Métodos de coleta de amostra para exame de citologia endometrial em éguas com endometrite / Sample collection methods for endometrial cytology examination in mares with endometritis

A endometrite é definida como uma inflamação do endométrio, podendo ser aguda ou crônica, infecciosa ou não infecciosa. Essa afecção é de grande importância econômica na medicina veterinária, podendo resultar em morte embrionária, aborto e até tornar a égua infértil, sendo uma das afecções que mais comprometem a sanidade uterina, colocando em risco os índices de prenhez obtidos pós-cobertura, pós-inseminação, e pós-inovulação de embriões. Existem diversos métodos para diagnóstico e o mais utilizado a campo é a citologia endometrial/uterina. Também existem algumas formas de coleta de amostra para análise laboratorial pela citologia, tais como: escova ginecológica, swab uterino guiado por mandril metálico ou plástico descartável e lavado uterino de baixo volume, seguido de sedimentação ou centrifugação podendo ser complementada por citocentrifugação. O diagnóstico pela citologia endometrial por meio da técnica da escova ginecológica é a mais utilizada entre os médicos veterinários, pois trata-se de um método prático para execução e rápido quanto à obtenção dos resultados sobre a presença ou não da endometrite, facilitando a conduta terapêutica quanto à utilização das éguas para reprodução ou descarte. Objetivou-se com esse estudo citaras formas de diagnóstico da endometrite em éguas, enfatizando a citologia endometrial e técnicas para obtenção de amostra, identificando a técnica mais indicada por diversos autores.(AU)

Endometritis is defined as an inflammation of the endometrium, which may be acute or chronic, infectious or noninfectious. This condition is of great economic importance in veterinary medicine, and may result in embryonic death, abortion and even render the mare infertile, being one of the conditions that most compromise uterine health, putting at risk the pregnancy rates obtained post-coverage, postinsemination, and post-embryo transfer. There are several methods for diagnosis and the most used in the field is endometrial/uterine cytology. There are also some forms of sample collection for laboratory analysis by cytology, such as: gynecological brush, uterine swab guided by metallic mandrel or disposable plastic and low volume uterine lavage, followed by sedimentation or centrifugation and may be complemented by cytocentrifugation. Diagnosis by endometrial cytology using the gynecological brush technique is the most used among Veterinary Practitioners, because it is a practical method to execute and fast to obtain the results in the presence of endometritis, facilitating the therapeutic conduct regarding the use of mares for breeding or discarding. The objective of this study was to cite the diagnostic methods of endometritis in mares, emphasizing endometrial cytology and its techniques for obtaining a sample, identifying the most indicated technique by several authors.(AU)

Métodos de coleta de amostra para exame de citologia endometrial em éguas com endometrite / Sample collection methods for endometrial cytology examination in mares with endometritis

A endometrite é definida como uma inflamação do endométrio, podendo ser aguda ou crônica, infecciosa ou não infecciosa. Essa afecção é de grande importância econômica na medicina veterinária, podendo resultar em morte embrionária, aborto e até tornar a égua infértil, sendo uma das afecções que mais comprometem a sanidade uterina, colocando em risco os índices de prenhez obtidos pós-cobertura, pós-inseminação, e pós-inovulação de embriões. Existem diversos métodos para diagnóstico e o mais utilizado a campo é a citologia endometrial/uterina. Também existem algumas formas de coleta de amostra para análise laboratorial pela citologia, tais como: escova ginecológica, swab uterino guiado por mandril metálico ou plástico descartável e lavado uterino de baixo volume, seguido de sedimentação ou centrifugação podendo ser complementada por citocentrifugação. O diagnóstico pela citologia endometrial por meio da técnica da escova ginecológica é a mais utilizada entre os médicos veterinários, pois trata-se de um método prático para execução e rápido quanto à obtenção dos resultados sobre a presença ou não da endometrite, facilitando a conduta terapêutica quanto à utilização das éguas para reprodução ou descarte. Objetivou-se com esse estudo citaras formas de diagnóstico da endometrite em éguas, enfatizando a citologia endometrial e técnicas para obtenção de amostra, identificando a técnica mais indicada por diversos autores.

Endometritis is defined as an inflammation of the endometrium, which may be acute or chronic, infectious or noninfectious. This condition is of great economic importance in veterinary medicine, and may result in embryonic death, abortion and even render the mare infertile, being one of the conditions that most compromise uterine health, putting at risk the pregnancy rates obtained post-coverage, postinsemination, and post-embryo transfer. There are several methods for diagnosis and the most used in the field is endometrial/uterine cytology. There are also some forms of sample collection for laboratory analysis by cytology, such as: gynecological brush, uterine swab guided by metallic mandrel or disposable plastic and low volume uterine lavage, followed by sedimentation or centrifugation and may be complemented by cytocentrifugation. Diagnosis by endometrial cytology using the gynecological brush technique is the most used among Veterinary Practitioners, because it is a practical method to execute and fast to obtain the results in the presence of endometritis, facilitating the therapeutic conduct regarding the use of mares for breeding or discarding. The objective of this study was to cite the diagnostic methods of endometritis in mares, emphasizing endometrial cytology and its techniques for obtaining a sample, identifying the most indicated technique by several authors.

Estudo comparativo das diferentes técnicas empregadas na contagem diferencial de leucócitos no leite

ABSTRACT: Milk somatic cell count (SCC) is the basis of mastitis and milk quality control programs, however it not differentiate the distinct leukocyte populations which in turn can improve the diagnosis of mastitis. Thus, the present study aimed to evaluate different techniques used to measure the distinct leukocyte populations in milk in attempt to improve the diagnosis of mastitis. Here, milk samples from 31 dairy cows (124 quarter milk samples) were used. The differential leukocytes count was determined by cytocentrifugation, direct microscopy smears, and monoclonal antibodies by flow cytometry. The automatic SCC was also performed. The results showed a positive and significant correlation between the proportion of polymorphonuclear leukocytes determined by all techniques and automatic cell count; although a discrete higher correlation between flow cytometry and automatic SCC was found. Furthermore, the present study reinforces the idea that macrophages were the predominant cell type in mammary gland with low SCC. The proportion of each leukocyte population differ among techniques, probably due to the subjectivity of the examiner in the evaluation of the differential leukocyte counts by cytocentrifugation and direct microscopy smears, which emphasize that flow cytometry can be a useful and feasible tool in the diagnosis and control of mastitis.

