Vacuolização neuronal e degeneração espinocerebelar em filhote de Rottweiler / Neuronal vacuolation and spinocerebellar degeneration in a Rottweiller puppy

Background: Spinocerebellar degenerations and neuronal vacuolations are alterations characterized by the formation of vacuoles in the nervous tissue, commonly called status spongiosus. This condition occurs in young Rottweiler dogs causing a disease called Neuronal Vacuolation and Spinocerebellar Degeneration. Clinically, it presents with ataxia of the pelvic limbs, which evolves to generalized ataxia, tetraparesis, and laryngeal paralysis. Histologically, spongiform and vacuolar alterations of the neuropil and neurons are highlighted. This reports a case of neuronal vacuolation and spinocerebellar degeneration in a Rottweiler puppy. Case: Necropsy was performed on the cadaver of a 5-month-old Rottweiler bitch that had been presenting with ataxia for approximately 1 month, in addition to dyspnea, pulmonary crepitations, and microphthalmia. Macroscopic evaluation revealed pale ocular and oral mucosae; marked gastric dilatation and abdominal distension; pulmonary hemorrhage and edema; hepatosplenomegaly; fatty degeneration of the liver; and congestion of meningeal blood vessels. Microscopically, histological evaluation of the spinal cord showed an increase in gray matter cellularity with marked presence of oligodendrocytes and microglia cells; moderate to severe multifocal intracytoplasmic micro- and macrovacuoles with displacement of the neurons' nuclei to the periphery of the cell; central chromatolysis of the neurons adjacent to neurons affected by vacuolation; and mild multifocal necrosis associated with mild multifocal neuronophagia. The white matter exhibited discrete digestion chambers, in addition to marked diffuse congestion of the leptomeninges. In the cerebellum, neurons in the nerve nuclei (emboliform, globose, and fastigial) showed moderate multifocal vacuoles in the cytoplasm, whereas adjacent neurons showed central chromatolysis, necrosis, and mild neuronophagia. Additional histological findings included lymphoid hyperplasia, fatty degeneration of the liver, pulmonary edema, and pulmonary hemorrhage. Discussion: Spongiform and degenerative encephalopathies are diseases recognized worldwide, mainly in cattle and sheep. However, the identification of these changes in new species has led to the need for further investigations. In dogs, the first reports occurred in 1995 and 1997 in Rottweiler animals. This disease affects young dogs, and although its pathogenesis is not completely known, it is believed to be associated with a genetic mutation in the RAB3GAP1 gene. Clinically, it is associated with clinical neurological manifestations, including progressive ataxia of the pelvic limbs, changes in spinal reflex, disordered proprioceptive reactions, laryngeal paralysis, as well as behavioral and gait alterations. In the clinical evaluation, leukoencephalomyelopathy and neuroaxonal dystrophy should be diseases considered as possible differential diagnoses, as they present with similar alterations. However, in histological evaluation, the exclusion of both is basically due to the absence of neuronal vacuolization. Unfortunately, the definitive diagnosis is only made post mortem, through a histopathological evaluation of the nervous tissue. Because it is a disease whose pathogenesis is little known and which shows signs of having a genetic character, histopathological examination for diagnostic purposes in young animals with neurological signs is of great importance.

Absence of Trichinella spiralis in swine carcasses slaughtered in the Midwestern region of Paraná state, Brazil / Ausência de Trichinella spiralis em carcaças de suínos abatidos na região Centro-Oeste do estado do Paraná, Brasil

Trichinella spiralis causes severe infections in humans, resulting in various clinical symptoms and even death, in several countries worldwide. Human trichinellosis has been reported in 55 countries, and mainly affects certain ethnic groups and tourists. It is caused by the ingestion of raw, undercooked meat or pork, or their by-products containing parasitic larvae. Infections in swine especially occur due to the parasitic contamination of food containing animal products, predation by rodents and other animals infected with T. spiralis, and due to the frequent habit of cannibalism in intensive production systems. This study aimed to evaluate the prevalence of T. spiralis in pig carcasses from a slaughterhouse located in the midwestern region of Paraná State, Brazil. Pools of 100 g of diaphragm, containing at least 1 g of tissue from each test animal, were collected, ground, and subjected to acid digestion with pepsin (1:10,000) and 25% hydrochloric acid. Sampling was performed in accordance to the methodology recommended by the European Union. All the 735,902 samples collected between 2010 and 2013, and in 2018, were negative for Trichinella spp. larvae. The pigs came from 483 farms from 90 municipalities from the three states of southern Brazil (Paraná, Santa Catarina and Rio Grande do Sul). The absence of the parasite in different animal species, reported by surveys conducted in Brazil, could confirm the country as free from trichinellosis. Although T. spiralis is not endemic to Brazil, it is necessary to subject the meat of adult pigs slaughtered here and exported to other countries to inspections and parasitological examinations. It is therefore necessary to continually inspect pig carcasses for T. spiralis in slaughterhouses worldwide.

Trichinella spiralis causa infecções graves em humanos, resultando em vários sintomas clínicos e até morte, em vários países do mundo. A triquinelose humana foi relatada em 55 países e afeta principalmente certos grupos étnicos e turistas. É causada pela ingestão de carne crua ou malpassada, ou seus subprodutos contendo larvas parasitas. As infecções em suínos ocorrem principalmente devido à contaminação parasitária de alimentos contendo produtos de origem animal, predação de roedores e outros animais infectados com T. spiralis, além do hábito frequente de canibalismo em sistemas de produção intensiva. Este trabalho objetivou avaliar a prevalência de T. spiralis em carcaças de suínos de um abatedouro localizado na região centro-oeste do Estado do Paraná. Conjuntos de 100 g de diafragma, contendo pelo menos 1 g de tecido de cada animal testado, foram coletados, triturados e submetidos a digestão ácida com pepsina (1:10.000) e ácido clorídrico a 25%. A amostragem foi realizada de acordo com a metodologia recomendada pela União Europeia. Todas as 735.902 amostras coletadas entre 2010 e 2013, e em 2018, foram negativas para larvas de Trichinella spp. Os suínos foram provenientes de 483 fazendas, de 90 municípios, dos três estados do sul do Brasil (Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul). A ausência do parasita em diferentes espécies animais, relatada por pesquisas realizadas no Brasil, poderia confirmar o país como livre de triquinelose. Embora T. spiralis não seja endêmica no Brasil, é necessário submeter a carne de suínos adultos abatidos aqui e exportados para outros países, a inspeções e exames parasitológicos. É, portanto, necessário inspecionar continuamente carcaças de suínos para T. spiralis em abatedouros de todo o mundo.

Toxoplasma gondii genotyping from free-range chickens (Gallus gallus domesticus) in a rural area of Rio Grande do Sul, Brazil / [Genotipagem de Toxoplasma gondii em galinhas domésticas em uma área rural do Rio Grande do Sul, Brasil]

Free-range chickens may ingest oocysts of T. gondii present in the environment and consequently harbor virulent strains of this parasite in different tissues, without any clinical signs. Isolation of T. gondii through bioassays on mice and cats from naturally infected chicken tissues has been described in several countries, demonstrating the importance of free-range chickens in the transmission of this parasite. The aim of this study was the genotypic characterization of T. gondii isolates obtained from naturally infected free-range chickens in a rural area of the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Brain and heart tissue from 12 chickens seropositive for T. gondii were processed using peptic digestion technique for parasite isolation. From 12 samples subjected to mouse bioassay, nine isolates were obtained. RFLP-PCR genotypic characterization was performed using 11 genetic markers: SAG1, 5'-3'SAG2, alt.SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1 and Apico. Genetic characterization of the isolates revealed the presence of five atypical genotypes according to ToxoDB (# 11, # 55, # 64, # 140 and # 163). Our results showed a wide genetic diversity of T. gondii in free-range chickens in this region.(AU)

