Arcopilus eremanthusum sp. nov. as sources of antibacterial and antioxidant metabolites.

In this study, we evaluated the antibacterial and antioxidant activities of ethyl acetate (EtOAc) extracts of Arcopilus eremanthusum sp. nov. (CML3766) isolated from E. erythopappus. The fungi were identified using the sequences of the internal transcribed spacer (ITS), large subunit (LSU), and RNA polymerase II second largest subunit (RPB2). Antibacterial activity was determined using the minimum bactericidal concentration (MBC) method. Antioxidant activity was evaluated using free radical scavenging methods with 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS•+) assays and the ß-carotene-linoleic acid system. The total phenolic compound content was measured using the Folin-Ciocalteu method. The endophytic fungal extract presented bactericidal activity, with an MBC of 2.44 and 19.5 µg/mL against Staphylococcus aureus GL 8702 and GL 5674, respectively, and 625 µg/mL for Salmonella enterica serovar Enteritidis. In addition, this fungus demonstrated an antioxidant activity of 52.30% protection in the ß-carotene method. The total concentration of phenolic compounds was 23.73 mg gallic acid equivalent (GAE)/g. Ferulic acid, trans-cinnamic acid, chlorogenic acid, catechin, vanillin, p-coumaric acid, and caffeic acid were quantified using high-performance liquid chromatography with diode array detection. The results demonstrate the potential of A. eremanthusum sp. nov. to serve as a source of antibacterial and antioxidant metabolites with possible future biotechnological applications.

Homologous and Heterologous Adaptation and Thermochemical Inactivation of Staphylococcus aureus with Exposure to Cinnamaldehyde.

ABSTRACT: Staphylococcus aureus causes food intoxication and can become resistant to a large number of antibacterial drugs. Thus, there is a growing interest in understanding the mechanisms involved in the adaptation of bacterial cells to environmental stresses or to antimicrobial agents. In this context, we evaluated the cinnamaldehyde (CIN) MBC for two contaminating food strains of S. aureus (GL 5674 and GL 8702) and tested the hypothesis that exposure of these strains to sublethal CIN concentrations and pH values could increase their resistance to this antimicrobial agent, to acid stress, and also to stress at high temperatures. Thus, the ability of the strains to adapt to CIN and acid stress was evaluated, as well as the cross-adaptation between acid stress and CIN. Strains GL 5674 and GL 8702 of S. aureus are sensitive to CIN in MBCs of 0.25 and 0.5% respectively, proving the antibacterial potential of this compound, but we proved the hypothesis of homologous adaptation to CIN. The strains grew in concentrations higher than the MBC after being previously exposed to sublethal concentrations of CIN. We also observed heterologous adaptation of the strains, which after exposure to the minimum pH for growth, were able to grow in concentrations of CIN greater than the MBC. GL 5674 showed greater adaptive plasticity, considerably reducing its minimum inhibitory pH and increasing its MBC after adaptation. Our results show a positive effect of adaptation to CIN on the resistance of S. aureus (P < 0.0001) to CIN at a temperature of 37°C. However, in the absence of adaptation, the presence of CIN in S. aureus cultures maintained at 37°C showed an efficient bactericidal effect associated with increased exposure time. Our results call attention to the conscious use of CIN as an antimicrobial agent and present the possibility of using CIN, in association with a temperature of 37°C and an exposure time of 35 min, as a promising measure for the elimination of pathogenic strains.

Preservative of Essential Oil Blends: Control of Clostridium perfringens Type a in Mortadella

Abstract The aim of this study was to evaluate the antimicrobial effect of the essential oils of cinnamon, cardamom, clove, oregano, and thyme and their synergism on vegetative cells and endospores of Clostridium perfringens type A inoculated in meat sausage (mortadella), as well as the influence of blends on the color, and lipid oxidation through the determination of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS index). The anticlostridial action of the oil blends was established. The two added oil blends (Treat. 1: oregano, clove, and thyme; Treat. 2: oregano, clove, and cinnamon) in combination with reduced nitrite content (75 ppm) promoted a lower growth of C. perfringens in mortadella stored at 15 °C for 21 days in comparison to treatments containing only 75 ppm of nitrite. The essential oil blends showed antioxidant action and did not alter food color, thus possessing potential application as a preservative for the meat products industry.