RESUMO: A contagem de células somáticas (CCS) é um parâmetro amplamente utilizado para monitorar a saúde do úbere e a qualidade do leite, porém não diferencia as distintas populações leucocitárias. Portanto, a diferenciação das populações celulares no leite pode aprimorar o diagnóstico da mastite bovina. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar as diferentes técnicas de contagem diferencial de leucócitos no leite para diagnosticar precisamente a mastite. Para tal, foram utilizadas 31 vacas da raça holandesa preta e branca em lactação (124 quartos mamários). Foram empregadas a contagem automática de células somáticas, e a contagem diferencial de leucócitos pelas técnicas de citocentrifugação, contagem diferencial de leucócitos por esfregaço direto, e citometria de fluxo com a utilização de anticorpos monoclonais específicos para identificação de cada população leucocitária. Os resultados demonstraram correlação positiva e significativa entre a proporção de leucócitos polimorfonucleares pelas diferentes técnicas e a contagem automática de células somáticas, sendo observada uma correlação discretamente mais forte com a citometria de fluxo. Além disso, foi demonstrado que os macrófagos são a população predominante no leite oriundo de glândula mamária com baixa CCS. Observaram-se também diferenças na proporção das distintas populações leucocitárias entre as distintas técnicas, resultado da possível subjetividade do examinador na contagem diferencial de leucócitos pelas técnicas de citocentrifugação e contagem microscópica direta por esfregaços, o que reforça que a citometria de fluxo pode ser uma ferramenta confiável no controle e diagnóstico da mastite.

Estudo comparativo das diferentes técnicas empregadas na contagem diferencial de leucócitos no leite / Comparative study of distinct techniques to determine differential leukocyte counts in milk

A contagem de células somáticas (CCS) é um parâmetro amplamente utilizado para monitorar a saúde do úbere e a qualidade do leite, porém não diferencia as distintas populações leucocitárias. Portanto, a diferenciação das populações celulares no leite pode aprimorar o diagnóstico da mastite bovina. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar as diferentes técnicas de contagem diferencial de leucócitos no leite para diagnosticar precisamente a mastite. Para tal, foram utilizadas 31 vacas da raça holandesa preta e branca em lactação (124 quartos mamários). Foram empregadas a contagem automática de células somáticas, e a contagem diferencial de leucócitos pelas técnicas de citocentrifugação, contagem diferencial de leucócitos por esfregaço direto, e citometria de fluxo com a utilização de anticorpos monoclonais específicos para identificação de cada população leucocitária. Os resultados demonstraram correlação positiva e significativa entre a proporção de leucócitos polimorfonucleares pelas diferentes técnicas e a contagem automática de células somáticas, sendo observada uma correlação discretamente mais forte com a citometria de fluxo. Além disso, foi demonstrado que os macrófagos são a população predominante no leite oriundo de glândula mamária com baixa CCS. Observaram-se também diferenças na proporção das distintas populações leucocitárias entre as distintas técnicas, resultado da possível subjetividade do examinador na contagem diferencial de leucócitos pelas técnicas de citocentrifugação e contagem microscópica direta por esfregaços, o que reforça que a citometria de fluxo pode ser uma ferramenta confiável no controle e diagnóstico da mastite.(AU)

Milk somatic cell count (SCC) is the basis of mastitis and milk quality control programs, however it not differentiate the distinct leukocyte populations which in turn can improve the diagnosis of mastitis. Thus, the present study aimed to evaluate different techniques used to measure the distinct leukocyte populations in milk in attempt to improve the diagnosis of mastitis. Here, milk samples from 31 dairy cows (124 quarter milk samples) were used. The differential leukocytes count was determined by cytocentrifugation, direct microscopy smears, and monoclonal antibodies by flow cytometry. The automatic SCC was also performed. The results showed a positive and significant correlation between the proportion of polymorphonuclear leukocytes determined by all techniques and automatic cell count; although a discrete higher correlation between flow cytometry and automatic SCC was found. Furthermore, the present study reinforces the idea that macrophages were the predominant cell type in mammary gland with low SCC. The proportion of each leukocyte population differ among techniques, probably due to the subjectivity of the examiner in the evaluation of the differential leukocyte counts by cytocentrifugation and direct microscopy smears, which emphasize that flow cytometry can be a useful and feasible tool in the diagnosis and control of mastitis.(AU)

Estudo comparativo das diferentes técnicas empregadas na contagem diferencial de leucócitos no leite / Comparative study of distinct techniques to determine differential leukocyte counts in milk

A contagem de células somáticas (CCS) é um parâmetro amplamente utilizado para monitorar a saúde do úbere e a qualidade do leite, porém não diferencia as distintas populações leucocitárias. Portanto, a diferenciação das populações celulares no leite pode aprimorar o diagnóstico da mastite bovina. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar as diferentes técnicas de contagem diferencial de leucócitos no leite para diagnosticar precisamente a mastite. Para tal, foram utilizadas 31 vacas da raça holandesa preta e branca em lactação (124 quartos mamários). Foram empregadas a contagem automática de células somáticas, e a contagem diferencial de leucócitos pelas técnicas de citocentrifugação, contagem diferencial de leucócitos por esfregaço direto, e citometria de fluxo com a utilização de anticorpos monoclonais específicos para identificação de cada população leucocitária. Os resultados demonstraram correlação positiva e significativa entre a proporção de leucócitos polimorfonucleares pelas diferentes técnicas e a contagem automática de células somáticas, sendo observada uma correlação discretamente mais forte com a citometria de fluxo. Além disso, foi demonstrado que os macrófagos são a população predominante no leite oriundo de glândula mamária com baixa CCS. Observaram-se também diferenças na proporção das distintas populações leucocitárias entre as distintas técnicas, resultado da possível subjetividade do examinador na contagem diferencial de leucócitos pelas técnicas de citocentrifugação e contagem microscópica direta por esfregaços, o que reforça que a citometria de fluxo pode ser uma ferramenta confiável no controle e diagnóstico da mastite.(AU)

Milk somatic cell count (SCC) is the basis of mastitis and milk quality control programs, however it not differentiate the distinct leukocyte populations which in turn can improve the diagnosis of mastitis. Thus, the present study aimed to evaluate different techniques used to measure the distinct leukocyte populations in milk in attempt to improve the diagnosis of mastitis. Here, milk samples from 31 dairy cows (124 quarter milk samples) were used. The differential leukocytes count was determined by cytocentrifugation, direct microscopy smears, and monoclonal antibodies by flow cytometry. The automatic SCC was also performed. The results showed a positive and significant correlation between the proportion of polymorphonuclear leukocytes determined by all techniques and automatic cell count; although a discrete higher correlation between flow cytometry and automatic SCC was found. Furthermore, the present study reinforces the idea that macrophages were the predominant cell type in mammary gland with low SCC. The proportion of each leukocyte population differ among techniques, probably due to the subjectivity of the examiner in the evaluation of the differential leukocyte counts by cytocentrifugation and direct microscopy smears, which emphasize that flow cytometry can be a useful and feasible tool in the diagnosis and control of mastitis.(AU)

Citocentrifugação e métodos convencionais na citologia uterina de éguas em estro e diestro / Cytocentrifugation and conventional methods in endometrial cytology of estrus and diestrus mares