Galinhas criadas ao ar livre podem ingerir oocistos de T. gondii presentes no ambiente e, com isso, albergar cepas virulentas desse parasita em diferentes tecidos, sem sinais clínicos. O isolamento de T. gondii por meio de bioensaios em camundongos e gatos, a partir de tecidos de galinhas naturalmente infectadas, tem sido descrito em vários países. Isso demonstra a importância das galinhas caipiras na epidemiologia desse parasita. O objetivo deste trabalho foi caracterizar genotipicamente isolados de T. gondii obtidos de galinhas caipiras naturalmente infectadas em uma área rural do município de Santa Maria, estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Fragmentos de cérebro e de coração, de 12 galinhas soropositivas para T. gondii, foram processados pela técnica de digestão péptica para isolamento do parasita. Das 12 amostras submetidas a bioensaio com camundongos, nove isolados foram obtidos. A caracterização genotípica por RFLP-PCR foi realizada utilizando-se 11 marcadores genéticos: SAG1, 5'-3'SAG2, alt.SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1 e Apico e revelou a presença de cinco genótipos atípicos de acordo com o ToxoDB (# 11, # 55, # 64, # 140 e # 163). Os resultados mostraram uma ampla diversidade genética de T. gondii em galinhas caipiras nessa região.(AU)

Absence of Trichinella spiralis in swine carcasses slaughtered in the Midwestern region of Paraná state, Brazil / Ausência de Trichinella spiralis em carcaças de suínos abatidos na região Centro-Oeste do estado do Paraná, Brasil

Trichinella spiralis causes severe infections in humans, resulting in various clinical symptoms and even death, in several countries worldwide. Human trichinellosis has been reported in 55 countries, and mainly affects certain ethnic groups and tourists. It is caused by the ingestion of raw, undercooked meat or pork, or their by-products containing parasitic larvae. Infections in swine especially occur due to the parasitic contamination of food containing animal products, predation by rodents and other animals infected with T. spiralis, and due to the frequent habit of cannibalism in intensive production systems. This study aimed to evaluate the prevalence of T. spiralis in pig carcasses from a slaughterhouse located in the midwestern region of Paraná State, Brazil. Pools of 100 g of diaphragm, containing at least 1 g of tissue from each test animal, were collected, ground, and subjected to acid digestion with pepsin (1:10,000) and 25% hydrochloric acid. Sampling was performed in accordance to the methodology recommended by the European Union. All the 735,902 samples collected between 2010 and 2013, and in 2018, were negative for Trichinella spp. larvae. The pigs came from 483 farms from 90 municipalities from the three states of southern Brazil (Paraná, Santa Catarina and Rio Grande do Sul). The absence of the parasite in different animal species, reported by surveys conducted in Brazil, could confirm the country as free from trichinellosis. Although T. spiralis is not endemic to Brazil, it is necessary to subject the meat of adult pigs slaughtered here and exported to other countries to inspections and parasitological examinations. It is therefore necessary to continually inspect pig carcasses for T. spiralis in slaughterhouses worldwide.(AU)

Trichinella spiralis causa infecções graves em humanos, resultando em vários sintomas clínicos e até morte, em vários países do mundo. A triquinelose humana foi relatada em 55 países e afeta principalmente certos grupos étnicos e turistas. É causada pela ingestão de carne crua ou malpassada, ou seus subprodutos contendo larvas parasitas. As infecções em suínos ocorrem principalmente devido à contaminação parasitária de alimentos contendo produtos de origem animal, predação de roedores e outros animais infectados com T. spiralis, além do hábito frequente de canibalismo em sistemas de produção intensiva. Este trabalho objetivou avaliar a prevalência de T. spiralis em carcaças de suínos de um abatedouro localizado na região centro-oeste do Estado do Paraná. Conjuntos de 100 g de diafragma, contendo pelo menos 1 g de tecido de cada animal testado, foram coletados, triturados e submetidos a digestão ácida com pepsina (1:10.000) e ácido clorídrico a 25%. A amostragem foi realizada de acordo com a metodologia recomendada pela União Europeia. Todas as 735.902 amostras coletadas entre 2010 e 2013, e em 2018, foram negativas para larvas de Trichinella spp. Os suínos foram provenientes de 483 fazendas, de 90 municípios, dos três estados do sul do Brasil (Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul). A ausência do parasita em diferentes espécies animais, relatada por pesquisas realizadas no Brasil, poderia confirmar o país como livre de triquinelose. Embora T. spiralis não seja endêmica no Brasil, é necessário submeter a carne de suínos adultos abatidos aqui e exportados para outros países, a inspeções e exames parasitológicos. É, portanto, necessário inspecionar continuamente carcaças de suínos para T. spiralis em abatedouros de todo o mundo.(AU)

Toxoplasma gondii genotyping from free-range chickens (Gallus gallus domesticus) in a rural area of Rio Grande do Sul, Brazil / [Genotipagem de Toxoplasma gondii em galinhas domésticas em uma área rural do Rio Grande do Sul, Brasil]

Free-range chickens may ingest oocysts of T. gondii present in the environment and consequently harbor virulent strains of this parasite in different tissues, without any clinical signs. Isolation of T. gondii through bioassays on mice and cats from naturally infected chicken tissues has been described in several countries, demonstrating the importance of free-range chickens in the transmission of this parasite. The aim of this study was the genotypic characterization of T. gondii isolates obtained from naturally infected free-range chickens in a rural area of the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Brain and heart tissue from 12 chickens seropositive for T. gondii were processed using peptic digestion technique for parasite isolation. From 12 samples subjected to mouse bioassay, nine isolates were obtained. RFLP-PCR genotypic characterization was performed using 11 genetic markers: SAG1, 5'-3'SAG2, alt.SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1 and Apico. Genetic characterization of the isolates revealed the presence of five atypical genotypes according to ToxoDB (# 11, # 55, # 64, # 140 and # 163). Our results showed a wide genetic diversity of T. gondii in free-range chickens in this region.(AU)

Galinhas criadas ao ar livre podem ingerir oocistos de T. gondii presentes no ambiente e, com isso, albergar cepas virulentas desse parasita em diferentes tecidos, sem sinais clínicos. O isolamento de T. gondii por meio de bioensaios em camundongos e gatos, a partir de tecidos de galinhas naturalmente infectadas, tem sido descrito em vários países. Isso demonstra a importância das galinhas caipiras na epidemiologia desse parasita. O objetivo deste trabalho foi caracterizar genotipicamente isolados de T. gondii obtidos de galinhas caipiras naturalmente infectadas em uma área rural do município de Santa Maria, estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Fragmentos de cérebro e de coração, de 12 galinhas soropositivas para T. gondii, foram processados pela técnica de digestão péptica para isolamento do parasita. Das 12 amostras submetidas a bioensaio com camundongos, nove isolados foram obtidos. A caracterização genotípica por RFLP-PCR foi realizada utilizando-se 11 marcadores genéticos: SAG1, 5'-3'SAG2, alt.SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1 e Apico e revelou a presença de cinco genótipos atípicos de acordo com o ToxoDB (# 11, # 55, # 64, # 140 e # 163). Os resultados mostraram uma ampla diversidade genética de T. gondii em galinhas caipiras nessa região.(AU)

First record of Bulimulus tenuissimus (Mollusca) as potential experimental intermediate host of Angiostrongylus cantonensis (Nematoda) / Primeiro registro de Bulimulus tenuissimus (Mollusca) como hospedeiro intermediário de Angiostrongylus cantonensis (Nematoda)

Snails are essential to complete the life cycle of the metastrongylid nematode Angiostrongylus cantonensis, the causative agent of infections in domestic and wild animals, mainly rodents, and also of neural angiostrongyliasis or eosinophilic meningitis in humans. There are many reports of mollusks that can act as intermediate hosts of this parasite, especially freshwater snails and the African giant Achatina fulica. The terrestrial gastropod Bulimulus tenuissimus is widely distributed in Brazil and other species of the same genus occur in Brazil and other countries, overlapping regions in which there are reports of the occurrence of A. cantonensis and angiostrongyliasis. In spite of this, there are no records in the literature of this species performing the role of intermediate host to A. cantonensis. The present study analyzed the experimental infection with first-stage larvae of A. cantonensis, under laboratory conditions, of B. tenuissimus, by using histology and electron microscopy techniques. Three weeks after exposure to L1 larvae, it was possible to recover L3 larvae in small numbers from the infected snails. Developing larvae were observed in the cephalopedal mass (foot), ovotestis, and mantle tissues, being located inside a granulomatous structure composed of hemocyte infiltration, but there was no calcium or collagen deposition in these structures in significant amounts. In the third week post exposure, it was possible observe a sheath around the developing larvae. The infected snails presented reduction in the fibrous muscular tissue in the foot region, loss of the acinar organization in the digestive gland, with increase of amorphous material inside the acini and loss of epithelial pattern of nuclear organization in the acinar cells. However, the ovotestis seemed unaffected by the infection, since there was a large number of developing oocytes and spermatozoa in different stages of formation. The digestion of infected snails allows us the third-stage recovery rate of 17.25%, at 14 days post exposure to the L1. These L3 recovered from B. tenuissimus were used to infect rats experimentally, and 43 days post infection first-stage (L1) larvae of A. cantonensis were recovered from fresh feces. The results presented constituted the first report of the role of B. tenuissimus as an experimental intermediate host to A. cantonensis and shed some light on a possible problem, since the overlapping distribution of B. tenuissimus and A. cantonensis in Brazil and other countries where different species of Bulimulus occur enables the establishment and maintenance of the life cycle of this parasite in nature, with wild rodents as reservoirs, acting as a source of infection to humans, causing neural angiostrongyliasis(AU).

