The effect of adding L-ergothioneine in culture medium on blastocyst development rates

Background: Oocytes and embryos produce energy through mitochondrial oxidative phosphorylation by using oxygen. The membrane structure of the embryo is mostly composed of unsaturated fatty acids, for this reason DNA fragmentation, apoptosis, and abnormal gene expression are shaped as a result of the lipid peroxidation during culture. Oxidative stress (OS) is one of the most important problems affecting the in vitro embryo development. Antioxidant supplementation to the culture medium has been an alternative way to reduce cell damage caused by oxidative stress in in vitro embryo production systems. In this study, it was aimed to determine the effect of L-ergothioneine on blastocyst development when added to the culture medium. Materials, Methods & Results: The material of the study consisted of oocytes aspirated from the ovaries of Holstein cows which were collected from the local slaughterhouse. The ovaries were delivered to the laboratory within 2-3 h in a thermos which provided a constant temperature of 25-30o C with physiological saline (0.9%) containing antibiotics. All follicles in the 3-8 mm range on the ovaries were aspirated using 20 G needle. The collected follicle fluid was filtered through filters with a pore diameter of 70 micrometers. Cells remaining in the filter were washed with OPU medium and transferred to the petri dishes. Fluids were examined under a stereomicroscope. The cumulus-oocyte complexes were classified, and A and B quality oocytes were included to the study (A, B, C, and D quality COC). Oocytes aspirated from the ovaries and collected later on were incubated in IVM medium for 22 h. After maturation, it was taken into IVF medium, semen was added and incubated for 20-22 h. Possible zygotes to be taken to the culture stage were transferred to culture (IVC) drops with (L-ergothioneine 100 µL/mL (n:121) added and without antioxidant (control (n:124)), and kept in the incubator for 6-7 days. Evaluated on the 7th day differences in in vitro embryo production stages were evaluated with the Chi-square test. The study was run in 5 replicates each time, with at least 20 possible zygotes for per group being cultured. It was determined that 262 (87.33%) of a total of 300 oocytes undergoing in vitro maturation were matured. It was determined that 245 of the mature oocytes were fertilized (93.51%). The cleavage rates of the groups were determined as 87.60% and 86.29%, respectively. Eighty-two (33.47%) blastocysts were obtained from 245 zygotes taken into the culture stage, and the blastocyst rates in the groups were found to be 40.50% and 26.61%, respectively. After the study, it was determined that the statistical difference between L-ergothioneine and control in cleavage rates was insignificant (P > 0.05) and blastocyst rates was significant (P < 0.05) Discussion: Oxygen content above normal ratios can increase the formation of reactive oxygen species (ROS), particularly hydrogen peroxide (H2 O2 ), hydroxyl radical (HO·), and peroxyl radicals (ROO·). The increased rate of ROS negatively affects the success of IVP in mammalian embryos. It was observed that L-ergothioneine, which has high antioxidant activity, improved blastocyst development rates, and higher blastocyst rates could be achieved compared to the control group. By investigating the use of L-ergothioneine in different doses, it was thought that the dose with the highest antioxidant activity could be added to the culture medium in in vitro embryo production and more blastocysts could be produced.

Effects of treatment with quercetin on the quality of cryopreserved bovine semen

Background: Semen cryopreservation is one of the most common biotechnologies in the reproduction of animals ofagricultural interest, especially bulls. However, cryopreservation can be harmful to sperm cells, with susceptibility tooxidative stress being one of the causes. The addition of antioxidants such as quercetin may inhibit and/or reduce suchdamage, reducing fertility. Quercetin can increasing sperm motility and interaction capacity between spermatozoa-oocyte,to increase cellular metabolism and reduced DNA fragmentation and oxidation following thawing. Therefore, the objective of this study was to evaluate the protective effect of quercetin on the metabolism of bovine semen following thawing.Materials, Methods & Results: Three Brahman bulls in reproduction age and previously considered fit for reproductionwere used. The semen samples were collected via the electroejaculation method, and the samples were homogenized toform pooled semen from three ejaculates, which was diluted in Tris-yolk egg-glicerol diluent medium. Quercetin was addedto diluent, to final concentrations of 0, 5, 10, 15 and 20 μg.mL-1 in each group. The samples were kept frozen in strawsof 500 μL, with concentration of 40,000,000 spermatozoid / mL for 15 days and were thawed in water at 36°C for 30 s.All the tests was performed in five replicates. The cell metabolism status was evaluated by quantification of superoxideradical production with a nitroblue tetrazolium test (NBT) and scanning spectrophotometry. By spermatic evaluation, thefollowing parameters were evaluated via the computerized system of sperm analysis (CASA): total motility (TM, %),progressive motility (PM, %), velocity curved line (VCL, mm/s), velocity straight line (VSL, mm/s), velocity averagepath (VAP, mm/s), distance curved line (DCL, mm), distance straight line (DSL, mm), distance average path (DAP, mm),amplitude of lateral head displacement (ALH, mm), beat cross frequency (BCF, Hz), wobble...

Effects of treatment with quercetin on the quality of cryopreserved bovine semen

Background: Semen cryopreservation is one of the most common biotechnologies in the reproduction of animals ofagricultural interest, especially bulls. However, cryopreservation can be harmful to sperm cells, with susceptibility tooxidative stress being one of the causes. The addition of antioxidants such as quercetin may inhibit and/or reduce suchdamage, reducing fertility. Quercetin can increasing sperm motility and interaction capacity between spermatozoa-oocyte,to increase cellular metabolism and reduced DNA fragmentation and oxidation following thawing. Therefore, the objective of this study was to evaluate the protective effect of quercetin on the metabolism of bovine semen following thawing.Materials, Methods & Results: Three Brahman bulls in reproduction age and previously considered fit for reproductionwere used. The semen samples were collected via the electroejaculation method, and the samples were homogenized toform pooled semen from three ejaculates, which was diluted in Tris-yolk egg-glicerol diluent medium. Quercetin was addedto diluent, to final concentrations of 0, 5, 10, 15 and 20 μg.mL-1 in each group. The samples were kept frozen in strawsof 500 μL, with concentration of 40,000,000 spermatozoid / mL for 15 days and were thawed in water at 36°C for 30 s.All the tests was performed in five replicates. The cell metabolism status was evaluated by quantification of superoxideradical production with a nitroblue tetrazolium test (NBT) and scanning spectrophotometry. By spermatic evaluation, thefollowing parameters were evaluated via the computerized system of sperm analysis (CASA): total motility (TM, %),progressive motility (PM, %), velocity curved line (VCL, mm/s), velocity straight line (VSL, mm/s), velocity averagepath (VAP, mm/s), distance curved line (DCL, mm), distance straight line (DSL, mm), distance average path (DAP, mm),amplitude of lateral head displacement (ALH, mm), beat cross frequency (BCF, Hz), wobble...(AU)

Influência das endometrites nas estruturas ovarianas e qualidade oocitária em tratos reprodutivos post-mortem de vacas / Influence of endometritis on ovarian structures and oocyte quality in post mortem reproductive tract of cows

Objetivou-se no presente estudo estimar o percentual de endometrites clínicas (EC) e subclínicas (ES) em tratos reprodutivos post-mortem de fêmeas bovinas, verificando sua influência sobre as estruturas ovarianas, alterações presentes no ovário, número e qualidade de oócitos recuperados. Foram coletados e avaliados 171 tratos reprodutivos em matadouro frigorífico. As endometrites foram diagnosticadas por meio de citologia endometrial e pela presença e características das secreções uterinas. Os diagnósticos foram confirmados pela análise histopatológica, sendo avaliada a existência de infiltrados de células inflamatórias no endométrio. Os ovários foram avaliados macroscopicamente quanto à estrutura e alterações ovarianas. A qualidade oocitária foi avaliada de acordo com o número de camadas de células do cumulus e aspecto do citoplasma, sendo assim, classificados como: grau I (GI), grau II (GII), grau III (GIII) e grau IV (GIV). Dentre as peças avaliadas, 8,20% (n = 14) apresentaram EC e 4,10% (n = 7) foram diagnosticadas com ES. Observou-se que a presença de endometrites não exerceu efeito sobre as estruturas e alterações ovarianas, assim como não alterou o número de oócitos recuperados. Em relação ao grau de qualidade oocitária, foi encontrado variação entre os diferentes graus de qualidade dentro dos grupos, no entanto, não houve correlação aparente com a presença de infecção uterina.(AU)

The objective of this study was to estimate the percentage of clinical (CE) and subclinical (SE) endometritis in post mortem bovine reproductive tracts, analyzing their influence on ovarian structures, changes in the ovary, and number and quality of oocytes collected. Endometritis were diagnosed by endometrial cytology, and by the presence and characteristics of uterine secretions. The diagnosis was confirmed through histopathological analysis, by evaluating the presence of infiltrated inflammatory cells in the endometrium. The ovaries were macroscopically evaluated for presence of physiological structures and alterations. The oocyte quality evaluation was performed according to the number of cumulus cells layers and cytoplasmic aspect, being classified as: grade I (GI), grade II (GII), grade III (GIII) and grade IV (GIV). Among the uterus evaluated, 8,20% (n = 14) of the animals presented EC, and 4,10% (n = 7) were diagnosed with ES. It was observed that the presence of endometritis had no effect on ovarian structures and alterations, nor did it influence the number of oocytes collected. Regarding the degree of oocyte quality, a variation was found between the different grades of quality within the groups, however, there was no apparent correlation with the presence of uterine infection.(AU)

Influência das endometrites nas estruturas ovarianas e qualidade oocitária em tratos reprodutivos post-mortem de vacas / Influence of endometritis on ovarian structures and oocyte quality in post mortem reproductive tract of cows

Objetivou-se no presente estudo estimar o percentual de endometrites clínicas (EC) e subclínicas (ES) em tratos reprodutivos post-mortem de fêmeas bovinas, verificando sua influência sobre as estruturas ovarianas, alterações presentes no ovário, número e qualidade de oócitos recuperados. Foram coletados e avaliados 171 tratos reprodutivos em matadouro frigorífico. As endometrites foram diagnosticadas por meio de citologia endometrial e pela presença e características das secreções uterinas. Os diagnósticos foram confirmados pela análise histopatológica, sendo avaliada a existência de infiltrados de células inflamatórias no endométrio. Os ovários foram avaliados macroscopicamente quanto à estrutura e alterações ovarianas. A qualidade oocitária foi avaliada de acordo com o número de camadas de células do cumulus e aspecto do citoplasma, sendo assim, classificados como: grau I (GI), grau II (GII), grau III (GIII) e grau IV (GIV). Dentre as peças avaliadas, 8,20% (n = 14) apresentaram EC e 4,10% (n = 7) foram diagnosticadas com ES. Observou-se que a presença de endometrites não exerceu efeito sobre as estruturas e alterações ovarianas, assim como não alterou o número de oócitos recuperados. Em relação ao grau de qualidade oocitária, foi encontrado variação entre os diferentes graus de qualidade dentro dos grupos, no entanto, não houve correlação aparente com a presença de infecção uterina.

