Characterization of Coagulase-Negative Staphylococci and pheno-genotypic beta lactam resistance evaluation in samples from bovine Intramammary infection / Caracterização de Staphylococcus coagulase negativa e avaliação fenogenotípica da resistência aos beta-lactâmicos em amostras oriundas de infecção intra-mamária em bovinos

This study aimed to identify Coagulase-Negative Staphylococci (CoNS) species isolated from bovine mastitis, through phenotypic and PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism-Polimerase Chain Reaction) methods and to compare both techniques to matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technique. Among them, the PCR-RFLP method, using a partially conserved sequence of the groEL gene, is a promising alternative, because of its reproducibility and reliability. On the other hand, the proteomic technique MALDI-TOF MS provides an accurate and much faster diagnosis and has been increasingly employed in microbiological identification. The pheno-genotypic profiles of beta-lactam resistance were also investigated, this characterization is important, considering that the use of antimicrobials is a key element for mastitis control in dairy farms. The concordance of the phenotypic, PCR-RFLP and MALDI-TOF MS assays to identify CoNS species was 77,5% (31/40). S. chromogenes was the species most frequently isolated. Antibiotic resistance rate was relatively low, registering values of 25.5% to penicillin, 9.6% to oxacillin and 6.2% to cefoxitin. Resistance to imipenem, cephalotin and amoxicillin+clavulanate was not observed. The mecA gene and its variant were detected in 7.6% and 4,1% of the isolates respectively. The blaZ gene was found in 43.2% of the strains resistant to penicillin.(AU)

Este estudo teve como objetivo identificar isolados de Staphylococcus coagulase-negativa (SCN) isolados de mastite bovina, por meio de métodos fenotípicos e PCR-RFLP (reação em cadeia de polimerase - polimorfismo nos fragmentos de restrição), e compará-los com a técnica de tempo de voo de ionização/desorção por laser assistida por matriz de espectrofotometria de massa (MALDI-TOF MS). O método de PCR-RFLP, que utiliza uma parte conservada da sequência do gene groEL, é uma alternativa promissora, por ser reprodutível e confiável. Por outro lado, a técnica proteômica MALDI-TOF MS permite uma acurácia e um diagnóstico muito mais rápidos e tem sido cada vez mais empregada na identificação microbiológica. Os perfis fenogenotípicos de resistência aos beta-lactâmicos também foram investigados. Essa caracterização é importante, considerando-se que os antimicrobianos são os elementos-chave para o controle da mastite na produção leiteira. A concordância entre os testes fenotípicos, PCR-RFLP E MALDI-TOF MS na identificação foi de 77,5% (31/40). S. chromogenes foi a espécie mais frequentemente isolada. A resistência antimicrobiana foi relativamente baixa, apresentando valores de 25,5% para penicilina, 9,6% para oxacilina e 6,2% para cefoxitina. Resistência ao imipenem, à cefalotina e à amoxacilina + ácido clavulâncico não foi observada. O gene mecA e sua variante foram detectados em 7,6% e 4,1% dos isolados, respectivamente. O gene blaZ foi encontrado em 43,2% dos isolados resistentes à penicilina.(AU)

Characterization of Coagulase-Negative Staphylococci and pheno-genotypic beta lactam resistance evaluation in samples from bovine Intramammary infection / Caracterização de Staphylococcus coagulase negativa e avaliação fenogenotípica da resistência aos beta-lactâmicos em amostras oriundas de infecção intra-mamária em bovinos

This study aimed to identify Coagulase-Negative Staphylococci (CoNS) species isolated from bovine mastitis, through phenotypic and PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism-Polimerase Chain Reaction) methods and to compare both techniques to matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technique. Among them, the PCR-RFLP method, using a partially conserved sequence of the groEL gene, is a promising alternative, because of its reproducibility and reliability. On the other hand, the proteomic technique MALDI-TOF MS provides an accurate and much faster diagnosis and has been increasingly employed in microbiological identification. The pheno-genotypic profiles of beta-lactam resistance were also investigated, this characterization is important, considering that the use of antimicrobials is a key element for mastitis control in dairy farms. The concordance of the phenotypic, PCR-RFLP and MALDI-TOF MS assays to identify CoNS species was 77,5% (31/40). S. chromogenes was the species most frequently isolated. Antibiotic resistance rate was relatively low, registering values of 25.5% to penicillin, 9.6% to oxacillin and 6.2% to cefoxitin. Resistance to imipenem, cephalotin and amoxicillin+clavulanate was not observed. The mecA gene and its variant were detected in 7.6% and 4,1% of the isolates respectively. The blaZ gene was found in 43.2% of the strains resistant to penicillin.(AU)