A citologia uterina consiste em método prático e eficiente para o diagnóstico de afecções uterinas na égua, contribuindo para a conduta terapêutica e o prognóstico quanto à fertilidade das fêmeas. Assim, o objetivo deste trabalho foi comparar diferentes técnicas de coleta de material para citologia uterina em éguas, a fim de se verificarem possíveis diferenças qualitativas e quantitativas e a praticidade na execução das metodologias. Para tanto, 12 éguas multíparas foram submetidas ao exame citológico uterino, durante o estro e o diestro, por meio de escova ginecológica e lavado uterino de baixo volume. Com esse ensaio, observou-se que não houve diferença significativa (P>0,05) no resultado da citologia uterina entre as diferentes técnicas avaliadas. No entanto, quando comparadas as fases do ciclo estral, houve uma diferença significativa (P<0,05) quanto ao percentual médio de polimorfonucleares neutrófilos, sendo de 8,07±2,80 no estro e de 1,55±0,28 no diestro. Conclui-se, desse modo, que as técnicas estudadas apresentaram resultados igualmente eficazes para detecção de neutrófilos ao exame citológico do útero em ambas as fases avaliadas do ciclo estral, apesar de, na fase de estro, a detecção de maior percentual de neutrófilos possibilitar um diagnóstico e um prognóstico mais precoces de endometrite e, portanto, uma conduta terapêutica mais adequada.(AU)

The endometrial cytology consists in an efficient and practical method for the diagnosis of uterine disorders in mares, contributing for therapeutic conduct and prognostic evaluation regarding the females' fertility. Therefore, the aim of this study was to compare different techniques of material sampling for endometrial cytology in mares, in order to verify possible qualitative and quantitative differences in the practicality of implementation of this methodology. Twelve multiparous mares underwent an endometrial cytological exam, during estrus and diestrus, by means of a cytobrush and a low-volume uterine flush. With this test, no statistical difference was observed (P>0.05) regarding the result of endometrial cytology between the evaluated techniques. However, in comparison to the estrous cycle's phases, a significant difference was verified (P<0.05) on the average percentage of polymorphonuclear neutrophils: 8.07±2.80 in estrus and 1.55±0.28 in diestrus. Thus, we conclude that the studied techniques presented equally effective results for the detection of neutrophils in the cytological exam for both evaluated stages of the estrous cycle, whereas in estrus phase, the detection of a higher percentage of neutrophils allows a more precocious diagnostic and prognostic of endometritis and, therefore, a more adequate therapeutic approach.(AU)

Citocentrifugação e métodos convencionais na citologia uterina de éguas em estro e diestro / Cytocentrifugation and conventional methods in endometrial cytology of estrus and diestrus mares

A citologia uterina consiste em método prático e eficiente para o diagnóstico de afecções uterinas na égua, contribuindo para a conduta terapêutica e o prognóstico quanto à fertilidade das fêmeas. Assim, o objetivo deste trabalho foi comparar diferentes técnicas de coleta de material para citologia uterina em éguas, a fim de se verificarem possíveis diferenças qualitativas e quantitativas e a praticidade na execução das metodologias. Para tanto, 12 éguas multíparas foram submetidas ao exame citológico uterino, durante o estro e o diestro, por meio de escova ginecológica e lavado uterino de baixo volume. Com esse ensaio, observou-se que não houve diferença significativa (P>0,05) no resultado da citologia uterina entre as diferentes técnicas avaliadas. No entanto, quando comparadas as fases do ciclo estral, houve uma diferença significativa (P<0,05) quanto ao percentual médio de polimorfonucleares neutrófilos, sendo de 8,07±2,80 no estro e de 1,55±0,28 no diestro. Conclui-se, desse modo, que as técnicas estudadas apresentaram resultados igualmente eficazes para detecção de neutrófilos ao exame citológico do útero em ambas as fases avaliadas do ciclo estral, apesar de, na fase de estro, a detecção de maior percentual de neutrófilos possibilitar um diagnóstico e um prognóstico mais precoces de endometrite e, portanto, uma conduta terapêutica mais adequada.(AU)

The endometrial cytology consists in an efficient and practical method for the diagnosis of uterine disorders in mares, contributing for therapeutic conduct and prognostic evaluation regarding the females' fertility. Therefore, the aim of this study was to compare different techniques of material sampling for endometrial cytology in mares, in order to verify possible qualitative and quantitative differences in the practicality of implementation of this methodology. Twelve multiparous mares underwent an endometrial cytological exam, during estrus and diestrus, by means of a cytobrush and a low-volume uterine flush. With this test, no statistical difference was observed (P>0.05) regarding the result of endometrial cytology between the evaluated techniques. However, in comparison to the estrous cycle's phases, a significant difference was verified (P<0.05) on the average percentage of polymorphonuclear neutrophils: 8.07±2.80 in estrus and 1.55±0.28 in diestrus. Thus, we conclude that the studied techniques presented equally effective results for the detection of neutrophils in the cytological exam for both evaluated stages of the estrous cycle, whereas in estrus phase, the detection of a higher percentage of neutrophils allows a more precocious diagnostic and prognostic of endometritis and, therefore, a more adequate therapeutic approach.(AU)

Bronchoalveolar lavage (BAL) in tapirs (Tapirus terrestris) with Mycobacterium tuberculosis / Lavado broncoalveolar (LBA) em antas (Tapirus terrestris) com Mycobacterium tuberculosis

This paper describes the in vivo Bronchoalveolar lavage (BAL) technique by endoscopy in tapirs (Tapirus terrestris) with clinical signs of tuberculosis. The technique was performed in two tapirs, male and female, from Curitiba Zoo, Paraná, Brazil. A flexible endoscope and a polyethylene catheter were used after the chemical restraint of the animals. For BAL technique, 60mL of saline 0.9% were infused with a polyethylene catheter, introduced by the endoscope's working channel, and 15mL of BAL were recovered, analyzed and submitted to cytocentrifugation. Slides were stained by Papanicolaou, periodic acid-Schiff (PAS) and Ziehl-Neelsen methods contained high quantity of inflammatory cells on light microscopy (macrophages 27.5%, lymphocytes 0.5%, neutrophis 67% and eosinophis 5%). BAL samples were submitted to culture, bacilloscopy and PCR and were negative for both animals. Based on this study, it was concluded that the bronchoalveolar lavage technique in tapirs is feasible, simple, noninvasive, practical and fast, providing an important clinical information in vivo regarding the functional status of the lower respiratory tract.(AU)

