Evaluation of pulmonary maturity in bovine neonates: analysis of amniotic fluid

ABSTRACT: Considering the representativeness of dairy cattle in our country, the concern about the mortality rates of the animals increases each time. Regarding to calf mortality, the Respiratory Distress Syndrome (RDS) has an important relevance during the neonatal period, and it is present in immature lungs. The amniotic fluid is in direct contact with the fetus, and it is able to offer evidence about his maturity. The aim of this study was to standardize the characteristics of the amniotic fluid, color, aspect, viscosity, quantification of lamellar body and surfactant evaluation by the Clements test and cytology, of term-born, mature and healthy calves. There were used 50 Black and White Holstein calves, which mothers were observed at calving in order to collect the amniotic fluid by puncture in the moment of exposure of the fetal membrane through the vaginal canal. Most amniotic fluid had a clear and hazy appearance due to varying degrees of viscosity and the presence or absence of clots. The Clements test could be adapted to the bovine species by the modification consisting in the addition of 3mL of amniotic fluid and 1mL of 95% ethanol. The methodology of the lamellar body count by the automated particle counter is not applicable for the bovine because of the small size of their lamellar body. The Nile Blue staining is unsatisfactory on predicting fetal maturity on the bovine species, different from cytology using Hematoxylin-Shorr stain. The presence of orange cells, increase in large amounts at the end of pregnancy. The cell stained orange counting, cells which are found in great amounts at the end of pregnancy. The present study stablished new parameters for evaluation of fetal and pulmonary maturity in the bovine species.

RESUMO: O objetivo desse estudo foi reunir novos dados práticos sobre a avaliação da maturidade pulmonar em neonatos bovinos, padronizando as características do líquido amniótico de bezerros maduros e hígidos, o que proporcionará a oportunidade de tratamento precoce dos animais prematuros, evitando prejuízos econômicos, principalmente quando consideramos os animais de alto valor genético. Amostras de líquido amniótico foram coletadas de 50 vacas da Raça Holandesa Preta e Branca. Corpos lamelares foram identificados por microscopia eletrônica de transmissão como estruturas de tamanho aproximado de 130nm, o que impede sua contagem em analisadores automáticos. O teste de Clements sofreu adaptações de técnica e se mostrou viável com a diluição de 3mL de líquido amniótico em 1mL de etanol a 95%. A citologia utilizando o método de Hematoxilina-Shorr, diferentemente do teste de Azul de Nilo, foi eficaz na identificação das células orangiofílicas, indicativas de maturidade fetal. Esses métodos mostraram-se originais e úteis ferramentas para a avaliação de maturidade pulmonar na espécie bovina, porém estudos com bezerros prematuros ainda são necessários.

Use of two new formulations as bovine embryo manipulation solution

This study aimed to evaluate the effect of two Embryo Manipulation Solutions (EMS and EMS supplemented) in maintenance of the viability of embryos, initially using structures derived from mice (first phase). Next, the efficiency of these solutions in routines of bovine embryo transfer was evaluated (second stage). Mice embryos were used in the stages of early blastocyst, and compact morula grades I and II. These embryos were initially randomly distributed and maintained for four hours in three solutions: Modified phosphate buffered saline (PBS; Control); EMS (treatment 1), and EMS supplemented (treatment 2). Subsequently, they were cultured in TCM 199 medium and evaluated in terms of total number of cells, morphometric characteristics, ultra structural aspects, detection of cell apoptosis, and quantification of Hsp70.3 gene expression. In the second phase, these same solutions were tested in the transfer of quality I and II bovine embryos (excellent and good). These embryos were transferred fresh to 58 recipients. The results showed that the total number of cells in embryos expanded blastocyst (ExB), the number of apoptotic cells, the cell, nuclear, nucleolar diameter and the nucleus/nucleolus ratio was similar among the treatments. The pregnancy rate shown on second phase was also similar. However, the EMS supplemented expressed more Hsp70.3 than EMS. The expression of Hsp70.3 was also greater for embryos in EMS than that of EMS supplemented. The McII embryos, EMS and EMS supplemented samples also expressed more Hsp70.3 compared to control embryos. In conclusion, the tested solutions can be used in routine embryo transfer techniques, replacing modified PBS solution as an effective media in maintaining embryo viability.

Evaluation of pulmonary maturity in bovine neonates: analysis of amniotic fluid / Avaliação maturidade pulmonar em neonatos bovinos: análise do líquido amniótico

Considering the representativeness of dairy cattle in our country, the concern about the mortality rates of the animals increases each time. Regarding to calf mortality, the Respiratory Distress Syndrome (RDS) has an important relevance during the neonatal period, and it is present in immature lungs. The amniotic fluid is in direct contact with the fetus, and it is able to offer evidence about his maturity. The aim of this study was to standardize the characteristics of the amniotic fluid, color, aspect, viscosity, quantification of lamellar body and surfactant evaluation by the Clements test and cytology, of term-born, mature and healthy calves. There were used 50 Black and White Holstein calves, which mothers were observed at calving in order to collect the amniotic fluid by puncture in the moment of exposure of the fetal membrane through the vaginal canal. Most amniotic fluid had a clear and hazy appearance due to varying degrees of viscosity and the presence or absence of clots. The Clements test could be adapted to the bovine species by the modification consisting in the addition of 3mL of amniotic fluid and 1mL of 95% ethanol. The methodology of the lamellar body count by the automated particle counter is not applicable for the bovine because of the small size of their lamellar body. The Nile Blue staining is unsatisfactory on predicting fetal maturity on the bovine species, different from cytology using Hematoxylin-Shorr stain. The presence of orange cells, increase in large amounts at the end of pregnancy. The cell stained orange counting, cells which are found in great amounts at the end of pregnancy. The present study stablished new parameters for evaluation of fetal and pulmonary maturity in the bovine species.(AU)