Os moluscos são um requisito essencial para a conclusão do ciclo de vida pelo nematoide metastrogilídeo Angiostrongylus cantonensis, o agente causador de infecções em animais domésticos e selvagens, principalmente roedores, e também de angiostrongilíase neural ou meningite eosinofílica em humanos. Há muitos relatos de moluscos que podem atuar como hospedeiro para este parasito, sendo o foco dado aos moluscos de água doce e no gigante africano Achatina fulica. O gastrópode terrestre Bulimulus tenuissimus é amplamente distribuído no território brasileiro e há outras espécies do mesmo gênero que ocorrem no Brasil e outros países, sobrepondo-se às regiões em que há relatos à ocorrência de A. cantonensis e angiostornigilíase. Apesar disso, não há registro na literatura, acerca desta espécie como hospedeiro intermediário para A. cantonensis. O presente estudo teve como objetivo verificar a possibilidade de infectar experimentalmente, utilizando larvas L1 de A. cantonensis, em condições laboratoriais, o molusco B. tenuissimus, utilizando técnicas de histologia e microscopia eletrônica. Três semanas após a exposição às larvas L1, foi possível recuperar larvas L3 dos moluscos infectados, em pequena quantidade. As larvas em desenvolvimento foram observadas na massa cefalopediosa (pé), ovotestis e nos tecidos do manto, sendo localizadas dentro de uma estrutura granulomatosa constituída por infiltração hemocitária, mas não houve deposição de cálcio ou colágeno nessas estruturas em quantidade significativa. Na terceira semana pós exposição, foi possível observar uma bainha ao redor das larvas em desenvolvimento. Os caracóis infectados apresentaram redução no tecido muscular fibroso na região do pé, perda da organização acinar na glândula digestiva, com aumento de material amorfo dentro dos ácinos e perda do padrão epitelial da organização nuclear nas células acinares. No entanto, o ovotestis, pareceu não ser afetado pela infecção, uma vez que houve um grande número de oócitos em desenvolvimento e espermatozóides em diferentes estágios de formação. A digestão dos moluscos infectados nos permitiu a recuperação de larvas de terceiro estágio (17,25%), aos 14 dias após a exposição à L1 de A. cantonensis . Estas L3 recuperadas de B. tenuissimus foram utilizados para infectar ratos experimentalmente, e 43 dias após a infecção, as larvas do primeiro estágio (L1) foram recuperadas de fezes frescas. Os resultados apresentados representam o primeiro registro do papel de B. tenuissimus como hospedeiro intermediário experimental de A. cantonensis e trazem alguma luz a um problema, até então silencioso, uma vez que a sobreposição da distribuição de B. tenuissimus e A. cantonensis no Brasil, e outros países, onde as diferentes espécies de Bulimulus ocorrem, torna possível o estabelecimento e manutenção do ciclo de vida deste parasito na natureza, com roedores selvagens como reservatório, agindo como fonte de infecção para humanos e causando a angiostrongilíase neural.(AU)

Maturity dependent variation in composition and characteristics of potentially digestible tissues of leucena / Variação dependente da maturidade na composição e características dos tecidos potencialmente digestiveis da Leucena

The objective of this study was to evaluate the effect of cutting age on the production, chemical composition, degradation kinetics and anatomy of Leucena (Leucaena leucocephala). The experimental design was a completely randomized design with a factorial arrangement 2x4 (two types of tissues and four cutting ages) for the production data of dry matter and 3x4 (three degrees of degrees of digestion of tissues and four cutting ages). Observed effect (P<0.05) for the total production of DM of Leucena in function of different ages. The tissue types grain and non-grain showed maximum production at 70 days of age, with production of 2333,00 and 716.60 kg DM ha-1, respectively. The parameters of degradation of DM evaluated decreased significantly with the increase in the maturity of the plant, in the same way the chemical composition presented behavior inherent to the advance of age. The effective degradability DM also decreased with the increase in the rate of passage (2, 5, and 8% h-1). The highest rate of degradation (c) was obtained for 30 days. With the advance in plant maturity increases the proportion of vascular tissue lignificad influencing parameters of ruminal degradation of Leucena. The ages assessed influenced the chemical composition of the Leucena (P<0.05), where the levels of dry matter, crude protein, acid detergent fiber and lignin and ash showed increasing linear behavior. The cutting age of 70 days offers an optimal point regarding the proportion of anatomical tissues correlated with the degradation and chemical composition of the Leucena.

Objetivou-se com este estudo avaliar o efeito da idade de corte sobre a produção, composição química, cinética de degradação e anatomia da Leucena (Leucaena leucocephala). Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado com arranjo fatorial 2x4 (dois tipos de tecidos e quatro idades de corte) para os dados de produção de matéria seca e 3x4 (três graus de digestão dos tecidos e quatro idades de corte). Verificou-se efeito (P<0,05) para a produção total de MS da Leucena em função das diferentes idades de corte. Os tecidos tipos forrageiros e não forrageiros apresentaram produção máxima aos 70 dias de idade, com produção de 2333,00 e 716,60 kg de MS ha-1, respectivamente. Os parâmetros de degradação da MS avaliadas diminuíram significamente com o aumento na maturidade da planta, da mesma forma a composição química apresentou comportamento inerente ao avançar da idade. A degradabilidade efetiva da MS também diminuíram com o aumento na taxa de passagem (2, 5 e 8% h-1). A maior taxa de degradação (c) foi obtida aos 30 dias. Com o avanço na maturidade da planta aumenta a proporção de tecido vascular lignificado influenciando nos parâmetros de degradação ruminal da Leucena. As idades avaliadas influenciaram a composição química da Leucena (P<0,05), onde os teores de matéria seca, proteína bruta, fibra em detergente ácido e Lignina e cinzas apresentaram comportamento linear crescente. A idade de corte de 70 dias apresenta um ponto ótimo quanto à proporção de tecidos anatômicos correlacionados com a degradação e composição química da Leucena.

Maturity dependent variation in composition and characteristics of potentially digestible tissues of leucena / Variação dependente da maturidade na composição e características dos tecidos potencialmente digestiveis da Leucena

The objective of this study was to evaluate the effect of cutting age on the production, chemical composition, degradation kinetics and anatomy of Leucena (Leucaena leucocephala). The experimental design was a completely randomized design with a factorial arrangement 2x4 (two types of tissues and four cutting ages) for the production data of dry matter and 3x4 (three degrees of degrees of digestion of tissues and four cutting ages). Observed effect (P<0.05) for the total production of DM of Leucena in function of different ages. The tissue types grain and non-grain showed maximum production at 70 days of age, with production of 2333,00 and 716.60 kg DM ha-1, respectively. The parameters of degradation of DM evaluated decreased significantly with the increase in the maturity of the plant, in the same way the chemical composition presented behavior inherent to the advance of age. The effective degradability DM also decreased with the increase in the rate of passage (2, 5, and 8% h-1). The highest rate of degradation (c) was obtained for 30 days. With the advance in plant maturity increases the proportion of vascular tissue lignificad influencing parameters of ruminal degradation of Leucena. The ages assessed influenced the chemical composition of the Leucena (P<0.05), where the levels of dry matter, crude protein, acid detergent fiber and lignin and ash showed increasing linear behavior. The cutting age of 70 days offers an optimal point regarding the proportion of anatomical tissues correlated with the degradation and chemical composition of the Leucena.(AU)