The objective of this study was to estimate the percentage of clinical (CE) and subclinical (SE) endometritis in post mortem bovine reproductive tracts, analyzing their influence on ovarian structures, changes in the ovary, and number and quality of oocytes collected. Endometritis were diagnosed by endometrial cytology, and by the presence and characteristics of uterine secretions. The diagnosis was confirmed through histopathological analysis, by evaluating the presence of infiltrated inflammatory cells in the endometrium. The ovaries were macroscopically evaluated for presence of physiological structures and alterations. The oocyte quality evaluation was performed according to the number of cumulus cells layers and cytoplasmic aspect, being classified as: grade I (GI), grade II (GII), grade III (GIII) and grade IV (GIV). Among the uterus evaluated, 8,20% (n = 14) of the animals presented EC, and 4,10% (n = 7) were diagnosed with ES. It was observed that the presence of endometritis had no effect on ovarian structures and alterations, nor did it influence the number of oocytes collected. Regarding the degree of oocyte quality, a variation was found between the different grades of quality within the groups, however, there was no apparent correlation with the presence of uterine infection.

EFEITO DA IDADE DE FÊMEAS NELORE (Bos indicus) NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES E TAXA DE GESTAÇÃO

O objetivo do presente estudo foi avaliar a quantidade e qualidade oocitária e produção de embriões de doadoras da raça Nelore (Bos indicus) de três categorias de idade (novilhas pré-púberes, novilhas púberes e vacas) e associá-las com taxa de gestação. Foram utilizadas 36 doadoras, sendo 11 novilhas pré-púberes (13±0,61 meses, 240±10,3 kg), 17 novilhas púberes (25±0,78 meses, 352±8,30 kg) e 8 vacas (83±28 meses, 560±12,1 kg). As fêmeas foram submetidas a três aspirações folicular guiadas por ultrassom (OPU), sem sincronização, em dias aleatórios do ciclo estral, com intervalo de 21 dias. Foram realizadas medidas do trato genital externo (comprimento da rima e largura da vulva) e avaliações ultrassonográficas dos ovários para quantificação de folículos antrais e média dos diâmetros dos ovários (XOV). Os embriões produzidos de oócitos das novilhas pré-púberes, novilhas púberes e vacas foram transferidos para receptoras multíparas da raça Nelore. O diagnóstico de gestação foi realizado 30 dias após a transferência de embriões por meio de ultrassonografia, e o diagnóstico confirmatório foi realizado 60 dias depois. As variáveis foram testadas quanto a distribuição por meio do procedimento Box-cox e transformadas quando necessário, e foram analisadas utilizando-se os procedimentos MIXED, GLIMMIX e CORR (SAS Inst., Inc., Cary, NC, US). O comprimento da rima diferiu entre vacas (9,56 ± 0,30a cm) e novilhas, sendo semelhante nas novilhas pré-púberes e púberes (7,85 ± 0,25b cm, e 8,40 ± 0,20b cm, respectivamente), enquanto a largura da vulva diferiu entre as três categorias de idade (4,60±0,11c, 5,58±0,09b, e 6,09±0,13a cm para vacas, novilhas prépúberes, e novilhas púberes). A XOV foi semelhante para a categoria das novilhas prépúberes e púberes mas diferiu da categoria das vacas (20,0 ± 0,57b mm, 20,8 ± 0,46b mm, e 25,96 ±0,67a mm para novilhas pré-púberes, novilhas púberes e vacas). Vacas apresentaram maior número de folículos totais (32,87 ± 5,32b; 35,0 ± 4,28b; e 58,68 ± 6,26a para novilhas pré-púberes, púberes e vacas), assim como maior número de folículos <5mm (30,0±5,3b, 31,7±4,2b, e 54,5±6,2a para novilhas pré-púberes, novilhas púberes e vacas), e de folículos de 5-8mm (1,7±0,36b, 1,8±0,29b, e 4,0±0,43a). Entretanto, o número de folículos >8mm foi maior na categoria das novilhas pré-púberes (1,0±0,16b, 1,3±0,12ab, e 1,0±0,19a). Em relação à produção oocitária, as vacas apresentaram maior número de oócitos viáveis (20,60 ± 5,12b, 19,05 ± 4,12b, e 34,14 ± 6,01a para novilhas pré-púberes, novilhas púberes e vacas), de oócitos inviáveis (6,96 ± 1,06b, 7,29 ± 0,85b, e 10,03 ± 1,25a), e de total clivados (13,09 ± 3,72b, 12,4 ± 3,19b, e 21,1 ± 4,22a), embora a taxa de clivagem tenha sido semelhante entre as categorias de idade (63,5%, 65,5%, e 62,2%). Entretanto, o número de blastocistos por OPU (5,57 ± 1,99, 6,66 ± 1,72, e 9,74 ± 2,26 para novilhas pré-púberes, novilhas púberes e vacas) e a taxa de blastocistos foram semelhantes entre as categorias de idade. Quando transferidos para as receptoras, os embriões das novilhas pré-púberes e das vacas apresentaram maior taxa de gestação aos 30 dias do que embriões das novilhas púberes (43,1%, 33,8%, e 40,4% para novilhas pré-púberes, novilhas púberes e vacas), e o mesmo ocorreu com a taxa de gestação aos 60 dias (41,3%, 30,6%, e 39,0%). A variável XOV foi mediana e positivamente correlacionada com produção oocitária e embrionária na categoria das novilhas pré-púberes e púberes, o que não foi observado na categoria das vacas, enquanto o número de folículos totais foi alta e positivamente correlacionado com produção oocitária e embrionária nas três categorias. Os resultados permitem concluir que vacas apresentam maior produção oocitária e folicular do que fêmeas jovens. Entretanto, quando os oócitos são submetidos a FIV não há diferença na produção de blastocistos. As variáveis XOV e número de folículos totais podem ser indicativos da produção oocitária e embrionária, principalmente em fêmeas jovens.

The aim of the present study was to evaluate the quantity and quality of oocytes and embryo production of Nelore donors (Bos indicus) from three age categories (prepubertal heifers, pubescent heifers and cows) and to associate them with gestation rate. Thirty-six donors were evaluated: 11 prepubertal heifers (13 ± 0.61 months, 240 ± 10.3 kg), 17 pubescent heifers (25 ± 0.78 months, 352 ± 8.30 kg) and 8 cows (83 ± 28 months, 560 ± 12.1 kg). The females were submitted to three follicular aspirations guided by ultrasound (OPU), without synchronization, on random days of the estrous cycle, with an interval of 21 days. Measurements of the external genital tract (length of the rhyme and width of the vulva) and ultrasound evaluations of the ovaries were performed to quantify antral follicles and mean ovary diameters (XOV). The embryos produced from oocytes of prepubescent heifers, pubescent heifers and cows were transferred to multiparous Nelore recipients. The pregnancy diagnosis was made 30 days after the embryo transfer by ultrasound, and the confirmatory diagnosis was made 60 days later. The variables were tested for distribution using the box-cox procedure and it was transformed when necessary. Variables were analyzed using the MIXED, GLIMMIX and CORR procedures (SAS Inst., Inc., Cary, NC, US). The length of the rhyme differed between cows (9.56 ± 0.30a cm) and heifers, being similar in prepubescent and pubescent heifers (7.85 ± 0.25b cm, and 8.40 ± 0.20b cm, respectively), while the width of the vulva differed between the three age categories (4.60 ± 0.11c, 5.58 ± 0.09b, and 6.09 ± 0.13a cm for cows, prepubescent heifers, and heifers pubescent). The XOV was similar for the category of prepubertal and pubescent heifers but it differed for the category of cows (20.0 ± 0.57b mm, 20.8 ± 0.46b mm, and 25.96 ± 0.67a mm for heifers prepubertal, pubescent heifers and cows). Cows showed a higher number of total follicles (32.87 ± 5.32b; 35.0 ± 4.28b; and 58.68 ± 6.26a for prepubescent, pubescent and cows heifers), as well as a greater number of follicles < 5mm (30.0 ± 5.3b, 31.7 ± 4.2b, and 54.5 ± 6.2a for prepubertal heifers, pubescent heifers and cows), and follicles of 5-8mm (1.7 ± 0, 36b, 1.8 ± 0.29b, and 4.0 ± 0.43a). However, the number of follicles >8mm was higher in the category of prepubertal heifers (1.0 ± 0.16b, 1.3 ± 0.12ab, and 1.0 ± 0.19a). Regarding oocyte production, cows showed a higher number of viable oocytes (20.60 ± 5.12b, 19.05 ± 4.12b, and 34.14 ± 6.01a for prepubescent heifers, pubescent heifers and cows), non-viable oocytes (6.96 ± 1.06b, 7.29 ± 0.85b, and 10.03 ± 1.25a), and total cleavages (13.09 ± 3.72b, 12.4 ± 3, 19b, and 21.1 ± 4.22a), although the cleavage rate was similar between age categories (63.5%, 65.5%, and 62.2%). However, the number of blastocysts per OPU (5.57 ± 1.99, 6.66 ± 1.72, and 9.74 ± 2.26 for prepubertal heifers, pubescent heifers and cows) and the rate of blastocysts were similar across age categories. When transferred to the recipients, embryos of prepubertal heifers and cows showed a higher gestation rate at 30 days than embryos of pubescent heifers (43.1%, 33.8%, and 40.4% for pre-pubescent, pubescent heifers and cows), and the same tendency occurred with the pregnancy rate at 60 days (41.3%, 30.6%, and 39.0%). The XOV variable was median and positively correlated with oocyte and embryonic production in the category of prepubescent and pubescent heifers, which was not observed in the category of cows, while the number of total follicles was high and positively correlated with oocyte and embryonic production in the three categories. The results allow us to conclude that cows have higher oocyte and follicular production than young females. However, when the oocytes are submitted to IVF there is no difference in the production of blastocysts. Furthermore, XOV and number of total follicles can be indicative of oocyte and embryonic production, especially in young females.