O objetivo desse estudo foi reunir novos dados práticos sobre a avaliação da maturidade pulmonar em neonatos bovinos, padronizando as características do líquido amniótico de bezerros maduros e hígidos, o que proporcionará a oportunidade de tratamento precoce dos animais prematuros, evitando prejuízos econômicos, principalmente quando consideramos os animais de alto valor genético. Amostras de líquido amniótico foram coletadas de 50 vacas da Raça Holandesa Preta e Branca. Corpos lamelares foram identificados por microscopia eletrônica de transmissão como estruturas de tamanho aproximado de 130nm, o que impede sua contagem em analisadores automáticos. O teste de Clements sofreu adaptações de técnica e se mostrou viável com a diluição de 3mL de líquido amniótico em 1mL de etanol a 95%. A citologia utilizando o método de Hematoxilina-Shorr, diferentemente do teste de Azul de Nilo, foi eficaz na identificação das células orangiofílicas, indicativas de maturidade fetal. Esses métodos mostraram-se originais e úteis ferramentas para a avaliação de maturidade pulmonar na espécie bovina, porém estudos com bezerros prematuros ainda são necessários.(AU)

Use of two new formulations as bovine embryo manipulation solution

This study aimed to evaluate the effect of two Embryo Manipulation Solutions (EMS and EMS supplemented) in maintenance of the viability of embryos, initially using structures derived from mice (first phase). Next, the efficiency of these solutions in routines of bovine embryo transfer was evaluated (second stage). Mice embryos were used in the stages of early blastocyst, and compact morula grades I and II. These embryos were initially randomly distributed and maintained for four hours in three solutions: Modified phosphate buffered saline (PBS; Control); EMS (treatment 1), and EMS supplemented (treatment 2). Subsequently, they were cultured in TCM 199 medium and evaluated in terms of total number of cells, morphometric characteristics, ultra structural aspects, detection of cell apoptosis, and quantification of Hsp70.3 gene expression. In the second phase, these same solutions were tested in the transfer of quality I and II bovine embryos (excellent and good). These embryos were transferred fresh to 58 recipients. The results showed that the total number of cells in embryos expanded blastocyst (ExB), the number of apoptotic cells, the cell, nuclear, nucleolar diameter and the nucleus/nucleolus ratio was similar among the treatments. The pregnancy rate shown on second phase was also similar. However, the EMS supplemented expressed more Hsp70.3 than EMS. The expression of Hsp70.3 was also greater for embryos in EMS than that of EMS supplemented. The McII embryos, EMS and EMS supplemented samples also expressed more Hsp70.3 compared to control embryos. In conclusion, the tested solutions can be used in routine embryo transfer techniques, replacing modified PBS solution as an effective media in maintaining embryo viability.(AU)

Evaluation of pulmonary maturity in bovine neonates: analysis of amniotic fluid / Avaliação maturidade pulmonar em neonatos bovinos: análise do líquido amniótico

Considering the representativeness of dairy cattle in our country, the concern about the mortality rates of the animals increases each time. Regarding to calf mortality, the Respiratory Distress Syndrome (RDS) has an important relevance during the neonatal period, and it is present in immature lungs. The amniotic fluid is in direct contact with the fetus, and it is able to offer evidence about his maturity. The aim of this study was to standardize the characteristics of the amniotic fluid, color, aspect, viscosity, quantification of lamellar body and surfactant evaluation by the Clements test and cytology, of term-born, mature and healthy calves. There were used 50 Black and White Holstein calves, which mothers were observed at calving in order to collect the amniotic fluid by puncture in the moment of exposure of the fetal membrane through the vaginal canal. Most amniotic fluid had a clear and hazy appearance due to varying degrees of viscosity and the presence or absence of clots. The Clements test could be adapted to the bovine species by the modification consisting in the addition of 3mL of amniotic fluid and 1mL of 95% ethanol. The methodology of the lamellar body count by the automated particle counter is not applicable for the bovine because of the small size of their lamellar body. The Nile Blue staining is unsatisfactory on predicting fetal maturity on the bovine species, different from cytology using Hematoxylin-Shorr stain. The presence of orange cells, increase in large amounts at the end of pregnancy. The cell stained orange counting, cells which are found in great amounts at the end of pregnancy. The present study stablished new parameters for evaluation of fetal and pulmonary maturity in the bovine species.(AU)

O objetivo desse estudo foi reunir novos dados práticos sobre a avaliação da maturidade pulmonar em neonatos bovinos, padronizando as características do líquido amniótico de bezerros maduros e hígidos, o que proporcionará a oportunidade de tratamento precoce dos animais prematuros, evitando prejuízos econômicos, principalmente quando consideramos os animais de alto valor genético. Amostras de líquido amniótico foram coletadas de 50 vacas da Raça Holandesa Preta e Branca. Corpos lamelares foram identificados por microscopia eletrônica de transmissão como estruturas de tamanho aproximado de 130nm, o que impede sua contagem em analisadores automáticos. O teste de Clements sofreu adaptações de técnica e se mostrou viável com a diluição de 3mL de líquido amniótico em 1mL de etanol a 95%. A citologia utilizando o método de Hematoxilina-Shorr, diferentemente do teste de Azul de Nilo, foi eficaz na identificação das células orangiofílicas, indicativas de maturidade fetal. Esses métodos mostraram-se originais e úteis ferramentas para a avaliação de maturidade pulmonar na espécie bovina, porém estudos com bezerros prematuros ainda são necessários.(AU)

Mid-pregnancy ewe shearing and the effects on fetus liver and muscle glycoprotein deposits