Objetivou-se com este estudo avaliar o efeito da idade de corte sobre a produção, composição química, cinética de degradação e anatomia da Leucena (Leucaena leucocephala). Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado com arranjo fatorial 2x4 (dois tipos de tecidos e quatro idades de corte) para os dados de produção de matéria seca e 3x4 (três graus de digestão dos tecidos e quatro idades de corte). Verificou-se efeito (P<0,05) para a produção total de MS da Leucena em função das diferentes idades de corte. Os tecidos tipos forrageiros e não forrageiros apresentaram produção máxima aos 70 dias de idade, com produção de 2333,00 e 716,60 kg de MS ha-1, respectivamente. Os parâmetros de degradação da MS avaliadas diminuíram significamente com o aumento na maturidade da planta, da mesma forma a composição química apresentou comportamento inerente ao avançar da idade. A degradabilidade efetiva da MS também diminuíram com o aumento na taxa de passagem (2, 5 e 8% h-1). A maior taxa de degradação (c) foi obtida aos 30 dias. Com o avanço na maturidade da planta aumenta a proporção de tecido vascular lignificado influenciando nos parâmetros de degradação ruminal da Leucena. As idades avaliadas influenciaram a composição química da Leucena (P<0,05), onde os teores de matéria seca, proteína bruta, fibra em detergente ácido e Lignina e cinzas apresentaram comportamento linear crescente. A idade de corte de 70 dias apresenta um ponto ótimo quanto à proporção de tecidos anatômicos correlacionados com a degradação e composição química da Leucena.(AU)

First record of Bulimulus tenuissimus (Mollusca) as potential experimental intermediate host of Angiostrongylus cantonensis (Nematoda)

Abstract Snails are essential to complete the life cycle of the metastrongylid nematode Angiostrongylus cantonensis, the causative agent of infections in domestic and wild animals, mainly rodents, and also of neural angiostrongyliasis or eosinophilic meningitis in humans. There are many reports of mollusks that can act as intermediate hosts of this parasite, especially freshwater snails and the African giant Achatina fulica. The terrestrial gastropod Bulimulus tenuissimus is widely distributed in Brazil and other species of the same genus occur in Brazil and other countries, overlapping regions in which there are reports of the occurrence of A. cantonensis and angiostrongyliasis. In spite of this, there are no records in the literature of this species performing the role of intermediate host to A. cantonensis. The present study analyzed the experimental infection with first-stage larvae of A. cantonensis, under laboratory conditions, of B. tenuissimus, by using histology and electron microscopy techniques. Three weeks after exposure to L1 larvae, it was possible to recover L3 larvae in small numbers from the infected snails. Developing larvae were observed in the cephalopedal mass (foot), ovotestis, and mantle tissues, being located inside a granulomatous structure composed of hemocyte infiltration, but there was no calcium or collagen deposition in these structures in significant amounts. In the third week post exposure, it was possible observe a sheath around the developing larvae. The infected snails presented reduction in the fibrous muscular tissue in the foot region, loss of the acinar organization in the digestive gland, with increase of amorphous material inside the acini and loss of epithelial pattern of nuclear organization in the acinar cells. However, the ovotestis seemed unaffected by the infection, since there was a large number of developing oocytes and spermatozoa in different stages of formation. The digestion of infected snails allows us the third-stage recovery rate of 17.25%, at 14 days post exposure to the L1. These L3 recovered from B. tenuissimus were used to infect rats experimentally, and 43 days post infection first-stage (L1) larvae of A. cantonensis were recovered from fresh feces. The results presented constituted the first report of the role of B. tenuissimus as an experimental intermediate host to A. cantonensis and shed some light on a possible problem, since the overlapping distribution of B. tenuissimus and A. cantonensis in Brazil and other countries where different species of Bulimulus occur enables the establishment and maintenance of the life cycle of this parasite in nature, with wild rodents as reservoirs, acting as a source of infection to humans, causing neural angiostrongyliasis.

Resumo Os moluscos são um requisito essencial para a conclusão do ciclo de vida pelo nematoide metastrogilídeo Angiostrongylus cantonensis, o agente causador de infecções em animais domésticos e selvagens, principalmente roedores, e também de angiostrongilíase neural ou meningite eosinofílica em humanos. Há muitos relatos de moluscos que podem atuar como hospedeiro para este parasito, sendo o foco dado aos moluscos de água doce e no gigante africano Achatina fulica. O gastrópode terrestre Bulimulus tenuissimus é amplamente distribuído no território brasileiro e há outras espécies do mesmo gênero que ocorrem no Brasil e outros países, sobrepondo-se às regiões em que há relatos à ocorrência de A. cantonensis e angiostornigilíase. Apesar disso, não há registro na literatura, acerca desta espécie como hospedeiro intermediário para A. cantonensis. O presente estudo teve como objetivo verificar a possibilidade de infectar experimentalmente, utilizando larvas L1 de A. cantonensis, em condições laboratoriais, o molusco B. tenuissimus, utilizando técnicas de histologia e microscopia eletrônica. Três semanas após a exposição às larvas L1, foi possível recuperar larvas L3 dos moluscos infectados, em pequena quantidade. As larvas em desenvolvimento foram observadas na massa cefalopediosa (pé), ovotestis e nos tecidos do manto, sendo localizadas dentro de uma estrutura granulomatosa constituída por infiltração hemocitária, mas não houve deposição de cálcio ou colágeno nessas estruturas em quantidade significativa. Na terceira semana pós exposição, foi possível observar uma bainha ao redor das larvas em desenvolvimento. Os caracóis infectados apresentaram redução no tecido muscular fibroso na região do pé, perda da organização acinar na glândula digestiva, com aumento de material amorfo dentro dos ácinos e perda do padrão epitelial da organização nuclear nas células acinares. No entanto, o ovotestis, pareceu não ser afetado pela infecção, uma vez que houve um grande número de oócitos em desenvolvimento e espermatozóides em diferentes estágios de formação. A digestão dos moluscos infectados nos permitiu a recuperação de larvas de terceiro estágio (17,25%), aos 14 dias após a exposição à L1 de A. cantonensis . Estas L3 recuperadas de B. tenuissimus foram utilizados para infectar ratos experimentalmente, e 43 dias após a infecção, as larvas do primeiro estágio (L1) foram recuperadas de fezes frescas. Os resultados apresentados representam o primeiro registro do papel de B. tenuissimus como hospedeiro intermediário experimental de A. cantonensis e trazem alguma luz a um problema, até então silencioso, uma vez que a sobreposição da distribuição de B. tenuissimus e A. cantonensis no Brasil, e outros países, onde as diferentes espécies de Bulimulus ocorrem, torna possível o estabelecimento e manutenção do ciclo de vida deste parasito na natureza, com roedores selvagens como reservatório, agindo como fonte de infecção para humanos e causando a angiostrongilíase neural.

Insuficiência pancreática exócrina em cão - Relato de caso / Exocrine pancreatic insufficiency in a dog ­ Case report / Insuficiencia pancreática exócrina en perro- Relato de caso

A insuficiência pancreática exócrina é uma incapacidade na secreção de enzimas digestivas decorrentes da diminuição do tecido acinar do pâncreas acarretando uma má digestão e absorção. O presente trabalho relata o caso de uma cadela SRD de um ano e meio com histórico de emagrecimento, esteatorréia, burburinhos e polifagia que foi diagnostica com insuficiência pancreática exócrina após teste de imunorreatividade da tripsina. O tratamento instituído com suplementação de enzimas pancreáticas foi eficiente no controle e evolução da doença.(AU)

Exocrine pancreatic insufficiency is the inability to secrete digestive enzymes due to the decrease in the acinar tissue of the pancreas leading to poor digestion and absorption. This work is a case report of a 1.5-years' old mongrel bitch with a history of weight loss, steatorrhea, rumbling sounds and polyphagia that was diagnosed with exocrine pancreatic insufficiency after a trypsin immunoreactivity test. The pancreatic enzyme supplementation was efficient in controlling the evolution of the disease.(AU)

La insuficiencia pancreática exocrina es una incapacidad en la secreción de enzimas digestivas derivadas de la disminución del tejido acinar del páncreas, acarreando mala digestión y absorción. El presente trabajo relata el caso de una perra SRD de un año y medio con historial de adelgazamiento, esteatorrea, burbujas y polifagia que fue diagnosticada con insuficiencia pancreática exocrina después de la prueba de inmune reactividad de la tripsina. El tratamiento instituido con suplementación de enzimas pancreáticas fue eficiente en el control y evolución de la enfermedad.(AU)

Insuficiência pancreática exócrina em cão - Relato de caso / Exocrine pancreatic insufficiency in a dog ­ Case report / Insuficiencia pancreática exócrina en perro- Relato de caso

