Epidemiological studies on dengue virus type 3 in Playa municipality, Havana, Cuba, 2001-2002.

OBJECTIVES: Recognizing the uniqueness of secondary dengue virus (DENV)-1/3 dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome (DHF/DSS) cases at an interval of 24 years, we sought to estimate DENV infections as well as the ratios between mild disease and DHF/DSS by DENV infection sequence in Playa District (Havana, Cuba) during the 2001-2002 outbreak of dengue virus type 3 (DENV-3). METHODS: A retrospective seroepidemiological study was conducted in 2003 in Playa District. Blood samples were collected from a 1% random sample of residents and were studied for the prevalence of dengue neutralizing antibodies. RESULTS: DENV-3 was found to have infected 7.2% (95% confidence interval (95% CI) 6.0-8.4%) of susceptible individuals (the entire cohort), the majority of whom experienced silent infections. Virtually every individual who had a secondary infection in the sequence DENV-1 then DENV-3 became ill, with a ratio of severe to mild cases of 1:35 (95% CI 1:67-1:23). Secondary infections in the sequence DENV-2/3 were less pathogenic than DENV-1/3. Mild disease accompanying secondary DENV2/3 occurred at a ratio of 1:4.49 infections (95% CI 1:5.77-1:3.42) secondary infections. CONCLUSIONS: The results obtained highlight the role of the infecting serotype and also the sequence of the viral infection in the clinical outcome of a dengue infection.

Niveles de óxido nítrico en monos Macacus irus inoculados con virus dengue / Serum nitric oxide in Macacus irus monkeys inoculated with dengue virus

Objetivo: partiendo de que los anticuerpos preexistentes en la infección secundaria por dengue suprimen la acción de moléculas con acciones antivirales como el óxido nítrico, se determinó el comportamiento de esa molécula en suero de monos Macacus irus inoculados con virus dengue 2 como infección primaria y en monos con una infección secuencial dengue 4-dengue2. Métodos: los niveles de óxido nítrico referidos como niveles de nitritos fueron detectados mediante la reacción de Griess. Resultados: los niveles máximos de óxido nítrico se detectaron en los animales que sufrieron una infección primaria a partir del séptimo día posinoculación, a diferencia de los monos con infección secundaria en que no se obtuvieron niveles mayores de 100 µM. Conclusiones: al parecer existe una asociación entre la infección secundaria y la inhibición de la producción del óxido nítrico.

Objective: To determine the action of nitric Oxide (NO) in serum samples of dengue 2 inoculated Macacus irus monkeys as primary infection and in dengue 4 -dengue 2 inoculated monkeys as secondary infection, taking into account that preexisting antibodies in secondary dengue infection elicit the action of antiviral molecules such as nitric oxide. Methods: NO levels referred as nitrite levels were detected by Griess colorimetric reaction. Results: The highest nitric oxide levels were detected in those animals with primary infection seven days after inoculation monkeys whereas those monkeys with secondary infection did not show NO levels over 100 µM. Conclusions: Our results suggest that there seems to be a relationship between secondary infection and NO production inhibition.

Niveles de óxido nítrico en monos Macacus irus inoculados con virus dengue / Serum nitric oxide in Macacus irus monkeys inoculated with dengue virus

Objetivo: partiendo de que los anticuerpos preexistentes en la infección secundaria por dengue suprimen la acción de moléculas con acciones antivirales como el óxido nítrico, se determinó el comportamiento de esa molécula en suero de monos Macacus irus inoculados con virus dengue 2 como infección primaria y en monos con una infección secuencial dengue 4-dengue2. Métodos: los niveles de óxido nítrico referidos como niveles de nitritos fueron detectados mediante la reacción de Griess. Resultados: los niveles máximos de óxido nítrico se detectaron en los animales que sufrieron una infección primaria a partir del séptimo día posinoculación, a diferencia de los monos con infección secundaria en que no se obtuvieron niveles mayores de 100 µM. Conclusiones: al parecer existe una asociación entre la infección secundaria y la inhibición de la producción del óxido nítrico(AU)