The reason why shearing ewes in midpregnancy does increase the lamb birth weight is not completely clears. Therefore, we focused on the analyses of the deposition of glycogen in different fetal tissues to investigate this issue. Thirteen pregnant Australian Merino ewes, raised in native pasture, were separated in two groups. One group (n = 7) was shorn (SE) at 70 days of pregnancy, whereas another group (n = 6) remained unshorn (NSE). Cesarean section was conducted in all the ewes at near parturition, when placenta and fetuses sampling were collected. Placenta, liver and muscle samples were fixed and stained with glycoproteinreactive acid-Schiff acid for analysis under light microscopy. The quantification of these glycoproteins was performed with the support of a program that analyzes the measurement of the intensity of staining by field. Five random fields from each sample were used, where statistical analyzes was used as normal test T. Among the analyzed regions, the deposition of glycoprotein between SE and NSE groups was statistically different in the hepatic portal vein (54,499.23 µm2 in SE and 34,830.73 µm2 in NSE) and in the total muscle area of the sample fragment (41,128, 7 µm2 and 31,942.7 µm2 , respectively; P < 0.05). We conclude that shearing ewes at the 70th day of gestation lead to accumulation of glycoproteins in the liver and muscle of fetuses, which may be responsible for the increase in birth weights in that group.(AU)

Mid-pregnancy ewe shearing and the effects on fetus liver and muscle glycoprotein deposits

The reason why shearing ewes in midpregnancy does increase the lamb birth weight is not completely clears. Therefore, we focused on the analyses of the deposition of glycogen in different fetal tissues to investigate this issue. Thirteen pregnant Australian Merino ewes, raised in native pasture, were separated in two groups. One group (n = 7) was shorn (SE) at 70 days of pregnancy, whereas another group (n = 6) remained unshorn (NSE). Cesarean section was conducted in all the ewes at near parturition, when placenta and fetuses sampling were collected. Placenta, liver and muscle samples were fixed and stained with glycoproteinreactive acid-Schiff acid for analysis under light microscopy. The quantification of these glycoproteins was performed with the support of a program that analyzes the measurement of the intensity of staining by field. Five random fields from each sample were used, where statistical analyzes was used as normal test T. Among the analyzed regions, the deposition of glycoprotein between SE and NSE groups was statistically different in the hepatic portal vein (54,499.23 µm2 in SE and 34,830.73 µm2 in NSE) and in the total muscle area of the sample fragment (41,128, 7 µm2 and 31,942.7 µm2 , respectively; P < 0.05). We conclude that shearing ewes at the 70th day of gestation lead to accumulation of glycoproteins in the liver and muscle of fetuses, which may be responsible for the increase in birth weights in that group.

Fetal sexing in small ruminants through visualization of the genital tubercle / Sexagem fetal em pequenos ruminantes por meio da visibilização do tubérculo genital

The objective of this study was to verify the accuracy of sexing and fetal number estimation in small ruminants by ultrasonographic examination. Fifty fetuses from 36 sheep and 23 fetuses from 11 goats were evaluated. In the case of sheep, twenty-four, ten, and two pregnancy were single, double, and triple, respectively. Regarding the goats, three, five, two, and one simple pregnancy were single, double, triple, and quadruple, respectively. The evaluations were performed on days 55 and 65 of gestation, by means of transrectal ultrasonographic examination, using a dual-frequency linear transducer, (6.0 and 8.0 MHz). Fetal sex was diagnosed by the location of the genital tubercle or visualization of external genitalia. The accuracy of fetal sexing was evaluated using the Chi-square test (X2) considering a 5% significance level. The gestational period interfered in the accuracy of fetal sexing in both species (P 0.05). Obtained results showed 30% and 82.61% accuracy on day 55 of gestation, and 90% and 95.83% on day 65 for goats and sheep, respectively. The fetal sex and the type of pregnancy did not interfere in the sexing accuracy in both species during the evaluated periods (P> 0.05). Thus, B-mode ultrasonography is an efficient method to perform an early diagnosis of fetal sex and to determine the number of fetuses in the studied small ruminants on day 65 of gestation. In addition, the accuracy of fetal sexing is not influenced by the type of pregnancy or fetal sex.(AU)

O objetivo com este estudo foi verificar a acurácia da sexagem e da estimativa do número fetal em pequenos ruminantes por meio de exame ultrassonográfico. Foram avaliados 50 fetos de 36 ovelhas e 23 fetos de 11 cabras. No caso das ovelhas, 24, 10 e duas gestações foram simples, duplas e triplas, respectivamente. Enquanto nas cabras, três, cinco, duas e uma gestação foram simples, duplas, triplas e quádrupla, respectivamente. As avaliações foram realizadas aos 55 e 65 dias de gestação, por meio de exame ultrassonográfico transretal, utilizando-se um transdutor linear de dupla frequência (6,0 e 8,0 MHz). O sexo fetal foi diagnosticado pela localização do tubérculo genital ou visibilização da genitália externa. A acurácia da sexagem fetal foi avaliada por meio do teste Qui-quadrado (X2) considerando 5% de significância. O período gestacional interferiu (P 0,05) na acurácia da sexagem fetal. Obteve-se 30% e 82,61% de acurácia aos 55 dias de gestação, e 90% e 95,83% aos 65 dias, para cabras e ovelhas, respectivamente. O sexo fetal e o tipo de gestação não interferiram (P>0,05) na acurácia da sexagem em ambas as espécies nos períodos avaliados. Desta forma, a ultrassonografia em modo-B é um método eficiente para realização de diagnóstico precoce do sexo fetal e para determinação do número de fetos nos pequenos ruminantes no 65° dia da gestação, além disso, a acurácia da sexagem fetal não é influenciada pelo tipo de gestação, nem pelo sexo fetal.(AU)