A insuficiência pancreática exócrina é uma incapacidade na secreção de enzimas digestivas decorrentes da diminuição do tecido acinar do pâncreas acarretando uma má digestão e absorção. O presente trabalho relata o caso de uma cadela SRD de um ano e meio com histórico de emagrecimento, esteatorréia, burburinhos e polifagia que foi diagnostica com insuficiência pancreática exócrina após teste de imunorreatividade da tripsina. O tratamento instituído com suplementação de enzimas pancreáticas foi eficiente no controle e evolução da doença.(AU)

Exocrine pancreatic insufficiency is the inability to secrete digestive enzymes due to the decrease in the acinar tissue of the pancreas leading to poor digestion and absorption. This work is a case report of a 1.5-years' old mongrel bitch with a history of weight loss, steatorrhea, rumbling sounds and polyphagia that was diagnosed with exocrine pancreatic insufficiency after a trypsin immunoreactivity test. The pancreatic enzyme supplementation was efficient in controlling the evolution of the disease.(AU)

La insuficiencia pancreática exocrina es una incapacidad en la secreción de enzimas digestivas derivadas de la disminución del tejido acinar del páncreas, acarreando mala digestión y absorción. El presente trabajo relata el caso de una perra SRD de un año y medio con historial de adelgazamiento, esteatorrea, burbujas y polifagia que fue diagnosticada con insuficiencia pancreática exocrina después de la prueba de inmune reactividad de la tripsina. El tratamiento instituido con suplementación de enzimas pancreáticas fue eficiente en el control y evolución de la enfermedad.(AU)

Anatomical and histological study of the liver and pancreas of two closely related mountain newts Neurergus microspilotus and N. kaiseri (Amphibia: Caudata: Salamandridae)

Anatomical and histological examinations were conducted on the digestive glands of two closely related mountain newts, Neurergus microspilotus (Nesterov, 1916) and Neurergus kaiseri Schmidt, 1952. In N. microspilotus and N. kaiseri the major digestive glands comprise a very large liver and a small pancreas. In both species the liver has two distinct lobes, right and left. Histologically, the parenchyma of the liver of both species is contained within a thin capsule of fibroconnective tissue. Glycogen deposits and fat storage often dissolve during the routine histological process and produce considerable histological variability. Sinusoids are lined with endothelial cells forming a very thin epithelial sheet, with discontinuous basement membrane. Bile ducts also occur within the parenchyma of the liver. The ducts are lined by simple cuboidal epithelium. The gall bladder is a storage depot for bile. Its mucosa is thrown into numerous folds. The epithelial lining of the tunica muscularis is arranged circularly. There is a lot of pigmentation in the hepatic parenchyma. The pancreas in N. microspilotus and N. kaiseri is roughly triangular in shape, and lies rather to the dorsal side of the duodenum, between it and the stomach. The exocrine portion of the pancreas consists of clusters of pyramidal cells, which are mostly organized in acini. In both species the cells have a dark basophilic cytoplasm, distinct basal nuclei, and many large eosinophilic zymogen granules containing enzymes responsible for the digestion of proteins, carbohydrates, fats and nucleotides.

First record of Bulimulus tenuissimus (Mollusca) as potential experimental intermediate host of Angiostrongylus cantonensis (Nematoda)

Abstract Snails are essential to complete the life cycle of the metastrongylid nematode Angiostrongylus cantonensis, the causative agent of infections in domestic and wild animals, mainly rodents, and also of neural angiostrongyliasis or eosinophilic meningitis in humans. There are many reports of mollusks that can act as intermediate hosts of this parasite, especially freshwater snails and the African giant Achatina fulica. The terrestrial gastropod Bulimulus tenuissimus is widely distributed in Brazil and other species of the same genus occur in Brazil and other countries, overlapping regions in which there are reports of the occurrence of A. cantonensis and angiostrongyliasis. In spite of this, there are no records in the literature of this species performing the role of intermediate host to A. cantonensis. The present study analyzed the experimental infection with first-stage larvae of A. cantonensis, under laboratory conditions, of B. tenuissimus, by using histology and electron microscopy techniques. Three weeks after exposure to L1 larvae, it was possible to recover L3 larvae in small numbers from the infected snails. Developing larvae were observed in the cephalopedal mass (foot), ovotestis, and mantle tissues, being located inside a granulomatous structure composed of hemocyte infiltration, but there was no calcium or collagen deposition in these structures in significant amounts. In the third week post exposure, it was possible observe a sheath around the developing larvae. The infected snails presented reduction in the fibrous muscular tissue in the foot region, loss of the acinar organization in the digestive gland, with increase of amorphous material inside the acini and loss of epithelial pattern of nuclear organization in the acinar cells. However, the ovotestis seemed unaffected by the infection, since there was a large number of developing oocytes and spermatozoa in different stages of formation. The digestion of infected snails allows us the third-stage recovery rate of 17.25%, at 14 days post exposure to the L1. These L3 recovered from B. tenuissimus were used to infect rats experimentally, and 43 days post infection first-stage (L1) larvae of A. cantonensis were recovered from fresh feces. The results presented constituted the first report of the role of B. tenuissimus as an experimental intermediate host to A. cantonensis and shed some light on a possible problem, since the overlapping distribution of B. tenuissimus and A. cantonensis in Brazil and other countries where different species of Bulimulus occur enables the establishment and maintenance of the life cycle of this parasite in nature, with wild rodents as reservoirs, acting as a source of infection to humans, causing neural angiostrongyliasis.

Resumo Os moluscos são um requisito essencial para a conclusão do ciclo de vida pelo nematoide metastrogilídeo Angiostrongylus cantonensis, o agente causador de infecções em animais domésticos e selvagens, principalmente roedores, e também de angiostrongilíase neural ou meningite eosinofílica em humanos. Há muitos relatos de moluscos que podem atuar como hospedeiro para este parasito, sendo o foco dado aos moluscos de água doce e no gigante africano Achatina fulica. O gastrópode terrestre Bulimulus tenuissimus é amplamente distribuído no território brasileiro e há outras espécies do mesmo gênero que ocorrem no Brasil e outros países, sobrepondo-se às regiões em que há relatos à ocorrência de A. cantonensis e angiostornigilíase. Apesar disso, não há registro na literatura, acerca desta espécie como hospedeiro intermediário para A. cantonensis. O presente estudo teve como objetivo verificar a possibilidade de infectar experimentalmente, utilizando larvas L1 de A. cantonensis, em condições laboratoriais, o molusco B. tenuissimus, utilizando técnicas de histologia e microscopia eletrônica. Três semanas após a exposição às larvas L1, foi possível recuperar larvas L3 dos moluscos infectados, em pequena quantidade. As larvas em desenvolvimento foram observadas na massa cefalopediosa (pé), ovotestis e nos tecidos do manto, sendo localizadas dentro de uma estrutura granulomatosa constituída por infiltração hemocitária, mas não houve deposição de cálcio ou colágeno nessas estruturas em quantidade significativa. Na terceira semana pós exposição, foi possível observar uma bainha ao redor das larvas em desenvolvimento. Os caracóis infectados apresentaram redução no tecido muscular fibroso na região do pé, perda da organização acinar na glândula digestiva, com aumento de material amorfo dentro dos ácinos e perda do padrão epitelial da organização nuclear nas células acinares. No entanto, o ovotestis, pareceu não ser afetado pela infecção, uma vez que houve um grande número de oócitos em desenvolvimento e espermatozóides em diferentes estágios de formação. A digestão dos moluscos infectados nos permitiu a recuperação de larvas de terceiro estágio (17,25%), aos 14 dias após a exposição à L1 de A. cantonensis . Estas L3 recuperadas de B. tenuissimus foram utilizados para infectar ratos experimentalmente, e 43 dias após a infecção, as larvas do primeiro estágio (L1) foram recuperadas de fezes frescas. Os resultados apresentados representam o primeiro registro do papel de B. tenuissimus como hospedeiro intermediário experimental de A. cantonensis e trazem alguma luz a um problema, até então silencioso, uma vez que a sobreposição da distribuição de B. tenuissimus e A. cantonensis no Brasil, e outros países, onde as diferentes espécies de Bulimulus ocorrem, torna possível o estabelecimento e manutenção do ciclo de vida deste parasito na natureza, com roedores selvagens como reservatório, agindo como fonte de infecção para humanos e causando a angiostrongilíase neural.