O presente trabalho descreve a técnica de lavado broncoalveolar (LBA) por endoscopia em antas (Tapirus terrestris) in vivo com sinais clínicos de tuberculose. A técnica foi realizada em duas antas, um macho e uma fêmea, provenientes do Zoológico de Curitiba, Paraná, Brasil, utilizando-se endoscópio flexível e sonda de polietileno, após a contenção química desses animais. Para o LBA, 60mL de solução fisiológica 0,9% foram infundidos com auxílio de cateter de polietileno, introduzido pelo canal de trabalho do endoscópio, e, aproximadamente, 15mL de LBA foram recuperados, acondicionados, analisados e submetidos à citocentrifugação. As lâminas foram coradas pelas técnicas de Papanicolau, ácido periódico de Schiff (PAS) e Ziehl- Neelsen, método que contém altas quantidades de células inflamatórias em microscopia (macrófagos 27,5%, linfócitos 0,5%, neutrófilos 67% e eosinófilos 5%). Amostras de LBA foram submetidas a cultura, baciloscopia e PCR e foram negativas em ambos os animais. Concluiu-se, baseado no presente trabalho, que técnica de lavado broncoalveolar é simples, não invasiva, funcional e rápida. Pode fornecer ao clínico importantes informações acerca do estado de funcionamento do aparelho respiratório in vivo.(AU)

Comparison between linear smear concentration and cytocentrifugation techniques to evaluate equine bronchoalveolar lavage cytology / Comparação entre as técnicas de esfregaço linear e citocentrifugação para avaliação citológica do lavado broncoalveolar equino

The bronchoalveolar lavage (BAL) is a sensitive method to diagnose diseases of the distal portion of the lower respiratory tract and has been broadly used by numerous researchers. Cytocentrifugation is the choice cytological preparation technique, but demands specific and costly equipment. Therefore, the present paper intends to verify the applicability of the linear smear technique to evaluate BAL samples. For this, BAL samples of 30 equines were used and the cytological preparations were done by cytocentrifugation and linear smear techniques. All glass microscope slides were fixed and stained with Giemsa for the differential cell count. Regarding the effect of the preparation technique on differential counts, no significant difference in any cell type was found. The linear smear is a reliable alternative and can be recommended as a substitution to cytocentrifugation.(AU)

O lavado broncoalveolar (LBA) é um método sensível para diagnosticar doenças do trato respiratório posterior e vem sendo utilizado por diversos pesquisadores. A citocentrifugação, técnica de escolha para processar amostras citológicas de LBA, exige equipamentos específicos e caros. Por isso, este trabalho verificou a aplicabilidade da técnica de esfregaço linear para avaliação citológica do LBA. Foram utilizadas amostras de LBA de 30 equinos adultos. As preparações citológicas foram realizadas tanto por citocentrifugação quanto por esfregaço linear. Todas as lâminas foram fixadas e coradas com Giemsa para realização da contagem celular diferencial. Não foram encontradas alterações morfológicas significativas e nem diferenças estatísticas entre nenhum dos tipos celulares processados pelos dois métodos, o que permite afirmar que o método de esfregaço linear é uma alternativa segura para avaliação morfológica celular do LBA de equinos, podendo ser utilizado no lugar da citocentrifugação quando esta não estiver disponível.(AU)

Correlação entre a contagem automática de células somáticas e a porcentagem de neutrófilos pela citometria de fluxo e pela técnica de citocentrifugação / Correlation between automatic somatic cell count and the percentage of neutrophils through flow cytometry and cytocentrifugation technique

O objetivo do presente estudo foi avaliar a correlação entre a contagem automática de células somáticas (CCS) com a porcentagem de neutrófilos pela técnica de citocentrifugação e pela citometria de fluxo. Para tal, 102 amostras de leite proveniente de 28 vacas da raça Holandesa foram coletadas e submetidas ao isolamento de células do leite e posterior identificação da população de neutrófilos. Após citocentrifugação, os neutrófilos foram identificados por microscopia óptica utilizando-se o corante de Rosenfeld. Os neutrófilos lácteos foram identificados por citometria de fluxo utilizando anticorpo monoclonal específico (CH138A) e anticorpo monoclonal secundário conjugado à ficoeritrina. O presente estudo demonstrou correlação positiva entre a CCS e a porcentagem de neutrófilos por citometria de fluxo (r= 0,625) e pela técnica de citocentrifugação (r= 0,267). Observou-se também correlação positiva entre a porcentagem de neutrófilos pela citometria de fluxo e pela técnica de citocentrifugação (r = 0,496), embora a porcentagem de neutrófilos no leite tenha sido maior pela técnica de citocentrifugação quando comparada com a citometria de fluxo. Deste modo, o presente estudo indica que a citometria de fluxo pode ser uma ferramenta útil no diagnóstico e controle da mastite bovina.(AU)

The purpose of the present study was to assess the correlation between the automatic somatic cell count (SCC) and the percentage of neutrophils through cytocentrifugation technique and flow cytometry. Thus, 102 milk samples from 28 Holstein dairy cows were collected and submitted to milk cell isolation procedures, and afterwards, the neutrophils were identified. After cytocentrigugation, the neutrophils were microscopically identified using the rosenfeld dye. The milk neutrophils were recognized by flow cytometry using primary mouse IgM monoclonal antibody (CH138A) and phycoerytrin (PE) goat anti-mouse IgM antibody. This study found a positive correlation between SCC and the percentage of neutrophils through cytocentrifugation (r= 0.267) and flow cytometry (r= 0.625). A positive correlation was also encountered between the percentage of neutrophils through cytocentrifugation and flow cytometry (r= 0.496), although the percentage of neutrophils was higher in samples submitted to cytocentrifugation. In conclusion, flow cytometry can be a useful tool in the diagnosis and control of mastitis.(AU)

Dinâmica da celularidade do colostro de vacas da raça Holandesa no pós-parto imediato / Cell dynamics of Holstein cow colostrum immediately after parturition

Avaliou-se a celularidade do colostro de 53 vacas da raça Holandesa, utilizando-se 171 amostras, colhidas após a primeira e a segunda ordenha pós-parto. Para a análise citológica quantitativa e qualitativa, foram utilizadas as técnicas de microscopia direta e citocentrifugação. O total de leucócitos obtido por contagem microscópica direta foi de 0,878x10(6) e 1,260x10(6), antes da primeira e da segunda ordenha, respectivamente, e os valores da mediana dos fagócitos obtidos antes da primeira e da segunda ordenha foram de 0,657 e 0,828x10(6) leucócitos mononucleares, e 0,178 e 0,392x10(6) leucócitos polimorfonucleares (P<0,0001). Os valores da mediana dos tipos leucocitários, antes da primeira e da segunda ordenha, foram: 0,640x10(6) e 0,772 monócitos/células epiteliais; 0,136x10(6) e 0,098 linfócitos; 0,045x10(6) e 0,203x10(6) neutrófilos, respectivamente. Concluiu-se que o colostro bovino da segunda ordenha apresentou aumento da quantidade de células somáticas e leucócitos polimorfonucleares/mL de colostro. Essas variações podem estar relacionadas à importância do colostro aos neonatos, ou a modificações fisiológicas e de defesa da glândula mamária, durante o período de adaptação dela.(AU)