Objective: To determine the action of nitric Oxide (NO) in serum samples of dengue 2 inoculated Macacus irus monkeys as primary infection and in dengue 4 -dengue 2 inoculated monkeys as secondary infection, taking into account that preexisting antibodies in secondary dengue infection elicit the action of antiviral molecules such as nitric oxide. Methods: NO levels referred as nitrite levels were detected by Griess colorimetric reaction. Results: The highest nitric oxide levels were detected in those animals with primary infection seven days after inoculation monkeys whereas those monkeys with secondary infection did not show NO levels over 100 µM. Conclusions: Our results suggest that there seems to be a relationship between secondary infection and NO production inhibition(AU)

Primary and secondary infections of Macaca fascicularis monkeys with Asian and American genotypes of dengue virus 2

The goal of this study was to compare the immune response and the protection capacity induced by the dengue virus 2 (DENV-2) American and Asian genotypes in Macaca fascicularis monkeys. Animals were infected with American or Asian DENV-2 strains and challenged 1 year later with a DENV-2 Asian genotype strain. The viremia and monkey antibody levels were similar for the different strains after primary and secondary infection; however, the functionality of the antibody response was different. A limited viral replication was demonstrated after the secondary infection in all the monkeys. No virus was isolated in tissue culture, while reverse transcription-PCR showed a late positive reaction in four of five challenged monkeys. The immunoglobulin M response pattern and the detection of antibodies to specific proteins by Western blotting supported the protection data. Despite the demonstration of the protective effect after homologous challenge, a strong anamnestic antibody response was observed(AU)

Primary and secondary infections of Macaca fascicularis monkeys with Asian and American genotypes of dengue virus 2.

The goal of this study was to compare the immune response and the protection capacity induced by the dengue virus 2 (DENV-2) American and Asian genotypes in Macaca fascicularis monkeys. Animals were infected with American or Asian DENV-2 strains and challenged 1 year later with a DENV-2 Asian genotype strain. The viremia and monkey antibody levels were similar for the different strains after primary and secondary infection; however, the functionality of the antibody response was different. A limited viral replication was demonstrated after the secondary infection in all the monkeys. No virus was isolated in tissue culture, while reverse transcription-PCR showed a late positive reaction in four of five challenged monkeys. The immunoglobulin M response pattern and the detection of antibodies to specific proteins by Western blotting supported the protection data. Despite the demonstration of the protective effect after homologous challenge, a strong anamnestic antibody response was observed.

PCR detection of dengue virus using dried whole blood spotted on filter paper.

Whole blood dried onto filter paper constitutes a potentially useful material for molecular testing of viruses, including dengue. In order to assess the stability of viral RNA, we carried out dengue-RNA detection in whole blood infected with dengue virus that had been previously spotted onto filter paper. Filter papers were stored at room temperature, 4 and -70 degrees C and processed for PCR assay at intervals of 2, 4, 6 and 9 weeks. Our results demonstrated that dengue-RNA was stable in filter paper for 9 weeks at all tested temperatures. Furthermore, we evaluated these conditions using frozen sera and dried blood samples onto filter paper from 52 patients with confirmed clinical diagnosis of dengue infection. PCR results showed a 100% specificity and 93% sensitivity for dried blood samples. This storage method facilitates the transportation and analysis by nucleic acid amplification techniques even when freezing conditions are not available.

Dengue 3 epidemic, Havana, 2001.

In June 2001, dengue transmission was detected in Havana, Cuba; 12,889 cases were reported. Dengue 3, the etiologic agent of the epidemic, caused the dengue hemorrhagic fever only in adults, with 78 cases and 3 deaths. After intensive vector control efforts, no new cases have been detected.

Induction of neutralizing antibodies and partial protection from viral challenge in Macaca fascicularis immunized with recombinant dengue 4 virus envelope glycoprotein expressed in Pichia pastoris.

A recombinant vaccine that expresses the envelope (E) gene of dengue virus type 4 was tested for immunogenicity and protection in Macaca fascicularis. One hundred micrograms of semipurified recombinant E protein (E4rec) expressed in Pichia pastoris was used to immunize three animals. Neutralizing antibodies to dengue 4 virus with a titer of 1:30 were detected in all immunized monkeys prior to challenge. Animals were challenged with 10(5) plaque-forming units of dengue 4 virus. One vaccine-immunized monkey was protected from viremia, while the other two were partially protected. Monkeys immunized with E4rec elicited the highest neutralizing antibody titers (P < 0.05) ranging from 1:85 to 1:640 at day 30. In both immunized and control animals, the longest duration of viremia correlated with earliest and highest level of IgM antibody to dengue virus. The vaccinated animals showed anamnestic antibody responses upon virus challenge, indicating successful priming by the recombinant vaccine. Our results suggest that E4rec expressed in P. pastoris can provide partial protection against viremia. However, the results were not effective enough to use it as a vaccine candidate. Further work is required to improve the quality of the immunogen.