Anatomical and histological study of the liver and pancreas of two closely related mountain newts Neurergus microspilotus and N. kaiseri (Amphibia: Caudata: Salamandridae)

Anatomical and histological examinations were conducted on the digestive glands of two closely related mountain newts, Neurergus microspilotus (Nesterov, 1916) and Neurergus kaiseri Schmidt, 1952. In N. microspilotus and N. kaiseri the major digestive glands comprise a very large liver and a small pancreas. In both species the liver has two distinct lobes, right and left. Histologically, the parenchyma of the liver of both species is contained within a thin capsule of fibroconnective tissue. Glycogen deposits and fat storage often dissolve during the routine histological process and produce considerable histological variability. Sinusoids are lined with endothelial cells forming a very thin epithelial sheet, with discontinuous basement membrane. Bile ducts also occur within the parenchyma of the liver. The ducts are lined by simple cuboidal epithelium. The gall bladder is a storage depot for bile. Its mucosa is thrown into numerous folds. The epithelial lining of the tunica muscularis is arranged circularly. There is a lot of pigmentation in the hepatic parenchyma. The pancreas in N. microspilotus and N. kaiseri is roughly triangular in shape, and lies rather to the dorsal side of the duodenum, between it and the stomach. The exocrine portion of the pancreas consists of clusters of pyramidal cells, which are mostly organized in acini. In both species the cells have a dark basophilic cytoplasm, distinct basal nuclei, and many large eosinophilic zymogen granules containing enzymes responsible for the digestion of proteins, carbohydrates, fats and nucleotides.(AU)

Isolation, culture, characterization and cryopreservation of stem cells derived from amniotic mesenchymal layer and umbilical cord tissue of bovine fetuses / Isolamento, cultura, caracterização e criopreservação de células tronco derivadas de camada amniótica mesenquimal e de tecido do cordão umbilical de fetuses bovinos

Stem cells are undifferentiated cells with a high proliferation potential. These cells can be characterized by their in vivo ability to self-renew and to differentiate into specialized cell lines. The most used stem cell types, in both human and veterinary fields, are the mesenchymal stem cells (MSC) derived from bone marrow and adipose tissue. Nowadays, there is a great interest in using stem cells derived from fetal tissues, such as amniotic membrane (AM) and umbilical cord tissue (UCT), which can be obtained non-invasively at delivery time. Due to the scarcity of studies in bovine species, the aim of this study was to isolate, characterize, differentiate and cryopreserve MSC derived from the mesenchymal layer of amniotic membrane (AM), for the first time, and umbilical cord tissue (UCT) of dairy cow neonates after assisted delivery (AD) and from fetus at initial third of pregnancy (IT) obtained in slaughterhouse. Cells were isolated by enzymatic digestion of the tissue fragments with 0.1% collagenase solution. Six samples of AM and UCT at delivery time and six samples of AM and UCT at first trimester of pregnancy were subjected to morphology evaluation, imunophenotype characterization, in vitro osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation and viability analysis after cryopreservation. All samples showed adherence to plastic and fibroblast-like morphology. Immunocytochemistry revealed expression of CD 44, NANOG and OCT-4 and lack of expression of MHC II in MSC from all samples. Flow cytometry demonstrated that cells from all samples expressed CD 44, did not or low expressed CD 34 (AM: IT-0.3%a, AD-3.4%b; UCT: 0.4%, 1.4%) and MHC II (AM: IT-1.05%a, AD-9.7%b; UCT: IT-0.7%a, AD-5.7%b). They were also capable of trilineage mesenchymal differentiation and showed 80% viability after cryopreservation. According to the results, bovine AM and UCT-derived cells, either obtained at delivery time or from slaughterhouse, are a painless and non-invasive source of MSC and can be used for stem cell banking.(AU)

As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos e possuem grande capacidade de multiplicação. Quando cultivadas in vitro são capazes de se auto renovar e dar origem a novos tipos celulares. As células tronco mais utilizadas, tanto na medicina humana como na medicina veterinária são as células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea e do tecido adiposo. Atualmente, uma grande tendência para a utilização de CTMs obtidas de tecidos fetais, como a membrana amniótica (MA), matriz extravascular do cordão umbilical (TCU) e sangue do cordão umbilical (SCU) pode ser observada, já que estas fontes podem ser colhidas no momento do parto por uma técnica não invasiva. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar, diferenciar e criopreservar CTMs obtidas de MA e TCU de fetos bovinos colhidos no momento do parto e de fetos do terço inicial da gestação em abatedouro-frigorífico. As células foram recuperadas por meio de digestão enzimática tecidual, realizada com solução de colagenase 0,1%. Foram colhidas amostras de MA e TCU no momento do parto (n=6) e de MA e TCU no terço inicial de gestação (n=6), as quais foram submetidas às análises morfológicas, imunofenotípica por imunocitoquímica e citometria de fluxo, diferenciações in vitro nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica e ainda, avaliação da viabilidade após a criopreservação por citometria de fluxo. Todas as amostras dos diferentes grupos demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico todas as amostras foram imunomarcadas para CD44, NANOG e Oct-4, com ausência de marcação para MHC II. Na análise imunofenotipica por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram marcação para CD44, ausência de marcação para ou baixíssima expressão de CD34 (MA: TI-0,3%a, PA-3.4%b; TCU: TI-0,4%, PA-1.4%) e nula ou baixa expressão de MHC II (MA: TI-1.5%a, PA-9.7%b; UCT: TI-0.7%a, PA-5.7%b. Apresentaram também capacidade de diferenciação in vitro nas três linhagens mesodermais e quando analisadas pós criopreservação por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram viabilidade de 80%. Estes resultados indicam que MA e TCU, obtidos tanto no momento de parto como em abatedouro, de fetos bovinos podem ser utilizados como fonte não invasiva e indolor de CTMs e possibilitam a formação de bancos de armazenamento de células.(AU)

Isolation, culture, characterization and cryopreservation of stem cells derived from amniotic mesenchymal layer and umbilical cord tissue of bovine fetuses / Isolamento, cultura, caracterização e criopreservação de células tronco derivadas de camada amniótica mesenquimal e de tecido do cordão umbilical de fetuses bovinos

Stem cells are undifferentiated cells with a high proliferation potential. These cells can be characterized by their in vivo ability to self-renew and to differentiate into specialized cell lines. The most used stem cell types, in both human and veterinary fields, are the mesenchymal stem cells (MSC) derived from bone marrow and adipose tissue. Nowadays, there is a great interest in using stem cells derived from fetal tissues, such as amniotic membrane (AM) and umbilical cord tissue (UCT), which can be obtained non-invasively at delivery time. Due to the scarcity of studies in bovine species, the aim of this study was to isolate, characterize, differentiate and cryopreserve MSC derived from the mesenchymal layer of amniotic membrane (AM), for the first time, and umbilical cord tissue (UCT) of dairy cow neonates after assisted delivery (AD) and from fetus at initial third of pregnancy (IT) obtained in slaughterhouse. Cells were isolated by enzymatic digestion of the tissue fragments with 0.1% collagenase solution. Six samples of AM and UCT at delivery time and six samples of AM and UCT at first trimester of pregnancy were subjected to morphology evaluation, imunophenotype characterization, in vitro osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation and viability analysis after cryopreservation. All samples showed adherence to plastic and fibroblast-like morphology. Immunocytochemistry revealed expression of CD 44, NANOG and OCT-4 and lack of expression of MHC II in MSC from all samples. Flow cytometry demonstrated that cells from all samples expressed CD 44, did not or low expressed CD 34 (AM: IT-0.3%a, AD-3.4%b; UCT: 0.4%, 1.4%) and MHC II (AM: IT-1.05%a, AD-9.7%b; UCT: IT-0.7%a, AD-5.7%b). They were also capable of trilineage mesenchymal differentiation and showed 80% viability after cryopreservation. According to the results, bovine AM and UCT-derived cells, either obtained at delivery time or from slaughterhouse, [...](AU)