Avaliação do teor de manganês em Pereskia grandfolia Haw / Evaluation of the manganese content in Pereskia grandfolia Haw

Pereskia grandfolia Haw, popularmente conhecida no Brasil como ora - pro - nobis, é considerada planta medicinal, classificada como uma hortaliça folhosa não convencional. É de fácil cultivo e propagação, de sabor agradável, rica em proteína. Pesquisas experimentais e clínicas têm reforçado a importância do manganês na saúde humana. O trabalho teve como objetivo avaliar a presença do micronutriente manganês nas folhas, no caule e nas flores da P. grandfolia Haw. A análise do mineral foi realizada utilizando espectrofotometria de absorção atômica acoplado a UV visível. Foi observado maior quantidade de manganês nas folhas da hortaliça (63,6 mg/kg). No caule 1,9 mg/Kg e nas flores não foi encontrado este mineral. Portanto, ora-pro-nobis pode complementar as necessidades diárias de manganês.

Avaliação do teor de zinco em Pereskia grandfolia Haw / Evaluation of the zinc content in Pereskia grandfolia Haw

A utilização de alimentos alternativos para o combate à fome na população de baixa renda é assunto que tem recebido atenção no Brasil nos últimos anos. O ora-pro-nobis (Pereskia grandfolia Haw), é uma planta de origem tropical de uso popular como alimento e medicinal, objeto de interesse na indústria alimentícia e farmacológica nos últimos anos, pelo alto teor de proteínas, lisina e mucilagem que apresenta. Estudos têm reforçado a importância do zinco na saúde humana. O trabalho teve como objetivo avaliar a presença do micronutriente zinco nas folhas, no caule e nas flores da Pereskia grandfolia Haw. A análise do mineral foi realizada utilizando espectrofotometria de absorção atômica acoplado a UV visível. Foi observado maior quantidade de zinco nas flores da hortaliça (24,8 mg/Kg). Nas folhas o resultado foi 23,8 mg/Kg e no caule 17,8 mg/Kg. Portanto, ora-pro-nobis pode complementar as necessidades diárias de zinco.

Diagnóstico e propostas de ações visando a melhoria da qualidade microbiológica do leite cru recebido em um laticínio localizado no Sul de Minas Gerais / Diagnosis and proposed actions aiming the improvement of the microbiological quality of raw milk received in a dairy located in the South of Minas Gerais

O objetivo deste estudo foi verificar a qualidade microbiológica do leite cru refrigerado recebido no Laticínio de uma Cooperativa localizada no Sul do Estado de Minas Gerais e propor ações corretivas. Amostras de leite foram coletadas dos compartimentos dos tanques de caminhões em três dias diferentes, plaqueadas em duplicata em Ágar Padrão para Contagem e incubadas a 7ºC por 10 dias. Foram identificadas 92 espécies através de espectrofotometria de massas MALDI-TOF-MS. Entre os isolados identificados o gênero Pseudomonas foi predominante, sendo conhecido por possuir grande capacidade de produção de enzimas degradativas em leite cru refrigerado. Foi possível verificar que somente o resfriamento do leite não garante a sua qualidade microbiológica, sendo necessárias outras ações visando à redução da contaminação microbiológica inicial do leite cru.

Óleo essencial de Lippia gracilis: atividade antioxidante e antimicrobiana contra Clostridium botulinum / Essential oil of Lippia gracilis: antioxidant and antimicrobial activity against Clostridium botulinum

Apesar da utilização dos aditivos nos alimentos, alguns microrganismos, como o Clostridium botulinum ainda causam preocupação. Óleos essenciais são opções de aditivo para a indústria de alimentos, pois podem apresentar atividade antimicrobiana e antioxidante. Diante disso, o objetivo foi extrair o ó leo essencial de Lippia gracilis, caracterizar sua composição química por CG/ EM, avaliar a atividade antioxidante pela redução do radical DPPH e a concentração mínima esporicida (CME) sobreClostridium sporogenes. O óleo essencial é composto majoritariamente pelos monoterpenos carvacrol, p-cimeno e terpineno, e apresentou baixa capacidade de estabilização do radical DPPH, IC50 > 500 μg/ mL. Em relação à ação sobre os endósporos do Clostridium sporogenes, a concentração mínima esporicida foi 1,5% de óleo essencial.

