindo a identificação de linhagens específicas. A variação no gene H pode permitir que o vírus evite o reconhecimento por anticorpos induzidos pela vacina, resultando em falha vacinal. O objetivo deste estudo foi caracterizar o gene H em estirpes de CDV de cães infectados naturalmente no estado de São Paulo. A análise filogenética revelou que as estirpes de CDV brasileiras estão geneticamente relacionadas as estirpes circulantes no Uruguai, na Argentina e na Europa. Não foi encontrada nenhuma evidência da circulação no estado de São Paulo das linhagens América do Sul 2 e 3. O grau de divergência genética entre linhagens selvagens de CDV brasileiras e as estirpes vacinais podem sugerir a possibilidade de falhas vacinais e consequentemente a ocorrência de surtos de cinomose canina.(AU)

Genetic characterization of the haemagglutinin gene in canine distemper virus strains from naturally infected dogs in Brazil / Caracterização genética do gene da hemaglutinina em vírus da cinomose canina de cães naturalmente infectados no Brasil

Canine distemper is one of the major infectious diseases in dogs and wild animals, resulting in high morbidity and mortality. The H gene has the greatest genetic variability among the genes encoded by the canine distemper virus (CDV) genome, and it has been used to characterise field samples, allowing the identification of specific lineages. Variation in the H gene can allow the virus to evade recognition by vaccine-induced antibodies, resulting in vaccine failure. The purpose of this study was to characterise H gene in CDV strains from naturally infected dogs in the state of São Paulo. The phylogenetic analysis revealed that Brazilian CDV strains were genetically related to the circulating CDV strains in Uruguay, Argentina, and Europe. We found no evidence of South America 2 and 3 CDV lineages circulating in Brazilian dogs. The degree of genetic divergence between wild Brazilian CDV strains and vaccine strains may suggest the possibility of vaccine failures and consequently the occurrence of canine distemper outbreaks.(AU)

A cinomose canina é uma das principais doenças infecciosas em cães e animais selvagens, resultando em alta morbidade e mortalidade. O gene H tem uma das maiores variabilidades genéticas entre os genes codificados pelo vírus da cinomose canina (CDV), e tem sido utilizado para caracterizar as estirpes de CDV, permitindo a identificação de linhagens específicas. A variação no gene H pode permitir que o vírus evite o reconhecimento por anticorpos induzidos pela vacina, resultando em falha vacinal. O objetivo deste estudo foi caracterizar o gene H em estirpes de CDV de cães infectados naturalmente no estado de São Paulo. A análise filogenética revelou que as estirpes de CDV brasileiras estão geneticamente relacionadas as estirpes circulantes no Uruguai, na Argentina e na Europa. Não foi encontrada nenhuma evidência da circulação no estado de São Paulo das linhagens América do Sul 2 e 3. O grau de divergência genética entre linhagens selvagens de CDV brasileiras e as estirpes vacinais podem sugerir a possibilidade de falhas vacinais e consequentemente a ocorrência de surtos de cinomose canina.(AU)

CARACTERIZAÇÃO DO GENE DA PROTEÍNA HEMAGLUTININA DO VÍRUS DA CINOMOSE CANINA EM CÃES NATURALMENTE INFECTADOS NOS ESTADOS DE MATO GROSSO E RONDÔNIA

O Morbillivirus canino (CDV) é o agente etiológico da cinomose canina (CC), uma importante doença de cães e carnívoros silvestres caracterizada por alta morbidade e mortalidade. A proteína hemaglutinina (H) presente no envelope possui importante função de adsorção viral e por isso apresenta elevada variabilidade genética em relação aos outros genes do CDV. Por essa razão tem sido utilizada para caracterizar as estirpes do CDV, permitindo a identificação de linhagens específicas. Diante do exposto o objetivo do presente estudo foi caracterizar a proteína hemaglutinina (H) em estirpes de CDV detectados em 15 cães naturalmente infectados no estado de Mato Grosso e Rondônia. As amostras foram coletadas de tecido nervoso central de cães que vieram a óbito. Foram inicialmente submetidas a RT-PCR para detecção do gene do nucleocapsídeo (N). As positivas foram em seguida testadas para amplificar o gene H. Em dez amostras houve amplificação completa do gene H. Análise filogenética revelou que as amostras se posicionaram em dois grupos: um geneticamente relacionado com isolados do Uruguai e, outro com linhagens oriundos de cepas brasileiras (especificamente dos estados do Paraná e Rio Grande do Sul), todas as sequências foram classificadas dentro do genótipo América do Sul I/ Europa.

Canine Morbillivirus (CDV) is the etiological agent of canine distemper (CC), an important disease of dogs and wild carnivores characterized by high morbidity and mortality. The hemagglutinin (H) protein present in the envelope has an important function of viral adsorption and therefore has high genetic variability in relation to the other CDV genes. For this reason, it has been used to characterize CDV strains, allowing the identification of specific strains. Given the above, the objective of the present study was to characterize the hemagglutinin (H) protein in CDV strains detected in 15 naturally infected dogs in the states of Mato Grosso and Rondônia. The samples were collected from central nervous tissue of dogs that died. They were initially submitted to RT-PCR to detect the nucleocapsid (N) gene. The positive ones were then tested to amplify the H gene. In ten samples, there was complete amplification of the H gene. Phylogenetic analysis revealed that the samples were positioned in two groups: one genetically related to isolates from Uruguay and the other with strains from Brazilian strains (specifically from the states of Paraná and Rio Grande do Sul), all sequences were classified within the South America I / Europe genotype.