Aplicación de métodos moleculares al diagnóstico y caracterización de una epidemia de dengue en Cuba / Application of molecular methods to the diagnosis and characterization of a dengue outbreak in Cuba

Despúes de un período de 16 años sin dengue en Cuba, los primeros casos clínicos fueron detectados en general en enero de 1997 en Santiago de Cuba mediante vigilancia epidemiológica activa con asistencia de laboratorio. Se realizó transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa/reacción en cadena de la polimerasa anidada (TI-RCP/RCP anidada) para la indentificación rápida del virus del dengue serotipo 2 (DEN-2) como agente etiológico...(AU)

Comportamiento biológico de 3 cepas del virus dengue-2 en 2 líneas celulares de mosquitos / Biological behavior of 3 strains of the dengue-2 virus in 2 cell lines of mosquitoes

Strains A-15 (isolated in Cuba, 1981), Jamaica (isolated in Jamaica, 1981) and Nueva Guinea "C" (standard) from dengue-2 virus were compared according to the time of appearance of the cytopathic effect (CPE), to the time of appearance of specific fluorescence and to the kynetics of viral multiplication on being innoculated in the cell lines AP-61 (Aedes pseudoscutellaris) and C6/36 HT (Aedes albopictus). The results showed that the CPE of highest intensity and earliest appearance was for A-15, followed by Jamaica and Nueva Guinea "C" (NGC). AP-61 seems to favor the CPE of Jamaica with respect to that of the same strain in C6/36 HT. The fluorescence was earlier for Jamaica and A-15 and more intensive for the latter, whereas NGC manifested late. This behaviour was similar in the 2 cellular systems. The greatest titres during the kinetics of viral multiplication were obtained from A-15 in both lines, although in AP-61 they tend to be equal from the 4th day on. The strain A-15 showed a particular behaviour of these biological properties on comparing them with the other strains under study, which may be related to changes found in its neucleotide sequence.

Comportamiento biológico de 3 cepas del virus dengue-2 en 2 líneas celulares de mosquitos / Biological behavior of 3 stumps of the virus dengue-2 in 2 cellular lines of mosquitos

Las cepas A-15 (aislada en Cuba, 1981), Jamaica (aislada en Jamaica en 1981) y Nueva Guinea C (estándar) del virus dengue-2 fueron comparadas atendiendo al tiempo de aparición del efecto citopático (ECP), tiempo de aparición de la fluorescencia específica y a la cinética de multiplicación viral, al ser inoculadas en las líneas celulares AP-61 (Aedes pseudoscutellaris) y C6//36 HT (Aedes albopictus). Los resultados mostraron que el ECP de mayor intensidad y más temprana aparición fue para A-15, seguido por Jamaica y Nueva Guinea C (NGC). AP-61 parece favorecer el ECP de Jamaica respecto al de la misma cepa en C6/36 HT. La fluorescencia fue más temprana para Jamaica y A-15, y resultó más intensa para la última, mientras que NGC se manifestó tardíamente. Este comportamiento fue similar en los 2 sistemas celulares. Los mayores títulos durante la cinética de multiplicación viral se obtuvieron de A-15 en ambas líneas, aunque en AP-61 tienden a igualarse a partir del 4to. día. La cepa A-15 mostró un comportamiento particular de estas propiedades biológicas al compararla con las otras cepas en estudio, lo que pudiera estar relacionado con cambios encontrados en su secuencia nucleotídica(AU)

Estudio de algunas propiedades biológicas de 3 cepas de dengue 2 con diferencias en sus secuencias nucleotídicas / Study of various biological properties of 3 strains of dengue 2 with differences in their nucleotide sequences

Some biological properties of Dengue-2 strains such as A-15 (isolated in Cuba in 1981); Jamaica (isolated in Jamaica in 1981) and New Guinea "C" (NG"C") standard strain differing in their nucleotide sequences were studied. The results showed that the cytopathic effect in C6/36 HT cell line occurred earlier in A-15 strain and that fluorescence was first detected in Jamaica and A-15 strains. This seems to indicate that rapid detection of strains does not have any relation to neither their history of passage nor the original isolation system. A-15 and NG"C" strains exhibited an heterogeneous pattern formed by big and small plaques but average size of plaques in NG"C" was lower whereas Jamaica showed only small plaques. The most neurovirulent strain in mice was NG"G" followed by A-15 whereas Jamaica was not neurovirulent at all. These results indicate that A-15 has a different biological behaviour which is probably due to intrinsic differences. It should be taken into account that 7 amino acid changes were found in the envelope protein which may have affected the expression of some biological properties.