Adaptação cruzada de Escherichia coli enteropatogênica ao cinamaldeído e citral / Cross adaptation of enteropatogenic Escherichia coli tocinnamaldehyde and citral

O objetivo do trabalho foi verificar a capacidade de adaptação cruzada de EPEC CDC O55 aos compostos majoritários citral e cinamaldeído. Para isso, foi determinada a Concentração Mínima Bactericida (CMB) do citral e em seguida,as células de EPEC foram expostas a concentração subletal de cinamaldeído (CMB/16). Posteriormente testadas frente a diferentes concentrações do composto citral (CMB/2; CMB; 1,2CMB; 1,4CMB; 1,6CMB; 1,8CMB e 2CMB), estas foram incubadas e plaqueadas em TSA (Ágar Triptona de Soja) empregando-se a técnica de microgotas. As células de EPEC foram classificadas como capazes de se adaptarem, quando cresceram em placas após cultivo em presença do composto em concentração igual ou maior que a CMB. A CMB do citral foi de 1,0% (v/v). As células de EPEC não apresentaram a capacidade de adaptação cruzada. Os resultados demonstram que os compostos majoritários são alternativas eficazes no controle de EPEC.

Adaptação de Escherichia coli enterotoxigênica ao eugenol / Adaptation of enterotoxigenic Escherichia coli to eugenol

O objetivo do trabalho foi verificar a capacidade de adaptação de ETEC- ATCC 35401 ao antimicrobiano eugenol. Para isso, a Concentração Mínima Bactericida (CMB) de eugenol foi determinada e em seguida,as células de ETEC foram expostas a concentrações subletais de eugenol (CMB/4, CMB/8 e CMB/16). Posteriormente testadas frente a diferentes concentrações do composto (CMB/2; CMB; 1,2CMB; 1,4CMB; 1,6CMB; 1,8CMB e 2CMB), estas foram incubadas e plaqueadas em TSA (Ágar Triptona de Soja) empregando a técnica de microgotas. As células de ETEC foram classificadas como capazes de se adaptarem quando essas cresceram em placas após cultivo em presença do componente em concentração igual ou maior que a CMB do eugenol (1,0% (v/v)). As células de ETEC apresentaram a capacidade de adaptação por crescerem na CMB, após exposta a CMB/16. Os resultados demonstram a necessidade de obtenção da concentração de uso adequado de eugenol a fim de evitar a adaptação.

Adaptação de Staphylococcus aureus ao óleo essencial de Cinnamomum cassia / Adaptation of Staphylococcus aureus to Cinnamomum cassia essential oil

O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de adaptação de Staphylococcus aureus ao óleo essencial (OE) de canela cássia (Cinnamomum cassia). Primeiro determinou-se a Concentração Mínima Bactericida (CMB) do OE de C. cassia utilizando a técnica de microdiluição. Em seguida as células de S.aureus foram expostas a concentrações subletais do OE de C. cassia(CMB/4 e CMB/8) por um período de 6h e testadas frente a diferentes concentrações do OE (CMB/2; CMB; 1,2CMB; 1,4CMB; 1,6CMB; 1,8CMB e 2CMB), estas foram incubadas e plaqueadas em TSA (Ágar Triptona de Soja) empregando a técnica de microgotas. As células de S.aureus apresentaram uma nova CMB, maior que a anterior, portanto foram classificadas como capazes de se adaptarem ao OE de C. cassia. Após a exposição a concentrações subletais do OE, a CMB foi de 0,0744%. Os resultados evidenciam a importância de se utilizar a concentração adequada do antimicrobiano para evitar a adaptação do microrganismo.

Óleos essenciais e nanoemulsões como alternativas no controle de Clostridium sporogenes em mortadela / Essential oils and nanoemulsions as alternatives in the control of Clostridium sporogenes in mortadela

Avaliou-se a ação antimicrobiana da combinação dos óleos essenciais de canela, pimenta chinesa, limão Taiti e cardamomo e de suas nanoemulsões no controle de Clostridium sporogenes e sua influência sobre a oxidação lipídica em mortadela. A Concentração Mínima Bactericida (CMB) de cada óleo foi determinada pelo método de macrodiluição. As CMB encontradas foram: 0,10% óleo essencial de pimenta chinesa e canela e 1,00% óleo essencial de cardamomo e limão Taiti. A nanoemulsão elaborada apresentou redução significativa no número de células vegetativas de C. sporogenes na mortadela, além de ser o tratamento mais eficiente no controle da oxidação lipídica. Os resultados obtidos comprovam a ação antimicrobiana dos óleos testados, sugerindo sua possível utilização como conservantes naturais em produtos alimentícios.