Estudo histoquímico e lectino-histoquímico da intoxicação por feijão preto (Phaseolus vulgaris) em búfalos

O feijão (Phaseolus vulgaris) é um grão comumente utilizado na alimentação humana e de animais monogástricos, que está ganhando espaço na nutrição de ruminantes em regiões tropicais. O Brasil é o maior produtor e exportador deste grão, o que torna o uso de excedentes de produção ou subprodutos na alimentação animal uma alternativa. P. vulgaris é uma leguminosa que possui elevado teor proteico e que tem um custo de produção menor em relação a proteína animal. Entretanto seus grãos apresentam alguns limitantes, como fatores antinutricionais em sua composição. Um destes fatores é a fito-hemaglutinina (PHA), uma lectina capaz de provocar intoxicação em humanos e animais. A intoxicação ocorre pela ingestão de grãos não processados, sendo a cocção o método mais empregado na desnaturação dos fatores antinutricionais como a PHA. A intoxicação é amplamente estudada em humanos e animais monogástricos, entretanto, estudos em ruminantes são escassos. O acompanhamento de um surto de intoxicação natural por P. vulgaris em búfalos há alguns anos possibilitou o presente projeto, que tem por objetivo aprofundar alguns aspectos histoquímicos e imuno-histoquímicos da intoxicação nesta espécie animal.

Bean (Phaseolus vulgaris) is a common grain used in human food and monogastric animals, which is gaining ground in ruminant nutrition in tropical regions. Brazil is the largest producer and exporter of this grain which makes the use of surplus production or by-products in animal feed an alternative. P. vulgaris is a legume that has a high protein content and a relatively lower production cost in relation to animal protein. However, it presents some limitations, as antinutritional factors in its composition. One of these factors is phytohemagglutinin (PHA), a lectin capable of causing intoxication in humans and animals. Intoxication occurs by ingestion of unprocessed grains. Cooking is the most used method for the denaturation of antinutritional factors such as PHA. Intoxication is widely studied in monogastric humans and animals, however, studies on ruminants are scarce. The follow up of an outbreak of natural poisoning by P. vulgaris in buffaloes a few years ago enabled the present project, which aims to deepen some histochemical and immunohistochemical aspects of intoxication in this animal species.

Neuroadaptação de cepa selvagem do CDV em camundongos (Mus musculus) e análise filogenética do gene Hemaglutinina em amostras de campo detectadas no Brasil

O vírus da cinomose canina (CDV) é um relevante patógeno de caninos domésticos e carnívoros selvagens. Pertencente á família Paramyxoviridae e ao gênero Morbillivirus, o CDV constitui o agente etiológico de uma infeção enzoótica mundialmente. Alguns relatos de cães supostamente vacinados que desenvolveram a doença trazem à tona questionamentos sobre a eficácia das formulações vacinais frente às cepas selvagens, levantando algumas hipóteses acerca da evolução do CDV. Com o objetivo de produzir uma linhagem do vírus de CDV capaz de reproduzir a enfermidade em camundongos e analisar o gene da Hemaglutinina do vírus CDV em amostras de campo de cães naturalmente infectados no Brasil, esta dissertação será apresentada na forma de dois artigos científicos. No primeiro, foi proposto o estabelecimento de uma linhagem de CDV neurotrópica para camundongos, capaz de induzir a doença a partir de uma cepa de CDV brasileira selvagem, através de inoculação intracerebral em camundongos Swiss neonatos, observando-se através de análises moleculares que não houve amplificação do material genético viral de interesse. No segundo artigo, amostras clínicas de cães naturalmente infectados no Brasil foram submetidas a um estudo filogenético utilizando o genoma full-lenght da glicoproteína H do CDV, onde foram obtidos cinco isolados distintos: H_CDV_A5_MG, H_CDV_A2_PE, H_CDV_A8_PE, H_CDV_A10_PE, H_CDV_A16_PE, todos agrupados no genogrupo Europa/América do Sul-1, grupo distinto do que abrange as cepas vacinais. Pesquisas de polimorfismos já descritos na literatura foram realizadas nos aminoácidos gerados, onde foi detectada a substituição R580Q nas amostras isoladas de Pernambuco, importante na eficiência da fusão e expressão da superfície proteica da hemaglutinina.

Canine distemper virus (CDV) is a relevant pathogen of domestic canines and wild carnivores. Belonging to the Paramyxoviridae family and the genus Morbillivirus, CDV is the etiologic agent of an enzootic infection worldwide. Some reports of supposedly vaccinated dogs that developed the disease raise questions about the efficacy of vaccine formulations against wild-type strains, raising some hypotheses about the development of CDV. With the objective of producing a CDV virus strain capable of reproducing the disease in mice and analyzing the Hemagglutinin CDV virus gene in field samples from naturally infected dogs in Brazil, this dissertation will be presented in the form of two scientific articles. In the first, it was proposed the establishment of a neurotropic CDV line for mice, capable of inducing the disease from a wild Brazilian CDV strain, through intracerebral inoculation in Swiss neonatal mice, observing through molecular analyzes that there was no amplification of viral genetic material of interest. In the second article, clinical samples of naturally infected dogs in Brazil were submitted to a phylogenetic study using the full-lenght genome of CDV H-glycoprotein, where five different isolates were obtained: H_CDV_A5_MG, H_CDV_A2_PE, H_CDV_A8_PE, H_CDV_A10_PE, H_CDV_A16_PE, all grouped in the genogroup Europe / South America-1, a group distinct from that covering the vaccine strains. Polymorphism studies already described in the literature were performed on the generated amino acids, where the R580Q substitution was detected in samples isolated from Pernambuco, important in the fusion efficiency and expression of the protein surface of hemagglutinin.