Avaliação de oócitos imaturos bovinos derivados de ovários com baixa e alta contagem de folículos antrais / Evaluation of bovine immature oocytes derived from ovaries with low and high antral follicle count

The aim was to evaluate the quantity and quality of immature oocytes obtained from bovine ovarieswith high and low antral follicle count (AFC). Therefore, ovaries were obtained from a slaughterhouse and thelaboratory were divided in two groups: high count (HC: ≥ 20) and low count (LC: <20) follicles. After thefollicular aspiration, retrieved oocytes were assessed by morphological appearance and brilliant cresyl blue test(BCB) in viable and non-viable. The data were analyzed by Fischer exact test (P < 0.05). After three replicates,85 ovaries were recovered and distributed between the groups HC (22) and LC (63). There was no significantdifference in the recovery rate. Furthermore, in the morphology and BCB test the viability rates werestatistically similar between groups (P > 0.05). Therefore, it is concluded that the AFC does not influence thequantity and quality of oocytes.(AU)

Avaliação de oócitos imaturos bovinos derivados de ovários com baixa e alta contagem de folículos antrais / Evaluation of bovine immature oocytes derived from ovaries with low and high antral follicle count

The aim was to evaluate the quantity and quality of immature oocytes obtained from bovine ovarieswith high and low antral follicle count (AFC). Therefore, ovaries were obtained from a slaughterhouse and thelaboratory were divided in two groups: high count (HC: ≥ 20) and low count (LC: 0.05). Therefore, it is concluded that the AFC does not influence thequantity and quality of oocytes.

EFEITO DA ADIÇÃO DO EUGENOL DURANTE A MATURAÇÃO SOBRE A PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Este estudo investiga o impacto da suplementação com eugenol na maturação in vitro ( de oócitos bovinos na produção de embriões. Um total de 516 complexos cumulus oócitos f o ram maturados em TCM 199 isoladamente (tratamento controle) ou suplementado com eugenol nas concentrações de 10 µM (EU 10), 20 µM (EU 20) ou 40 µM (EU 40). Após a MIV, os oócitos foram submetidos à fertilização in vitro ( e ao cult ivo de embriões. As porcentagens de oócitos em MII e produção de blastocistos foram semelhantes (P 0,05) entre os tratamentos. No entanto, a adição de eugenol a 40 µM ao meio de M IV melhorou (P 0,05) a taxa de clivagem quando comparada com o tratamento controle. Além disso, foi observada uma correlação positiva (r 0,61, P 0,03) entre a taxa de cli vagem e a concentração de eugenol. Os tratamentos E U 10 e E U 20 apresentaram maior (P 0,05) número total médio de células/blastocisto expandido quando comparados aos tratamentos controle e E U 40. Em conclusão, a adição de eugenol ao meio de M IV melhorou a taxa de clivagem bovina e a qualidade do embrião de maneira dependente da concentração.

This study investigates the impact of eugenol supplementation on bovine oocyte in vitro maturation (IVM) and embryo production. A total of 516 cumulus oocyte complexes were matured in TCM-199+ alone (control treatment) or supplemented with eugenol at the concentrations of 10 M (EU-10), 20 M (EU-20) or 40 M (EU-40). After IVM, the oocytes were submitted to in vitro fertilization (IVF) and embryo culture. The percentages of MII oocytes and blastocyst production were similar (P > 0.05) among the treatments. However, the addition of eugenol at 40 M to the IVM medium improved (P < 0.05) the cleavage rate when compared with the control treatment. Moreover, a positive correlation (r = 0.61, P < 0.03) was observed between cleavage rate and eugenol concentration. The EU-10 and EU-20 treatments had greater (P < 0.05) mean total number of cells/expanded blastocyst when compared to the control and EU-40 treatments. In conclusion, the eugenol addition to the IVM medium improved bovine cleavage rate and embryo quality in a concentration-dependent manner.

Recovery of equine oocytes by scraping of the follicular wall with different specifications of needles and morphological analysis of cumulus oophorus / Recuperação de oócitos equinos por raspagem da parede folicular com diferentes especificações de agulhas e análise morfológica do cumulus oophorus

In follicular aspiration, physical aspects are of high significance for the technique to succeed, such as vacuum pressure, caliber of the needle and the way the follicular wall curettage is performed. The aim of this study was to investigate the recovery rate of equine oocytes aspirated by scraping of the follicular wall, testing different calibers of disposable needles, as well as the morphological evaluation of the cumulus oophorus complexes (COCs). Mares ovaries (n=447) obtained at a local slaughterhouse were transported to the laboratory in a thermal container (20 °C) and had the tunica albuginea and connective tissues dissected. The aspirated follicles had 10 to 25 mm in diameter, and 30x8 (21G 1 ») or 40x12 (18G 1 ½) needles were used for the aspiration, forming group A (G-A) and group B (G-B), respectively. In G-A and G-B, 480 and 548 follicles were aspirated, respectively. Under the stereomicroscope, the oocytes were evaluated according to the quality of the ooplasm and characteristics of the cumulus cells (grade I, II, III and denuded). The statistical analysis was performed using the Students t-test, logistic regression and test of proportions, and differences were considered significant when P<0.05. There was no difference between recovery rates of groups G-A (66.5%; 330/496) and G-B (65.5%; 359/548). In the G-A group, grade II oocytes were related to higher recovery rates (46.9%; 145/330) than grade I (23.6%; 72/330), grade III (20.6%; 59/330) and denuded oocytes (8.5%; 24/330; P<0.05).(AU)

Na obtenção de oócitos para a espécie equina, aspectos físicos são de alta significância para o sucesso da técnica, como a pressão de vácuo e o calibre de agulha utilizado, além da forma como é realizada a raspagem da parede folicular. O objetivo deste estudo foi investigar o índice de recuperação de oócitos equinos aspirados pela técnica de raspagem da parede folicular, testando calibres distintos de agulhas descartáveis, assim como avaliação morfológica dos complexos cumulus oophorus (CCOs). Foram utilizados ovários de éguas (n=447), obtidos em abatedouro local, transportados ao laboratório em recipiente térmico (20 ºC) e submetidos à dissecação da túnica albugínea e tecidos conectores. Os folículos aspirados obtinham diâmetro entre 10 mm a 25 mm, e para tanto utilizou-se a agulha 30x8 (21G 1 ») ou 40x12 (18G 1 ½), formando respectivamente, o grupo A (G-A) e grupo B (G-B). No G-A e G-B aspiraram-se 480 e 548 foliculos, respectivamente. Sob lupa estéreo-microscópica avaliou-se os oócitos quanto à qualidade do ooplasma e características das células do cumulus oophorus (grau I, II, III e desnudo). Para análise estatística utilizou-se teste t Student, regressão logistica e teste de proporções, e as diferenças foram consideradas significativas quando P 0,05. A taxa de recuperação entre G-A e G-B não apresentou diferença; 66,5% (330/496) e 65,5% (359/548), respectivamente. Houve diferençaquanto à qualidade dos oócitos no G-A, no qual os oócitos de grau II obtiveram melhor taxa (46,9%; 145/330; P<0,05) frente ao grau I (23,6%; 72/330), grau III (20,6%; 59/330) e desnudo (8,5%; 24/330). Entretanto, no G-B não houve diferença estatística quanto aos graus de qualidade do CCOs recuperados, grau I (23,4%; 77/359), grau II (43,2%; 145/359), grau III (22,5%; 73/359) e desnudo (11,1%; 32/359).(AU)

Recovery of equine oocytes by scraping of the follicular wall with different specifications of needles and morphological analysis of cumulus oophorus / Recuperação de oócitos equinos por raspagem da parede folicular com diferentes especificações de agulhas e análise morfológica do cumulus oophorus

In follicular aspiration, physical aspects are of high significance for the technique to succeed, such as vacuum pressure, caliber of the needle and the way the follicular wall curettage is performed. The aim of this study was to investigate the recovery rate of equine oocytes aspirated by scraping of the follicular wall, testing different calibers of disposable needles, as well as the morphological evaluation of the cumulus oophorus complexes (COCs). Mares ovaries (n=447) obtained at a local slaughterhouse were transported to the laboratory in a thermal container (20 °C) and had the tunica albuginea and connective tissues dissected. The aspirated follicles had 10 to 25 mm in diameter, and 30x8 (21G 1 ») or 40x12 (18G 1 ½) needles were used for the aspiration, forming group A (G-A) and group B (G-B), respectively. In G-A and G-B, 480 and 548 follicles were aspirated, respectively. Under the stereomicroscope, the oocytes were evaluated according to the quality of the ooplasm and characteristics of the cumulus cells (grade I, II, III and denuded). The statistical analysis was performed using the Student’s t-test, logistic regression and test of proportions, and differences were considered significant when P<0.05. There was no difference between recovery rates of groups G-A (66.5%; 330/496) and G-B (65.5%; 359/548). In the G-A group, grade II oocytes were related to higher recovery rates (46.9%; 145/330) than grade I (23.6%; 72/330), grade III (20.6%; 59/330) and denuded oocytes (8.5%; 24/330; P<0.05).

Na obtenção de oócitos para a espécie equina, aspectos físicos são de alta significância para o sucesso da técnica, como a pressão de vácuo e o calibre de agulha utilizado, além da forma como é realizada a raspagem da parede folicular. O objetivo deste estudo foi investigar o índice de recuperação de oócitos equinos aspirados pela técnica de raspagem da parede folicular, testando calibres distintos de agulhas descartáveis, assim como avaliação morfológica dos complexos cumulus oophorus (CCOs). Foram utilizados ovários de éguas (n=447), obtidos em abatedouro local, transportados ao laboratório em recipiente térmico (20 ºC) e submetidos à dissecação da túnica albugínea e tecidos conectores. Os folículos aspirados obtinham diâmetro entre 10 mm a 25 mm, e para tanto utilizou-se a agulha 30x8 (21G 1 ») ou 40x12 (18G 1 ½), formando respectivamente, o grupo A (G-A) e grupo B (G-B). No G-A e G-B aspiraram-se 480 e 548 foliculos, respectivamente. Sob lupa estéreo-microscópica avaliou-se os oócitos quanto à qualidade do ooplasma e características das células do cumulus oophorus (grau I, II, III e desnudo). Para análise estatística utilizou-se teste t Student, regressão logistica e teste de proporções, e as diferenças foram consideradas significativas quando P 0,05. A taxa de recuperação entre G-A e G-B não apresentou diferença; 66,5% (330/496) e 65,5% (359/548), respectivamente. Houve diferençaquanto à qualidade dos oócitos no G-A, no qual os oócitos de grau II obtiveram melhor taxa (46,9%; 145/330; P<0,05) frente ao grau I (23,6%; 72/330), grau III (20,6%; 59/330) e desnudo (8,5%; 24/330). Entretanto, no G-B não houve diferença estatística quanto aos graus de qualidade do CCOs recuperados, grau I (23,4%; 77/359), grau II (43,2%; 145/359), grau III (22,5%; 73/359) e desnudo (11,1%; 32/359).