Este estudo teve como objetivo identificar isolados de Staphylococcus coagulase-negativa (SCN) isolados de mastite bovina, por meio de métodos fenotípicos e PCR-RFLP (reação em cadeia de polimerase - polimorfismo nos fragmentos de restrição), e compará-los com a técnica de tempo de voo de ionização/desorção por laser assistida por matriz de espectrofotometria de massa (MALDI-TOF MS). O método de PCR-RFLP, que utiliza uma parte conservada da sequência do gene groEL, é uma alternativa promissora, por ser reprodutível e confiável. Por outro lado, a técnica proteômica MALDI-TOF MS permite uma acurácia e um diagnóstico muito mais rápidos e tem sido cada vez mais empregada na identificação microbiológica. Os perfis fenogenotípicos de resistência aos beta-lactâmicos também foram investigados. Essa caracterização é importante, considerando-se que os antimicrobianos são os elementos-chave para o controle da mastite na produção leiteira. A concordância entre os testes fenotípicos, PCR-RFLP E MALDI-TOF MS na identificação foi de 77,5% (31/40). S. chromogenes foi a espécie mais frequentemente isolada. A resistência antimicrobiana foi relativamente baixa, apresentando valores de 25,5% para penicilina, 9,6% para oxacilina e 6,2% para cefoxitina. Resistência ao imipenem, à cefalotina e à amoxacilina + ácido clavulâncico não foi observada. O gene mecA e sua variante foram detectados em 7,6% e 4,1% dos isolados, respectivamente. O gene blaZ foi encontrado em 43,2% dos isolados resistentes à penicilina.(AU)

Enterotoxin genes, multidrug resistance, and molecular typing of Staphylococcus spp. isolated from organic bovine milk / Genes de enterotoxinas, multirresistência a antimicrobianos e caracterização molecular de espécies de Staphylococcus spp. isoladas de leite bovino orgânico

The multidrug resistant and the emergence of methicillin-resistant staphylococci isolated from animals, food, and humans are public health concern. These microorganisms produce different toxins related to food poisoning in humans. This study aimed to characterize Staphylococcus spp. isolated from two organic milk farms in Brazil. A total of 259 milk samples were collected, from which 58 (22.4%) Staphylococcus spp. were isolated. The highest sensibility to ceftiofur and sulfamethoxazole/trimethoprim was observed in 96.6% of Staphylococcus spp., and whereas 89% were resistant to penicillin G. The mecA gene was detected in 13.8% of the isolates. SEA and SEC were the most common enterotoxins detected. PFGE revealed genetic heterogeneity from S. intermedius and S. warneri analyzed, while S. aureus presented similar profiles among isolates from the two studied herds. To the best of our knowledge, the current study describes for the first time presence of enterotoxins, mecA gene, and genetic diversity of staphylococci isolated from organic dairy farms in Brazil.(AU)

A emergência de estafilococos multirresistentes e resistentes à meticilina, isolados de animais, alimentos e humanos é uma preocupação em saúde pública. Esses micro-organismos produzem diferentes toxinas relacionadas à intoxicação alimentar em humanos. Este estudo caracterizou Staphylococcus spp. isolados em duas fazendas orgânicas no Brasil. Foram coletadas 259 amostras de leite em duas propriedades leiteiras orgânicas, nas quais 58 (22,4%) estirpes de Staphylococcus spp. foram isoladas. A maior sensibilidade dos isolados foi observada para ceftiofur e sulfametoxazol/trimetoprim em 96,6%. Em contraste, acima de 89% de resistência dos estafilicocos foi encontrada para penicilina G. O gene mecA foi identificado em 13,8% dos isolados. SEA e SEC foram as enterotoxinas mais comumente detectadas. PFGE revelou heterogeneidade genética entre S. intermedius e S. warneri, enquanto S. aureus demonstraram perfis semelhantes entre isolados dos dois rebanhos estudados. Relata-se pela primeira vez no Brasil a detecção de enterotoxinas, o gene mecA e diversidade genética em estafilococos isolados de vacas em produção orgânica.(AU)

Enterotoxin genes, multidrug resistance, and molecular typing of Staphylococcus spp. isolated from organic bovine milk / Genes de enterotoxinas, multirresistência a antimicrobianos e caracterização molecular de espécies de Staphylococcus spp. isoladas de leite bovino orgânico