Detecção molecular e análise filogenética do gene H de amostras do vírus da cinomose canina em circulação no município de Campinas, São Paulo / Molecular detection and phylogenetic analysis of the gene H from canine distemper virus isolates circulating at the municipality of Campinas, São Paulo

O vírus da cinomose canina (CDV), um Morbillivirus da família Paramyxoviridae, é o agente etiológico de doença neurológica e sistêmica em cães. O diagnóstico laboratorial da infecção requer o isolamento viral ou detecção do material genético do vírus em secreções ou tecidos de cães com suspeita clínica da doença. A diversidade genética entre os isolados de CDV pode ser aferida pelo sequenciamento efilogenia molecular do gene que codifica a hemaglutinina viral (gene H), havendo atualmente um especial interesse em comparar as amostras circulantes a campo com o genogrupo América-1, que abrange as cepas presentes nas vacinas disponíveis no mercado. No presente estudo, foi realizada a detecção molecular do gene H de CDV a partir de amostras biológicas colhidas ante- e post- -mortem de 15 cães com sinais clínicos sugestivos de cinomose na região metropolitana de Campinas, São Paulo. Dez dos 15 cães analisados tiveram ao menos um órgão positivo na detecção molecular e os amplicons obtidos foram submetidos ao sequenciamento nucleotídico seguido de análise filogenética molecular. De forma semelhante ao que já foi reportado para estudo analisando a diversidade do gene H em outros países, a reconstrução filogenética obtida para as amostras de casos de cinomose da região de Campinas demonstrou as mesmas foram agrupadas junto a amostras norte-americanas, europeias e japonesas recentes, em um grupo genético distinto do grupo de amostras clássicas de CDV, nomeado America-1, o qual engloba as estirpes vacinais Snyder Hill, Onderstepoort e Lederle.(AU)

Canine distemper virus (CDV), a Morbillivirus of the family Paramyxoviridae, is the etiological agent of neurological and systemic disease in dogs. The laboratory diagnosis of infection requires viral isolation or detection of genetic material of the virus in secretions or tissues of dogs with clinical suspicion of the disease. The genetic diversity among isolates of CDV can be assessed by sequencing and phylogenetic analysis of the gene that encodes the viral hemagglutinin (H gene), and there is currently a special interest in comparing the strains currently circulating in the field with the genogroup America-1, which comprises strains present in vaccines available in the market. In this study, the molecular detection of CDV gene H was performed from biological samples harvested ante-and post-mortem from 15 dogs with clinical signs suggestive of canine distemper in the metropolitan region of Campinas, São Paulo. Ten of the 15 dogs examined had at least one positive organ under molecular detection and the obtained amplicons were sequenced and further analyzed by molecular phylogenetic analysis. Similarly to what has already been reported on previous studies regarding the diversity of the gene H in other countries, the phylogenetic reconstruction obtained for the samples of cases of distemper from Campinas region showed they were grouped with the North American, European and Japanese newly described samples, a genetic group distinguished from classical samples of CDV, named America-1, which encompasses the vaccine strains Snyder Hill, Onderstepoort and Lederle.(AU)

Isolation and characterization of a pandemic H1N1 influenza virus in pigs in Brazil / Isolamento e caracterização do vírus da influenza pandêmico H1N1 em suínos no Brasil

Influenza A virus (IAV) infections are endemic in pork producing countries around the world. The emergence of the pandemic 2009 human H1N1 influenza A virus (pH1N1) raised questions about the occurrence of this virus in Brazilian swine population. During a 2009-2010 swine influenza virus research project at Embrapa Swine and Poultry (CNPSA), an outbreak of a highly transmissible H1N1 influenza A virus disease was detected in a pig herd in Santa Catarina State, Brazil. The virus caused a mild disease in growing pigs and sows without mortality. Three clinically affected piglets were euthanized. Gross lesions included mild to moderate consolidation of cranioventral areas of the lung. Microscopically, the lesions were characterized by necrotizing obliterative bronchiolitis and bronchointerstitial pneumonia. Immunohistochemistry using a monoclonal antibody against type A influenza virus nucleoprotein revealed positive staining in the nuclei of the bronchiolar epithelial cells. Lung tissue from three piglets and nasal swabs from five sows and four piglets were positive for influenza A by RT-PCR. Influenza virus was isolated from one lung, later confirmed by the hemagglutination test (HA titer 1:128) and RT-PCR. Sequence analyses of Hemmaglutinin (HA) and Matrix (M) genes revealed that the virus was consistent with the pandemic (A/H1N1) 2009 influenza virus strain that circulated in humans. This is the first report of an outbreak of pandemic A/H1N1 influenza virus in pigs in Brazil.