Estudio de algunas propiedades biológicas de 3 cepas de dengue 2 con diferencias en sus secuencias nucleotídicas / I study of some biological properties of 3 stumps of fastidiousness 2 with differences in their sequences nucleotídicas

Se estudiaron algunas propiedades biológicas de las cepas de dengue 2: A-15 (aislada en Cuba en 1981), Jamaica (aislada en Jamaica en 1981) y la cepa estándar Nueva Guinea C (NGC) que presentan diferencias en sus secuencias nucleotídicas. Los resultados mostraron que la aparición del efecto citopático en la línea celular C6/36 HT fue más temprano para la cepa A-15 y la fluorescencia se detectó primero en las cepas Jamaica y A-15, esto parece indicar que la rapidez de la detección de las cepas no guarda relación con su historia de pases ni con el sistema de aislamiento original. A-15 y NG C mostraron un patrón heterogéneo de placas grandes y pequeñas; la talla promedio fue menor en la segunda. Jamaica sólo presentó placas pequeñas. La capa más neurovirulenta en ratones fue la NG C seguida por A-15, mientras que Jamaica no fue neurovirulenta. Estos resultados sugieren que A-15 tiene un comportamiento biológico distinto, probablemente por causa de diferencias intrínsecas. Se debe considerar que se hallaron 7 cambios aminoacídicos en la proteína de envoltura que pudieran haber afectado la expresión de algunas propiedades biológicas(AU)

Reacción en cadena de la polimerasa para la detección rápida y determinación del serotipo de virus del dengue en muestras clínicas / Polymerase chain reaction for rapid detection and serotyping of dengue viruses in clinical samples

El trabajo que aquí se presenta describe las ventajas de usar la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RCP-TI) para detectar e identificar con rapidez virus del dengue en muestras clínicas. Se sometieron directamente a RCP-TI 27 muestras obtenidas de pacientes con fiebre de dengue y fiebre hemorrágica de dengue durante epidemias en Colombia, Nicaragua y Panamá. El ADN de cadena doble obtenido con la RCP-TI se identificó mediante una segunda amplificación (RCP de anidación) utilizando cebadores específicos para cada tipo de virus, aislamiento vírico e inmunofluorescencia indirecta (IFI) y con electroinmunoensayo enzimático detector de anticuerpos IgM contra el virus del dengue. El genoma vírico amplificado se detectó e identificó en un máximo de 8 horas. Los parámetros calculados para hacer el diagnóstico por RCP-TI, usando el aislamiento vírico y la IFI como estándar de oro, fueron una sensibilidad de 100%; una especificidad de 78%; un valor predictivo positivo de 69% y un valor predictivo negativo de 100%. Cabe notar que dos de los especímenes que dieron resultados positivos a la prueba de RCP-TI anidada y negativos al aislamiento vírico mostraron anticuerpos específicos de tipo IgM. Los resultados de la RCP-TI en general mostraron una estrecha concordancia con los del aislamiento vírico, lo cual sugiere que la RCP es un procedimiento que facilita enormemente el diagnóstico rápido y temprano del dengue.

This study describes the benefits of using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for the rapid detection and typing of dengue virus in clinical samples. Twenty-seven serum specimens from patients with dengue fever and dengue hemorrhagic fever in Colombia, Nicaragua, and Panama were directly subjected to RT-PCR for the detection of dengue virus. The resulting double-stranded DNA product was typed by a second round of PCR amplification (nested PCR) with type specific primers, viral culture/indirect immunofluorescence (IIF), and enzyme-linked electroimmunoassay for IgM anti-dengue antibodies. The amplified virus genome was detected and typed within 8 hours. Nested RT-PCR, using viral culture and IIF as the gold standard, showed 100% sensitivity; 78% specificity; 69% positive predictive value, and 100% negative predictive value. It is noteworthy that two of the specimens whose results were positive with nested RT-PCR and negative with viral culture showed specific IgM antibodies. The results of the RT-PCR were in close agreement with those obtained through viral culture. This suggests PCR can greatly facilitate the rapid and early diagnosis of dengue infection.

