Análise molecular de patógenos pela reação em cadeia da polimerase no líquido cefalorraquiano de pacientes infectados com HIV / Molecular analysis of pathogens in cerebrospinal fluid by the polymerase chain reaction in HIV-infected patients

Introdução: A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi teste de grande impacto no diagnóstico das meningites e encefalites linfocíticas durante a última década. Esse método foi extensivamente usado no diagnóstico das infecções do sistema nervoso central (SNC), devido a sua habilidade em detectar amostras mínimas de DNA-alvo no líquido cefalorraquiano. Objetivo: O objetivo deste estudo foi identificar a prevalência dos patógenos oportunistas responsáveis por causar problemas neurológicos em pacientes infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e avaliar sua associação com os achados clínicos, laboratoriais e da tomografia computadorizada cerebral (TCC). Pacientes e métodos: Um estudo transversal foi realizado em 203 amostras de líquido cefalorraquiano (LCR) de pacientes do sul do Brasil infectados com HIV e com aparente encefalite e meningite linfocíticas. As amostras foram analisadas para os seguintes agentes pelo método da reação em cadeia da polimerase "nested" ou dupla (N-PCR): citomegalovírus, vírus do Epstein-Barr, vírus do herpes simplex tipos 1 e 2, vírus da varicella zoster, vírus do herpes humano tipo 6, vírus JC, Toxoplasma gondii e micobactérias. Resultado: Pelo menos um patógeno foi encontrado em 77 (38%) dos indivíduos. O Epstein-Barr foi o mais prevalente, com 40 casos (19,7%), seguido pelo citomegalovívus, com 12 casos (15%) e pelo vírus JC, em 9 casos (4,4%). Um N-PCR positivo mostrou associação com aumento de proteínas e de celularidade (P=0,001), meningismo (P=0,017) e tomografia computadorizada anormal (P=0,006). Conclusão: O painel de PCR empregado foi efetivo na identificação de infecções neurológicas severas em pacientes HIV positivos (AU)

Introduction: Polymerase chain reaction (PCR) has had great impact on the diagnosis of lymphocytic meningitis and encephalitis over the last decade. It has been extensively used in the diagnosis of central nervous system (CNS) infections for its ability to detect small amounts of target DNA in the cerebrospinal fluid (CSF). Objective: The aim of this study was to identify the prevalence of opportunistic pathogens responsible for neurological disorders in patients infected with human immunodeficiency virus (HIV) and to evaluate its association with clinical, laboratory and cerebral computed tomography (CCT) findings. Patients and methods: A cross-sectional study was performed on 203 cerebrospinal fluids (CSF) from HIV-infected patients from Southern Brazil, with apparent lymphocytic meningitis and encephalitis. CSF samples were analyzed with probes for cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, herpes simplex virus types 1 and 2, varicella zoster virus, human herpes virus type 6, JC virus, Toxoplasma gondii and mycobacterium in nested polymerase chain reaction (N-PCR). Results: At least one pathogen was found in 77 (38.0%) individuals. Epstein-Barr virus was the most prevalent with 40 cases (19.7%), followed by cytomegalovirus with 12 cases (5.9%) and JC virus with 9 cases (4.4%). Positive NPCR showed association with high spinal fluid protein and cell count (P=0.001), meningism (P=0.017) and abnormal CCT (P=0.006). Conclusion: The PCR panel used was effective in screening several neurological infections in HIV positive patients (AU)

Determinação do limite mínimo de detecção da técnica de PCR “nested” para o vírus da hepatite B (HBV) / Evaluation of minimum detection limit to hepatitis B virus (HBV) PCR “nested”

Mundialmente, a hepatite pelo vírus B (HBV) é considerada um dos maiores problemas de saúde pública, apesar da vacinação. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que mais de 2 bilhões de pessoas estejam infectadas pelo HBV. O Brasil é classificado como área de incidência intermediária pela OMS. No entanto, estudos de prevalência detectaram diferenças de índices de infecção nas regiões geográficas: 8% na região Amazônica, 2,5% nas regiões Centro-Oeste e Nordeste, 2% na Sudeste e 1% na região Sul. Um diagnóstico sensível e específico é de fundamental importância para os pacientes portadores do HBV. O objetivo deste estudo foi determinar o limite mínimo de detecção da técnica de PCR “nested” “in house” para o HBV. Diluições seriadas de uma amostra quantificada de HBV (1000 cópias/mL; 750 cópias/mL; 500 cópias/mL; 250 cópias/mL) foram submetidas à técnica de PCR “nested”. O alvo da amplificação por PCR foi a região do core e pré-core do vírus. Para extração dos ácidos nucléicos da amostra foi empregado o kit comercial QIAmp. O limite mínimo de detecção encontrado foi de 500 cópias/mL ou 10 cópias por reação de PCR.