A infecção causada pelo vírus Influenza A (IAV) é endêmica em suínos no mundo inteiro. O surgimento da pandemia de influenza humana pelo vírus A/H1N1 (pH1N1) em 2009 levantou dúvidas sobre a ocorrência deste vírus em suínos no Brasil. Durante o desenvolvimento de um projeto de pesquisa do vírus de influenza suína em 2009-2010, na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA), foi detectado em um rebanho de suínos em Santa Catarina, Brasil, um surto de influenza altamente transmissível causado pelo subtipo viral H1N1. Este vírus causou uma doença leve em suínos em crescimento e em fêmeas adultas, sem mortalidade. Tres leitões clinicamente afetados foram eutanasiados. As lesões macroscópicas incluiam consolidação leve a moderada das áreas cranioventrais do pulmão. Microscopicamente, as lesões foram caracterizadas por bronquiolite necrosante obliterativa e pneumonia broncointersticial. A imunohistoquímica, utilizando um anticorpo monoclonal contra a nucleoproteína do vírus influenza A, revelou marcação positiva no núcleo das células epiteliais bronquiolares. O tecido pulmonar de três leitões e os suabes nasais de cinco fêmeas e quatro leitões foram positivos para influenza A pela RT-PCR. O vírus influenza foi isolado de um pulmão, mais tarde sendo confirmado pelo teste de hemaglutinação (título HA 1:128) e por RT-PCR. A análise das seqüências de nucleotídeos dos genes da hemaglutinina (HA) e proteína da matriz (M) revelou que o vírus isolado foi consistente com o vírus pandêmico A/H1N1/2009 que circulou em humanos no mesmo período. Este é o primeiro relato de um surto de influenza causado pelo vírus pandêmico A/H1N1 em suínos no Brasil.

Isolation and characterization of a pandemic H1N1 influenza virus in pigs in Brazil / Isolamento e caracterização do vírus da influenza pandêmico H1N1 em suínos no Brasil

Influenza A virus (IAV) infections are endemic in pork producing countries around the world. The emergence of the pandemic 2009 human H1N1 influenza A virus (pH1N1) raised questions about the occurrence of this virus in Brazilian swine population. During a 2009-2010 swine influenza virus research project at Embrapa Swine and Poultry (CNPSA), an outbreak of a highly transmissible H1N1 influenza A virus disease was detected in a pig herd in Santa Catarina State, Brazil. The virus caused a mild disease in growing pigs and sows without mortality. Three clinically affected piglets were euthanized. Gross lesions included mild to moderate consolidation of cranioventral areas of the lung. Microscopically, the lesions were characterized by necrotizing obliterative bronchiolitis and bronchointerstitial pneumonia. Immunohistochemistry using a monoclonal antibody against type A influenza virus nucleoprotein revealed positive staining in the nuclei of the bronchiolar epithelial cells. Lung tissue from three piglets and nasal swabs from five sows and four piglets were positive for influenza A by RT-PCR. Influenza virus was isolated from one lung, later confirmed by the hemagglutination test (HA titer 1:128) and RT-PCR. Sequence analyses of Hemmaglutinin (HA) and Matrix (M) genes revealed that the virus was consistent with the pandemic (A/H1N1) 2009 influenza virus strain that circulated in humans. This is the first report of an outbreak of pandemic A/H1N1 influenza virus in pigs in Brazil.(AU)

A infecção causada pelo vírus Influenza A (IAV) é endêmica em suínos no mundo inteiro. O surgimento da pandemia de influenza humana pelo vírus A/H1N1 (pH1N1) em 2009 levantou dúvidas sobre a ocorrência deste vírus em suínos no Brasil. Durante o desenvolvimento de um projeto de pesquisa do vírus de influenza suína em 2009-2010, na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA), foi detectado em um rebanho de suínos em Santa Catarina, Brasil, um surto de influenza altamente transmissível causado pelo subtipo viral H1N1. Este vírus causou uma doença leve em suínos em crescimento e em fêmeas adultas, sem mortalidade. Tres leitões clinicamente afetados foram eutanasiados. As lesões macroscópicas incluiam consolidação leve a moderada das áreas cranioventrais do pulmão. Microscopicamente, as lesões foram caracterizadas por bronquiolite necrosante obliterativa e pneumonia broncointersticial. A imunohistoquímica, utilizando um anticorpo monoclonal contra a nucleoproteína do vírus influenza A, revelou marcação positiva no núcleo das células epiteliais bronquiolares. O tecido pulmonar de três leitões e os suabes nasais de cinco fêmeas e quatro leitões foram positivos para influenza A pela RT-PCR. O vírus influenza foi isolado de um pulmão, mais tarde sendo confirmado pelo teste de hemaglutinação (título HA 1:128) e por RT-PCR. A análise das seqüências de nucleotídeos dos genes da hemaglutinina (HA) e proteína da matriz (M) revelou que o vírus isolado foi consistente com o vírus pandêmico A/H1N1/2009 que circulou em humanos no mesmo período. Este é o primeiro relato de um surto de influenza causado pelo vírus pandêmico A/H1N1 em suínos no Brasil.(AU)

Fatores antinutricionais e coeficientes de digestibilidade aparente da proteína de produtos de soja para o pacu (Piaractus mesopotamicus) / Anti-nutritional factors and protein apparent digestibility coefficients of soybeans sources to pacu (Piaractus mesopotamicus)