The multidrug resistant and the emergence of methicillin-resistant staphylococci isolated from animals, food, and humans are public health concern. These microorganisms produce different toxins related to food poisoning in humans. This study aimed to characterize Staphylococcus spp. isolated from two organic milk farms in Brazil. A total of 259 milk samples were collected, from which 58 (22.4%) Staphylococcus spp. were isolated. The highest sensibility to ceftiofur and sulfamethoxazole/trimethoprim was observed in 96.6% of Staphylococcus spp., and whereas 89% were resistant to penicillin G. The mecA gene was detected in 13.8% of the isolates. SEA and SEC were the most common enterotoxins detected. PFGE revealed genetic heterogeneity from S. intermedius and S. warneri analyzed, while S. aureus presented similar profiles among isolates from the two studied herds. To the best of our knowledge, the current study describes for the first time presence of enterotoxins, mecA gene, and genetic diversity of staphylococci isolated from organic dairy farms in Brazil.(AU)

A emergência de estafilococos multirresistentes e resistentes à meticilina, isolados de animais, alimentos e humanos é uma preocupação em saúde pública. Esses micro-organismos produzem diferentes toxinas relacionadas à intoxicação alimentar em humanos. Este estudo caracterizou Staphylococcus spp. isolados em duas fazendas orgânicas no Brasil. Foram coletadas 259 amostras de leite em duas propriedades leiteiras orgânicas, nas quais 58 (22,4%) estirpes de Staphylococcus spp. foram isoladas. A maior sensibilidade dos isolados foi observada para ceftiofur e sulfametoxazol/trimetoprim em 96,6%. Em contraste, acima de 89% de resistência dos estafilicocos foi encontrada para penicilina G. O gene mecA foi identificado em 13,8% dos isolados. SEA e SEC foram as enterotoxinas mais comumente detectadas. PFGE revelou heterogeneidade genética entre S. intermedius e S. warneri, enquanto S. aureus demonstraram perfis semelhantes entre isolados dos dois rebanhos estudados. Relata-se pela primeira vez no Brasil a detecção de enterotoxinas, o gene mecA e diversidade genética em estafilococos isolados de vacas em produção orgânica.(AU)

Comparison phenotypic and genotypic identification of Staphylococcus species isolated from bovine mastitis / Comparação da identificação fenotípica e genotípica de espécies do gênero Staphylococcus isoladas de mastite bovina

In addition to Staphylococcus aureus nowadays other coagulase-positive staphylococci (CoPS) and coagulase-negative staphylococci (CoNS), earlier considered of minor importance, are now accepted as relevant pathogens for humans and animals. The involvement of these microorganisms in bovine mastitis etiology and the possibility their transmission through milk to humans justify the requirement of developing reliable methods for identification of the most frequent species among them. The purpose of this study was to compare the phenotypic techniques with the genotypic method carried out by sequencing of the rpoB gene in identification of several species of the genus Staphylococcus isolated from bovine mastitis. A total of 300 staphylococci isolates of bovine mastitis cases from several Brazilian dairy herds were studied by phenotypic and genotypic techniques, respectively: 150 CoPS and 150 CoNS strains. A total of 18 CoNS different species and 4 CoPS species were identified. Among the CoNS the following species were recognized: 48 (32%) Staphylococcus warneri, 22(15%) S. epidermidis, 20(13%) S. hyicus, 10(7%) S. xylosus, 7(5%) S. haemolyticus, 6(4%) S. simulans, 6(4%) S. schleiferi subsp schleiferi, 6(4%) S. hominis, 5(3%) S. pasteuri, 4(2.7%) S. cohnii, 3(2%) S. saprophyticus subsp. saprophyticus 3(2%) S. chromogenes 3(2%) S. sciuri, 2(1%) S. saccharolyticus, 2(1%) S. lugdunensi, 1(0,7%) S. auricularis, 1(70%) S. saprophyticus subsp. bovis, 1(0.7%) S. capitis. And among the 150 CoPS were identified respectively: 105 (70%) S. aureus, 21(14%), S. hyicus, 19(13%) S. intermedius e 5(3%) S. schleiferi subsp coagulans. Considering the 150 CoNS isolates, the identifications performed by phenotypic and genotypic tests presented 96.7% of concordance, kappa coefficient of agreement = 0.933, SE (standard error) of kappa=0.021 (95% confidence interval: 0.893 to 0.974), Pearson's correlation coefficient (r) = 0.9977, (confidence interval 95%: 0.9938 a 0.9992) and in relation to 150 CPS isolates it was detected an agreement of 98.7%, kappa = 0.960, SE of kappa = 0.016, (95% confidence interval: 0.929 to 0.992) Pearson's correlation coefficient (r) = 0.9994 (95% confidence interval: 0.9681 to 1.0000). The verified agreement strength between the identification methods can be considered as excellent. These results assure that according to laboratory resources any of them will be suitable to perform the staphylococci identification.(AU)