Colostrum cellularity was studied in 53 Holstein cows using 171 samples, collected before the first and second postpartum milking. Direct microscopic counts and cytocentrifugation were used in the quantitative and qualitative cytological analyses. The total number of leukocytes obtained by means of direct microscopic count was equal to 0.878 x 10(6) and 1,260 x 10(6) , before the first and second milking, respectively. The median of phagocyte counts before the first and second milking were, respectively,0.657 and 0.828 x 10(6) mononuclear leukocytes, and 0.178 and 0.392 x 10(6) polymorphonuclear leukocytes (P<0.0001). The median of leukocyte counts, before the first and second milking were, respectively, 0.640 x 10(6) and 0.772 monocytes/epithelial cells; 0.136 x 10(6) and 0.098 lymphocytes; 0.045 x 10(6) and 0.203 x 10(6) neutrophils. It was concluded that bovine colostrum of the second milking showed an increase in the number of somatic cells and polymorphonuclear leukocytes and polymorphonuclear leukocytes/mL. This variation may be either related to the importance of colostrum to neonates, or to physiological and defense changes that occur in the mammary gland during immediate after postpartum.(AU)

CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DOS LEUCÓCITOS PRESENTES NO LEITE DE CABRAS SADIAS UTILIZANDO-SE A COLORAÇÃO DE VERDE DE METIL E PIRONINA E A CITOCENTRIFUGAÇÃO

ABSTRACT The characteristics of the apocrine milk secretion observed in goats make it necessary to use specific techniques to determine the quantity and quality of cells found in this kind of milk. Among these characteristics is the presence of cytoplasmic bodies. The objective of the present study was to determine total leukocyte counts in the milk of healthy goats using direct microscopy and methyl green-pyronin Y and automatic cell count by flow cytometry as well as to determine leukocyte types by means of cytocentrifugation. A total of 102 milk samples from healthy Saanen, Brown Alpine and Toggenburg goats were analyzed. The median value of direct microscopic and automatic counts was 142,840 and 406,000 somatic cells/mL of milk, and mean values obtained in cytocentrifugation were 73.24 ± 18.35% neutrophils, 3.55 ± 3.06% lymphocytes and 24.33 ± 18.89% monocytes and epithelial cells. According to the results obtained, it was concluded that methyl green-pyronin Y is an important method, perhaps the most precise one, for determining cell counts in goat milk, because it excludes cytoplasmic bodies. Moreover, the different cell types found in milk are important defenses of the mammary gland against mastitis-causing pathogens.

RESUMO As particularidades da secreção láctea do tipo apócrina, na espécie caprina, tornam necessárias técnicas específicas para a determinação da quantidade e da qualidade das células presentes no leite desta espécie. Dentre estas particularidades, pode-se citar a presença dos corpúsculos citoplasmáticos. De acordo com estas características, o objetivo do presente trabalho foi determinar a contagem total de leucócitos no leite de cabras sadias, por meio da contagem microscópica direta com verde de metil e pironina-Y, e a contagem celular automática por citometria de fluxo, assim como determinar os tipos leucocitários, através da técnica de citocentrifugação. Foram analisadas 102 de leite de cabras sadias, das raças Saanen, Parda Alpina e Toggenburg. O valor mediano obtido pela contagem microscópica direta e automática foi de 142.840 e 406.000 células somáticas/mL de leite, respectivamente. Os valores médios obtidos na citocentrifugação foram de 73,24 ± 18,35% de neutrófilos, 3,55 ± 3,06% de linfócitos e 24,33 ± 18,89% de monócitos e células epiteliais. De acordo com os resultados, pode-se concluir que o valor obtido pela coloração de verde de metil e pironina-Y é significativamente menor, sendo um importante método para a determinação da celularidade presente no leite de cabras, pois exclui os corpúsculos citoplasmáticos característicos desta espécie.

Contagem total e diferencial dos leucócitos presentes no leite de cabras sadias utilizando-se a coloração de verde de metil e pironina e a citocentrifugação / Total and differential leukocyte counts in the milk of healthy goats, using methyl green-pyronin stain and cytocentrifugation

As particularidades da secreção láctea do tipo apócrina, na espécie caprina, tornam necessárias técnicas específicas para a determinação da quantidade e da qualidade das células presentes no leite desta espécie. Dentre estas particularidades, pode-se citar a presença dos corpúsculos citoplasmáticos. De acordo com estas características, o objetivo do presente trabalho foi determinar a contagem total de leucócitos no leite de cabras sadias, por meio da contagem microscópica direta com verde de metil e pironina-Y, e a contagem celular automática por citometria de fluxo, assim como determinar os tipos leucocitários, através da técnica de citocentrifugação. Foram analisadas 102 de leite de cabras sadias, das raças Saanen, Parda Alpina e Toggenburg. O valor mediano obtido pela contagem microscópica direta e automática foi de 142.840 e 406.000 células somáticas/mL de leite, respectivamente. Os valores médios obtidos na citocentrifugação foram de 73,24 ± 18,35% de neutrófilos, 3,55 ± 3,06% de linfócitos e 24,33 ± 18,89% de monócitos e células epiteliais. De acordo com os resultados, pode-se concluir que o valor obtido pela coloração de verde de metil e pironina-Y é significativamente menor, sendo um importante método para a determinação da celularidade presente no leite de cabras, pois exclui os corpúsculos citoplasmáticos característicos desta espécie.

The characteristics of the apocrine milk secretion observed in goats make it necessary to use specific techniques to determine the quantity and quality of cells found in this kind of milk. Among these characteristics is the presence of cytoplasmic bodies. The objective of the present study was to determine total leukocyte counts in the milk of healthy goats using direct microscopy and methyl green-pyronin Y and automatic cell count by flow cytometry as well as to determine leukocyte types by means of cytocentrifugation. A total of 102 milk samples from healthy Saanen, Brown Alpine and Toggenburg goats were analyzed. The median value of direct microscopic and automatic counts was 142,840 and 406,000 somatic cells/mL of milk, and mean values obtained in cytocentrifugation were 73.24 ± 18.35% neutrophils, 3.55 ± 3.06% lymphocytes and 24.33 ± 18.89% monocytes and epithelial cells. According to the results obtained, it was concluded that methyl green-pyronin Y is an important method, perhaps the most precise one, for determining cell counts in goat milk, because it excludes cytoplasmic bodies. Moreover, the different cell types found in milk are important defenses of the mammary gland against mastitis-causing pathogens.

Citologia do leite de búfalas (Bubalus bubalis) hígidas criadas no Estado de São Paulo, Brasil

The quantitative and qualitative evaluations of cells present on milk are important for understanding many events, physiologic or not, of the mammary gland. Despite that, citations in the literature are conflicting concerning healthy buffaloes. This study evaluated milk cellularity in 108 samples of healthy buffaloes mammary glands. They were analyzed by somatic cell count, automatic and microscopic, and the cellular types in slides of milk smear and also after cytocentrifugation of cellular suspension (differential citology evaluation). Results of milk somatic cells count, by microscopic and automatic techniques, were similar but cellular predominance (from Prescott - Breed or cytocentrifugation) differed in relative values. More mononuclear cells were found in slides of cytocentrifugation of cellular suspension smears and more leucocytes on direct microscopic count technique. The cytocentrifugation smears showed a better evaluation of cellular morphology, identifying 61.1% of monocytes and macrophages, 32.9% of neutrophils, 5.3% of lymphocytes and 0.7% of eosinophils. Mononuclear phagocytes showed a high plasticity on structure with many morphological patterns.