Este estudo teve como objetivo determinar as atividades dos inibidores de tripsina, hemaglutinante e teores de taninos no farelo de soja e na soja crua e processada, e avaliar o coeficiente de digestibilidade aparente da fração proteica para juvenis de pacu. Oscoeficientes de digestibilidade aparente da proteína da soja crua, extrusada, tostada e macerada foram determinadas usando óxido de cromo (0,5%) como marcador. Foi elaborada dieta de referência com 26% de proteína bruta e 4.352 kcal kg-1, e a cada alimentoavaliado foram substituídas 30% da dieta-teste. As fezes foram coletadas por pressão abdominal. Todos os produtos analisados apresentaram fatores antinutricionais, mas foiobservada menor atividade de inibidor de tripsina no farelo de soja. Sojas que receberam tratamento térmico apresentaram os melhores coeficientes de digestibilidade e menoresvalores de atividade hemaglutinante do que a soja crua. Não foram observados efeitos dos inibidores de tripsina e taninos sobre o coeficiente de digestibilidade da proteína, mas foiobservada relação negativa entre os teores de hemaglutinina com a digestibilidade da proteína bruta. Para a alimentação do pacu recomenda-se a utilização do farelo de soja e dasoja processada por extrusão ou tostada.(AU)

This study aimed to determine theactivities of trypsin inhibitors, hemagglutinant and tannin levels in soybean meal and in raw andprocessed soy, as well evaluate the protein apparent digestibility coefficient for pacu juveniles. The apparent coefficients of raw, extruded, toasted and milled soy were determined usingchromium oxide (0.5%) as marker. A reference diet was created with 26% crude protein and 4,352 kcal kg-1, with each feed containing 30% of the test diet. Feces were collected by abdominalpressure. All analyzed products presented anti-nutritional factors, but the lowest trypsin inhibitoractivity was observed in soybean meal. Soy that received thermal treatment presented better digestibility coefficients and lower hemagglutinating activity values than raw soy. No effects of trypsin and tannin inhibitor were observed on the protein digestibility coefficient, but a negative relationship was observed between hemagglutinin levels and protein digestibility coefficient. The use of soybean meal and extruded or toasted soy is recommended for pacu feeding.(AU)

Fatores antinutricionais e coeficientes de digestibilidade aparente da proteína de produtos de soja para o pacu (Piaractus mesopotamicus) / Anti-nutritional factors and protein apparent digestibility coefficients of soybeans sources to pacu (Piaractus mesopotamicus)

Este estudo teve como objetivo determinar as atividades dos inibidores de tripsina, hemaglutinante e teores de taninos no farelo de soja e na soja crua e processada, e avaliar o coeficiente de digestibilidade aparente da fração proteica para juvenis de pacu. Oscoeficientes de digestibilidade aparente da proteína da soja crua, extrusada, tostada e macerada foram determinadas usando óxido de cromo (0,5%) como marcador. Foi elaborada dieta de referência com 26% de proteína bruta e 4.352 kcal kg-1, e a cada alimentoavaliado foram substituídas 30% da dieta-teste. As fezes foram coletadas por pressão abdominal. Todos os produtos analisados apresentaram fatores antinutricionais, mas foiobservada menor atividade de inibidor de tripsina no farelo de soja. Sojas que receberam tratamento térmico apresentaram os melhores coeficientes de digestibilidade e menoresvalores de atividade hemaglutinante do que a soja crua. Não foram observados efeitos dos inibidores de tripsina e taninos sobre o coeficiente de digestibilidade da proteína, mas foiobservada relação negativa entre os teores de hemaglutinina com a digestibilidade da proteína bruta. Para a alimentação do pacu recomenda-se a utilização do farelo de soja e dasoja processada por extrusão ou tostada.

This study aimed to determine theactivities of trypsin inhibitors, hemagglutinant and tannin levels in soybean meal and in raw andprocessed soy, as well evaluate the protein apparent digestibility coefficient for pacu juveniles. The apparent coefficients of raw, extruded, toasted and milled soy were determined usingchromium oxide (0.5%) as marker. A reference diet was created with 26% crude protein and 4,352 kcal kg-1, with each feed containing 30% of the test diet. Feces were collected by abdominalpressure. All analyzed products presented anti-nutritional factors, but the lowest trypsin inhibitoractivity was observed in soybean meal. Soy that received thermal treatment presented better digestibility coefficients and lower hemagglutinating activity values than raw soy. No effects of trypsin and tannin inhibitor were observed on the protein digestibility coefficient, but a negative relationship was observed between hemagglutinin levels and protein digestibility coefficient. The use of soybean meal and extruded or toasted soy is recommended for pacu feeding.

