AVALIAÇÃO IN VITRO DO POTENCIAL FAGOCITÁRIO DE CÉLULAS GIGANTES TUMORAIS DO HISTIOCITOMA FIBROSO MALIGNO CANINO

O Histiocitoma Fibroso Maligno é uma neoplasia incomum em cães, mas que pode surgir em vários tipos de tecidos do organismo e possui um prognóstico desfavorável, o que faz com que estudos avançados a seu respeito se tornem relevantes. O objetivo do presente trabalho foi investigar o potencial fagocítico de células do histiocitoma fibroso maligno canino e compará-lo com o de macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico. Como ferramentas de estudo, foram utilizadas células DH82 originadas de um histiocitoma canino, na forma mononucleada e que receberam interleucina 4 (IL-4) adicionada ao meio de cultivo para formação de sua forma gigante multinucleada Com o intuito de avaliar o potencial fagocítico desse tipo celular neoplásico, essas células foram expostas a partículas de Zymosan conjugadas a molécula fluorescente FITC, e adquiridas em citômetro de fluxo. A citometria permitiu determinar a porcentagem de células que internalizaram ou não as partículas. Como resultado do experimento foram obtidos uma média de 69,2% de células mononucleares que fagocitaram as partículas de Zymosan e de 76,6% de células gigantes com esse mesmo potencial, não havendo diferença significativa entre as duas formas da célula. Com essa pesquisa foi possível determinar que o potencial fagocítico de suas células originárias, os monócitos, está presente nas células DH82 e DH82 gigantes, potencial este que provavelmente seja responsável, pelo menos em parte, pelo prognóstico desfavorável dessa doença.

Malignant Fibrous Histiocytoma is an uncommon neoplasm in dogs, but it can appear in many types of tissues in the body and has an unfavorable prognosis, making advanced studies of it relevant. As study tools, DH82 cells from an original dog histiocitoma in their mononuclear form and received inoculation of interleukin 4 (IL 4) in the culture medium, to become multinucleate giant DH82 cells. In addition, normal monocytes were collected from the peripheral whole blood of a healthy dog, also cultured in both forms, for comparison with the neoplastic cells. In order to evaluate the phagocytic potential of this neoplastic cell type, these cells were exposed to Zymosan particles conjugated to fluorescent molecule FITC and acquired on a flow cytometer. Cytometry allowed determining the percentage of cells that internalized or not the particles. As a result of the experiment, a mean of 69,2% of mononuclear cells that phagocytosed and 76,6% of giant cells with this same potential were obtained, since there was no difference between the two types of cells. With this research, it was possible to determine that the phagocytic potential of its original cells, monocytes, is present in DH82 and multinucleate giant DH82 cells, which showed that this potential is probably responsible, at least in part for the unfavorable prognosis of this disease.

Uso do probiótico mananoligossacarídeo para cordeiros recebendo ração com alto teor de concentrado

Objetivou-se com esse estudo avaliar o efeito de mananoligossacarídeo (Brown et al.) sobre a saúde do trato gastrintestinal e desempenho de cordeiros em terminação. Os cordeiros (20 machos e 8 fêmeas) mestiços (Santa Inês X Dorper) com peso médio de 23 kg (± 4,13 kg) foram alocados em baias individuais, consumindo dieta peletizada contendo 17% feno (Cynodon dactylon L) e 83% de concentrado com adição de MOS, nas doses de 0, 5, 10 e 15 gramas por dia por animal. Não foi observado diferenças para ganho de peso. Entretanto, o consumo de matéria seca (Brown et al.) apresentou efeito quadrático à inclusão de MOS (1,31; 1,19; 1,21; 1,36 kg MS-1 dia, respectivamente). A digestibilidade da matéria seca (Brown et al.) e orgânica (MO) foi afetada pela inclusão de MOS, com menores digestibilidade quando o consumo de MS foi maior. A menor digestibilidade dos carboidratos não fibrosos foi a principal causa da menor digestibilidade da MS e MO. A inclusão de MOS em dieta com alta inclusão de CNF não é capaz de reduzir a presença de células vacuolizadas, hiperqueratose e paraqueratose no tecido do rúmen. A contagem de monócitos do sangue reduziu linearmente com a inclusão de MOS na dieta. Conclui-se que a inclusão de até 15g de MOS/dia por animal não afetou as variáveis de desempenho animal de cordeiros confinados, nem as avaliações de tecido do rúmen.