Fetal sexing in small ruminants through visualization of the genital tubercle / Sexagem fetal em pequenos ruminantes por meio da visibilização do tubérculo genital

The objective of this study was to verify the accuracy of sexing and fetal number estimation in small ruminants by ultrasonographic examination. Fifty fetuses from 36 sheep and 23 fetuses from 11 goats were evaluated. In the case of sheep, twenty-four, ten, and two pregnancy were single, double, and triple, respectively. Regarding the goats, three, five, two, and one simple pregnancy were single, double, triple, and quadruple, respectively. The evaluations were performed on days 55 and 65 of gestation, by means of transrectal ultrasonographic examination, using a dual-frequency linear transducer, (6.0 and 8.0 MHz). Fetal sex was diagnosed by the location of the genital tubercle or visualization of external genitalia. The accuracy of fetal sexing was evaluated using the Chi-square test (X2) considering a 5% significance level. The gestational period interfered in the accuracy of fetal sexing in both species (P 0.05). Obtained results showed 30% and 82.61% accuracy on day 55 of gestation, and 90% and 95.83% on day 65 for goats and sheep, respectively. The fetal sex and the type of pregnancy did not interfere in the sexing accuracy in both species during the evaluated periods (P> 0.05). Thus, B-mode ultrasonography is an efficient method to perform an early diagnosis of fetal sex and to determine the number of fetuses in the studied small ruminants on day 65 of gestation. In addition, the accuracy of fetal sexing is not influenced by the type of pregnancy or fetal sex.

O objetivo com este estudo foi verificar a acurácia da sexagem e da estimativa do número fetal em pequenos ruminantes por meio de exame ultrassonográfico. Foram avaliados 50 fetos de 36 ovelhas e 23 fetos de 11 cabras. No caso das ovelhas, 24, 10 e duas gestações foram simples, duplas e triplas, respectivamente. Enquanto nas cabras, três, cinco, duas e uma gestação foram simples, duplas, triplas e quádrupla, respectivamente. As avaliações foram realizadas aos 55 e 65 dias de gestação, por meio de exame ultrassonográfico transretal, utilizando-se um transdutor linear de dupla frequência (6,0 e 8,0 MHz). O sexo fetal foi diagnosticado pela localização do tubérculo genital ou visibilização da genitália externa. A acurácia da sexagem fetal foi avaliada por meio do teste Qui-quadrado (X2) considerando 5% de significância. O período gestacional interferiu (P 0,05) na acurácia da sexagem fetal. Obteve-se 30% e 82,61% de acurácia aos 55 dias de gestação, e 90% e 95,83% aos 65 dias, para cabras e ovelhas, respectivamente. O sexo fetal e o tipo de gestação não interferiram (P>0,05) na acurácia da sexagem em ambas as espécies nos períodos avaliados. Desta forma, a ultrassonografia em modo-B é um método eficiente para realização de diagnóstico precoce do sexo fetal e para determinação do número de fetos nos pequenos ruminantes no 65° dia da gestação, além disso, a acurácia da sexagem fetal não é influenciada pelo tipo de gestação, nem pelo sexo fetal.

Distribution of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in bovine fetal tissue of the placenta / Distribuição de 5-metilcitosina e 5-hidroximetilcitosina em placenta fetal bovina

5-methylcytosine (5-mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) are modified cytosines found in mammals that are involved in the regulation of gene expression. The aim of this study was to characterize the global patterns of 5-mC and 5-hmC of the fetal placenta of Nellore cattle as well as blood and sperm as controls. 5-mC and 5-hmC levels were determined using MethylFlash Methylated/Hydroxymethylated DNA Quantification Kit, respectively. Placenta tissues showed lower levels of 5-mC and 5-hmC compared to sperm. The male cotyledon showed higher levels of 5-hmC than the female. For the first time, the levels of 5-mC and 5-hmC in Bos taurus indicus were characterized, which may contribute to our understanding of the mechanisms of epigenetic regulation in the placenta. The presence of 5-hmC in somatic tissues suggest that 5-hmC has its own biological function and it is not only a byproduct from the oxidation of 5-mC. These results may be of interest in ARTs, especially in cloning in the diagnosis/prognosis of aberrant placentation and the viability of pregnancies.(AU)

5-metilcitosina (5-mC) e 5-hidroximetilcitosina (5-hmC) são citosinas modificadas encontradas nos mamíferos que estão envolvidas com a regulação da expressão gênica. O objetivo do presente estudo foi caracterizar os padrões globais de 5-mC e 5-hmC em placenta fetal de animais da raça Nelore, assim como em sangue e espermatozoides, usados como controles. Os níveis de 5-mC e 5-hmC foram determinados usando os kits MethylFlash Methylated/Hydroxymethylated DNA Quantification, respectivamente. Tecidos placentários apresentaram menores níveis de 5-mC e 5-hmC quando comparados com espermatozoides. Cotilédones de machos apresentaram maiores níveis de 5-hmC do que os de fêmeas. Os níveis de 5-mC e 5-hmC em animais Bos taurus indicus foram caracterizados pela primeira vez, o que pode contribuir para o nosso conhecimento sobre a regulação dos mecanimos epigenéticos na placenta. A presença de 5-hmC em tecidos somáticos sugerem que essa base pode ter sua própria função biológica, sendo não somente um sub-produto da oxidação da 5-mC. Esses resultados podem ser de interesse nas Tecnologias de Reprodução Assistida, especialmente na clonagem, no diagnóstico/prognóstico de placentação aberrante e viabilidade da progênie.(AU)

Distribution of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in bovine fetal tissue of the placenta / Distribuição de 5-metilcitosina e 5-hidroximetilcitosina em placenta fetal bovina