Indução à maturação final e ovulação de lambari (Astyanax altiparanae) com análogos do hormônio liberador de gonadotropinas (GnRH)

A presente tese foi dividida em três capítulos, no primeiro é apresentada uma revisão bibliográfica dos temas relacionados à tese, os outros dois capítulos são manuscritos gerados a partir dos experimentos realizados durante o doutorado. No manuscrito I (capítulo II) avaliamos o desempenho reprodutivo de fêmeas de lambari (Astyanax altiparanae) usando diferentes protocolos de reprodução em cativeiro, como a administração de análogo do hormônio liberador de gonadotrofina de salmão (sGnRHa) e extrato de pituitária de carpa (CPE), bem como sem o uso de terapia hormonal. Foram realizados dois experimentos consecutivos com machos e fêmeas maduros de lambari (seis meses de idade) usando dose única (Exp. 1) ou fracionada (10% + 90% - intervalo de 12h) (Exp. 2). No Exp. 1, seis doses de sGnRHa (variando de 1 a 160 g kg -1 ) foram aplicadas em três repetições (cinco fêmeas e 10 machos cada); no Exp. 2, três doses de sGnRHa (10, 100 e 1000 g kg -1 ) foram aplicadas em quatro repetições (cinco fêmeas e 10 machos cada). Em ambos os experimentos, 6 mg de CPE kg -1 e solução salina foram usados como controles positivo e negativo, respectivamente. A quantificação de 17-20-dihidroxi-4- pregnen-3-ona (17,20-P) e níveis plasmáticos de prostaglandina F2 e avaliações histológicas ovarianas foram introduzidas no Exp. 2 separando fêmeas desovadas e não desovadas. Usando uma única dose, a taxa de desova foi baixa e semelhante entre todos os grupos (de 0 a 20%). Usando doses fracionadas, a taxa de desova de CPE (60%) foi maior do que todos os outros grupos (de 10 a 25%), com exceção da dose mais alta de sGnRHa (40%). A desova e elevação dos níveis de 17,20-P ocorreram em algumas fêmeas do controle negativo (Exp. 2). Portanto, a terapia com doses fracionadas de CPE melhorou a ovulação de lambari, mas não foi condicional para a obtenção da ovulação. Apenas as fêmeas não desovadas induzidas com doses fracionadas de CPE, mas não com sGnRHa e nem no controle negativo, atingiram a maturação final. Além disso, a desova nos grupos com sGnRHa ocorreu em uma extensão semelhante à do controle negativo e os grupos tratados com sGnRHa não mostraram qualquer resposta dose-dependente considerando todas variáveis avaliadas. Portanto, é possível que a desova nos grupos sGnRHa se deva apenas ao agrupamento de peixes, semelhante ao controle negativo. Em conclusão, a dose fracionada de CPE foi o único tratamento que provocou maturação final em todas as fêmeas tratadas e um aumento significativo no desempenho reprodutivo em comparação com todos os outros tratamentos. No manuscrito II (capítulo III) avaliamos o efeito do análogo do hormônio liberador do hormônio luteinizante (LHRHa) com e sem domperidona no desempenho reprodutivo de lambari e na liberação de 17,20-P e PGF 2 , bem como avaliação histológica das estruturas ovarianas em dois experimentos independentes e consecutivos. No primeiro experimento cinco doses de LHRHa (20, 60, 180, 540 e 1620 g kg -1 ) foram testadas com três repetições cada, enquanto no segundo experimento a dose de 180 g kg -1 foi testada em combinação com 20 mg kg -1 de domperidona (D) com quatro repetições. Em ambos os experimentos utilizamos solução salina 0,9% como controle negativo e 6 mg de CPE kg -1 como controle positivo e as fêmeas de todos os grupos receberam duas injeções (10% + 90% - intervalo de 12h). As doses testadas de LHRHa não apresentram resultados superiores aos do controle negativo. Associando o LHRHa com D não foram obtidos resultados superiores ao LHRHa sem associação, sugerindo que a dopamina parece não apresentar um papel no controle neuroendócrino da reprodução dessa espécie ou que este antidopaminérgico não é o mais indicado para o lambari. O grupo tratado com CPE foi o único com melhor desempenho que o controle negativo, indicando que o CPE foi a melhor terapia hormonal para induzir a desova em lambari (entre os testados por nós). Houve uma diminuição nas taxas de fertilização e eclosão que coincidiram com as duas doses mais altas de LHRH (540 e 1620 g kg -1 ), sugerindo que essas doses podem ter causado uma superestimulação da hipófise na produção de LH, a qual pode ter afetado a qualidade dos ovos.

The present thesis was divided into three chapters, in the first one a review of the themes related to the thesis is presented, the other two chapters are manuscripts prepared from the experiments carried out during the doctorate. In the manuscript I (chapter II) we evaluated lambari (Astyanax altiparanae) reproductive performance using different protocols of reproduction in captivity, such as the administration of analogue of salmon gonadotropin- releasing hormone (sGnRHa) and carp pituitary extract (CPE) as well as without the use of hormonal therapy. We performed two consecutive experiments with mature lambari males and females (six months old) using single (Exp. 1) or fractioned doses (10% + 90% - 12h interval) (Exp. 2). In Exp. 1, six sGnRHa doses (ranging from 1 to 160 g kg -1 ) were applied in three replicates (five females and 10 males each); in Exp. 2, three sGnRHa doses (10, 100 and 1000 g kg -1 ) were applied in four replicates (five females and 10 males each). In both experiments 6 mg of CPE kg -1 and saline solution were used as positive and negative controls, respectively. Quantification of 17-20-dihydroxy-4-pregnen-3-one (17,20-P) and prostaglandin F 2 plasma levels and ovarian histological evaluations were introduced in Exp. 2 via the separation of spawned and unspawned females. Using a single dose, the spawning rate was low and similar between all groups (from 0 to 20%). Using fractioned doses, the spawning rate of CPE (60%) was higher than all other groups (from 10 to 25%), with the exception of the highest sGnRHa dose (40%). Spawning and elevation of 17,20-P levels occurred in some females of the negative control (Exp. 2). Therefore, only CPE fractioned doses therapy improved lambari ovulation but were not conditional for obtaining ovulation. Only unspawned females treated with fractioned CPE doses, but neither sGnRHa nor negative control, attained final oocyte maturation.In addition, spawning in sGnRHa groups occurred in a similar extent as in negative control and sGnRHa-treated groups did not show any dose dependent response considering all variables measured. Therefore, it was possible that spawning in sGnRHa groups were just due to grouping of fish, similar to negative control. In conclusion, the fractioned dose of CPE was the only treatment that provoked final oocyte maturation in all treated females and a significant enhance in reproductive performance comparing to all other treatments. In the manuscript II (chapter III) we evaluated the effect of luteinizing hormone-releasing hormone ethylamide analogue (LHRHa) with and without domperidone on reproductive performance of lambari and the quantification of plasma levels of 17,20-P and PGF 2 , as well as histological evaluation of ovarian structures in two independent and consecutive experiments. In the first, five doses of LHRHa (20, 60, 180, 540 and 1620 g kg -1 ) were tested with three replicates each, while in the second the dose of 180 g kg -1 was tested in combination with 20 mg kg -1 domperidone (D) with four replicates. In both experiments, we used 0.9% saline as a negative control and 6 mg CPE kg -1 as a positive control and the females of all groups received two injections (10%; and 90% after 12 h). The doses we tested of LHRHa did not show results superior to those of the negative control. When associating LHRHa with D, we did not obtain results superior to LHRHa without association, suggesting that dopamine does not seem to play a role in the neuroendocrine control of the reproduction of this species or that this antidopaminergic is not the most suitable for lambari. The group treated with CPE was the only one with better performance than the negative control, indicating that CPE was the best hormonal therapy to induce spawning in lambari (among those tested by us). There was a decrease in fertilization and hatching rates that coincided with the two highest doses of LHRH (540 and 1620 g kg -1 ), suggesting that these doses may have caused an overstimulation of the pituitary in the production of LH, which may have affected egg quality.

UTILIZAÇÃO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Um dos aspectos relevantes a se considerar para o sucesso durante a produção in vitro (PIV) de embriões é a constituição dos meios que compõem as etapas da biotecnologia reprodutiva. Os meios precisam suprir as necessidades metabólicas tanto dos gametas, durante a maturação oocitária e capacitação espermática, quanto do embrião durante as primeiras divisões celulares. A maior parte dos protocolos de PIV utiliza algum soro sanguíneo na composição dos meios como fonte de hormônios, proteínas, fatores de crescimento e nutrientes. Por outro lado, o soro contém citocinas, vitaminas e muitas outras substâncias que podem afetar a maturação, a fertilização e o desenvolvimento embrionário. Diversos trabalhos vêm reportando a utilização de Plasma Rico em Plaquetas (PRP) como alternativa para utilização de soros fetais durante o cultivo de células, principalmente de células tronco. Outros estudos demonstraram que o PRP está repleto de fatores de crescimento, como FGF, TGF, PDGF, IGF e EGF, bem como fatores de ligação como fibrinogênio e serotonina, vitais para a cultura celular e foliculogênese. Portanto, este trabalho tem por objetivo avaliar a utilização de PRP em substituição ao soro fetal bovino (SFB) durante a maturação de oócitos utilizados na produção in vitro de embriões bovinos. Os complexos cúmulos-oócitos (CCOs) foram distribuídos nos seguintes grupos experimentais durante a maturação in vitro (MIV): Grupo G1 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP); Grupo G2 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP mais 5% de SFB); Grupo G3 (Meio de MIV com adição de 5% de SFB); e grupo G4 (Meio de MIV sem adição de PRP e/ou SFB); . Após 20 horas de maturação, os CCOs foram passados para a placa de fecundação contendo o meio TALP FERT livre de soros. Aproximadamente 24 horas após a fertilização, os prováveis zigotos foram transferidos para gotas com meio SOF (Synthetic fluid oviduct) contendo 10% de SFB. foram avaliadas as taxas de clivagem e formação de blastocistos nos dias 2 e 7, do desenvolvimento embrionário, respectivamente. Também foi avaliada a qualidade dos CCOs maturados a partir da análise de expressão gênica de alguns marcadores genéticos. Os resultados demonstraram que não houveram diferenças significativas em relação aos grupos experimentais no tocante a taxas de produção de embriões (tanto nas primeiras clivagens quanto na formação de blastocistos) evidenciando que o PRP pode se tornar uma alternativa mais barata na PIVE em comparação ao SFB.