Adaptação homóloga e heteróloga de células sésseis de Cronobacter sakazakii a óleos essenciais / Homologous and heterologous adaptation of Cronobacter sakazakii sessile cells to essential oils

Cronobacter sakazakii é patogênico, importante contaminante de fórmulas infantis, que apresenta tolerância aos sanificantes comerciais. Assim, os óleos essenciais se destacam. O objetivo desse trabalho foi avaliar a adaptação homologa e heteróloga de células sésseis de C. sakazakii aos óleos de canela, ho wood e menta. C. sakazakii foi adaptado a concentrações subletais dos óleos e desafiado a diferentes concentrações dos mesmos, determinando-se a adaptação homóloga. Já para avaliação da adaptação heteróloga os óleos foram diferentes daqueles usados na adaptação. De modo geral a adaptação tornou as células sésseis mais sensíveis aos óleos, entretanto, houve adaptação homóloga para o óleo de canela. Também foi observada adaptação heteróloga. C. sakazakii na forma séssil foi capaz de desenvolver adaptação homóloga e heteróloga.

Inativação termoquímica de Staphylococcus aureus ao cinamaldeído / Thermochemical inactivation of Staphylococcus aureus by cinnamaldehyde

Staphylococcus aureus é uma bactéria patogênica, associada à toxinose alimentar e pela sua capacidade em se tornar resistente a grande número de antimicrobianos. Alternativa para seu controle é a utilização de cinalmadeído, componente majoritário do óleo essencial de canela. O objetivo desse trabalho foi avaliar a inativação S. aureus por cinamaldeído em duas temperaturas. S. aureus foi incubado em caldo triptona de soja adicionado de 0,5% de Tween 80 (v/v) e 0,25% (v/v) de cinamaldeído nas temperaturas de 37 °C e 7 °C por 5, 10, 20, 30 e 35 minutos. Não foi observada ação bactericida do cinamaldeído na temperatura de 7°C, entretanto, a 37°C, após 35 minutos de contato não foram detectadas células viáveis. Dessa forma, destaca-se a importância da temperatura para a ação antimicrobiana do cinamaldeído.

Sinergismo de óleos essenciais sobre endósporos de Clostridium sporogenes / Essential oils sinergisms on Clostridium sporogenes endospores

A forma mais comum de inibir a produção de toxina botulínica em produtos cárneos cozidos é pela adição de sais de nitrito, o que pode gerar substâncias carcinogênicas (nitrosaminas), sendo desejável sua substituição. Os óleos essenciais vêm se destacando como agentes antimicrobianos, sendo interessante seu uso como conservante. O objetivo desse trabalho foi avaliar a ação sinergística de óleos essenciais sobre endósporos de Clostridium sporogenes, utilizado como modelo de pesquisa para C. botulinum. As concentrações mínimas esporicidas (CME) dos óleos de alecrim, tomilho, cravo, manjericão, ho wood e alho foram de 3% e de 0,375% para pimenta e canela. Os óleos de orégano e noz moscada não apresentaram ação esporicida nas concentrações testadas. Entre as combinações, as melhores foram de pimenta chinesa (0,1306%), alho (1,1%) e manjericão (1,1%) e pimenta chinesa (0,1306%), alho (1,1%) e tomilho branco (1,1%). Os resultados sugerem o sinergismo entre os óleos, sendo promissor seu uso em alimentos.