A semi-nested RT-PCR assay targeted to hemagglutinin-esterase gene of Bovine Coronavirus / Reação de hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene da hemaglutinina-esterase do Coronavírus Bovino

Bovine coronavirus (BCoV) is a non-segmented positive-sense single-stranded RNA virus whose envelope is constituted by a lipid bilayer with four structural proteins (HE, S, E and M) giving its characteristic crown-like virions appearance. Hemagglutinin-esterase (HE), is a polymorphic protein with a function of secondary receptor binder, and studies on the diversity of HE gene allow insights on BCoV evolution and host-parasite interactions. A semi-nested RT-PCR was developed for the amplification of a 441bp-long product of the HE gene of BCoV (nt 543 to 562). Optimal annealing temperatures were tested in a gradient thermocycler for the semi-nested assay and employed in the final protocol. The analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titer: 256) in a BCoV-free fecal suspension, with positive results up to 10-6 dilution, a high analytical sensitivity without PCR inhibition. The final semi-nested RT-PCR protocol was applied to 21 fecal samples of cows previously positive to BCoV and DNA sequencing of the 441bp amplicons of 14 of these resulted in highly-scored BCoV HE gene sequences after BLAST/n analysis. This semi-nested RT-PCR is a powerful tool for surveys of phylogenetic diversity in field strains of BCoV and for comparative studies among different genes of Coronavirus.(AU)

O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus RNA simples fita, de sentido positivo, não segmentado com envelope constituído de uma camada dupla de lipídios com quatro proteínas (HE, S, E e M) que resultam no aspecto de coroa dos vírions. Como a HE (hemaglutinina-esterase) é uma proteína polimórfica com uma função de receptor aglutinante secundária, estudos sobre a diversidade do gene HE podem possibilitar maiores informações sobre a evolução e interação hospedeiro-parasita do BCoV. Uma reação de hemi-nested RT-PCR foi desenvolvida para a amplificação de um produto de 441pb do gene HE do BCoV (nt 543 ao 562). Temperaturas ótimas de hibridização foram testadas em um termociclador com gradiente para a reação de hemi-nested e utilizada no protocolo final. A sensibilidade analítica foi determinada por meio da diluição serial na base 10 do BCoV amostra Kakegawa (título HA: 256) em uma suspensão fecal negativa para BCoV, resultando positiva até a diluição de 10-6, mostrando uma alta sensibilidade analítica sem inibição na PCR. O protocolo final da hemi-nested RT-PCR foi aplicado a 21 amostras fecais de vacas previamente positivas para BCoV e o sequenciamento de DNA do produto de 441pb de 14 amostras resultaram em sequências com elevado escore do gene HE do BCoV após a análise no BLAST/n. Essa hemi-nested RT-PCR é uma ferramenta poderosa para estudos de diversidade filogenética de linhagens de campo de BCoV e para estudos comparativos entre os diferentes genes dos Coronavírus.(AU)

Um estudo sobre a diversidade molecular dos genes S e HE de Coronavírus bovino (BCoV) / A study on the molecular diversity of S and HE genes of Bovine coronavirus (BCoV)

Coronavírus bovino (BCoV) é o agente causador de doença, tanto entérica como respiratória em bovinos, mas até agora existem controvérsias sobre a relação genealógica entre as amostras de BCoV em diferentes tecidos. Neste estudo, amostras de fezes e secreções nasais de 14 vacas de um mesmo rebanho apresentando simultaneamente disenteria epizoótica e doença respiratória foram estudados quanto a presença de BCoV. As amostras virais detectadas tiveram tanto o gene de espícula (S) como o gene hemaglutinina-esterase (HE) parcialmente sequenciados. Para o gene HE, foram obtidas 12 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes e para o gene S, foram obtidas 14 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes, com 100% de identidade nucleotídica para cada gene para as amostras deste estudo. Estes resultados apresentam algumas divergências com estudos anteriores os quais relatam que linhagens diferentes de BCoV podem ser esperados em casos de disenteria e doença respiratória em vacas, pois linhagens com sequências idênticas dos genes S e HE podem não mostrar diferenças em relação tropismo pelos diferentes tecidos. Sequências completas de duas amostras brasileiras de BCoV mostram que o já descrito padrão filogeográfico baseado no sequenciamento do gene S parcial foi mantido, foram encontradas substituições de aminoácidos específicos.

Bovine coronavirus (BCoV) is the causative agent of both enteric and respiratory disease in cattle, but hitherto there were some controversy on the genealogic relationship amongst strains from these different tissues. In this study, samples of feces and nasal secretions of 14 cows from a same herd simultaneously presenting epizootic dysentery and respiratory disease were screened for BCoV and the strains detected had both the spike (S) and hemagglutinin-esterase (HE) genes partially sequenced. For HE gene, 12 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained and for S gene, 14 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained, with 100% nucleotide identities for each gene for the strains of this study. These results have some disagreements with previous reports which try to put forward that divergent BCoV strain should be expected in cases of dysentery and respiratory disease in cows, showing that strain with identical S and HE sequences might show no differences in tropisms. Complete S gene sequences of two Brazilian BCoV strains show that the already described phylogeographic pattern based on partial S gene is sustained, though specific amino acids subtitutions are found.