The objective of this work was to evaluate the effects of mannan oligosaccharides (Brown et al.) on the performance of finishing lambs. Twenty eight (20 male and 8 female) crossbred lambs (Santa Inês × Dorper) 23 kg BW (±4,13) were housed in individual pens and fed with a pelleted diet containing 17% of grass hay (Cynodon dactylon L) and 83% of concentrates, supplemented with 0, 5, 10 or 15 g/d of MOS per animal. Daily weight gain was not affected by MOS in diet. However, the dry matter (DM) intake presented a quadratic trend with MOS addition (1.31, 1.19, 1.21 and 1.36 kg/d, respectively). Dry matter and organic matter (OM) digestibility were also affected quadratically by MOS, with lower digestibility matching higher DM intake values. Lower digestibility of non-fiber carbohydrates was the main cause of reduced DM and OM digestibility. The supplementation with MOS increased the intensity of vacuolated cells, parakeratosis and hyperkeratosis in the rumen epithelium. Counts of blood monocytes decreased linearly with MOS supplementation. In conclusion, supplementation with up to 15 g/d of MOS per animal did not affect the performance of confined finishing lambs.

ESTUDO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES E POLIMORFONUCLEARES NO INTESTINO DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania infantum

O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo descritivo sobre o perfil das células granulocíticas e monocíticas na mucosa intestinal de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum, na presença ou na ausência do parasita no intestino. Além disso, realizou-se um estudo de correlação entre a intensidade parasitária e os fatores clínicos do hospedeiro, as células envolvidas e as alterações histopatológicas da parede intestinal. Dos 39 cães avaliados, somente 20 foram utilizados no estudo, sendo, 17 positivos para leishmaniose visceral canina (LVC) e três negativos. Os animais com LVC foram eutanasiados no Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Ilha Solteira, SP, Brasil, e os negativos vieram a óbito natural por motivos diversos. As técnicas de histoquímica e imunoistoquímica foram utilizadas para marcar as células estudadas, identificar as amastigotas de Leishmania e auxiliar nas análises histopatológicas do trato intestinal. Os cães foram divididos em três grupos (G1, G2 e G3). Oito cães positivos para LVC e com amastigotas de L. infantum no intestino foram selecionados para o grupo G1; nove cães positivos para LVC sem amastigotas intestinais para o grupo G2 e, três cães negativos compuseram o grupo controle (G3). Todos os animais não apresentaram coinfecção parasitária gastrintestinal, mediante exames coproparasitológicos realizados in vivo ou pos-morten. As variáveis clínicas dos animais, a intensidade parasitária e a presença das células mononucleares (linfócitos T CD4+, CD8+ e macrófagos) foram avaliadas por uma classificação semiquantitativa baseada em escores que variaram de 1 a 4. Já as células granulocíticas (neutrófilos, eosinófilos e mastócitos) foram quantificadas na mucosa (unidade de vilo e cripta - UVC), submucosa e na muscular. Para as análises de comparação entre os grupos (G1, G2 e G3), o teste de KrusKal-Wallis foi empregado para avaliar as váriaveis clínicas, o teste t para células granulocíticas, e o teste de Duncan para comparar as células monocíticas. As análises de correlação foram baseadas no teste de Spearman (dados semiquantitativos) e no coeficiente de correlação linear de Pearson (dados quantitativos). Formas amastigotas de L. infantum foram detectadas em 40% dos animais (8/20) e estavam distribuídas na lâmina própria da mucosa (vilosidades e criptas), submucosa e na camada muscular do intestino delgado e na mucosa e submucosa do intestino grosso. A reação inflamatória mais destacada no grupo G1 foi caracterizada por infiltrado crônico de células mononucleares, principalmente macrófagos, linfócitos e plasmócitos. Embora os cães do grupo G1 estivessem mais clinicamente comprometidos, não diferiram estatisticamente do grupo G2 em todas as variáveis estudadas, principalmente ao nível da mucosa intestinal, mas apresentaram diferenças significativas em relação ao grupo (G3). Além disso, no grupo G1, houve correlação positiva e significativa entre a intensidade parasitária, as alterações estruturais microscópicas da mucosa e os sinais clínicos sistêmicos. De acordo com a análise das células granulocíticas (neutrófilos, eosinófilos e mastócitos), foi observado um aumento significativo (p 0,05) nos animais do grupo G2, seguido pelos animais do grupo G1, em relação aos controles. Os polimorfonucleares (neutrófilos e eosinófilos) apresentaram-se em maior quantidade no intestino delgado do que no intestino grosso. Já os mastócitos e eosinófilos apresentaram correlação positiva entre si por todo o trato intestinal. As células T CD4+ foram pouco expressivas nos três grupos avaliados, não apresentando diferença significativa (p 0,05) entre eles. No entanto, ocorreu aumento significativo 18 de linfócitos T CD8+ e de macrófagos no grupo G1 em relação aos grupos G2 e G3, principalmente nos órgãos mais infectados por amastigotas de L. infantum, como o duodeno e o cólon. A intensidade parasitária por L. infantum no intestino grosso esteve correlacionada negativamente com as células T CD4+, e positivamente com os linfócitos T CD8+ e macrófagos. Em conclusão, os cães polissintomáticos para LVC do grupo G1 demonstraram alterações microscópicas na mucosa intestinal, marcada por processos inflamatórios associados com a proliferação de células mononucleares como macrófagos e linfócitos T CD8+. Já os cães polissintomáticos do grupo G2 apresentaram uma hiperplasia de células granulocíticas sugerindo uma possível infecção secundária por agentes não parasitários. Concluiu-se ainda que a doença LVC pelo seu caráter debilitante e imunossupressor pode comprometer a homeostasia intestinal, indireta ou diretamente pela presença de formas amastigotas de L. infantum correlacionadas com alguns sinais clínicos específicos da doença e com alterações patológicas na mucosa intestinal.