As avaliações quantitativas e qualitativas das células presentes no leite são empregadas para a compreensão de diversos processos, fisiológicos ou não da glândula mamária. Apesar disso, as citações da literatura são conflitantes quanto às búfalas sadias e, para elucidar essa questão, avaliou-se a celularidade do leite em 108 amostras de quartos mamários de búfalas hígidas em lactação, submetendo-as à contagem de células somáticas (CCS), automática e por microscopia óptica, além de estabelecer-se a predominância celular empregando duas técnicas (Prescott e Breed e citocentrifugação). Os resultados das CCS do leite, por técnicas microscópica e automática foram semelhantes, mas a predominância celular analisada por microscopia diferiu em valores relativos. Foram identificadas mais células mononucleares nas lâminas de suspensão celular citocentrifugada, e mais leucócitos polimorfonucleares na técnica de Prescott e Breed. A lâmina de citocentrifugação permitiu melhor avaliação da morfologia celular sendo identificados 61,1% de monócitos e macrófagos; 32,9% de neutrófilos; 5,3% de linfócitos e 0,7% de eosinófilos. Os fagócitos mononucleares apresentaram uma acentuada plasticidade de suas estruturas, com variados padrões morfológicos.

Citologia do leite de búfalas (Bubalus bubalis) hígidas criadas no Estado de São Paulo, Brasil

The quantitative and qualitative evaluations of cells present on milk are important for understanding many events, physiologic or not, of the mammary gland. Despite that, citations in the literature are conflicting concerning healthy buffaloes. This study evaluated milk cellularity in 108 samples of healthy buffaloes mammary glands. They were analyzed by somatic cell count, automatic and microscopic, and the cellular types in slides of milk smear and also after cytocentrifugation of cellular suspension (differential citology evaluation). Results of milk somatic cells count, by microscopic and automatic techniques, were similar but cellular predominance (from Prescott - Breed or cytocentrifugation) differed in relative values. More mononuclear cells were found in slides of cytocentrifugation of cellular suspension smears and more leucocytes on direct microscopic count technique. The cytocentrifugation smears showed a better evaluation of cellular morphology, identifying 61.1% of monocytes and macrophages, 32.9% of neutrophils, 5.3% of lymphocytes and 0.7% of eosinophils. Mononuclear phagocytes showed a high plasticity on structure with many morphological patterns.

As avaliações quantitativas e qualitativas das células presentes no leite são empregadas para a compreensão de diversos processos, fisiológicos ou não da glândula mamária. Apesar disso, as citações da literatura são conflitantes quanto às búfalas sadias e, para elucidar essa questão, avaliou-se a celularidade do leite em 108 amostras de quartos mamários de búfalas hígidas em lactação, submetendo-as à contagem de células somáticas (CCS), automática e por microscopia óptica, além de estabelecer-se a predominância celular empregando duas técnicas (Prescott e Breed e citocentrifugação). Os resultados das CCS do leite, por técnicas microscópica e automática foram semelhantes, mas a predominância celular analisada por microscopia diferiu em valores relativos. Foram identificadas mais células mononucleares nas lâminas de suspensão celular citocentrifugada, e mais leucócitos polimorfonucleares na técnica de Prescott e Breed. A lâmina de citocentrifugação permitiu melhor avaliação da morfologia celular sendo identificados 61,1% de monócitos e macrófagos; 32,9% de neutrófilos; 5,3% de linfócitos e 0,7% de eosinófilos. Os fagócitos mononucleares apresentaram uma acentuada plasticidade de suas estruturas, com variados padrões morfológicos.

Componentes imunológicos do colostro bovino: células, teores de imunoglobulinas e atividade bactericida dos fagócitos para a Escherichia coli enterotoxigênica (ECET) / Immunological components of bovine collostrum: cells, immunoglobulin content and bactericidal activity of phagocytes against enterotoxigenic Escherichia coli

Estudou-se quantitativamente e qualitativamente a citologia, os teores de imunoglobulinas, e a atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino contra a Escherichia coli enterotoxigênica (ECET), analisando-se a influência da opsonização prévia destas células. Para tal finalidade foram utilizadas 53 vacas da raça Holandesa, das quais realizou-se a colheita de um total 212 amostras de colostro obtidas antes da primeira e segunda ordenha. As amostras positivas (n=41) ao exame bacteriológico do leite foram excluídas desta pesquisa. Para a análise citológica quantitativa e qualitativa do colostro, foram utilizadas as técnicas de microscopia direta e citocentrifugação, respectivamente. As dosagens das imunoglobulinas (IgG, IgM e IgA) foram realizadas por meio da técnica de imunodifusão radial, utilizando-se Kits comerciais. Para a avaliação da atividade bactericida indireta dos fagócitos e verificação da influência da opsonização prévia da ECET, foram realizados os seguintes ensaios: utilizando somente suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares em meio de cultura (Grupo Controle - C); suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares adicionados a suspensão de ECET não opsonizada (Grupo NO); suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares adicionados a suspensão de ECET previamente opsonizada com 10% de sobrenadante de colostro bovino delipidado (Grupo O). A atividade bactericida indireta dos fagócitos foi mensurada por meio da quantidade de nmoles de peróxido de hidrogênio liberado por estas células, nos ensaios C, NO e O. Após as avaliações dos resultados das determinações realizadas, conclui-se que: (1) o colostro bovino de segunda ordenha apresenta maior quantidade de células/mL, que aquele de primeira ordenha; (2) a predominância celular demonstrada com o uso das técnicas de microscopia direta e de citocentrifugação foi de células mononucleares; (3) colostro bovino de segunda ordenha possui maior quantidade de neutrófilos polimorfonucleares, quando comparada àquela da primeira ordenha, utilizando as técnicas de microscópica direta e de citocentrifugação, para a contagem dos tipos leucocitários; (4) os tipos celulares predominantes no colostro bovino de primeira e segunda ordenha foram macrófagos/células epiteliais, seguidos por linfócitos, neutrófilos e eosinófilos, respectivamente, utilizando a técnica de citocentrifugação para diferenciação celular; (5) o colostro bovino de primeira ordenha possui maiores teores de imunoglobulinas das classes G e M, que o da segunda ordenha, havendo predomínio da IgG, sobre a IgM e IgA independente da ordem de ordenha. (6) os fagócitos do colostro bovino de primeira ordenha apresentaram maior atividade celular avaliada pela liberação de peróxido de hidrogênio, que os da segunda ordenha; (7) a estimulação antigênica com ECET não foi suficiente para aumentar a atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino; (8) a opsonização da ECET com soro colostral não determinou diferenças significativas na atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino, mensurada pela quantidade de peróxido de hidrogênio liberado por estas células; (9) existe correlação positiva entre os teores de imunoglobulinas da classe M e a quantidade de peróxido de hidrogênio liberado pelos fagócitos do colostro bovino; (10) o comportamento quantitativo observado para as imunoglobulinas e células do colostro bovino, considerando a ordem das ordenhas, sugere que os anticorpos teriam função prioritária na imunidade do neonato, enquanto o aumento de neutrófilos estaria voltado aparentemente para a proteção da glândula mamária