Um estudo sobre a diversidade molecular dos genes S e HE de Coronavírus bovino (BCoV) / A study on the molecular diversity of S and HE genes of Bovine coronavirus (BCoV)

Coronavírus bovino (BCoV) é o agente causador de doença, tanto entérica como respiratória em bovinos, mas até agora existem controvérsias sobre a relação genealógica entre as amostras de BCoV em diferentes tecidos. Neste estudo, amostras de fezes e secreções nasais de 14 vacas de um mesmo rebanho apresentando simultaneamente disenteria epizoótica e doença respiratória foram estudados quanto a presença de BCoV. As amostras virais detectadas tiveram tanto o gene de espícula (S) como o gene hemaglutinina-esterase (HE) parcialmente sequenciados. Para o gene HE, foram obtidas 12 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes e para o gene S, foram obtidas 14 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes, com 100% de identidade nucleotídica para cada gene para as amostras deste estudo. Estes resultados apresentam algumas divergências com estudos anteriores os quais relatam que linhagens diferentes de BCoV podem ser esperados em casos de disenteria e doença respiratória em vacas, pois linhagens com sequências idênticas dos genes S e HE podem não mostrar diferenças em relação tropismo pelos diferentes tecidos. Sequências completas de duas amostras brasileiras de BCoV mostram que o já descrito padrão filogeográfico baseado no sequenciamento do gene S parcial foi mantido, foram encontradas substituições de aminoácidos específicos. (AU)

Bovine coronavirus (BCoV) is the causative agent of both enteric and respiratory disease in cattle, but hitherto there were some controversy on the genealogic relationship amongst strains from these different tissues. In this study, samples of feces and nasal secretions of 14 cows from a same herd simultaneously presenting epizootic dysentery and respiratory disease were screened for BCoV and the strains detected had both the spike (S) and hemagglutinin-esterase (HE) genes partially sequenced. For HE gene, 12 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained and for S gene, 14 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained, with 100% nucleotide identities for each gene for the strains of this study. These results have some disagreements with previous reports which try to put forward that divergent BCoV strain should be expected in cases of dysentery and respiratory disease in cows, showing that strain with identical S and HE sequences might show no differences in tropisms. Complete S gene sequences of two Brazilian BCoV strains show that the already described phylogeographic pattern based on partial S gene is sustained, though specific amino acids subtitutions are found. (AU)

Produção de antígenos recombinantes do vírus da doença de Newcastle para aplicação no imunodiagnóstico

Foi realizada a clonagem e expressão do gene da glicoproteína HN da estirpe La Sota do vírus da doença de Newcastle (VDN), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina no sistema hospedeiro constituído por leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae, que apesar de tentativas de otimização, não evidenciou a expressão da proteína recombinante. Após isso, foram produzidas as porções N-terminal e C-terminal da glicoproteína HN como proteínas recombinantes de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o peptídeo SUMO no sistema hospedeiro constituído pela bactéria Escherichia coli. Contatou-se que o sistema procarioto de expressão foi mais eficiente e permitiu a geração de dois peptídeos, que depois de devidamente caracterizados e purificados foram utilizados como antígenos para a realização de testes de imunodiagnóstico em sustituição aos kits comerciais utilizados atualmente. Foram desenvolvidos dois ensaios de ELISA baseados na adsorção de um antígeno formado pela expressão da porção N-terminal da glicoproteína HN (ELISA HN N-terminal) e na porção C-terminal da mesma glicoproteína (ELISA HN C-terminal), recuperados a partir da purificação da fração solúvel de culturas de E. coli. O ELISA C-terminal mostrou os melhores coeficientes de correlação com o teste padrão HI e com o teste S-ELISA-ConA, além de melhores índices de sensibilidade, especificidade e acurácia. Com isso, o ELISA baseado em um antígeno da porção C-terminal da glicoproteína HN e uma única diluição do soro desenvolvido neste estudo pode ser aplicado no diagnóstico e monitoramento pós-vacinal do VDN

Was carried out the cloning and expression of the glycoprotein gene of the strain La Sota HN of the Newcastle disease virus (NDV), as a recombinant fusion protein containing a poly-histidine tail at the host system consisting of the yeast species Saccharomyces cerevisiae, which despite attempts at optimizing, showed no expression of recombinant protein. After that, the portions N-terminal and C-terminal from glycoprotein HN were produced as recombinant proteins containing a fusion tail and the poly-histidine peptide SUMO at the host system consisting of Escherichia coli. It was noted that the prokaryotic expression system was more efficient and allowed the generation of two peptides, which once characterized and purified were used as antigens for immunodiagnostic tests replacement in the commercial kits currently used. Were developed two ELISA assays based on the adsorption of the antigen formed by expression of the N-terminal portion of the HN glycoprotein (HN ELISA N-terminal) and the C-terminal portion of the same glycoprotein (HN ELISA C-terminus), recovered from purification of the soluble fraction of cultures of E. coli. The C-terminal ELISA showed the best correlation coefficients with the standard HI test and ELISA test S-ConA-, and higher sensitivity, specificity and accuracy. Therefore, the ELISA of the antigen based on a C-terminal portion of the glycoprotein HN and a single serum dilution developed in this study can be applied in the diagnosis and monitoring of post-vaccination VDN

Hemagglutinating properties of Salmonella enterica serovar Enteritidis isolated from different sources

Twenty-five strains of Salmonella enterica serovar Enteritidis isolated from different sources were examined for hemagglutinating activity. Bacteria cultured in different media induced hemagglutination of human erythrocytes, but no reaction was observed with erythrocytes from other animal species. The hemagglutinating expression activity was better for cultures on CFA agar at 37ºC than other conditions examined. The hemagglutination was inhibited by D-mannose, D-mannitol, melibiose, D-raffinose, L-rhamnose and sucrose. The absence of cell-surface appendages in electron microscope examinations suggested a nonfimbrial hemagglutinin. The data suggest that Salmonella Enteritidis produces nonfimbrial mannose-sensitive hemagglutinin, specific for human erythrocytes, which could be extracted in soluble form.