The aim of this study was a descriptive evaluation on the profile of granulocytic and monocytes cells in the intestines of dogs naturally infected by Leishmania infantum in the presence or absence of the parasite in the intestine. In addition, i t was performed a correlation study among parasite intensity, clinical factors of the host, the cells and the histopathological changes of the intestinal wall. 39 dogs were evaluated, but only 20 were used in the studies, 17 positive for canine visceral leishmaniasis (CVL) and three negative. The animals with CVL were euthanized in the Zoonosis Control Center (CCZ) of Ilha Solteira, SP, Brazil, and the negative animals had natural death for several reasons. The histochemical and immunohistochemical techniques were used to stain the cells and Leishmania amastigotes, and to proceed the histopathological analysis of the intestinal tract. The dogs were divided into three groups (G1, G2 and G3). Eight dogs positive for CVL and with amastigotes of L. infantum in the gut was selected to G1 group; nine CVL positive dogs without intestinal amastigotes were in G2 group and three negative dogs in the control group (G3). All animals showed no gastrointestinal parasite coinfection by coproparasitological examinations in vivo or post-mortem. Clinical variables of the animals, the parasite intensity, the presence of monocytic cells (CD4+ and CD8+ T lymphocytes and macrophages) were evaluated by a semiquantitative analysis based on scores ranging from 1 to 4. However, granulocytic cells (neutrophils, eosinophils, and mast cells) was quantified in the mucosa (villus and crypt unit - UVC), submucosa and muscle. For comparison analysis between groups (G1, G2 and G3), the Kruskal-Wallis test was used to evaluate the clinical variables, the t test for granulocytic cells, and Duncan's test to compare the monocytic cells. Correlation analyzes were based on Spearman test (semiquantitative data) and linear correlation coefficient of Pearson (quantitative data). Amastigote forms of L. infantum were detected in 40% animals (8/20) and was distributed in the lamina propria of mucosa (villi and crypts), submucosal and muscular layers of the small intestine and in the mucosa and submucosa of the colon. The most prominent inflammatory reaction in group G1 was characterized by a chronic infiltration of mononuclear cells, mainly macrophages, lymphocytes and plasma cells. Dogs from G1 group were the most infected; however, there was not statistical difference from G2 group for all variables studied, particularly in the intestinal mucosa, but statistically differed in relation to the control group (G3). In the G1 group, there was a positive and significant correlation between parasite intensity, the microscopic structural changes in the mucosa, and systemic clinical signs. According to the analysis of granulocytic cells (neutrophils, eosinophils and mast cells), a significant increase in numbers of cells was observed (p 0.05) in the G2 group, followed by the animals from G1, compared to control group (G3). There was not statistical difference (p 0.05) in numbers of CD4+ T lymphocytes among groups G1, G2 or G3. However, there was significant increase (p 0.05) of CD8+ T lymphocytes and macrophages in group G1 in relation to G2 and G3 groups, mainly in duodenum and colon, which were the most infected organs by L. infantum. The intensity of infection by L. infantum in the large intestine was negatively correlated with CD4+ T cells and positively with CD8+ T lymphocytes and macrophages. In conclusion, polysymptomatic dogs for CVL (G1) showed microscopic changes in the intestinal mucosa, marked by inflammation associated with the proliferation of mononuclear 20 cells such as macrophages and CD8+ T lymphocytes. The increase of granulocytic cells in dogs from G2 group, suggests a possible infection by other not parasitic agents present in the intestinal wall from these animals. Since the CVL is a debilitate and immunosuppressive disease it can change the intestinal homeostasy, indirect or directly by the presence of intestinal L. infantum amastigotes that was correlated with severe specific clinical signs of the disease and with intestinal mucosal pathological alterations.