One of the relevant aspects to be considered for success during the in vitro production (IVP) of embryos is the constitution of the means that make up the stages of reproductive biotechnology. The media must meet the metabolic needs of both gametes, during oocyte maturation and sperm formation, and of the embryo during the first cell divisions. Most IVP protocols use some blood serum in the composition of the media as a source of hormones, proteins, growth factors, and nutrients. On the other hand, the serum contains cytokines, vitamins and many other substances that can affect maturation, fertilization, and embryonic development. Several studies have reported the use of Platelet Rich Plasma (PRP) as an alternative to the use of fetal sera during cell culture, mainly stem cells. Other studies have shown that PRP is full of growth factors, such as FGF, TGF, PDGF, IGF, and EGF, as well as binding factors such as fibrinogen and serotonin, which are vital for cell culture and folliculogenesis. Therefore, this work aims to evaluate the use of PRP to replace fetal bovine serum (SFB) during the maturation of oocytes used in the in vitro production of bovine embryos. Cumulus-oocyte complexes (CCOs) were distributed in the following experimental groups during in vitro maturation (IVM): Group G1 (IVM medium with addition of 5% PRP); Group G2 (MIV medium with addition of 5% PRP plus 5% SFB); Group G3 (MIV medium with addition of 5% SFB); and group G4 (MIV medium without addition of PRP and/or SFB). After 20 hours of maturation, the CCOs were passed to the fertilization plate containing the serum-free TALP FERT medium. Approximately 24 hours after fertilization, the probable zygotes were transferred to drops with SOF (Synthetic fluid oviduct) medium containing 10% SFB. the rates of cleavage and blastocyst formation were evaluated on days 2 and 7, of embryonic development, respectively. The quality of matured CCOs was also evaluated from the analysis of gene expression of some genetic markers. The results demonstrated that there were no significant differences in relation to the experimental groups regarding embryo production rates (both in the first cleavages and in the formation of blastocysts), showing that PRP can become a cheaper alternative in PIVE compared to SFB

QUALIDADE DE OÓCITOS DE VACAS LEITEIRAS E PRODUÇÃO DE EMBRIÕES A PARTIR DE OÓCITOS MATURADOS IN VITRO COM MELATONINA

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar o efeito da adição de melatonina ao meio de maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos aspirados de vacas leiteiras sobre a taxa de clivagem (TC), a produção e a qualidade de embriões. Adicionalmente, objetivou-se estabelecer uma associação entre qualidade oocitária e grupamento genético, considerando as variáveis fisiológicas e ambientais obtidas durante o experimento. Os oócitos foram obtidos em 52 sessões de ovum pick-up (OPU) realizadas no verão e na primavera, em três fazendas. Em cada sessão de OPU as variáveis climáticas (temperatura e umidade do ar) e os parâmetros fisiológicos das vacas (frequência respiratória, temperatura retal e superficial, produção de leite e dias em leite DEL) foram aferidos. No total foram realizadas 29 sessões de aspiração em vacas Holandês (H; n = 15, fazenda 1) e 23 sessões em vacas mestiças Holandês x Zebu (HZ; n = 16, fazenda 2; n = 7, fazenda 3). Os oócitos obtidos foram classificados de acordo com sua qualidade em excelentes, bons, regulares, desnudos e degenerados. Oócitos obtidos no verão, exceto degenerados, foram distribuídos a um de três tratamentos: 0 mol/L (controle), 10-6 ou 10-4 mol/L de melatonina na MIV. A TC foi avaliada no dia 3 (D3) após a fertilização in vitro (FIV) e a produção de embriões no D8. A qualidade dos blastocistos foi avaliada pela contagem do número de células e de células apoptóticas. O índice temperatura-umidade (ITU) foi de 79,0 ± 1.4 na fazenda 1; 77,7 ± 3,2 na fazenda 2 e 68,5 ± 1,8 na fazenda 3. As variáveis fisiológicas não diferiram (P > 0,05) entre os grupamentos genéticos (frequência respiratória - movimentos/minuto): H = 74,2 ± 10,5 e HZ = 53,4 ± 6,9; temperatura retal (°C): H = 38,3 ± 0,3 e HZ = 38,3 ± 0,2; temperatura superficial (°C): H = 36,6 ± 1,4 e HZ = 36,9 ± 0,9). O grupamento genético influenciou a qualidade oocitária (P < 0,05). As proporções de oócitos grau 1 (H = 3,2 ± 1,2; HZ = 27,6 ± 4,6; P < 0,0001) e grau 2 (H = 1,6 ± 0,6; HZ = 12,9 ± 2,2; P < 0,0001) foram menores e a proporção de degenerados foi maior (H = 5,2 ± 1,5; HZ = 1,7 ± 0,6; P 0,05) nas vacas Holandesas. A frequência respiratória foi negativamente (P < 0,05) associada a oócitos grau 1 e positivamente associada a oócitos grau 2. DEL foi positivamente associado (P < 0.05) a oócitos grau 1 e negativamente associado a oócitos degenerados. A proporção de oócitos viáveis (graus 1 e 2) foi menor (P < 0,0001) nas vacas Holandesas do que em mestiças. Umidade do ar e frequência respiratória foram negativamente associadas (P < 0,01) a oócitos bons. A interação (P = 0,03) entre os efeitos de fazenda e tratamento sobre a taxa de clivagem foi observada, sendo que somente na fazenda 1, a concentração 10-4 mol/L aumentou (P < 0,09) a TC (70,0 ± 17,0%) comparada ao controle (22,0 ± 15,6%) e somente na fazenda 2, a TC foi aumentada (P < 0,09) pela melatonina na concentração 10-6 mol/L (50,0 ± 20,3%) comparada ao controle (20,0 ± 13,5%). Em conclusão, os parâmetros fisiológicos não diferiram entre os grupamentos genéticos, mas vacas mestiças produziram oócitos de qualidade superior em relação às Holandesas. A adição de melatonina ao meio de MIV pode ser uma estratégia para aumentar a taxa de clivagem dos embriões produzidos de vacas leiteiras lactantes durante o verão. Porém, a dose a ser adicionada difere de acordo com o grupamento genético, sendo maior para vacas Holandesas do que para vacas mestiças HZ.

The objective of this study was to evaluate the effect of the addition of melatonin to the in vitro maturation (IVM) medium of bovine oocytes aspirated from dairy cows on cleavage rate (CR), embryo production and quality. Additionally, we aimed to establish an association between oocyte quality and genetic groups, considering the physiological and environmental variables recorded throughout the trial. Oocytes were obtained in 52 ovum pick-up (OPU) sections performed during summer and spring in three farms. In each OPU section, environmental variables (temperature and relative humidity) and physiological parameters of cows (respiratory frequency, rectal and superficial temperature, milk production and days in milk DIM) were obtained. Overall, 29 OPU sections were performed in Holstein cows (H; n = 15, farm 1) and 23 aspirations were performed in crossbred Holstein x Zebu - HZ (n = 16, farm 2; n = 7, farm 3). Oocytes obtained were classified according to its quality in excellent, good, regular, denuded and degenerate. Oocytes obtained during summer, except degenerate, were distributed to one of three treatments: 0 mol/L (control), 10-6 mol/L or 10-4 mol/L of melatonin in IVM. CR was evaluated on day 3 (D3) after in vitro fertilization (IVF), and embryo production on day 8 (D8). Quality of blastocysts was evaluated through count of embryo cell number and apoptotic cell number. The temperature-humidity index (THI) was 79.0 ± 1.4 on farm 1; 77.7 ± 3.2 on farm 2; and 68.5 ± 1.8 on farm 3. Physiological variables did no differ (P > 0.05) between genetic groups (respiratory frequency movements/minute): H = 74.2 ± 10.5; HZ = 53.4 ± 6.9; rectal temperature (°C) H = 38.3 ± 0.3; HZ = 38.3 ± 0.2; superficial temperature H = 36.6 ± 1.4; HZ = 36.9 ± 0.9). Genetic group influenced oocyte quality (P < 0.05). The proportions of grade 1 (H = 3.2 ± 1.2; HZ = 27.6 ± 4.6; P < 0.0001) and grade 2 (H = 1.6 ± 0.6; HZ = 12.9 ± 2.2; P < 0.0001) oocytes were lower and the proportion of degenerate (H = 5.2 ± 1.5; HZ = 1.7 ± 0.6; P = 0.05) was greater in Holstein cows. The covariate respiratory frequency was significative (P < 0.05) and negatively associated to grade 1 oocytes and positively associated to grade 2 oocytes. DIM was significative (P < 0.05) and positively associated to grade 1 oocytes and negatively associated to degenerate oocytes. The proportion of viable oocytes (grade 1 and 2) was lower (P < 0.0001) in Holstein than in HZ-crossbred. Relative humidity and respiratory frequency were significative (P < 0.01) and negatively associated to good oocytes. An interaction (P = 0.03) between the effects of farm and treatment regarding CR was observed. Only on farm 1, the concentration 10-4 mol/L increased (P <0.09) the CR (70.0 ± 17.0%) compared to control (22.0 ± 15.6%), and only on farm 2, CR was increased (P < 0.09) by melatonin in the concentration 10-6 mol/L (50.0 ± 20.3%) compared to control (20.0 ± 13.5%). In conclusion, physiological parameters did not differ between genetic groups, but HZ crossbreds cows produced greater quality oocytes in comparison to Holstein. The addition of melatonin to the IVM medium may be a strategy to increase CR of embryos produced from lactating dairy cows during summer. However, the dose to be added differs according to genetic group, and it is greater from Holstein than crossbred HZ cows.

Efeito da insulina na criopreservação do sêmen bovino sobre a produção in vitro de embriões

Resumo: A insulina é um hormônio anabólico capaz de atuar na proteção das células espermáticas para minimizar os insultos da criopreservação, também atua na produção de embriões in vitro (PIV) trazendo benefícios no desenvolvimento embrionário devido ao seu efeito antiapoptótico e mitogênico. Desta forma, o presente trabalho visa avaliar os efeitos da adição de insulina ao meio de criopreservação de sêmen sobre o potencial da PIV de embriões. Para isso, foram utilizados dois ejaculados de seis touros (n=12), sendo que cada ejaculado foi distribuído em dois tratamentos para a criopreservação: Grupo controle (CO): sêmen diluído em meio Triladyl (n=12) e Grupo Insulina (IN): sêmen diluído em meio Triladyl suplementado com insulina (150 µUI/mL, n=12). Duas palhetas de sêmen de cada partida de cada tratamento foram descongeladas, homogeneizadas e submetidas à seleção em gradiente de Percoll®. Os espermatozoides obtidos após Percoll® foram avaliados quanto a motilidade, vigor, integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial mitocondrial e fragmentação de DNA e, após foram utilizados para a fertilização in vitro (FIV) de embriões. Para a PIV foram feitas quatro repetições, sendo aspirados folículos de ovários provenientes de abatedouro comercial e selecionados os complexos cumulus-oócito que apresentavam camadas de células do cumullus compactas e oócito com citoplasma homogêneo. Os oócitos foram submetidos ao processo de maturação in vitro (MIV) (22h/38,5oC/5%CO2) e realizada a FIV logo após a maturação. Os oócitos maturados foram distribuídos em dois grupos, sendo que um grupo recebeu o sêmen CO (n=1587) e o outro o sêmen IN (n= 1580). Após a fertilização os oócitos foram incubados (18h/38,5oC/5%CO2) e os zigotos presumíveis foram transferidos para o cultivo in vitro seguindo a ordem dos tratamentos e incubados por 8 dias (38,5ºC/5%CO2/5%O2/90%N2). A resposta da FIV foi determinada pela taxa de clivagem no terceiro dia do cultivo. No dia 8, avaliou-se o número de blastocisto e a taxa de desenvolvimento em relação aos zigotos presumíveis. Os dados foram submetidos à análise de variância pelo procedimento misto (PROC MIXED) do programa SAS versão 9.3. Em todas as análises estatísticas, o nível de significância considerado foi de P0,05. A taxa de clivagem não foi afetada pela adição de insulina ao diluidor de criopreservação do sêmen (64,21±2,04 x 63,62±1,69%), mas foi notada que a insulina causou redução nas taxas de blastocisto (CO: 24,06±2,69% x IN: 20,04±2,54%) e de desenvolvimento embrionário (CO: 35,81±3,23% x IN: 30,21±3,37%). Por outro lado, foram encontrados efeitos de touro para as taxas de clivagem (variando de 54,19±2,34 a 71,91±2,39%), de blastocisto (variando de 6,76±0,97 a 36,18±2,22%) e de desenvolvimento embrionário (variando de 12,32±1,53 a 50,12±2,04%), mas estas alterações não foram relacionadas com variações na qualidade espermática. Em conclusão, a insulina não apresenta efeito benéfico sobre as taxas de produção de embriões in vitro.