As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos e possuem grande capacidade de multiplicação. Quando cultivadas in vitro são capazes de se auto renovar e dar origem a novos tipos celulares. As células tronco mais utilizadas, tanto na medicina humana como na medicina veterinária são as células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea e do tecido adiposo. Atualmente, uma grande tendência para a utilização de CTMs obtidas de tecidos fetais, como a membrana amniótica (MA), matriz extravascular do cordão umbilical (TCU) e sangue do cordão umbilical (SCU) pode ser observada, já que estas fontes podem ser colhidas no momento do parto por uma técnica não invasiva. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar, diferenciar e criopreservar CTMs obtidas de MA e TCU de fetos bovinos colhidos no momento do parto e de fetos do terço inicial da gestação em abatedouro-frigorífico. As células foram recuperadas por meio de digestão enzimática tecidual, realizada com solução de colagenase 0,1%. Foram colhidas amostras de MA e TCU no momento do parto (n=6) e de MA e TCU no terço inicial de gestação (n=6), as quais foram submetidas às análises morfológicas, imunofenotípica por imunocitoquímica e citometria de fluxo, diferenciações in vitro nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica e ainda, avaliação da viabilidade após a criopreservação por citometria de fluxo. Todas as amostras dos diferentes grupos demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico todas as amostras foram imunomarcadas para CD44, NANOG e Oct-4, com ausência de marcação para MHC II. Na análise imunofenotipica por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram marcação para CD44, ausência de marcação para ou baixíssima expressão de CD34 (MA: TI-0,3%a, PA-3.4%b; TCU: TI-0,4%, PA-1.4%) e nula ou baixa expressão de MHC II (MA: TI-1.5%a, PA-9.7%b; UCT: TI-0.7%a, PA-5.7%b. [...](AU)

Recovery of ammonia from anaerobically digested manure using gas-permeable membranes

Nitrogen (N) can be recovered from different types of wastewaters. Among these wastewaters, anaerobically digested swine manure (digestate) has the highest N content in ammonia form (NH3). It is desirable to reduce N in digestate effluents to safely incorporate them in arable soil in N vulnerable zones (NVZ) and to mitigate NH3 emissions during N land application. Additional benefit is to minimize inhibition of the anaerobic process by removing NH3 during the anaerobic digestion process. This work aimed to apply the gas-permeable membrane technology to evaluate ammonia (NH3) recovery from high-ammonia digested swine manure. Anaerobically digested swine manure with NH4+ content of 4,293 mg N L1 was reduced by 91 % (to 381 mg N L1) during the 32-day experiment. Although the results showed a total N recovery efficiency of 71 %, it is possible to increase this recovery efficiency to > 90 % by adjusting the area of the membrane system to match the high free ammonia concentration (FA) in digested swine manure. Moreover, final digestate pH and alkalinity were kept around 8.1 and 8,923 mgCaCO3 L1, which are convenient for the anaerobic process or incorporation in arable soil when the process is finished.

Recovery of ammonia from anaerobically digested manure using gas-permeable membranes

Nitrogen (N) can be recovered from different types of wastewaters. Among these wastewaters, anaerobically digested swine manure (digestate) has the highest N content in ammonia form (NH3). It is desirable to reduce N in digestate effluents to safely incorporate them in arable soil in N vulnerable zones (NVZ) and to mitigate NH3 emissions during N land application. Additional benefit is to minimize inhibition of the anaerobic process by removing NH3 during the anaerobic digestion process. This work aimed to apply the gas-permeable membrane technology to evaluate ammonia (NH3) recovery from high-ammonia digested swine manure. Anaerobically digested swine manure with NH4+ content of 4,293 mg N L1 was reduced by 91 % (to 381 mg N L1) during the 32-day experiment. Although the results showed a total N recovery efficiency of 71 %, it is possible to increase this recovery efficiency to > 90 % by adjusting the area of the membrane system to match the high free ammonia concentration (FA) in digested swine manure. Moreover, final digestate pH and alkalinity were kept around 8.1 and 8,923 mgCaCO3 L1, which are convenient for the anaerobic process or incorporation in arable soil when the process is finished.(AU)

Avaliação de dois métodos de estocagem de amostras teciduais para diagnóstico molecular de Sarcocystis spp

No Brasil existem três espécies de gambás, Didelphis aurita, Didelphis albiventris e Didelphis marsupialis. Entre os diversos agentes patológicos que estes hospedeiros albergam, estão os protozoários do gênero Sarcocystis de grande interesse na medicina veterinária por causar a Mieloencefalite Protozoária Equina (EPM). Com a evolução dos métodos de diagnóstico a biologia molecular possibilitou a identificação de espécies em hospedeiros diferentes. Com isso o presente trabalho tem por objetivo avaliar dois métodos de conservação tecidual com a finalidade de melhorar o diagnóstico molecular. Para tanto, foram utilizados cinco gambás D. aurita para a obtenção dos esporocistos contidos na lâmina própria do intestino delgado. Estes foram extraídos da mucosa após digestão da mesma com hipoclorito de sódio 10%. Após a contagem e morfometria dos esporocistos, cada amostra foi padronizada em inóculos contendo 60 e 120 esporocistos em 1 mL, que foram inoculados em periquitos australianos (Melopsittacus undulatus). Dois periquitos foram inoculados com solução de soro fisiológico, perfazendo um total de 12 periquitos. De todos os periquitos que morreram ou foram eutanasiados no período de quatro meses, foram coletadas amostras de tecidos e conservadas a temperatura de -20 ºC com e sem a imersão em álcool absoluto. Foi realizada a biologia molecular dos esporocistos com o primer ITS 18S 9L/1H. Utilizando este mesmo primer foi realizado o diagnóstico molecular dos seguintes tecidos: coração, língua, coxa, peito, fígado, pulmão e cérebro, com o intuito de comparar a eficiência dos métodos de conservação. Como resultado dos valores morfométricos em micrômetros dos esporocistos obtivemos o comprimento médio de 11,2 ± 0,9 (7-15,6) e largura média de 7,7 ± 0,6 (3,8-10,9). Todas as amostras de raspado de mucosa contendo os esporocistos foram positivas para a PCR utilizando o primer ITS. O método de conservação a -20°C sem e com imersão em álcool absoluto apresentaram eficiência na preservação do DNA dos tecidos, embora não foram encontradas diferenças estatísticas significativas entre os dois métodos avaliados. Nas infecções agudas foram observadas lesões histopatológicas em região hepática e pulmonar, com formação de merontes nos pulmões. Nas infecções crônicas foram encontrados 20 cistos maduros e imaturos nos tecidos do peito, coxa e da língua que mensurados tiveram valores em micrômetros de 25,4 ± 7,1 (12,7-34,8) de largura e 45,9 ± 24,6 (16,8-113,0) de comprimento. Com os resultados obtidos podemos inferir que os gambás D. aurita estão parasitados com espécies de Sarcosystis spp. que tem aves como hospedeiro intermediário.

In Brazil there are three species of possums, Didelphis aurita, Didelphis albiventris and Didelphis marsupialis. Among the various pathological agents that these hosts harbor, protozoa of the genus Sarcocystis is object of great interest in veterinary medicine for causing Equine Protozoan Myeloencephalitis (EPM). With the evolution of diagnostic methods, molecular biology has enabled to identify species in different hosts. Thus, the present work aims to evaluate two methods of tissue conservation in order to improve the molecular diagnosis. For this purpose, five D. aurita possums were used to obtain the sporocysts contained in the small intestine lamina propria. These were extracted from the mucosa after digestion with 10% sodium hypochlorite. After sporocyst counting and morphometry, each sample was standardized on inocula containing 60 and 120 sporocysts in 1 mL, which were inoculated into budgerigars (Melopsittacus undulatus). Two parakeets were inoculated with saline solution, making a total of 12 parakeets. From all the parakeets that died or were euthanized in the period of four months, tissue samples were collected and kept at -20 ºC with and without immersion in absolute alcohol. Molecular biology of the sporocysts was performed with the ITS 18S 9L / 1H primer. Using this same primer, the molecular diagnosis of the following tissues was performed: heart, language, thigh, chest, liver, lung and brain, in order to compare the efficiency of conservation methods. As a result of the morphometric values in micrometers of the sporocysts, we obtained an average length of 11.2 ± 0.9 (7-15.6) and an average width of 7.7 ± 0.6 (3.8-10.9). All mucosa scrape samples containing sporocysts were positive for PCR using the ITS primer. The method of conservation at -20 ° C without and with immersion in absolute alcohol showed efficiency in the preservation of DNA tissue, although no statistically significant differences were found between the two methods evaluated. In acute infections, histopathological lesions were observed in the hepatic and pulmonary regions, with formation of merons in the lungs. In chronic infections, 20 mature and immature cysts were found in the chest thigh and tongue tissues, which were measured with micrometers values of 25.4 ± 7.1 (12.7-34.8) in width and 45.9 ± 24.6 (16.8-113.0) in length. With the results obtained, its possible to infer that D. aurita possums are parasitized with Sarcosystis spp. species that have birds as an intermediate host.