Bovine collostrum citology, immunoglobulin content and bactericidal activity of phagocytes against enterotoxigenic Escherichia coli were studied qualitatively and quantitatively, analyzing the influence of previous opsonization of the bacterium. In order to achieve this aim, 53 Holstein cows were used to obtain 212 collostrum samples before the first and second milkings. Samples positive (n=41) in the bacteriological examination of milk were excluded from the trial. Direct microscopy and cytocentrifugation were used in the quantitative and qualitative cytological analysis of collostrum, respectively. Immunoglobulin (IgG, IgM and IgA) contents were determined by means of radial immunodiffusion using commercial kits. Indirect bactericidal activity of phagocytes and assessment of the influence of ETEC previous opsonization were carried out as follows: using only a suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes in culture medium (Control group - C); suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes added to a suspension of non-opsonized ETEC (NO group); suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes added to an ETEC suspension previously opsonized with 10% of supernatant of delipidated bovine collostrum (O group). Indirect bactericidal activity of phagocytes was measured by means of the amount of hydrogen peroxide nmoles released by these cells in assays C, NO and O. After results were evaluated, it was concluded that: (1) bovine collostrum obtained in the second milking showed more cells/mL than first milking collostrum; (2) the predominance of mononuclear cells was determined by both direct microscopy and cytocentrifugation; (3) bovine collostrum obtained in the second milking showed greater quantity of polymorphonuclear neutrophils than that of the first milking, as determined in cell type counts by direct microscopy and cytocentrifugation; (4) cell types predominating in bovine collostrum of the first and second milking were macrophages / epithelial cells, followed by lymphocytes, neutrophils and eosinophils, respectively, using cytocentrifugation for cell differentiation; (5) first milking bovine collostrum showed greater levels of immunoglobulins G and M than that of the second milking, with a predominance of IgG compared with IgM and IgA, no matter the milking order; (6) phagocytes in first milking collostrum showed greater cell activity than those in the second milking collostrum, as evaluated by hydrogen peroxide release; (7) antigenic stimulation of ETEC was not enough to increase bactericidal activity of phagocytes in bovine collostrum; (8) ETEC opsonization with collostral serum did not lead to significant differences in bactericidal activity of bovine collostrum phagocytes, as measured by the amount of hydrogen peroxide released by these cells; (9) there was a positive correlation between the contents of immunoglobulin M and the amount of hydrogen peroxide released by phagocytes in bovine collostrum; (10) quantitative behavior observed for immunoglobulins and cells of bovine collostrum considering the milking order, suggest that antibodies would have a essential function in neonate immunity, whereas the increase in neutrophils would apparently be linked to mammary gland protection

Evaluation of alveolar macrophage function after experimental infection with equine herpesvirus-1 in horses / Avaliação da função dos macrófagos alveolares após infecção experimental em cavalos por herpesvírus eqüino tipo 1

The role of the pulmonary alveolar macrophages (PAM) in the lung defense mechanism was evaluated in horses infected with equine hespesvirus-1 (EHV-1). Five adult horses were exposed to 10(6.6) TCID50 EHV-1 by intranasal instillation. Cytology of bronchoalveolar lavage (BAL) was performed using cytocentrifugation of samples and slides stained by Rosenfeld. Cell concentration was adjusted to 2´106 cells/ml, for the measurement of macrophage activity - spreading, phagocytosis of zymosan particles and release of hydrogen peroxide (H2O2). All animals were positive in virus isolation on the second, third and fifth days post-inoculation (DPI). Seroconversion was observed on the 14th DPI. Lymphocytosis was observed by BAL cytology on the 16th DPI. Measurement of macrophage activity demonstrated a marked increase in the spreading rate, on the 23rd and 30th DPI. Phagocytosis was decreased on the second DPI, and returned to levels similar to those observed before inoculation on the 23rd DPI. The amount of H2O2 released by PAM declined on day 2, but, by day 16, they returned to values similar to those observed before inoculation. The decline in PAM activity in the acute phase of disease is indirect evidence that these cells have an important role in lung defense mechanisms against this agent.(AU)

O papel dos macrófagos alveolares (MA) nos mecanismos de defesa pulmonar foi estudado em cavalos infectados pelo herpesvírus eqüino tipo 1 (EHV-1). Cinco cavalos adultos foram inoculados com 106,6 TCID50 do EHV-1, por instilação intranasal. A citologia do lavado broncoalveolar (LBA) foi feita usando-se citocentrifugação das amostras e confecção de lâminas coradas por Rosenfeld. A concentração celular foi ajustada para 2´106 células/ml, para mensuração da atividade macrofágica - espraiamento, fagocitose de partículas de zymosan e liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2). Observou-se soroconversão no 14o dia pós-inoculação (DPI) e isolamento viral positivo no segundo, terceiro e quinto DPI. Na citologia do LBA observou-se linfocitose no 16o DPI. Os testes de mensuração da atividade macrofágica demonstraram aumento significativo nos índices de espraiamento no 23o e 30o DPI e diminuição no índice de fagocitose no segundo DPI, retornando a valores semelhantes aos observados antes da inoculação a partir do 23o DPI. Houve diminuição na liberação de H2O2 no segundo DPI, e no 16o DPI esses valores retornaram aos observados antes da inoculação. O declínio da atividade fagocítica dos MA, na fase aguda da infecção, indicou que essas células atuam de forma importante nos mecanismos de defesa pulmonar contra esse agente.(AU)

Avaliação da função de macrófagos alveolares em cavalos clinicamente sadios / Evaluation of alveolar macrophage function in healthy horses

Devido à importância dos macrófagos alveolares (MA) nos mecanismos de defesa pulmonar, foram realizados estudos para avaliar a atividade desses fagócitos em cavalos hígidos. Foram realizados lavados broncoalveolares (LBA) em cinco cavalos clinicamente sadios. A citologia foi realizada pela citocentrifugação das amostras e posterior confecção de lâminas coradas pelo método de Rosenfeld. Todas as amostras do LBA foram centrifugadas e a concentração celular foi ajustada para 2x10 elevada a sexta potência células/ml, para a mensuração da atividade macrofágica (testes de espraiamento, fagocitose e liberação de peróxido de hidrogênio). A contagem diferencial das células presentes no LBA demonstrou a predominância de macrófagos (59,0 + ou _6,9 por cento). Os resultados obtidos nos testes de mensuração da atividade macrofágica foram: índice de espraiamento 25,1 + ou -19,7 por cento, índice de fagocitose 89,4 + ou -6,2 por cento e liberação de peróxido de hidrogênio 1,6 + ou -0,3nmoles/2x10 elevado a quinta potência células (sem PMA - phorbol 12-myristate 13-acetate) e 1,8 + ou -0,4nmoles/2x10 elevado a quinta potência células (com PMA). Os resultados demonstraram um padrão de atividade para MA de cavalos hígidos, os quais apresentaram índices de ativação mesmo sem elicitação prévia, indicando que as técnicas utilizadas foram adequadas para tal propósito (AU)