Abstract: Insulin is an anabolic hormone capable of acting in the protection of sperm cells to minimize cryopreservation insults, also acts in the production of in vitro embryos (PIV) bringing benefits in embryonic development due to its effect antiapoptotic and mitogenic. Thus, the present study aims to evaluate the effects of insulin addition to the means of cryopreservation of semen on the potential of PIV of embryos. For this, two ejaculates of six bulls (n=12) were used, each ejaculate was distributed in two treatments for cryopreservation: Control group (CO): semen diluted in Triladyl medium (n = 12) and Insulin Group (IN): semen diluted in Triladyl medium supplemented with insulin (150 µIU / mL, n = 12).Two semen reeds from each match of each treatment were thawed, homogenized and submitted to percoll gradient selection®. Sperm obtained after Percoll® were evaluated for motility, vigor, (acridine orange), plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial potential and DNA fragmentation, and after they were used for in vitro fertilization (IVF) of embryos. For PIV, four replications were performed, and ovaries follicles from commercial slaughterhouse were aspirated and the cumulative-oocyte complexes that presented layers of compact and oocyte cumullus cells with homogeneous cytoplasm were selected The oocytes were submitted to the maturation process in vitro (IVM) (22h/38.5oC/5%CO2) and IVF performed shortly after maturation. Matured oocytes were distributed into two groups, one group received semen CO (n=1587) and the other semen IN (n= 1580). After fertilization the oocytes were incubated (18h/38.5oC/5%CO2) and the presumed zygotes were transferred to in vitro cultivation following the order of treatments and incubated for 8 days (38.5ºC/5%CO2/5%O2/90%N2). The IVF response was determined by the cleavage rate on the third day of cultivation. On day 8, the number of blastocyst and the development rate were evaluated in relation to presumed zygotes. The data were submitted to variance analysis by the mixed procedure (PROC MIXED) of the SAS version 9.3 program. In all statistical analyses, the significance level considered was P0.05. Cleavage rate was not affected by the addition of insulin to the cryopreservation dilution of semen (64.21±2.04 x 63.62±1.69%), but insulin was noted to have caused a reduction in blastocyst rates (CO: 24.06±2.69% x IN: 20.04±2.54%) and embryonic development (CO: 35.81±3.23% x IN: 30.21±3.37%). On the other hand, bull effects were found for cleavage rates (ranging from 54.19±2.34 to 71.91±2.39%), blastocyst (ranging from 6.76±0.97 to 36.18±2.22%) and embryonic development (ranging from 12.32±1.53 to 50.12±2.04%), but these changes were not related to variations in sperm quality. In conclusion, insulin has no beneficial effect on embryo production rates in vitro.

ESTIMULAÇÃO OVARIANA VISANDO A PRODUÇÃO DE OÓCITOS EM OVELHAS DA RAÇA SANTA INÊS

A manipulação hormonal das funções ovarianas usando associação de gonadotrofinas e 2 progestágenos é amplamente aplicada nas tecnologias de reprodução assistida (ARTs) para 3 aumentar a obtenção de oócitos em ovelhas vivas. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito 4 de protocolos estimulatórios, considerando a resposta ovariana, a modulação gênica e seu 5 impacto sobre a qualidade dos complexos cumulus oócitos (CCOs) imaturos em ovelhas da raça 6 Santa Inês. No experimento 1, avaliou-se o uso de duas doses (80 e 120 mg) e dois regimes de 7 administração (única ou múltipla) do FSH. População folicular, taxa de recuperação, 8 quantidade de CCOs viáveis e BCB+ não diferiram, mas houve efeito do regime em múltipla 9 aplicação sobre a proporção de CCOs GI/II. A expressão de genes marcadores de qualidade e 10 da via esteroidogênica foi afetada (P<0.05) pelo FSH. A abundância na via esteroidogênica foi 11 reduzida com o aumento da dose de FSH nos protocolos de única aplicação, mas em múltipla 12 somente o LHr foi afetado. Comparando-se a mesma dose de FSH em diferentes regimes; 80 mg 13 em única aplicação reduziu a expressão de FSHr e ER, porém em 120 mg apenas o LHr foi 14 reduzido. No experimento 2, foi avaliado o uso da progesterona (P4) e acetato de 15 medroxiprogesterona (MAP) durante a estimulação com 80 mg de FSH em múltipla 16 administração previamente estabelecida no experimento 1. A resposta ovariana e os parâmetros 17 oocitários não diferiram entre os grupos. Contudo, a expressão gênica foi alterada pelos 18 progestágenos, onde receptores da via esteroidogênica (FSHr, LHr, Er) e marcadores de 19 qualidade (ZAR1, GDF9 e Bcl-2) foram abundantes em P4 (P <0,05). RELN foi subexpresso e 20 Bcl-2 superexpresso em MAP (P <0,05). FSHr, LHr e RELN foram superexpressos (P <0,05) 21 em P4 (vs MAP). Em conclusão, 80 mg de FSH em múltipla aplicação foi eficiente no 22 incremento da população folicular, obtenção de CCOs desenvolvidos (BCB+) e na modulação 23 de genes de impacto na qualidade. P4 e MAP não alteraram a dinâmica folicular, número de 24 folículos, número de CCOs e nem a qualidade morfológica dos mesmos. A P4 exógena modulou 25 positivamente a abundância dos genes com importância na aquisição da competência. O uso de 26 80 mg de FSH associado a um dispositivo intravaginal contendo P4 melhora a obtenção de 27 CCOs imaturos mais competentes para uso em ARTs em ovelhas. 28

progestogens are widely applied in the assisted reproductive technologies (ARTs) to enhance 3 oocyte obtaining in live female of small ruminants. The aim of this study was to evaluate the 4 effect of stimulatory protocols, considering ovarian response, gene modulation and its impact 5 on the quality of immature cumulus oocytes complex (COCs) in Santa Inês sheep. At 6 experiment 1, doses (80 and 120 mg) and application regimen (single or multiple) of FSH were 7 evaluated. Follicular population, recovery rate, number of viable COCs and BCB+ COCs did 8 not differ among groups, but there was effect on the proportion of GI / II COCs in the multiple 9 application regime. FSH affected expression of quality markers and steroidogenic pathway 10 (P<0.05). Abundance in the steroidogenic pathway was reduced with increasing of the FSH 11 dose in single application, but in multiple only LHr was affected. When comparing the same 12 FSH dose in different regimen, 80 mg in single application reduced the expression of FSHr and 13 ER, but in 120 mg only the LHr was reduced. At experiment 2, the effect of progesterone (P4) 14 and medroxyprogesterone acetate (MAP) used during FSH stimulation were evaluated. Ovarian 15 response and oocyte parameters did not differ among groups. However, gene expression was 16 altered by progestogens: steroidogenic pathway receptors (FSHr, LHr, Er) and quality markers 17 (ZAR1, GDF9 and Bcl-2) were up-regulated in P4. RELN was down-regulated and Bcl-2 up-18 regulated in MAP (P <0.05). FSHr, LHr and RELN were up-regulated (P <0.05) in P4 (vs 19 MAP). In conclusion, 80 mg of FSH in multiple applications was efficient to increase the 20 follicular population, fully grown (BCB +) COCs obtaining and modulated positively the genes 21 expression. P4 and MAP did not alter the follicular dynamics, number of follicles, number of 22 CCOs or their morphological quality. Exogenous P4 positively modulated the abundance of 23 genes with importance in competence acquisition. The use of 80 mg of FSH associated with an 24 intravaginal device containing P4 improves the obtaining of competent immature COCs for use 25 in ARTs in sheep. 26

FECUNDAÇÃO IN VITRO APÓS MICROINJEÇÃO CITOPLASMÁTICA PARA A EXPRESSÃO EPISSOMAL TRANSIENTE DO GENE IGF2

Embriões bovinos produzidos in vitro por fecundação in vitro (PIV/FIV) e transferência nuclear (TN) apresentam diferenças bioquímicas, metabólicas, moleculares, histológicas e de desenvolvimento quando comparados aos seus equivalentes in vivo. Destacam-se anormalidades tanto pré-natais durante a placentação e mortalidade embrionária por subdesenvolvimento inicial, quanto pós-natais, caracterizados pela Síndrome do Neonato Anormal (AOS). Estudos evidenciam que há importantes alterações nos padrões de imprinting genômico embriões de PIV, especialmente no padrão de expressão de imprinting do sistema IGF, sendo o ligante IGF2, um gene de expressão paterna de caráter pleiotrópico e de efeito promotor de crescimento e diferenciação, e o receptor IGF2R, um gene de expressão materna que contrapõe os efeitos do gene IGF2. Assim, o presente estudo objetivou realizar a superexpressão epissomal transiente do gene IGF2 pela técnica de microinjeção citoplasmática em embriões bovinos no estádio de 1-célula produzidos por FIV visando o aumento da eficiência nos índices de desenvolvimento, cinética e qualidade embrionária in vitro até o Dia 7 de desenvolvimento. Após nove repetições, um total de 1.752 complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos foram maturados e fecundados in vitro e posteriormente segregados em seis grupos experimentais: um controle não-microinjetado, um controle microinjetado com tampão tris-EDTA, ou TE (0 ng/L), e quatros grupos de microinjeção com doses crescentes (10, 20, 40, 80 ng/L) do vetor de expressão epissomal do gene IGF2 acompanhado do gene da proteína GFP em TE. No Dia 2 de desenvolvimento, foram avaliadas as taxas de clivagem e sobrevivência pós-microinjeção, além do número de blastômeros, e no Dia 7 de desenvolvimento, após cultivo in vitro, avaliaram-se as taxas de blastocisto, estádio de desenvolvimento e qualidade embrionária, taxa de embriões fluorescentes e número total de células em blastocistos. A microinjeção citoplasmática de zigotos foi efetiva em dispor o vetor de expressão no ooplasma, independente dos grupos, com média de 58% de blastocistos com fluorescência positiva no Dia 7 de desenvolvimento. A dose de 10 ng/L de microinjeção do vetor promoveu uma menor taxa de blastocistos (10,4%), porém com blastocistos em estádios mais avançados de desenvolvimento (93,0%), com melhor qualidade morfológica (73% de Grau 1) e maior número de células (116,0 ± 3,0) em relação ao controle FIV não microinjetado (23,3%, 75,0%, 58,0%, e 75,0 ± 6,8, respectivamente). Em resumo, a microinjeção de embriões com um vetor de superexpressão do gene IGF2 promoveu uma taxa de desenvolvimento similar aos controles, com diferenças quando se utilizou a dose de 10 ng/L, com uma menor taxa de blastocistos, porém com maior cinética de desenvolvimento, qualidade morfológica e número de células totais, indicando um possível efeito promotor do crescimento do gene IGF2 no desenvolvimento de embriões bovinos de PIV, do estádio de 1-célula até blastocisto.