5-methylcytosine (5-mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) are modified cytosines found in mammals that are involved in the regulation of gene expression. The aim of this study was to characterize the global patterns of 5-mC and 5-hmC of the fetal placenta of Nellore cattle as well as blood and sperm as controls. 5-mC and 5-hmC levels were determined using MethylFlash Methylated/Hydroxymethylated DNA Quantification Kit, respectively. Placenta tissues showed lower levels of 5-mC and 5-hmC compared to sperm. The male cotyledon showed higher levels of 5-hmC than the female. For the first time, the levels of 5-mC and 5-hmC in Bos taurus indicus were characterized, which may contribute to our understanding of the mechanisms of epigenetic regulation in the placenta. The presence of 5-hmC in somatic tissues suggest that 5-hmC has its own biological function and it is not only a byproduct from the oxidation of 5-mC. These results may be of interest in ARTs, especially in cloning in the diagnosis/prognosis of aberrant placentation and the viability of pregnancies.(AU)

5-metilcitosina (5-mC) e 5-hidroximetilcitosina (5-hmC) são citosinas modificadas encontradas nos mamíferos que estão envolvidas com a regulação da expressão gênica. O objetivo do presente estudo foi caracterizar os padrões globais de 5-mC e 5-hmC em placenta fetal de animais da raça Nelore, assim como em sangue e espermatozoides, usados como controles. Os níveis de 5-mC e 5-hmC foram determinados usando os kits MethylFlash Methylated/Hydroxymethylated DNA Quantification, respectivamente. Tecidos placentários apresentaram menores níveis de 5-mC e 5-hmC quando comparados com espermatozoides. Cotilédones de machos apresentaram maiores níveis de 5-hmC do que os de fêmeas. Os níveis de 5-mC e 5-hmC em animais Bos taurus indicus foram caracterizados pela primeira vez, o que pode contribuir para o nosso conhecimento sobre a regulação dos mecanimos epigenéticos na placenta. A presença de 5-hmC em tecidos somáticos sugerem que essa base pode ter sua própria função biológica, sendo não somente um sub-produto da oxidação da 5-mC. Esses resultados podem ser de interesse nas Tecnologias de Reprodução Assistida, especialmente na clonagem, no diagnóstico/prognóstico de placentação aberrante e viabilidade da progênie.(AU)

Técnicas de citologia aspirativa, biópsia e citobloco de medula óssea para identificação e determinação de intensidade parasitária na leishmaniose visceral canina / Techniques of aspiration cytology, biopsy and cell block of the bone marrow for the identification and determination of parasite intensity in Canine Visceral Leishmaniasis

O objetivo com este estudo foi comparar as técnicas de citologia aspirativa, biópsia e citobloco para identificação e quantificação parasitológica de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em medula óssea de cães. Amostras de tecido medular de 26 animais, em diferentes estágios clínico-laboratoriais da doença, foram estudadas obedecendo-se os mesmos critérios de investigação nas técnicas de citologia aspirativa, biópsia e citobloco. O menor número de campos para a confirmação parasitológica foi constatado no esfregaço direto obtido por citologia aspirativa. O estágio clínico-laboratorial não influenciou no número de campos necessários para a primeira visualização do agente em nenhuma das técnicas (p>0,05), e menor intensidade parasitária foi observada nas lâminas de citobloco. As técnicas de citologia aspirativa e biópsia concordaram na estimativa do coeficiente de infectividade no tecido estudado (p<0,05). Apesar de a técnica de citobloco permitir a concentração de células e o melhor reaproveitamento de amostras, não demonstrou ser um método adequado para rápida identificação e quantificação parasitológica na leishmaniose visceral canina. Considerando-se suas vantagens, a citologia aspirativa foi o melhor método para detecção microscópica do parasito e determinação do nível de intensidade parasitária no tecido estudado.(AU)

The aim of the present study was to compare the aspiration cytology, biopsy and cell block techniques for identification and parasitological quantification of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi in dog bone marrow. Bone marrow tissue samples from 26 animals, in different clinical-laboratory stages of the disease, were studied according to the same criteria of investigation in the aspiration cytology, biopsy and cell block techniques. The lowest number of fields for the parasitological confirmation was found in the direct smear obtained by aspiration cytology. The clinical-laboratory stage did not influence the number of fields required for the first visualization of the agent in any of the techniques (p> 0.05) and less parasitic intensity was observed in the cell block slides. The aspiration cytology and biopsy techniques agreed on the estimation of infectivity coefficient in the tissue studied (p< 0.05). Although the cell block technique allows the concentration of cells and better reutilization of samples, it has not been shown to be an adequate method for rapid identification and parasitological quantification in canine visceral leishmaniasis. Considering its advantages, aspiration cytology was the best method for microscopic detection of the parasite and determination of the level of parasite intensity in the tissue studied.(AU)

Técnicas de citologia aspirativa, biópsia e citobloco de medula óssea para identificação e determinação de intensidade parasitária na leishmaniose visceral canina / Techniques of aspiration cytology, biopsy and cell block of the bone marrow for the identification and determination of parasite intensity in Canine Visceral Leishmaniasis