Due to the importance of alveolar macrophages (AM) in pulmonary defense mechanisms, studies were performed in order to evaluate the activity of these cells. Bronchoalveolar lavages (BAL) were obtained from five healthy horses, and cytology was performed on glass slides after cytocentrifugation of the samples. Slides were stained by Rosenfeld. All BAL samples were centrifuged and cell concentration was adjusted to 2´106 cells/ml, for the measurement of AM activity (spreading, phagocytosis and hydrogen peroxide release tests). Differential counting of the BAL cells demonstrated that macrophages were the predominant type of cell (59.0± 6.9%). Measurement of AM activity presented the following results: spreading rate, 25.1± 19.7%, phagocytosis rate, 89.4± 6.2% and hydrogen peroxide release, 1.6± 0.3nmoles/2´105 cells (without PMAphorbol 12-myristate 13-acetate) and 1.8± 0.4nmoles/2´105 cells (with PMA). Results presented a pattern for the activity of AM in healthy horses enabling the demonstration of an activation rate even without known previous eliciting factors. These results indicate that the tests of macrophage activity measurement are adequate for evaluation of phagocytic activity of AMs. (AU)

Avaliação dos fagócitos no leite de búfalas (Bubalus bubalis) hígidas criadas no Estado de São Paulo / Evaluation of phagocytes from healthy buffaloes (Bubalus bubalis) milk bred in Sao Paulo state

O presente estudo teve por objetivo avaliar quantitativa e qualitativamente os fagócitos presentes no leite de búfalas (Bubalus bubalis) hígidas criadas nos Estado de São Paulo. Para tal, o experimento foi subdividido em três etapas, designadas capítulos, conforme os objetivos: (1) determinar e estudar a celularidade do leite de búfalas hígidas; (2) estabelecer metodologia adequada para a recuperação das células somáticas do leite de búfalas, possibilitando a avaliação in vitro; (3) descrever e avaliar as provas de atividade fagocítica das células presentes no leite de búfalas hígidas, através de testes de mensuração direta (espraiamento e fagocitose de partículas de Zymosan) e por testes indiretos, que mensuram os metabólitos de oxigênio gerados na “explosão respiratória”. Foram colhidas 132 amostras de leite de 35 búfalas hígidas (sem alterações ao exame físico da glândula mamária, bem como resultado da prova de CMT e exame microbiológico negativos). Após as avaliações do CMT, da CCS, da contagem diferencial, da viabilidade celular, do exame bacteriológico, dos testes de fagocitose, de espraiamento e da liberação de peróxido de hidrogênio, concluiu-se que: (1) os resultados das contagens de células somáticas, microscópica e automática, foram semelhantes, mas a predominância celular diferiu conforme a técnica empregada, sendo identificadas percentualmente mais células mononucleares na lâmina de suspensão celular citocentrifugada, e mais polimorfonucleares no leite submetido à técnica de Prescott e Breed; o leite diluído e citocentrifugado permitiu melhor avaliação da morfologia celular sendo identificados: 61,1% de monócitos e macrófagos; 32,9% de neutrófilos; 5,3% de linfócitos e 0,7% de eosinófilos; os fagócitos mononucleares apresentaram uma acentuada plasticidade na estrutura, com variados padrões morfológicos; (2) a baixa celularidade do leite necessitou maiores volumes da amostra mas, o aumento do volume da amostra aumenta a concentração celular obtida, mas não de forma ilimitada pois pode passar a comprometer a viabilidade das mesmas pelo excesso de manipulação e tempo exigidos pelas amostras mais volumosas; não foi necessária a elicitação, sendo possível a recuperação de 2 x 106 células viáveis/mL de leite de búfalas hígidas com 500 mL de leite, no mínimo; (3) os macrófagos aderidos espraiaram significativamente, além de apresentarem correlação com outro marcador de ativação celular, no caso, a liberação de peróxido de hidrogênio; mais da metade dos macrófagos aderidos fagocitaram partículas de Zymosan; os fagócitos mantêm sua capacidade de liberar peróxido de hidrogênio, espontaneamente ou não, em grau máximo, com uma significativa variação entre amostras

The aim of this study was to make a quantitative and a qualitative evaluation of phagocytes from healthy buffaloes (Bubalus bubalis) milk bred in Sao Paulo state. For this purpose, the experiment was divided in three parts, called chapters, as specific objectives: (1) establish and study the cellularity of healthy buffaloes milk; (2) establish an adequate method for the recuperation of somatic cells from buffaloes milk, making possible an in vitro evaluation; (3) standardize and evaluate the phagocytic activity tests of cells from healthy buffaloes milk, through direct measurement methods (spreading and phagocytosis of Zymosan particles) and indirect methods, which measure the oxygen metabolites from the respiratory burst. Milk samples (n=132) of healthy 35 buffaloes (without alterations on the physical examination of the mammary gland, and also negative results on CMT and microbiologic exams) were obtained. After the evaluations of CMT, SCC, differential cells count, cellular viability, bacteriologic exam, phagocytic tests, spreading and hydrogen peroxide liberation, the conclusions were: (1) the results of somatic cells count, microscopic and automatic, were similar but the cellular predominance differed with the utilized method, being percentually identified more mononuclear cells on slide of cytocentrifugation cellular suspension and more polymorphonuclear on milk submitted to the Prescott and Breed methods; the diluted and cytology by cytocentrifugation of milk permitted a best evaluation of the cellular morphology, being identified: 61.1% of monocytes and macrophages; 32.9% of neutrophils; 5.3% of lymphocytes and 0.7% of eosinophils; mononuclear phagocytes showed a high plasticity on structure with many morphological patterns; (2) a lower cellularity on milk requires higher quantities of the samples but an increase on sample volume increases cellular concentrations obtained, not on an unlimited way because it can compromise the cells viability with the excess of manipulation and time required by the biggest samples; it was not necessary the elicitation, being possible the recuperation of 2 x 106 viable cells/mL on milk of healthy buffaloes with 500 mL of milk minimum (3) adherent macrophages spreaded and were correlated with hydrogen peroxide release; majority of adherent macrophages phagocyted Zymosan particles; milk phagocytes showered a high oxidative metabolism, undependably of PMA stimulation, but with a great individual variation