AVALIAÇÃO DO INFILTRADO MACROFÁGICO NOS CARCINOMAS MAMÁRIOS DE CADELAS E SUA CORRELAÇÃO COM A TAXA DE SOBREVIDA

O infiltrado inflamatório no microambiente tumoral, em especial nos tumores mamários, tem despertado grande interesse na oncologia, por desempenhar diferentes funções na progressão ou regressão tumoral a depender dos tipos e subtipos celulares envolvidos. O presente estudo objetivou avaliar (1) a presença e intensidade de infiltrado macrofágico no microambiente tumoral; (2) a expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3 nos macrófagos; e (3) a possível relação destes parâmetros com a evolução tumoral e a sobrevida, como um possível fator prognóstico em cadelas portadoras de carcinomas mamários. Foram estudadas 22 cadelas com diagnóstico histopatológico de carcinoma em tumor misto benigno de mama (CaTMB), divididas em dois grupos, sendo G1 constituído por cadelas sem metástase (11) e G2 com metástase (11); em G1 e G2 os animais foram subclassificados de acordo com a utilização ou não do tratamento quimioterápico. As cadelas foram submetidas a análise clínico-patológica (tamanho do tumor; presença de metástase em linfonodo; estadiamento clínico; graduação histológica; distribuição e intensidade do infiltrado inflamatório; quantificação e verificação do estado de ativação de macrófagos no infiltrado por análise imunoistoquímica da expressão de SOCS1 e SOCS3), imunofenotipagem de leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo com marcadores celulares CD14, MHCI e MHCII, e avaliação da taxa de sobrevida. A morfometria do infiltrado inflamatório associado ao tumor revelou, em todos os grupos, predominância da distribuição multifocal e intensidade moderada. A maior proporção de macrófagos no infiltrado inflamatório (400) foi associada a uma maior taxa de sobrevida. A imunomarcação revelou maiores proporções de macrófagos SOCS3 positivos nas cadelas que não apresentavam metástases para linfonodo, enquanto que os macrófagos SOCS1 positivos predominaram nas cadelas com metástase (p<0,05). Adicionalmente, a análise multivariada revelou associações entre estadiamento clínico, graduação histológica, sobrevida, tratamento quimioterápico e expressão de moléculas MHCI em monócitos circulantes. Os resultados das análises quantitativa e qualitativa dos macrófagos no infiltrado inflamatório indicam que o estado de ativação, sugerido pela maior expressão das proteínas SOCS3 e 1, define a relação do infiltrado macrofágico com a resposta imune antitumoral ou com a progressão tumoral associada ao desenvolvimento de metástases, respectivamente.