O objetivo com este estudo foi comparar as técnicas de citologia aspirativa, biópsia e citobloco para identificação e quantificação parasitológica de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em medula óssea de cães. Amostras de tecido medular de 26 animais, em diferentes estágios clínico-laboratoriais da doença, foram estudadas obedecendo-se os mesmos critérios de investigação nas técnicas de citologia aspirativa, biópsia e citobloco. O menor número de campos para a confirmação parasitológica foi constatado no esfregaço direto obtido por citologia aspirativa. O estágio clínico-laboratorial não influenciou no número de campos necessários para a primeira visualização do agente em nenhuma das técnicas (p>0,05), e menor intensidade parasitária foi observada nas lâminas de citobloco. As técnicas de citologia aspirativa e biópsia concordaram na estimativa do coeficiente de infectividade no tecido estudado (p<0,05). Apesar de a técnica de citobloco permitir a concentração de células e o melhor reaproveitamento de amostras, não demonstrou ser um método adequado para rápida identificação e quantificação parasitológica na leishmaniose visceral canina. Considerando-se suas vantagens, a citologia aspirativa foi o melhor método para detecção microscópica do parasito e determinação do nível de intensidade parasitária no tecido estudado.(AU)

The aim of the present study was to compare the aspiration cytology, biopsy and cell block techniques for identification and parasitological quantification of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi in dog bone marrow. Bone marrow tissue samples from 26 animals, in different clinical-laboratory stages of the disease, were studied according to the same criteria of investigation in the aspiration cytology, biopsy and cell block techniques. The lowest number of fields for the parasitological confirmation was found in the direct smear obtained by aspiration cytology. The clinical-laboratory stage did not influence the number of fields required for the first visualization of the agent in any of the techniques (p> 0.05) and less parasitic intensity was observed in the cell block slides. The aspiration cytology and biopsy techniques agreed on the estimation of infectivity coefficient in the tissue studied (p< 0.05). Although the cell block technique allows the concentration of cells and better reutilization of samples, it has not been shown to be an adequate method for rapid identification and parasitological quantification in canine visceral leishmaniasis. Considering its advantages, aspiration cytology was the best method for microscopic detection of the parasite and determination of the level of parasite intensity in the tissue studied.(AU)

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação

ABSTRACT The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P 0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P 0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.

RESUMO Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P 0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P 0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação / Effect of conjugated linoleic acid addition in in vitro culture medium in F1 Holstein X Zebu embryo survival post vitrification

Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P<0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P<0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.(AU)

The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P <0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P<0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.(AU)

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação / Effect of conjugated linoleic acid addition in in vitro culture medium in F1 Holstein X Zebu embryo survival post vitrification

Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P<0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P<0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.(AU)

The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P <0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P<0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.(AU)

Utilização da LAMP (amplificação isotermal mediada por Loop) como ferramenta para determinação do sexo na espécie eqüina

A sexagem fetal em equinos representa uma abordagem de grande importância para a equideocultura. Através da determinação do sexo do feto, tomadas de decisões por parte do produtor podem ser realizadas quanto ao concepto, como, a manutenção do potro no plantel, venda e determinação do valor da venda, utilização para determinada atividade, entre outros. Algumas técnicas já são utilizadas com essa finalidade, como ultrassonografia, aplicações moleculares, bioquímicas e citogenéticas, porém, o longo tempo empregado nas técnicas, a necessidade de mão-de-obra treinada, e a utilização de equipamentos laboratoriais caros, oneram e restringem a sua realização. O objetivo deste trabalho é desenvolver um protocolo baseado na técnica de LAMP (Amplificação Isoretmal Mediada por Loop) para sexagem de equinos que possa ser aplicada para a sexagem fetal utilizando o DNA circulante no sangue materno. Para isso, foram realizados estudos para a identificação de genes macho específicos, que foram determinantes para o desenvolvimento do trabalho in silico, com desenhos e análise de primers e na otimização das técnicas da Reação em cadeia da Polimerase (PCR) e LAMP. Foi coletado sangue de 10 cavalos e 10 éguas e realizada ainda a quantificação e diluição do DNA obtido para a determinação da quantidade mínima de DNA necessário para obtenção de resultados esperados. Através dessa quantificação a menor concentração adotada para a otimização da etapa colorimétrica na técnica de LAMP foi de 0,004 ng/L de DNA. Após a otimização, foi coletado sangue venoso de 13 éguas prenhas, nos tempos de 30, 60, 90 dias de gestação, e, através da extração de DNA do plasma sanguíneo, foi realizado o teste de diagnóstico do sexo dos fetos por LAMP. Como resultados das otimizações da PCR e LAMP foi verificado que é possível diagnosticar o sexo dos equinos através dos genes escolhidos. No entanto, não se obteve resultado quanto a sexagem fetal utilizando o sangue materno até os 90 dias de gestação. Assim, considera-se a necessidade de realização de testes de diagnóstico fetal com a ampliação do período de coleta do sangue materno, quanto a idade gestacional das éguas, no terço médio e final da gestação.

The equine fetal sexing represents a great important subject for an equine culture. Through the fetal gender determination, producer decisions may be taken regarding the conceptus, as a foal maintenance in a squad, sale and sale price determination, assignment for a given task, and others. Some techniques have already been used for this goal, as ultrasound, molecular, biochemical and cytogenetics applications, however, the long time period required for each technique of those, specialized labor skills needs and expensive laboratory equipment burden this realization. The aim of this study is to develop an equine sexing protocol based on LAMP technique allowed to be applied to fetal sexing using the DNA that flows into maternal blood. Therefore, studies were performed to identify specific male genes that were determinants to in silico work development, with drawings and primers analysis and optimization of Polymerase Chain Reaction (PCR) and LAMP technique. Blood of 10 male and 10 female horses were collected and the quantification and dilution of DNA obtained were done to determinate the minimum amount DNA required to expected results. Through this quantification, the least adopted concentration to the optimization of colorimetric step in a LAMP technique was 0,004 ng/L of DNA. After optimization, venous blood of 13 male inseminated horses were collected, at times of 30, 60, 90 days after and, through the DNA plasma blood extraction, the fetal gender diagnostic test were made by LAMP. As an optimization of PCR and LAMP results were verified that is possible the equine sex diagnosis by the choose genes. However, results about fetal sexing were no obtained using maternal blood until 90 days of pregnancy. So that, the necessity carrying out fetal diagnostic tests with the extension of the maternal blood collection period regarding the gestational age of the mares, for the middle and final third of gestation.