Cinética de produção de ácidos orgânicos na fermentação de soro lácteo com cultura mista de Propionibacterium freundenreichii subsp ATCC 6207 e Lactobacillus paracasei / Kinetics of production organic acids in the fermentation of milk whey with mixed culture of Propionibacterium freundenreichii subsp ATCC 6207 and Lactobacillus paracasei

Foi estudada a cinética de produção de ácidos orgânicos na fermentação de soro lácteo com cultura mista de Propionibacterium freundenreichii subsp ATCC 6207 e Lactobacillus paracasei. Foram analisados os efeitos das concentrações de células de L. paracasei, de lactose e de CaCO3 sobre a produção de ácidos orgânicos com auxílio de delineamento composto central rotacional (DCCR), totalizando 18 ensaios. Foi verificada existência de uma região ótima usando meio de fermentação contendo concentração acima de 45 g L-1 de lactose e abaixo de 20 g L-1 de CaCO3, com melhor produção dos ácidos orgânicos. A cultura pode eficientemente utilizar soro lácteo para produção de ácidos orgânicos, diminuindo impactos ambientais provocado pelo este subproduto da produção de queijo.

Effect of Brazilian green propolis on microorganism contaminants of surface of Gorgonzola-type cheese.

Blue cheeses are susceptible to yeast and bacterial growth on their surface, which causes spoilage during ripening process and the formation of slime. The dairy industry frequently control the proliferation of undesirable microorganisms with natamycin and high salt concentration. The green propolis is a complex of substances that presents antimicrobial properties with great potential as preservative in the food industry. The aims of the present study were to identify the mesophilic aerobic microorganisms present on the surface of Gorgonzola-type cheese, evaluate the antifungal and antibacterial effects of the ethanol extract of green propolis (EEP) on the development of those microorganisms and verify the effects of EEP on the sensory quality of cheese. Ten yeast species belonging to genera Yarrowia, Candida, Debaryomyces and Saccharomyces were identified, as well as seven species of bacteria belonging to genera Staphylococcus, Bacillus, Enterococcus, Corynebacterium and Proteus. The EEP showed minimum biocide concentration (MBC), between 0.3% (weight/weight) and 5% for Bacillus cereus and Proteus vulgaris, respectively. Saccharomyces cerevisiae was the most sensitive species (MBC of 0.63%) and Candida parapsilosis the most resistant one (MBC of 5%). In the sensory analysis, the cheeses involved with EEP at 5% concentration did not differ from the control, while at 10%, there was a slight decrease in acceptance. The EEP has potential and feasibility to be used in Gorgonzola-type cheese, inhibiting the main bacteria and yeasts without affecting largely the sensory characteristics of the product.

Antibacterial and anti-biofilm activity of cinnamon essential oil and eugenol / Atividade antibacteriana e anti-biofilme de óleo essencial de canela e eugenol

ABSTRACT: Biofilms are responsible for most of the interference caused by microorganisms in food processing. The aim of this study was to evaluate the cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) essential oil and eugenol sanitizer and anti-biofilm activity against biofilms. Concentrations used of essential oil were 0.0% (control) 0.12%; 0.48%; 0.96% and 1.92%; the amount of eugenol was 0.76%. Concentrations were determined from other published studies. Number of viable cells and quantification the bacterial biomass were determined. Anti-biofilm treatment was effective in preventing the formation of biofilms. The 1.92% concentration was the most satisfactorily with Escherichia coli reduction of 5.91log CFUcm-2 and Staphylococcus aureus reduction of 5.17log CFUcm-2 (P<0.05) biomass of the two bacteria. Sanitizing treatment was not effective in reducing biomass. Seen this, the cinnamon and eugenol essential oil may be promising alternatives for controlling biofilms.

RESUMO: Os biofilmes são responsáveis pela maior parte da interferência causada pelos micro-organismos no processamento de alimentos. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-biofilme do óleo essencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) e do composto majoritário eugenol. As concentrações utilizadas de óleo essencial foram de 0,0% (controle), 0,12%; 0,48%; 0,96% e 1,92%; a concentração de eugenol foi de 0,76%. As concentrações foram determinadas a partir de outros estudos publicados. Determinou-se o número de células viáveis e quantificou-se a biomassa bacteriana. O tratamento anti-biofilme foi eficaz na prevenção e formação de biofilmes. A concentração de 1,92% foi satisfatória, com redução de 5,91log CFUcm-2 de células viáveis em biofilme de Escherichia coli e redução de 5,17log CFU cm-2 de Staphylococcus aureus. A biomassa de ambas bactérias foi reduzida significativamente (P<0,05), entretanto, o tratamento sanitizante não foi eficaz na redução da biomassa. Diante dos resultados, o óleo essencial de canela e eugenol podem ser alternativas promissoras no controle de biofilmes.