The inflammatory infiltrate in the tumor microenvironment, particularly in breast tumors, has aroused great interest in oncology due to their different roles in tumor progression or regression depending on the types and cell subsets involved. The objective of this study was to evaluate the presence and intensity of macrophage infiltrate in the tumor microenvironment; the expression of SOCS1 and SOCS3 proteins in these macrophages; and the relation of the former parameters to tumor development and survival, as possible prognostic factors of breast carcinomas evolution in female dogs. Were studied 22 female dogs with histopathological diagnosis of carcinoma in benign mixed tumor (CaTMB), divided into two groups consisting of animals without metastasis (G1=11) and animals with metastasis (G2=11); in G1 and G2, the dogs were graded according with the use or not of chemotherapy. All animals underwent clinicopathological analysis (tumor size, lymph node metastasis, clinical stage, histological grade, distribution and intensity of the inflammatory infiltrate, especially macrophages, as well as their possible activation state by immunohistochemical analysis anti-SOCS1 and anti-SOCS3) immunophenotyping by flow cytometry of PBMC for cell markers CD14, MHCI and MHCII, and assessment of survival rate. The morphology of the inflammatory infiltrate associated with tumor showed, in all groups, prevalence of multifocal distribution and moderate intensity. The higher intensity of the macrophage infiltrate (400) was associated with a higher survival rate. The immunostaining revealed a higher proportion of positive macrophages for SOCS3 in dogs who had no metastasis to lymph node, while the positive SOCS1 macrophages predominated in animals with metastases (p <0.05). In addition, the multivariate analysis revealed associations between clinical staging, graduation, survival, chemotherapy and expression of MHCI molecules in circulating monocytes. The results obtained in the present study indicated that the activation state, suggested by expression of SOCS3 and 1 proteins, defines the relationship of the macrophage infiltration with antitumor or immune response to tumor progression associated with the development of metastasis, respectively.

Monócitos e mastócitos peritoneais na doença inflamatória do cólon, em ratos

In order to determine the behavior of monocytes and mast cells in the free peritoneum in the presence of inflammatory disease of the colon, cells known to participate actively in the inflammatory process, ulcerative colitis was induced in rats with 10% acetic acid. Twenty Wistar rats were divided into two groups of 10 animals each, controls and animals submitted to the induction of colitis. Macrophages were labeled with Trypan blue and the cells were captured from the free peritoneum after 5 days of evolution of the disease. The number of monocytes/macrophages was 3 times higher in the peritoneal fluid obtained from animals with inflammatory disease than in the controls and the number of mast cells was twice higher (p 0,001). These data permit us to propose that the peritoneum actively participates in the inflammatory process.

Com o objetivo de conhecer o comportamento dos monócitos e mastócitos em peritônio livre na vigência de doença inflamatória do cólon, células que sabe-se participam ativamente do processo inflamatório, colite ulcerativa é induzida em ratos com ácido acético à 10%. Utilizaram-se 20 animais Wistar, 10 para controle e 10 para indução de colite. Os macrófagos são marcados com azul de Tripan e células são capturadas do peritônio livre após 5 dias de evolução. Observou-se que o número de monócitos/macrófagos era 3 vezes maior no líquido peritoneal obtido dos animais com doença inflamatória do que nos seus controles e o número dos mastócitos 2 vezes maior (p 0,001). Estes achados permitem admitir que o peritônio participa ativamente do processo inflamatório.

Aderência e atividade microbicida de monócitos em portadores de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica cirúrgica

Surgical treatment in children suffering from schistosomissis mansoni includes splenectomy; ligature of left gastric vein and auto-implantation of spleen morsels into the greater omentum. The efficacy of this procedure may be responsible for the disappearance of overwhelming post-splenectomy infection (OPSI), in this kind of patients. This condition may be assigned to the lowering of IgM, circulating lymphocytes, properdin and to the absence of tutfsin, which may lead to the deficiency of mono-macrophage activity cells, responsible for bacteria adherence, phagocytosis and its destruction. PURPOSE: To analyze the functional features of the monocytes from young patients, who underwent splenectomy, ligature of left gastric vein and auto-implantation of morsels of spleen tissue on the major omentum. These patients were cared for at - University Hospital - "Serviço de Cirurgia Geral da Criança, Hospital das Clínicas, UFPE", from 1991 to 2000. METHODS: It was analyzed the rates of monocytes in vitro adherence to the solid surface and the generation of O2- radical by the monocytes, stimulated with acetate miristate of phorbol (PMA) and PMA + tuftsin, in 3 groups. The 1st group (AI), constituted by 18 patients with schistosomiasis mansoni in the hepatosplenic form and treated with splenectomy, ligature of left gastric vein and auto-implantation of fragments of spleen tissue on the major omentum; the 2nd group (ESP), formed by 09 patients with schistosomiasis mansoni in the hepatosplenic form who underwent azigo-portal disconnection with splenectomy and the 3rd one (CT) constituted by 12 voluntary teenagers from the same geographic area and with the same socio-economical conditions. RESULTS: There was no significant difference in the monocyte adherence rate among the 3 groups. With regard to the generation of O2- release, the monocytes of patients from AI group had a super oxide generation similar to that of individuals from CT group, and higher than the patients from ESP group. The monocyte treatment with tuftsin did not change the kinetic of the superoxide generation on the 3 groups. CONCLUSIONS: The monocytes of the surgical hepatosplenic schistosomiasis mansoni bearers who underwent splenectomy, ligature of the left gastric vein and auto-implantation of spleen tissue into the major omentum showed functional similar features as comparared to normal people from the same social-economical-geographical conditions.