AVALIAÇÃO HISTOMOLECULAR DA DIMENSÃO FRACTAL E DA REMODELAÇÃO DA MATRIZ EXTRACELULAR DURANTE O DESENVOLVIMENTO OVARIANO

Avaliação histomolecular da dimensão fractal e da remodelação da matriz extracelular durante o desenvolvimento ovariano A fisiologia reprodutiva de fêmeas mamíferas é distinta em decorrência de sua fase estral, formação dos gametas femininos e dos folículos ovarianos iniciada no período pré-natal. O aparecimento dos estágios pré-antrais no ovário tem padrão temporal espécie-específico. Em fêmeas de Bos taurus indicus, estudos já demonstraram que folículos primordiais, primários e secundários aparecem próximo aos 90, 120 e 150 dias de gestação, respectivamente. Embora os estudos foquem na remodelação da matriz extracelular (MEC) durante a formação e funcionalidade de ovários adultos, há escassez no entendimento sobre os mecanismos que controlam a formação dos folículos pré-antrais durante a gestação. O objetivo do estudo foi caracterizar o fenótipo histomolecular do remodelamento MEC através da dimensão fractal (DF), quantificação de colágeno e perfil de transcritos envolvidos com remodelação de MEC em ovários de fetos bovinos associados à temporalidade de formação dos folículos pré-antrais. Assim, a fim de investigar o remodelamento tecidual ao longo do desenvolvimento ovariano fetal, foi utilizado ovários de fetos para quantificar a DF, o colágeno total e a abundância relativa de mRNA de genes relacionados ao remodelamento da MEC (COL1A1, COL1A2, COL4A1, MMP2, MMP9, MMP14, TIMP1 e TIMP2). Para tanto, pares de ovários fetais foram obtidos de fêmeas Bos taurus indicus com 60, 90, 120 e 150 dias de gestação em matadouro, sendo um deles destinado à extração de RNA total e posterior investigação dos transcritos alvos e o outro para análise de colágeno total e DF. O presente estudo demonstrou que a partir dos 120 dias houve maior área de colágeno total no ovário fetal. Nas análises de coloração em hematoxilina eosina (HE), a DF foi menor aos 150 dias quando comparada aos 60 dias de gestação, todavia, apresentou padrão inverso na coloração de picrosirius. A expressão dos genes alvos da abundância relativa dos transcritos de mRNA para COL1A1, COL4A1, MMP2, MMP14, TIMP1 e TIMP2 foi maior aos 150 dias em comparação ao dia 60. Conclui-se que a dimensão fractal reflete às alterações morfológicas durante a organização estrutural do tecido ovariano fetal e que a expressão de genes relacionados ao remodelamento da MEC é modulada ao longo da gestação em ovários fetais bovinos.

Histomolecular evaluation of the fractal dimension and remodeling of the extracellular matrix during the ovarian development The reproductive physiology of female mammals is different due to their estrous phase, the formation of female gametes and ovarian follicles that started in the prenatal period. The appearance of preantral stages in the ovary has a species-specific temporal pattern. In females of Bos taurus indicus, studies have already shown that primordial, primary and secondary follicles appear close to 90, 120 and 150 days of gestation, respectively. Although studies have focused on remodeling the extracellular matrix (ECM) during the formation and functionality of adult ovaries, there is a lack of understanding about the mechanisms that control the formation of preantral follicles during pregnancy. The aim of the study was to characterize the histomolecular phenotype of ECM remodeling through the fractal dimension (FD), quantification of collagen and profile of transcripts involved with remodeling of ECM in ovaries of bovine fetuses associated with the temporality of formation of pre-antral follicles. Thus, in order to investigate tissue remodeling along fetal ovarian development, fetal ovaries were used to quantify FD, total collagen and relative mRNA abundance of genes related to ECM remodeling (COL1A1, COL1A2, COL4A1, MMP2, MMP9, MMP14, TIMP1 and TIMP2). For this purpose, pairs of fetal ovaries were obtained from Bos taurus indicus females at 60, 90, 120 and 150 days of gestation in a slaughterhouse, one of which was destined for the extraction of total RNA and further investigation of the target transcripts and the other for collagen analysis. total and FD. The present study demonstrated that after 120 days there was a greater area of total collagen in the fetal ovary. In the staining analyzes in hematoxylin eosin (HE), the FD was lower at 150 days when compared to 60 days of gestation, however, it presented an inverse pattern in the picrosirius staining. The expression of the target genes for the relative abundance of mRNA transcripts for COL1A1, COL4A1, MMP2, MMP14, TIMP1 and TIMP2 was greater at 150 days compared to day 60. It is concluded that the fractal dimension reflects the morphological changes during structural organization of fetal ovarian tissue and that the expression of genes related to ECM remodeling is modulated throughout pregnancy in fetal bovine ovaries.