Diagnóstico virológico de un brote de fiebre y rash producido por Parvovirus B19, Cuba, 1995 / Virologycal diagnosis of an aoutbreak of fever and rash caused by Parvovirus B19, Cuba, 1995

Se reportan los resultados obtenidos en el estudio de un brote de fiebre y rash ocurrido en Ciudad de La Habana en marzo de 1995. En las muestras de 35 pacientes se descartaron dengue, sarampión, rubéola, herpes simple y Epstein Barr como agentes causales del brote. Mediante la detección de anticuerpos IgM y la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) se identificó al Parvovirus B19 como agente causal del brote. En 14/18 muestras (77,7 por ciento) se comprobó la infección por este agente por alguna de las técnicas empleadas. Este estudio se refiere al primer brote confirmado de Parvovirus B19 en Cuba

Diagnóstico virológico de un brote de fiebre y rash producido por Parvovirus B19, Cuba, 1995 / Virologycal diagnosis of an aoutbreak of fever and rash caused by Parvovirus B19, Cuba, 1995

Se reportan los resultados obtenidos en el estudio de un brote de fiebre y rash ocurrido en Ciudad de La Habana en marzo de 1995. En las muestras de 35 pacientes se descartaron dengue, sarampión, rubéola, herpes simple y Epstein Barr como agentes causales del brote. Mediante la detección de anticuerpos IgM y la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) se identificó al Parvovirus B19 como agente causal del brote. En 14/18 muestras (77,7 por ciento) se comprobó la infección por este agente por alguna de las técnicas empleadas. Este estudio se refiere al primer brote confirmado de Parvovirus B19 en Cuba(AU)

Identificacion por ELISA de agentes productores de efecto citopatico ligero aislados durante la epidemia de neuropatia en Cuba, 1991 / Identification by ELISA of light cytopathic effect-producin agents isolated during the neuropathy epidemy in cuba, 1991

Utilizando como referencia la cepa 44/93 aislada durante la epidemia de neuropatia en Cuba en 1991 y caracterizada como productora en cultivo celular de efecto citopatico ligero (ECP-L), se logro la normalizacion de un ELISA para la identificacion rapida de otras cepas con similar efecto. El ensayo consistio en un ELISA tipo sandwich donde las condiciones seleccionadas para cada reactivo (10 g/mL para el anticuerpo de recubrimiento, 1 mg/mL para el antigeno y dilucion 1/2 000 para el conjugado) permitieron una adecuada discriminacion entre el antigeno y el control de antigeno para la cepa de referencia empleada. La evolucion de un papel de cepas virales de referencia y de otras cepas productoras de ECP-L, mostro un 100 por ciento de coincidencia entre este metodo y el aislamiento en cultivo celular. Los resultados obtenidos nos permiten recomendar la utilizacion de este ensayo como una alternativa mas precisa en la identificacion de estos agentes

Identificación por ELISA de agentes productores de efecto citopático ligero aislados durante la epidemia de neuropatía en Cuba, 1991 / Identification by ELISA of light cytopathic effect-producin agents isolated during the neuropathy epidemy in cuba, 1991

Utilizando como referencia la cepa 44/93 aislada durante la epidemia de neuropatía en Cuba en 1991 y caracterizada como productora en cultivo celular de efecto citopático ligero (ECP-L), se logró la normalización de un ELISA para la identificación rápida de otras cepas con similar efecto. El ensayo consistió en un ELISA tipo sandwich donde las condiciones seleccionadas para cada reactivo (10 µg/mL para el anticuerpo de recubrimiento, 1 mg/mL para el antígeno y dilución 1/2 000 para el conjugado) permitieron una adecuada discriminación entre el antígeno y el control de antígeno para la cepa de referencia empleada. La evolución de un papel de cepas virales de referencia y de otras cepas productoras de ECP-L, mostró un 100 por ciento de coincidencia entre este método y el aislamiento en cultivo celular. Los resultados obtenidos nos permiten recomendar la utilización de este ensayo como una alternativa más precisa en la identificación de estos agentes(AU)