Bovine IVP embryos produced by in vitro fertilization (IVF) or nuclear transfer (TN) usually have significant biochemical, metabolic, molecular, histological and developmental differences through birth and beyond when compared to the in vivo counterparts. To note, prenatal abnormalities during placentation and embryonic mortality due to early underdevelopment, and postnatal clinical symptoms, collectively named the Abnormal Offspring Syndrome (AOS,) are common occurrences for IVP embryos. Studies show that important changes usually occur in the pattern of genomic imprinting in IVP embryos, especially in the imprinting pattern of the IGF system, with the IGF2 ligand being a pleiotropic paternally expressed gene with a growth promoting effect, and the receptor IGF2R being a maternal expressed gene that counteracts the effects of the IGF2 gene. Thus, the present study aimed to induce a transient episomal overexpression of the IGF2 gene in bovine IVP embryos following the cytoplasmic microinjection at the 1-cell stage for the increase in embryo development, kinetics and morphological quality up to Day 7 of development. After nine replicates, a total of 1,752 bovine cumulus-oocyte complexes (CCOs) were matured and fertilized in vitro and subsequently segregated into six experimental groups: a non-microinjected control group, a microinjected control group using only tris-EDTA buffer, or TE (0 ng/L ), and four microinjection groups at increasing doses (10, 20, 40, 80 ng/L) of the vector in TE for the episomal expression of the IGF2 and the GFP genes. On Day 2 of development, cleavage and post-microinjection survival rates were evaluated, in addition to the estimation of the number of blastomeres. On Day 7 of development, blastocyst rates and stage of development, embryo quality, GFP fluorescence and total cell numbers were evaluated in resulting blastocysts after in vitro culture. Cytoplasmic microinjection of zygotes was effective in delivering the expression vector into the ooplasm, irrespective of the groups, with 58% of positive GFP fluorescence in Day-7 blastocysts. Considering developmental rates and embryo kinetics, the 10 ng/L microinjection vector dose promoted a lower blastocyst rate (10.4%), but with blastocysts at more advanced stages of development (93.0%), better morphological quality (73% Grade 1) and higher number of cells (116.0 ± 3.0) than non-microinjected IVF controls (23.3%, 75.0%, 58.0%, and 75.0 ± 6.8, respectively). In summary, the microinjection of embryos with an IGF2 gene overexpression vector promoted a developmental rate similar to IVF controls, with differences only when the 10-ng/L dose was used, with a lower blastocyst rate, but with higher developmental kinetics, morphological quality and total number of cells, indicating a possible growth promoting effect of the IGF2 gene on development of bovine IVP embryos, from the 1-cell to the blastocyst stages.

Efeito "In vitro" e "In Vivo" da adição de cafeína sobre as características do espermatozóide Eqüino pós-descongelamento.

A criopreservação do sêmen equino é um importante instrumento no melhoramento genético pela maximização do uso de bons reprodutores da espécie. No entanto, este processo reduz a motilidade e longevidade do espermatozoide. Portanto, substâncias ativadoras da motilidade espermática podem ser de suma importância para o sucesso da inseminação artificial com sêmen criopreservado equino. A cafeína é um estimulante da motilidade e capacitação espermática, as quais são características necessárias para a fecundação do oócito. Deste modo, sua adição previa a inseminação artificial com sêmen congelado-descongelado pode ser uma alternativa para aumentar a taxa de fertilidade do sêmen congelado equino. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a qualidade espermática in vitro e a fertilidade in vivo do sêmen congelado equino com a adição de diferentes concentrações de cafeína. Para isso, um ejaculado de 9 garanhões foi congelado com diluidor INRA82 e após o descongelamento às amostras foram adicionadas três diferentes concentrações de cafeína perfazendo quatro tratamentos: T1) controle INRA82 (sem adição de cafeína), T2) T1+3mM de cafeína, T3) T1+5mM de cafeína, e T4) T1+7,5mM de cafeína. A motilidade e cinética espermática foram avaliadas com um sistema de análise espermática computadorizada (CASA), a funcionalidade de membrana espermática com um teste hiposmótico e integridade e taxa de reação acrossômica espontânea com citometria de fluxo. As amostras foram avaliadas em quatro tempos: t0) imediatamente após o descongelamento do sêmen, t20) 20 minutos, t30) 30 minutos, t40) 40 minutos e t50) 50 minutos após o descongelamento do sêmen. Após o descongelamento do sêmen, as amostras foram submetidas ao método de seleção espermática swim-up para avaliação do número de espermatozoides recuperados e morfologicamente normais. Estes foram avaliados em quatro tempos: t20) 20 minutos, t40) 40 minutos, t60) 60 minutos e t80) 80 minutos após o swim-up e comparados com o sêmen pós-descongelamento (controle). As concentrações espermáticas de nitrito e peróxido de hidrogênio (µM/µg de proteína) do controle e com 5mM de cafeína foram mensuradas com espectrofotometria. A taxa de fertilidade in vivo foi avaliada por meio de inseminação artificial (IA) de 8 éguas/tratamento, sendo testados o tratamento controle e com 5mM de cafeína. A adição de cafeína não diferiu em relação as taxas de espermatozoides com funcionalidade e integridade de membrana espermática, e taxa de reação acrossômica espontânea entre os grupos (P>0,05). Entretanto, na concentração de 5mM de cafeína houve aumento da motilidade total dos espermatozoides pós-descongelamento (38,9±2,8), diminuição da concentração de nitrito (11,4±2,1), e aumento da taxa de recuperação (7,9x106 /ml), e de espermatozoides com morfologia normal (79,9±1,0), após swim-up comparada ao controle (32,6±3,4; 12,8±2,9; 3,4x106 /ml±0,7; 70,0±2,0 , respectivamente, P<0,05). A taxa de fertilidade das éguas inseminadas com a adição de 5mM de cafeína foi superior (62,5%) à do grupo controle (12,5%, P<0,05). Em conclusão, a concentração de 5mM de cafeína adicionada ao sêmen equino pós descongelamento exerceu efeito antioxidante e ativador da motilidade espermática equina. Provavelmente, estes foram os responsáveis pelo aumento da taxa de fertilidade das éguas inseminadas com adição de cafeína comparadas ao grupo controle. Portanto, a adição de 5mM de cafeína ao sêmen congelado e descongelado aumentou a taxa de fertilidade equina, podendo ser uma alternativa para o uso na IA de éguas com sêmen de garanhões de baixa qualidade seminal pós-descongelamento.

The cryopreservation of equine semen is a crucial tool in genetic improvement by maximizing the use of sires with high genetic merit. However, the cryopreservation process reduces sperm motility and longevity. Thus, sperm motility activating substances may play an important role for the success of equine artificial insemination (AI) with frozen semen. Caffeine is a stimulant of sperm motility and capacitation, which are important attributes to oocyte fertilization. Consequently, the addition of caffeine prior to the AI with frozen-thawed semen can be an alternative to increase the fertility rate of frozen equine semen. The aim of the present work was to evaluate the in vitro sperm quality and in vivo fertility of frozen-thawed equine semen after addition of different caffeine concentrations. Thus, one ejaculate of 9 stallions (n=9) was frozen with INRA82 frozen extender and after thawing three different concentrations of caffeine were added to the samples performing four treatments: T1) control INRA82 (no caffeine addition), T2) T1+3mM caffeine, T3) T1+5mM caffeine, and T4) T1+7.5mM caffeine. The sperm kinetics and motility were evaluated with a computer assisted sperm analysis (CASA), sperm membrane functionality with a hypoosmotic swelling test, and sperm integrity and spontaneous acrosome reaction rate with flow cytometry. The samples were evaluated in four periods: t0) immediately after thawing, t20) 20 min, t30) 30 min, t40) 40 min, and t50) 50 min after semen thawing. The post-thawed samples were subjected to the swim-up sperm selection method and the number of recovered and morphologically normal sperm were recorded. Such samples were evaluated at four period: t20) 20 min, t40) 40 min, t60) 60 min and t80) 80 min after swim-up and compared to the post-thawing sperm (control). Nitrite and hydrogen peroxide concentrations (µM / µg protein) from the control and treatment with 5mM caffeine addition were measured with spectrophotometry. The in vivo fertility rate was assessed with artificial insemination (AI) of 8 mares/ treatments, control and 5mM caffeine. There was no difference between the rate of sperm with functional and intact membrane, and spontaneous acrosome reaction between the control and 5mM caffeine group (P>0,05). However, the concentration of 5mM of caffeine induced an increase of the total sperm motility (38.9±2.8), reduced the nitrite concentration (11.4±2.1), and also increased the sperm recovery rate (7.9x106 /ml) and sperm with normal morphology (79.9±1.0) after swim-up compared to control (32.6±3.4; 12.8±2.9; 3.4x106 /ml±0.7; 70.0±2.0, P<0.05), respectively. Moreover, the AI rate of the 5mM caffeine group was significantly higher (62.5%) than the control group (12.5%, P<0.05). In conclusion, 5mM of caffeine play a significant role as antioxidant and motility activator of post-thawed equine sperm. Possibly, these factors were responsible for the higher fertility rate of the inseminated mares with thawed semen with 5mM caffeine compared to the control. Thus, the addition of 5mM of caffeine to the frozenthawed stallion sperm increased the equine fertility rate, so that it may be an alternative to the use in the mares AI with stallion semen with low post-thawed quality.