A cirurgia nas crianças portadoras de esquistossomose mansônica inclui esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e o auto-implante de tecido esplênico no omento maior. A eficácia desse procedimento pode ser responsável pelo desaparecimento da sepse fulminante pós-esplenectomia (SFPE) neste tipo de paciente. Esta condição é atribuída à diminuição de IgM, de linfócitos circulantes, de properdina e ausência de tuftsina, o que conduz a deficiência da atividade das células macrófágicas, que são responsáveis pela aderência à bactéria, fagocitose e destruição das mesmas. OBJETIVO: Analisar os aspectos funcionais dos monócitos destes pacientes, operados quando crianças, no Serviço de Cirurgia Geral da Criança do Hospital das Clínicas da UFPE, entre 1991 a 2000. MÉTODOS: Foram analisados os índices de aderência in vitro dos monócitos e a geração do ânion superóxido (O2-), em três grupos. O 1º, auto-implante (AI), constituído por 18 portadores de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica, submetidos a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior; o 2º, (ESP), formado por nove pacientes similares, submetidos a esplenectomia e desconexão ázigo-portal, e o 3º,(CT), constituído por 12 adolescentes sadios, oriundos da mesma condição sócio-econômica-geográfica. RESULTADOS: Não houve diferença no índice de aderência entre os três grupos. Os monócitos dos pacientes do grupo AI tiveram a geração de O2- semelhante à dos indivíduos do grupo CT, e significantemente maior do que os pacientes do grupo ESP. CONCLUSÕES: Os monócitos dos portadores de esquistossomose hepatoesplênica submetidos a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior se mostram funcionalmente similares aos de indivíduos normais da mesma condição sócio-econômica-geográfica.

Isolamento e identificação de ehrlichia canis em cultura de monócitos de sangue periférico canino

A erliquiose canina é uma doença de prevalência mundial, causada por um microrganismo intracelular obrigatório, a Ehrlichia canis, que infecta células mononucleares, causando doença grave. O presente trabalho teve como objetivo a elaboração do cultivo de monócitos caninos para o isolamento, identificação e criopreservação de E. canis. As células mononucleares de amostras sangue periférico canino heparinizado, foram separadas pelo uso de gradiente de densidade Ficoll Hypaque d=1077 e após ajustar a concentração para 1x106 monócitos viáveis/mL, foram colocadas em suspensão em meio RPMI 1640 enriquecido de 2mM de L-glutamina e 10% de soro bovino fetal e distribuídos em placas de 24 alvéolos e incubados a 37°C em estufa umidificada e tensão constante de 5% de CO2. Os cães infectados por E. canis foram identificados por meio de pesquisa de mórulas em esfregaços sangüíneos e confirmados pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Amostras de sangue de animais infectados foram submetidos ao mesmo protocolo acima descrito para isolamento das células mononucleares e utilizados para infectar culturas de monócitos de cães sadios para isolamento e propagação de E. canis. O período de acompanhamento foi de 30 dias. O tempo de aparecimento das primeiras formas erliquiais variou de dois a 10 dias, havendo propagação com a continuidade da incubação, porém de maneira discreta e variada. A remoção dos monócitos das placas de cultura foi realizada com uso de Lidocaína 0,5%. A criopreservação de monócitos infectados por E. canis foi realizado em freezer ?80°C e nitrogênio líquido, após acrescentar DMSO a 10% em soro bovino fetal. A propagação da E. canis é dependente da dose do parasita inoculada na cultura de monócitos caninos. O emprego de Lidocaína 0,5% é um método eficiente para a remoção e manutenção da viabilidade das células aderentes em placas de culturas de monócitos caninos. A viabilidade das culturas de monócitos infectados com E. canis é mantida após o congelamento em freezer -80°C ou em nitrogênio líquido. A cultura primária de monócitos caninos para isolamento e propagação de E. canis é laboriosa, com dificuldades na separação de células mononucleares e manutenção em cultura, por se tratarem de células com durabilidade limitada