Linalool, citral, eugenol and thymol: control of planktonic and sessile cells of Shigella flexneri.

The antimicrobial activity of linalool, citral, eugenol and thymol was determined in growth studies of both planktonic (PC) and biofilm cells (BC) Shigella flexneri. These components were evaluated either in isolation or in combinations using a sequential experimental strategy with Plackett & Burman and central composite rotational designs totaling 47 treatments. The minimum inhibitory concentration for PC was 0.125% (v v-1) for linalool and 0.5% (v v-1) for citral, eugenol and thymol. The biofilm minimum bactericidal concentration was 3 and 1% (v v-1) for linalool and citral, respectively, and 2% (v v-1) for eugenol and thymol. In the mixtures, the minimum concentrations in the efficient assays for PC growth inhibition were 0.0003, 0.0443 and 0.0443% (v v-1), for linalool, citral and thymol, respectively. In the BC, only two assays with concentrations of 0.0558, 0.0558 and 0.319% (v v-1) and 0.035, 0.035 and 0.3999% (v v-1) for linalool, citral and thymol, respectively, inhibited Shigella growth. Synergism was observed among the components, where PC and BC growth inhibition occurred at lower concentrations than those noted individually. The bactericidal effect of the components in microplate was different from the observed in stain steel coupons. Therefore, the obtained model can describe and predict the PC count of S. flexneri in medium with the tested compounds and they could be an alternative for the use in microbiological control in food industry.

Antibacterial activity and in vivo wound healing potential of phenolic extracts from jaboticaba skin.

In this study, different phenolic extracts were obtained from the jaboticaba skin meal (JSM), whose phenolic compounds were characterized and their antibacterial activities were assessed. Moreover, the activity of lyophilized ethanolic extract of jaboticaba skin (EEJS) on wound healing was analyzed in rats. The JSM phenolic extracts were obtained in four ways: aqueous, methanolic, ethanolic, and acetone extracts. The phenolic compounds were characterized in these extracts by high-performance liquid chromatography, and their antibacterial activities were evaluated. The in vivo experiment was divided into four groups and received the following treatments: G1-silver sulfadiazine (positive control); G2-EEJS at 10%; G3-EEJS at 5%, and G4-EEJS at 2.5%. The aqueous extract did not inhibit the growing of any bacterium. The ethanolic, acetone, and methanolic extracts inhibited the growing of all bacteria tested at the concentrations of 1.25%, 2.50%, and 5.00%, respectively. The ethanolic extract was the one that showed the highest bacterial inhibition potential and the highest contents of phenolic compounds, especially of catechin, epicatechin gallate, and epicatechin. The G3 and G4 treatments presented faster wound healing compared to the G1 one, as it promoted a less intense inflammatory reaction and full closure of the wounds at an accelerated rate.

Extraction and identification of antimicrobial peptides from the Canastra artisanal minas cheese.

Canastra artisanal Minas cheese samples were collected in Minas Gerais - Brazil. The samples were evaluated in order to observe the presence of antimicrobial peptides during 30 days of ripening. Soluble peptides extracted from the cheeses were fractionated by reverse phase liquid chromatography and their fractions evaluated for inhibitory action of E. coli. Fractions containing antimicrobial activity were analyzed by MALDI-TOF/TOF and then peptides were sequenced and identified using MASCOT Daemon coupled with UniProt database. The identified peptides were then validated by SCAFFOLD application. The peptides present in fractions with antimicrobial activity were RPKHPIKHQ, RPKHPIKHQG, RPKHPIKHQGLPQ and RPKHPIKHQGLPQE, HQPHQPLPPT and MHQPHQPLPPT. Peptide sequences PKHPIKHQ, RPKHPIKHQG, RPKHPIKHQGLPQ and RPKHPIKHQGLPQE were originated from αs1-casein and are their fragments belonging to Isracidine, which in turn is a well known antimicrobial peptide. The HQPHQPLPPT and MHQPHQPLPPT peptides were related to ß-casein and were isolated in other studies, but their biological activities are still unknown.