Estratégias para o aumento na eficiência de produção de suínos geneticamente modificados

Os animais geneticamente modificados (GM) são uma importante fonte de proteína e nutrição para a maioria dos seres humanos e desempenharão papel fundamental para satisfazer a crescente demanda por alimentos em uma população mundial cada vez maior. Existem atualmente várias técnicas disponíveis para a produção animais GM, sendo que a clonagem por transferência nuclear de célula somática (TNCS), desde o nascimento da ovelha Dolly, continua sendo a técnica padrão ouro para se obter animais transgênicos. Apesar da clonagem por TNCS estar estabelecida há mais 20 anos, a eficiência continua baixa, com variações entre as diferentes espécies já clonadas. Esta baixa eficiência é multifatorial, tendo como pontos-chave a qualidade do material biológico utilizado (oócitos), o processo de ativação química partenogenética e a reprogramação celular após a fusão da célula doadora com o citoplasma receptor. Vários intentos foram realizados para avaliar a qualidade oocitária de forma menos subjetiva. A exposição dos oócitos a uma solução hipertônica é uma das opções viáveis e com resultados promissores. A ativação química dos embriões reconstruídos deve ser feita de maneira mais fisiológica possível, tentando mimetizar os processos biológicos que ocorrem na fecundação. Existem várias outras técnicas disponíveis para a produção de animais GM, incluindo a introdução de transgene em embriões, dentre estas, a microinjeção e a eletroporação de zigotos. A última década experimentou uma revolução no desenvolvimento de métodos de edição gênica que permitem a introdução de alterações específicas em genomas complexos. Esta revolução se deu início com o uso de meganucleases, Zinc Fingers, TALENS e, mais recentemente, com o descobrimento do uso das CRISPRs. Este aumento na precisão das ferramentas de edição irá melhorar características dos animais de produção com base no genoma para a produção de alimentos. A genética de precisão também aumentará o desenvolvimento de biomateriais terapêuticos e modelos de doenças humanas como recursos para o desenvolvimento de terapias avançadas para pacientes. O uso das nucleases de edição, especialmente as CRISPRs, abriu um leque de possibilidade de outras técnicas para serem empregadas na edição sítio-dirigida, como a microinjeção citoplasmática e a eletroporação de zigotos. Este trabalho teve como objetivo aumentar a eficiência na produção embriões suínos utilizando a clonagem por TNCS selecionando os oócitos de maneira menos subjetiva, aumentando a eficiência na ativação partenogenética pelo uso de quelantes de zinco, e aumentando a produção e qualidade embrionária expondo embriões a um inibidor de desacetilase de histonas (Scriptaid), assim como de desenvolver um protocolo de eletroporação de embriões suínos funcional e repetível para a edição gênica em diferentes loci utilizando CRISPRs combinada com complexos ribonucleoproteicos.

Genetically modified (GM) animals are an important source of protein and nutrition for humans and will play key roles in meeting the growing demand for food in an ever-growing world population. There are currently several techniques available for the production of GM animals, but cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT), since the birth of Dolly, remains the gold standard technique for obtaining transgenic animals. Although cloning by SCNT was established more than 20 years, the efficiency in producing cloned animals remains low, with variations among the species already cloned. Such low efficiency is multifactorial, having as key points the quality of the biological material for use (oocytes), the parthenogenetic chemical activation process, and the cellular reprogramming after the fusion of the donor cell with the recipient cytoplasm. Several attempts have been made to evaluate oocyte quality in a less subjective and visual way as it is usually done. The exposure of oocytes to a hypertonic solution is one of the viable options with promising results. Also, the chemical activation of the reconstructed embryos should be done in a more physiological way, in an attempt to mimic the biological processes that occur after fertilization. Several other techniques are also available for the delivery of transgenes into embryos for the production of GM animals, among them, zygote microinjection and electroporation. The last decade has undergone a revolution in the development of methods for gene editing that allow the introduction of specific modifications into complex genomes. Such revolution began with the use of meganucleases, such as Zinc Fingers, TALENS and more recently, with the discovery and the use of CRISPRs. This increase in accuracy in the editing tools will improve animal traits for food production. Precision genetics will also enhance the development of therapeutic biomaterials and human disease models as resources for the development of advanced therapies for patients. The use of editing nucleases, especially CRISPRs, has opened up a range of possibilities for other techniques to be used in site-directed editing, such as cytoplasmic microinjection and zygote electroporation. This study aimed to increase the efficiency in the production of porcine embryos using SCNT cloning by selecting oocytes in less subjective ways, by increasing the parthenogenetic activation efficiency using zinc chelators, and by improving embryo production by exposing cloned embryos to a histone deacetylase inhibitor (Scriptaid), as well as by developing a functional and repeatable protocol for the electroporation of pig embryos for gene editing at different loci using CRISPRs combined with ribonucleoprotein complexes.

Efeitos da substituição de SFB por IGF-I sobre os aspectos celulares e moleculares da produção in vitro de embriões bovinos

O objetivo do presente estudo foi avaliar o benefício da substituição do soro fetal bovino (SFB) pelo fator de crescimento semelhante à insulina tipo I (IGF-1) durante a maturação in vitro (MIV) ou cultivo in vitro (CIV), sobre qualidade embrionária e expressão de genes em embriões pré- e pós-compactação. Delineamento experimental foi fatorial 3 x 3 (três suplementos de MIV e três de CIV), com 9 grupos experimentais. Foram realizadas 20 réplicas (oócitos 400/grupo). Complexos cúmulus-oócito (COCs) graus I e II foram maturados in vitro com a adição de 10% de SFB (SFB), ou 3 mg/mL polivinil-álcool (PVA), ou PVA + 100 ng/mL de IGF-1 (IGF) a 38,5 ºC em 5% de CO2 em ar por 22 a 24 horas. Foram fertilizados e incubados durante 18 horas. Os zigotos foram cultivados com a adição de: 2,5% de SFB (SFB), ou 3 mg/mL de PVA (PVA), ou PVA + 100 ng/mL de IGF-1 (IGF) por sete dias a 38,5ºC em 5% de CO2 em ar. As taxas de clivagem e blastocisto foram avaliadas após 48 e 168 horas de cultivo, respectivamente. A técnica simplificada de coloração diferencial de células da massa celular interna (MCI) e trofoectoderma (TE) foi utilizada para avaliar a distribuição celular de blastocistos (n = 155) e a técnica de TUNEL para avaliação do índice de apoptose (n = 207). Concentrações de glicose e lactato obtidas do meio MIV utilizaram-se para analisar o metabolismo de glicose. mRNA foi extraído de embriões de 6 8 células colhidos após 66 horas post-inseminação (4 pools de 15 embriões por grupo) e de blastocistos expandidos de 7 dias (4 pools de 5 embriões por grupo). A expressão gênica foi realizada no sistema BioMark HD® de microfluídica, pelo arranjo 96.96 Dynamic Array. Os dados foram analisados ANOVA do PROC GLIMMIX do SAS. Foi utilizado o teste Tukey para comparação de médias. Valores de p 0.05 foram considerados significativos. A clivagem foi maior (p < 0,05) nos grupos maturados em SFB. MIV e CIV com SFB presentou maior (p < 0.05) taxa de produção de blastocisto e maior quantidade de blastocistos expandidos que PVA e IGF. MIV com IGF-I aumentou o consumo de glicose e síntese de lactato dos COCs e levou à produção de blastocistos com maior (p < 0.05) número total de células. Embriões cultivados em IGF-I tiveram maior (p < 0.05) quantidade de células na MCI e embriões cultivados em PVA tiveram maior (p < 0.05) apoptose do que SFB. Os genes NANOG, OTX2, POU5F1 e IFNT2 foram mais expressos em blastocistos cultivados em PVA e IGF do que em SFB. O IGF-I regula TP53, BAX, CASP3, CASP9, HSPA1A e IGF1R para prevenir apoptose. IGF-I durante a MIV em meio semi-definido estimula o metabolismo de glicose de COCs, melhora a qualidade embrionária, aumentando o número total de células de blastocistos. IGF-I durante a CIV aumenta o numero de células na MCI, melhora a expressão de biomarcadores importantes de qualidade embrionária com a possibilidade de melhorar o desenvolvimento embrionário.

The aim of the present study was to analyze the benefits of fetal bovine serum (FBS) replacement by insulin-like growth factor I (IGF-I) during in vitro maturation (IVM) and in vitro culture (IVC), on embryo quality and temporal gene expression in embryos pre- and post-compaction. A 3 x 3 factorial design was performed (three supplements for IVM and three for IVC), with a total of 9 experimental groups. A total of 20 replicates (oocytes 400/group) were performed. Grade I and II cumulus-oocyte complexes (COCs) matured in vitro with the addition of 10% of FBS (FBS), or 3 mg/mL of polyvinyl-alcohol (PVA), or PVA + 100 ng/mL IGF-1 (IGF) at 38.5 ºC in an atmosphere of 5% CO2 for 22 to 24 hours. After IVM, oocytes were fertilized and incubated for 18 hours. Possible zygotes were cultured with the respective addition of: 2.5% of FBS (FBS), or 3 mg/mL of PVA (PVA), or PVA + 100 ng/mL of IGF-1 (IGF) for seven days at 38.5 ºC in an atmosphere of 5% CO2. Cleavage and blastocyst rates were analyzed at 48 and 168 hours of culture respectively. Simplified technique for differential staining of inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) cells was performed to analyze cell allocation of blastocysts (n = 155) and TUNEL assay for apoptosis rate analysis (n = 207). Glucose and lactate concentrations were measured in IVM spent media to analyze glucose metabolism. mRNA was extracted from 6 8 cells embryos collected after 66 hours post insemination (4 pools of 15 embryos per group) and 7 day expanded blastocysts (4 pools of 5 embryos per group). Gene expression analysis was performed with BioMark HD® system with microfluidic chip 96.96 Dynamic Array. Data were analyzed by ANOVA from PROC GLIMMIX model from SAS. Tuckey test was used to compare means. P value 0.05 was considered to be significant. Cleavage rate was higher (p < 0.05) for groups matured in FBS. IVM and IVC in FBS presented higher (p < 0.05) total blastocyst yield and greater quantity of expanded blastocysts than PVA and IGF. IVM with IGF-I increased glucose uptake and lactate synthesis of COCs and produced blastocysts with increased (p < 0.05) total cell number. Embryos cultured in IGF-I had greater (p < 0.05) amount of cells in the ICM and embryos cultured in PVA had higher (p < 0.05) apoptosis rate than FBS. NANOG, OTX2, POU5F1 and IFNT2 genes were more expressed in blastocysts cultured in PVA and IGF than in FBS. IGF-I regulates TP53, BAX, CASP3, CASP9, HSPA1A and IGF1R genes to prevent apoptosis. The addition of IGF-I during IVM in chemically semi-defined media stimulates glucose metabolism of COCs and improves embryo quality, increasing total cell number of blastocysts. The addition of IGF-I during IVC increases the amount of cells of the ICM, improves expression of important embryo quality biomarkers with the possibility to enhance embryo development.