Geração de organóides intestinais a partir de células-tronco derivadas do saco vitelino canino

Os organóides intestinais possuem grande relevância na terapia celular, pois fornecem informações mais precisas sobre a composição e arquitetura de tecidos em relação ao cultivo bidimensional, além de servir como modelo de estudo para interação de hospedeiros e testes de fármacos. O saco vitelino, membrana de nutrição fetal, é um dos responsáveis pela formação do epitélio intestinal durante o desenvolvimento embrionário. Com isso, este trabalho teve como objetivo verificar se o cultivo tridimensional in vitro de células-tronco derivadas do saco vitelino canino possui capacidade de desenvolver organóides intestinais. Células-tronco mesenquimais do saco vitelino canino foram isoladas e caracterizadas, sendo posteriormente cultivadas tridimensionalmente em Matrigel® sob diferentes condições de indução da diferenciação, sendo o próprio tecido do saco vitelino digerido também testado para este cultivo tridimensional, utilizando como grupo controle células-tronco intestinais caninas. As estruturas derivadas dos diferentes tipos de cultivo foram testadas com RT-qPCR para diferentes marcadores endodermais e intestinais, sendo a quantificação das amostras avaliada utilizando o método 2-CT. As estruturas tridimensionais derivadas do tecido do saco vitelino foram capazes de desenvolver morfologia semelhante ao grupo controle, possuindo marcação para células epiteliais intestinais e células do cólon intestinal. Enquanto que as estruturas derivadas do grupo das mesenquimais, apesar de apresentar expressão de células intestinais, não desenvolveu uma morfologia adequada. Concluindo assim que o saco vitelino canino possui capacidade para desenvolver organóides intestinais, enquanto que as células-tronco mesenquimais isoladas, apesar de serem capazes de sofrer diferenciação intestinal, não formam uma morfologia semelhante a organóides no cultivo tridimensional.

The intestinal organoids have great relevance in cell therapy, since they provide more precise information on the composition and architecture of tissues in relation to the two-dimensional culture, besides serving as a study model for host interaction and drug tests. The yolk sac, fetal nutrition membrane, is one of the responsible for the formation of the intestinal epithelium during the embryonic development. The objective of this study was to verify if the in vitro three-dimensional culture of stem cells derived from the canine yolk sac has the capacity to develop intestinal organoids. The mesenchymal stem cells of the canine yolk sac were isolated and characterized, and were subsequently cultured three-dimensionally in Matrigel® under different conditions of induction of differentiation, and the same yolk sac tissue was also tested for this three-dimensional culture using canine intestinal stem cell as control. The structures derived from the different culture types were tested with RT-qPCR for different endodermal and intestinal markers, and the quantification of the samples was evaluated using the 2-CT method. The three-dimensional structures derived from yolk sac tissue were able to develop similar morphology to the control group, expressing intestinal epithelial cells and intestinal colon cells genes. While the structures derived from the mesenchymal group, despite presenting intestinal cell expression, did not develop an adequate morphology. Concluding that the canine yolk sac is capable of developing intestinal organoids, whereas isolated mesenchymal stem cells, although capable of undergoing intestinal differentiation, do not form organoids-like structures in three-dimensional culture.

Avaliação imunofenotípica de subpopulações linfocitárias no sangue do cordão umbilical e periférico de suínos neonatos (Sus scrofa) / Imunophenotyping avaliation of lymphocyte subsets in cord blood and peripheral blood of newborn piglets (Sus scrofa)

Considerando a importância do uso do sangue do cordão umbilical como fonte potencial de células tronco hematopoiéticas e o uso do suíno doméstico (Sus scrofa) como modelo para pesquisas biomédicas em medicina regenerativa, e por outro lado, visando dar um contributo sobre a quantificação das subpopulações linfocitárias no sangue do cordão umbilical e periférico, objetivou-se quantificar as células CD4+, CD5+ e CD8+ nas amostras de sangue de suínos neonatos. Analisaram-se as amostras do sangue do cordão umbilical e periférico de 48 leitões de linhagem Topigs, provenientes de porcas hígidas, inseminadas artificialmente e de parto natural. Foram coletadas amostras de sangue do cordão umbilical e periférico no momento do nascimento, por meio de venopunção da veia umbilical e seio venoso retro-oftálmico, respectivamente. As quantificações imunofenotípicas de células CD4+, CD5+ e CD8+ foram obtidas por citometria de fluxo. Os valores médios obtidos para as contagens das células CD4+, CD5+ e CD8+ do sangue do cordão umbilical e periférico apresentaram-se inferiores aos reportados para o sangue periférico de suínos adultos, sugerindo um componente imunológico imaturo. A proporção CD4+:CD8+ obtida no sangue do cordão umbilical (3,2±1,2 por cento) e no sangue periférico (3,2±1,7 por cento) ilustrou a predominância dos linfócitos TCD4+ com relação aos TCD8+. A quantidade relativa de células CD4+ e CD8+ no sangue do cordão umbilical e periférico foi de 1,37±0,86 por cento e 1,15±0,57 por cento, respectivamente.(AU)

Considering the importance of umbilical cord blood as a potential source of stem cell and, on the other hand, the use of the domestic swine (Sus scrofa) as a useful model for biomedical research in regenerative medicine and aiming to contribute about the quantification of lymphocyte subsets in umbilical cord blood and peripheral blood of newborn piglets, this study aimed to quantify CD4+, CD5+ and CD8+ cells from umbilical cord blood and peripheral blood from pigs at term blood samples. Were analyzed samples of the umbilical cord blood and peripheral of 48 piglets of Topigs lineage, from healthy mothers, artificially inseminated and natural birth. Blood samples were collected from the umbilical cord at birth, by the umbilical vein, and peripheral blood by venous sinus retro-ophthalmic. The immunological measurements of CD4+, CD5+ and CD8+ were obtained by flow cytometry. The relative average values for the CD4+, CD5+ e CD8+ counts in umbilical cord blood and peripheral blood of newborn piglets were inferior to those reported for peripheral blood in adult pigs, suggesting immunological immaturity. The ratio CD4+:CD8+ in umbilical cord blood (3.2±1.2 percent) and peripheral blood (3.2±1.7 percent) showed a predominance of TCD4+ over TCD8+. The percentage of CD4+ and CD8+ cells was 1.37±0.86 percent and 1.15±0.57 percent, respectively, in umbilical cord blood and peripheral blood.(AU)