All over the world, the hepatitis B virus (HBV) is considered one of the major problems of public health, despite vaccination. World Health Organization (WHO) estimates that more than 2 billions of persons are infected by HBV. Brazil is classified as an area of intermediary incidence by WHO. However, prevalence studies have detected differences of infection indexes in geographic regions: 8% in the Amazonian region, 2,5% in middle-west and Northeast, 2% in Southeast and 1% in South. A sensitive and specific diagnosis is very important to the HBV carrier patients. The aim of this study was to determine the minimum limit of detection of the nested PCR in house technique for HBV. Serial dilutions of one quantified sample of HBV (1000 copies/mL; 750 copies/mL; 500 copies/mL; 250 copies/mL) were submitted to a nested PCR. The target of PCR was viral core and pre-core region. Commercial kit, QiAmp, was employed to purify nucleic acids from the sample. The minimum detection limit found was 500 copies/mL or 10 copies per PCR reaction.

Determinação do limite mínimo de detecção da técnica de pcr "semi-nested" para Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumaniae / Determination of detection minimum limit by polymerase chain reaction seminested to Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae

Mundialmente, as meningites bacterianas constituem importante causa de morbimortalidade na infância, exigindo um diagnóstico rápido e preciso no manejo dos pacientes. O objetivo deste estudo foi determinar o limite mínimo de detecção da técnica de PCR “semi-nested” “in house” para os três principais agentes causadores de meningites bacterianas: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae. Diluições seriadas de cada bactéria foram submetidas à técnica de PCR “semi-nested” para detecção simultânea dos três microrganismos, pela amplificação de uma região do gene bacteriano 16S rRNA. Os produtos finais foram amplicons específicos de diferentes pesos moleculares para N. meningitidis, H. influenzae e gênero-específico para Streptococcus sp. A forma de visualização dos resultados foi através de eletroforese em gel de agarose para a detecção dos produtos da PCR. Determinou-se que o limite mínimo de detecção para Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae foi respectivamente de 103, 102 e 104 UFC/mL

The prevalence of congenital cytomegalovirus infection in newborn infants at an intensive care unit in a public hospital.

OBJECTIVE: To determine the prevalence of congenital cytomegalovirus infection in newborn infants admitted to an intensive care unit in a public hospital in Porto Alegre. METHODS: A cross-sectional study of 261 newborn infants born at a public hospital in the city of Porto Alegre in 2003 and admitted to the intensive care ward. Urine samples were collected within 7 days of birth and a polymerase chain reaction-PCR performed to test for cytomegalovirus DNA. RESULTS: The prevalence of congenital cytomegalovirus infection among the study population was 0.8% (95% CI: 0.097-2.86). It was not possible to assess risk factors because this prevalence was so low. CONCLUSIONS: The prevalence of congenital cytomegalovirus infection in an intensive care unit at a public hospital in Porto Alegre was not considered elevated and was comparable with prevalence rates found by other studies.

Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae and Streptococcus sp. by polymerase chain reaction for the diagnosis of bacterial meningits

Avaliamos o desempenho da reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção simultânea da Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus sp. no diagnóstico das meningites bacterianas e sua aplicabilidade na rotina diagnóstica. Foi realizado um estudo de coorte com 182 crianças apresentando suspeita de meningite bacteriana. Em 84, havia alterações clínicas e laboratoriais sugestivas de meningite bacteriana. Destas, 65 tiveram o agente etiológico identificado pelos métodos laboratoriais de rotina e 19 ficaram sem diagnóstico etiológico. Em 98 pacientes foi excluído o diagnóstico de meningite bacteriana. Analisando o desempenho da PCR encontramos sensibilidade de 88,1%, especificidade de 99,0% e valores preditivos positivo e negativo de 98,7% e 90,1% respectivamente. Nos 19 pacientes com meningite bacteriana mas sem diagnóstico etiológico a PCR detectou microrganismos em 14, sendo 12 N. meningitidis, um H. influenzae e um Streptococcus sp. A PCR possui o potencial de poder aumentar os índices de identificação das técnicas tradicionais, principalmente nas situações onde a microscopia direta, cultura ou identificação antigênica são negativos ou inconclusivos.

Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae and Streptococcus sp. by polymerase chain reaction for the diagnosis of bacterial meningitis.

The simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and Streptococcus sp. was assessed by polymerase chain reaction (PCR) for the diagnosis of bacterial meningitis, as well as the applicability of PCR as a routine test. A cohort study was carried out with 182 children (2 months to 12 years of age) with suspicion of bacterial meningitis. Routine tests identified the etiologic agent in 65/84 children whose clinical status and laboratory findings suggested the presence of bacterial meningitis. Bacterial meningitis was ruled out in 98 children. In 19 children, the etiologic diagnosis was not possible using standard methods; in 14 of these patients, the etiologic agent was identified by PCR (N. meningitidis=12; H. influenzae=1; Streptococcus sp.=1). The sensitivity of PCR was 88.1%; specificity, 99.0%; positive predictive value, 98.7%; and negative predictive, 90.1%. PCR is a useful complementary diagnostic technique, especially when Gram stain, culture, or antigenic detection are negative or inconclusive.

Investigation of lysosomal storage diseases in nonimmune hydrops fetalis.

OBJECTIVE: To investigate lysosomal storage diseases (LSD) in cases of nonimmune hydrops fetalis (NIHF). METHODS: Thirty-three cases of NIHF were investigated, 28 in the prenatal period and 5 in hydropic newborns. In addition to a general investigation for NIHF, specific enzymatic analyses for the detection of LSD were performed. RESULTS: In our sample, we detected five patients (15%) with LSD, each patient having one of the following diseases: mucolipidosis, Niemann-Pick disease, galactosialidosis, sialidosis and mucopolysaccharidosis type IV A. CONCLUSION: Although LSDs are rare disorders as a group, they should be considered as a possible cause of NIHF, even in the absence of consanguinity or of a previous family history. By excluding the more frequent causes of NIHF, an LSD investigation assists in clarifying the etiology of many hydropic cases, making more appropriate genetic counseling for parents possible.

Polymerase chain reaction for the laboratory diagnosis of aseptic meningitis and encephalitis

A protocol for testing cerebrospinal fluid specimens using a range of PCR assays for the diagnosis of central nervous system infection was developed and used to test prospectively 383 specimens. PCR assays were used for the detection of adenovirus, Borrelia burgdorferi, enteroviruses, Epstein Barr virus, cytomegalovirus, herpes simplex virus, human herpes virus type 6, JC virus, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, lymphocytic choriomeningitis virus, measles virus, mumps virus, Mycobacterium sp., Mycoplasma pneumoniae, Toxoplasma gondii and varicella zoster virus. Of the 383 specimens tested in this study, 46 (12.0 percent) were found to be positive. The microorganisms detected were CMV, enterovirus, Epstein Barr virus, herpes simplex virus, human herpes virus type 6, JC virus, L. monocytogenes, Mycobacterium genus, Toxoplasma gondii and varicella zoster virus. The introduction of the PCR protocol described has improved the diagnosis of a range of central nervous system infections in our laboratory. We believe however that further evaluation of these assays in immunocompromised patients is necessary to better determine the predictive value of positive PCR results in these patient groups

Utilizaçäo da Reaçäo em Cadeia da Polimerase no diagnóstico precoce da infecçäo pelo HIV em crianças nascidas de mäes soropositivas / The use of Polimerase Chain Reaction (PCR) in the early diagnosis of HIV infection in infants born to seropositive mothers