DEVELOPMENT OF A TISSUE ENGINEERING PLATFORM USING BOVINE SPECIES AS A MODEL: PLACENTAL SCAFFOLDS SEEDED WITH BOVINE ADIPOSE-DERIVED CELLS

A tecnologia de células-tronco e as ciências de biomateriais obtiveram um grande avanço nas últimas décadas e se tornaram mais populares em todo o mundo. Pesquisadores buscam investigar e avaliar diferentes fontes de células e de biomateriais que, em combinação, possam fornecer uma plataforma de engenharia tecidual de baixo custo e produzida em larga escala, para serem utilizadas em testes de drogas, terapias celulares e transplantes, com objetivo de fornecer suporte terapêutico à lesões e regeneração de tecidos danificados. Em geral, os três componentes mais importantes da engenharia de tecidos são: a escolha do tipo de célula, a fonte do biomaterial (scaffold), criação e manutenção de um ambiente propício à formação tecidual. Quando esses três componentes são gerenciados com sucesso, o microambiente celular in vitro é mais semelhante ao que a célula está exposta in vivo, permitindo que o crescimento e diferenciação celular ocorra de maneira mais fidedigna e eficiente. A placenta bovina descelularizada demonstrou ter uma rica matriz extracelular, vasos bem desenvolvidos, sendo um biomaterial com alta disponibilidade e baixo custo. No entanto, não há informação sobre o potencial dos scaffolds placentários em serem repovoados com células-tronco mesenquimais (MSC) derivadas do tecido adiposo, processo chamado recelularização. Ainda, também não há informação sobre a capacidade dos scaffolds placentários, de após recelularização, oferecer um ambiente adequado para diferenciação dessas células em diferentes linhagens. Assim, a fim de fornecer informações sobre a capacidade do complexo MSC - scaffold placentário em ser usado com sucesso na engenharia tecidual, os objetivos desta tese foram: estudar o potencial dos scaffolds placentários bovinos em oferecer suporte para recelularização por células-tronco derivadas do tecido adiposo bovino, bem como avaliar a capacidade de diferenciação celular em linhagens osteogênica e condrogênica. O primeiro artigo desta tese trata-se de uma revisão de literatura, que discute a natureza das células-tronco mesenquimais, suas aplicações na medicina regenerativa, a importância da tecnologia com células- tronco na indústria pecuária e o uso da espécie bovina na medicina translacional. O segundo artigo consiste na avaliação da recelularização e da diferenciação celular. As placentas bovinas foram decelularizadas por perfusão de SDS do vaso umbilical e as linhas celulares estabelecidas após digestão enzimática do tecido adiposo de seisxiv vacas e seleção por adesão rápida à placa de cultivo. Em seguida, as células foram cultivadas com os scaffolds em um sistema de agitação 2D por 21 dias em meio de diferenciação ou manutenção. Quando cultivadas na placa de cultivo, as células isoladas exibiram morfologia semelhante ao fibroblasto, expressão de CD90, CD73 e CD105, enquanto não expressaram os marcadores CD34 e CD45. Além disso, as células foram capazes de se diferenciar em linhagens condrogênicas e osteogênicas, fornecendo evidências de sua natureza mesenquimal. Posteriormente, quando cultivadas com os scaffolds, as células aderiram-se aos mesmos por projeções celulares, estabeleceram comunicação célula-scaffold e se proliferaram, fato evidenciado por análise histológica e microscopia eletrônica de varredura (SEM). Em seguida, o potencial das células em se diferenciarem em linhagem osteogênica quando cultivadas com scaffold foi avaliado. Durante um período de cultivo de 21 dias no meio osteogênico, as células se proliferaram e diferenciaram de maneira dependente do tempo, ou seja, a cada semana pode ser observado maior abundância de células, evidenciada pela coloração dos núcleos celulares e aumento da intensidade da coloração para COLAGENO 1 (COL1), que também foi expresso por reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR). O mesmo padrão foi observado pela análise histológica; acúmulos generalizados de cálcio também foram mais abundantes nos scaffolds na terceira semana de cultivo, evidenciado pela coloração de Von Kossa. A análise SEM revelou que as células secretaram estruturas globulares quando cultivadas sob condições de indução osteogênica, condizente com a secreção observada pela análise histológica. Em relação à diferenciação condrogênica, os corantes Safranina e Fast Green revelaram sucesso na diferenciação, através da coloração de proteoglicanos, células semelhantes aos condrócitos e colágeno tipo II. A análise SEM mostrou que as células mudaram sua morfologia de fibroblastos para globulares quando cultivadas com meio de indução condrogênica por 21 dias. Além disso, os complexos célulasscaffold expressaram um marcador de linhagem cartilaginosa, COLAGENO 2 (COL2), que são condizentes com as observações histológicas e SEM. Considerando os resultados, este estudo demonstrou que os scaffolds placentários bovinos cultivados com células-tronco derivadas de tecido adiposo bovino possuem potencial para serem utilizados na engenharia de tecidos ósseos e cartilaginosos.

Stem cell technologies and biomaterial sciences have advanced and grown more popular all over the world. The researchers aim to investigate and evaluate different sources of cells and biomaterials that, in combination, could provide a low cost, highly scalable tissue engineering platform that could be used in drug tests, cell therapies and cell transplantation. The three most important components of tissue engineering systems in general are cell source, biomaterial source (scaffolding system), and the creation and maintenance of an environment that is conducive to tissue formation. When these three components are successfully managed, the tissue engineering treatment achieves a faithful imitation of the in vivo environment, allowing for the differentiation of cells into the desirable cell types. Decellularized bovine placenta has been demonstrated to be rich in extracellular matrix (ECM) and to have well-developed vasculature, representing a highly available, low cost, practically scalable biomaterial. However, it is not known if placental scaffolds have the potential to support recellularization with adipose-derived cells and their subsequent differentiation into different lineages. Thus, in order to provide information on the ability of the mesenchymal stem cell (MSC) - placental scaffold complex to be used in tissue engineering approaches, the objectives of this thesis were: to study the potential of bovine placental scaffolds to support adipose-derived cell recellularization and their differentiation into osteogenic and chondrogenic lineages. The first article of this thesis is a literature review that discusses the nature of mesenchymal stem cells, their applications in regenerative medicine, the importance of stem cell technologies to the livestock industry and the use of bovine species for translational medicine. The second article consists of an evaluation of scaffold recellularization and the differentiation of cells on the scaffolds. The bovine placentae were decellularized by umbilical vessel sodium dodecyl sulfate (SDS) perfusion and cell lines were established after the enzymatic digestion of adipose tissue from six cows and cell selection by rapid adherence to the culture plate. Then, cells were seeded onto the scaffolds and cultured in a 2D rocker system for 21 days in either differentiation or maintenance medium. The isolated cells, when cultured in the plastic dish, exhibited fibroblast-like morphology, CD90, CD73 and CD105 expression, and lacked CD34 and CD45 expression. Moreover, the cells were able to undergo differentiation into chondrogenic and osteogenic lineages, providing evidence of their mesenchymalxii nature. Subsequently, the cells adhered to the scaffolds by cell projections, established cell-scaffold communication, and proliferated while maintaining cell-cell communication, which was evidenced by histological and scanning electron microscopy (SEM) assays. Throughout a 21-day culture period in the osteogenic medium, the cells exhibited proliferation and differentiation in a time-dependent manner, which can be observed by the greater abundance of cells in later periods, evidenced by cell nuclei staining (4,6-diamidino-2-phenylindole - DAPI) and increased intensity of staining for COLLAGEN 1 (COL1) in the immunohistochemical assay, and by its expression as measured by real time polymerase chain reaction (qRT-PCR). This same pattern was observed by histological analysis. Widespread calcium accumulations were also more abundant on the scaffolds as time progressed, as evidenced by Von Kossa staining. The SEM analysis revealed that cells secreted globular/round structures when seeded under osteogenic induction conditions, in accordance with histological findings. Regarding chondrogenic differentiation, Safranin O and Fast Green staining revealed successful differentiation through staining of proteoglycans, chondrocyte-like cells and type II collagen on the scaffold. The SEM analysis showed that the cells changed morphology from fibroblast-like to globular when cultured with chondrogenic induction medium for 21 days. Additionally, cellscaffold complexes expressed a cartilage marker, COLLAGEN 2 (COL2), which is conducive to the histological and SEM observations. Considering the results as a whole, this study demonstrated that placental scaffolds seeded with adipose-derived cells have the potential to be used in bone and cartilage tissue-engineering applications.