Foram estudadas 25 amostras de Salmonella enterica sorotipo Enteritidis isoladas de diferentes fontes, em testes de hemaglutinação. Amostras bacterianas cultivadas em diferentes meios de cultura causavam hemaglutinação na presença de hemácias humanas, entretanto, não foi observada reação com hemácias de outras espécies. A expressão da atividade hemaglutinante foi melhor em ágar CFA a 37ºC. A hemaglutinação foi inibida por D-manose, D-manitol, melibiose, D-rafinose, L-ramnose e sacarose. A análise ultraestrutural não revelou a presença de estruturas filamentosas na superfície bacteriana, sugerindo que a hemaglutinina de Salmonella Enteritidis seja de natureza não fimbrial. Os dados sugerem que Salmonella Enteritidis produz uma hemaglutinina não fimbrial manose-sensível, específica para hemácias humanas, que pode ser extraída na forma solúvel.

Hemagglutinating properties of Salmonella enterica serovar Enteritidis isolated from different sources

Twenty-five strains of Salmonella enterica serovar Enteritidis isolated from different sources were examined for hemagglutinating activity. Bacteria cultured in different media induced hemagglutination of human erythrocytes, but no reaction was observed with erythrocytes from other animal species. The hemagglutinating expression activity was better for cultures on CFA agar at 37ºC than other conditions examined. The hemagglutination was inhibited by D-mannose, D-mannitol, melibiose, D-raffinose, L-rhamnose and sucrose. The absence of cell-surface appendages in electron microscope examinations suggested a nonfimbrial hemagglutinin. The data suggest that Salmonella Enteritidis produces nonfimbrial mannose-sensitive hemagglutinin, specific for human erythrocytes, which could be extracted in soluble form.

Foram estudadas 25 amostras de Salmonella enterica sorotipo Enteritidis isoladas de diferentes fontes, em testes de hemaglutinação. Amostras bacterianas cultivadas em diferentes meios de cultura causavam hemaglutinação na presença de hemácias humanas, entretanto, não foi observada reação com hemácias de outras espécies. A expressão da atividade hemaglutinante foi melhor em ágar CFA a 37ºC. A hemaglutinação foi inibida por D-manose, D-manitol, melibiose, D-rafinose, L-ramnose e sacarose. A análise ultraestrutural não revelou a presença de estruturas filamentosas na superfície bacteriana, sugerindo que a hemaglutinina de Salmonella Enteritidis seja de natureza não fimbrial. Os dados sugerem que Salmonella Enteritidis produz uma hemaglutinina não fimbrial manose-sensível, específica para hemácias humanas, que pode ser extraída na forma solúvel.

Cloning, sequencing, expression, and characterization of the tsh gene from an avian pathogenic Escherichia coli strain / Clonagem, sequenciamento, expressão e caracterização do gene tsh de uma cepa de Escherichia coli patogênica de aves

The temperature-sensitive hemagglutinin (Tsh) belongs to a family of high-molecular-weight serine protease autotransporters of Enterobacteriaceae (SPATEs), which can cleave different substrates. We isolated and characterised the tsh gene from an avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strain, APEC13 serotype O2:H9, which was cloned in pET101. The 4.2 kb region of cloned DNA coded one protein of approximately 140 kDa (r-Tsh). The recombinant plasmid pET101-tsh conferred to E. coli BL21 strain (tsh) the hemagglutination-positive phenotype against chicken erythrocytes. The r-Tsh was purified by Ni-NTA column and used to produce antibody anti-Tsh. A 1.6 kb fragment of the tsh sequence was also amplified and cloned in pCR4, and a partial sequence showed high homology with other sequence analysed. The anti-Tsh reacted with the protein r-Tsh and native Tsh of APEC13, as demonstrated by Western blot, showing that r-Tsh has conserved epitopes and that its antigenicity was preserved. The anti-Tsh also inhibited the hemagglutinating activity of strains APEC13 and BL21/pET101-tsh.

A hemaglutinina temperatura sensível (Tsh) pertence à família das serino-proteases autotransporte de Enterobacteriacea (SPATE), as quais são capazes de clivar diferentes substratos. Nós isolamos e caracterizamos o gene de Escherichia coli patogênica aviária (APEC) amostra APEC 13, sorotipo O2:H9,clonado em pET101. A região de 4.2 kb do DNA clonado codifificou uma proteína de aproximadamente 140 kDa (r-Tsh). O plasmídio recombinante pET101-tsh conferiu um fenótipo de hemaglutinação positivo para a linhagem BL21 (tsh-) para eritrócitos de galinha. A proteína r-Tsh foi purificada em coluna de níquel e utilizada na produção de anticorpos anti-Tsh. Um fragmento de 1.6 kb foi amplificado e subclonado em pCR4, e a seqüência parcial mostrou alta homologia com outras seqüências analisadas. O anti-Tsh reagiu com as proteínas r-Tsh e Tsh nativa da amostra APEC13, como demonstrado pela técnica de Western blot, mostrando que a r-Tsh tem epitopos conservados e que sua antigenicidade foi preservada. O anti-Tsh também inibiu a atividade hemaglutinante das amostras APEC13 e BL21/pET 101-tsh.