O diagnóstico da infecçäo pelo HIV é feito através de testes sorológicos que detectam a presença de anticorpos específicos contra o HIV. Em crianças com menos de 24 meses esses testes näo säo conclusivos devido a transferência passiva de anticorpos IgG anti-HIV das mäes infectadas para seus recém-nascidos, positivando todas as reaçöes sorológicas. A transmissäo vertical do HIV ocorre em 15 a 50 porcento dessas crianças, sendo importante diferenciar precocemente as infectadas das näo infectadas para oferecer tratamento e profilaxia adequados. O desenvolvimento de técnicas que detectam a presença do vírus, entre elas a reaçäo em cadeia da polimerase (PCR), tem permitido essa diferenciaçäo. Desde 1994 temos realizado o teste PCR-HIV-DNA qualitativo em filhos de mäes HIV soropositivas. Foram testadas um total de 205 pacientes, sendo que, em 149 foi possível definir o estado de infecçäo pelo HIV independente do resultado da PCR. Nas 43 crianças consideradas infectadas a PCR foi positiva em 40 (sensibilidade de 93,3 porcento). Todas as 106 crianças näo infectadas apresentaram PCR negativo (especificidade de 100 porcento). O valor preditivo positivo encontrado foi de 100 porcento e o valor preditivo negativo de 97,2 porcento. Observamos também, que crianças nascidas de mäes HIV positivas tratadas com AZT na gestaçäo e trabalho de parto apresentaram nítida diminuiçäo nos índices de infectividade (9,4 porcento) em relaçäo aos filhos de mäes näo tratadas (33,7 porcento)

Diagnóstico molecular das infecçöes do Sistema Nervoso Central pela Reaçäo em Cadeia da Polimerase (PCR) / Molecular diagnosis of Central Nervous System infections by Polimerase Chain Reaction (PCR)

A identificaçäo do agente etiológico é de fundamental importância no tratamento e prognóstico das infecçöes do Sistema Nervoso Central (SNC) porém, os métodos convencionais de diagnóstico tem limitado sucesso. A Reaçäo em Cadeia da Polimerase (PCR) tem possibilitado o diagnóstico de infecçöes virais,bacterianas e por protozoários de maneira mais rápida e precisa. O objetivo deste estudo foi implantar, em nosso serviço, uma rotina ágil para o diagnóstico molecular dos microorganismos que mais freqüentemente acometem o SNC. As amostras de líquor (LCR) foram testadas para 20 agentes infecciosos: Herpes simplex, Herpes zooster, Enterovírus, vírus da Linfocoriomeningite, vírus Epstein-Barr, Adenovírus, Herpes hominis tipo 6, Sarampo, Caxumba, Mycobacterium sp, Citomegalovírus, Toxoplasma gondii, vírus JC, Listeria monocytogenes, Borrelia burgdorferi, Mycoplasma pneumoniae, Leptospira interrogans, Neisseria meningitidis, Haemophylus influenzae e Streptococcus sp. A técnica usada foi o PCR "nested" com extraçäo do RNA ou DNA das amostras pelo método de Boom modificado. Em algumas reaçöes utilizou-se a combinaçäo de "primers" de patógenos diferentes ("multiplex"), possibilitando a pesquisa de até três microrganismos na mesma reaçäo, agilizando os resultados. Foram testadas 281 amostras de LCR suspeitos de meningite ou meningo-encefalite linfocitária ou asséptica. A PCR foi positiva em 18 amostras (6,4 porcento). microrganismos detectados foram: Mycobacterium sp, Herpes simplex, Citomegalovírus, Herpes hominis tipo 6 e Toxoplasma gondii. Em estudo paralelo com 22 amostras liquóricas de pacientes com meningite bacteriana, a PCR foi positiva em 21 casos (95,4 porcento). Os microrganismos encontrados foram: H. influenzae, Streptococcus sp e N. meningitidis. Em quatro pacientes com PCR positiva a cultura do LCR foi negativa. A introduçäo da técnica de PCR em nosso laboratório otimizou o diagnóstico etiológico das infecçöes do SNC e tem se revelado de grande importância clínica.

Imunodeficiências primárias: revisäo da experiência clínica de 15 anos / Primary immunodeficiencies: review of 15 years clinical experience

A experiência clínica com imunodeficiência primárias acontece ao longo de muitos anos, devido a raridade das entidades patológicas. Os pacientes apresentam, na maioria, infecçöes de repetiçäo motivadas por defeitos ora no âmbito da imunidade humoral, da imunidade celular, do sistema de fagocitose ora do sistema do complemento sérico. Os métodos de avaliaçäo destes doentes säo diversos e evoluíram nos últimos anos. Nossos pacientes foram avaliados de acordo com o quadro clínico e os testes imunológicos disponíveis na época. Observamos 87 imunodeficientes, com a seguinte ordem de freqüência: deficiência seletiva, imunodeficiência comum variável, candidíase mucocutânea crônica, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia com telangiectasis, imunodeficiência com hiper-IgM, agamaglobulinemia ligada ao sexo, síndrome de Di George. Este trabalho focalizará especialmente as deficiências linfocitárias