Além de Staphylococcus aureus atualmente outros estafilococos coagulase positiva (SCP) e estafilococos coagulase-negativos (SCN), anteriormente considerados de menor relevância, são reconhecidos como importantes patógenos para humanos e animais. O envolvimento desses micro-organismos na etiologia da mastite bovina e a possibilidade da sua transmissão através do leite aos humanos justifica a utilização de métodos confiáveis para a identificação das espécies mais frequentes. O objetivo deste estudo foi comparar as técnicas fenotípicas com o método genotípico realizada por sequenciamento do gene rpoB na identificação de espécies do gênero Staphylococcus spp. isolados de mastite bovina. Um total de 300 estafilococos isolados de casos de mastite bovina em diferentes rebanhos leiteiros brasileiros foram estudados por técnicas fenotípicas e genotípicas, respectivamente: 150 linhagens de SCP e 150 linhagens de SCN. Foram identificados um total de 18 espécies de SCN e 4 espécies SCP. Entre os SCN as seguintes espécies identificadas: 48 (32%) Staphylococcus warneri, 22 (15%) S. epidermidis, 20 (13%) S. hyicus, 10 (7%) S. xylosus, 7 (5%) S. haemolyticus, 6 (4%) S. simulans, 6 (4%) S. schleiferi subsp schleiferi, 6 (4%) S. hominis, 5 (3%) S. pasteuri, 4 (2,7%) S. cohnii, 3 (2%) S. saprophyticus subsp. saprophyticus, 3 (2%) S. chromogenes, 3 (2%) S. sciuri, 2 (1%) S. saccharolyticus, 2 (1%) S. lugdunensi, 1 (0,7%) S. auricularis, 1 (70 %) S. saprophyticus subsp. bovis, 1 (0,7%) S. capitis. E entre as 150 SCP foram identificados, 105 (70%) S. aureus, 21 (14%), S. hyicus, 19 (13%) S. intermedius e 5 (3%) S. schleiferi subsp coagulans. Considerando-se os 150 SCN isolados, as identificações realizadas por testes fenotípicos e genotípicos apresentaram 96,7% de concordância, coeficiente de concordância kappa = 0,933, SE (erro padrão) de kappa = 0,021 (95% intervalo de confiança: 0,893-0,974), coeficiente de correlação de Pearson (r) = 0,9977, (intervalo de confiança de 95%: 0,9938 a 0,9992) e em relação a 150 SCP isolados foi observado uma concordância de 98,7%, kappa = 0,960, sE de kappa = 0,016, (95% de intervalo de confiança: 0,929 a 0,992) coeficiente de correlação de Pearson (r) = 0,9994 (95% intervalo de confiança: 0,9681-1,0000). A correlação entre os métodos de identificação pode ser considerada como excelente. Esses resultados demonstraram que de acordo com os recursos disponíveis no laboratório, poderia ser utilizada qualquer uma das metodologias.(AU)

Comparison phenotypic and genotypic identification of Staphylococcus species isolated from bovine mastitis / Comparação da identificação fenotípica e genotípica de espécies do gênero Staphylococcus isoladas de mastite bovina

In addition to Staphylococcus aureus nowadays other coagulase-positive staphylococci (CoPS) and coagulase-negative staphylococci (CoNS), earlier considered of minor importance, are now accepted as relevant pathogens for humans and animals. The involvement of these microorganisms in bovine mastitis etiology and the possibility their transmission through milk to humans justify the requirement of developing reliable methods for identification of the most frequent species among them. The purpose of this study was to compare the phenotypic techniques with the genotypic method carried out by sequencing of the rpoB gene in identification of several species of the genus Staphylococcus isolated from bovine mastitis. A total of 300 staphylococci isolates of bovine mastitis cases from several Brazilian dairy herds were studied by phenotypic and genotypic techniques, respectively: 150 CoPS and 150 CoNS strains. A total of 18 CoNS different species and 4 CoPS species were identified. Among the CoNS the following species were recognized: 48 (32%) Staphylococcus warneri, 22(15%) S. epidermidis, 20(13%) S. hyicus, 10(7%) S. xylosus, 7(5%) S. haemolyticus, 6(4%) S. simulans, 6(4%) S. schleiferi subsp schleiferi, 6(4%) S. hominis, 5(3%) S. pasteuri, 4(2.7%) S. cohnii, 3(2%) S. saprophyticus subsp. saprophyticus 3(2%) S. chromogenes 3(2%) S. sciuri, 2(1%) S. saccharolyticus, 2(1%) S. lugdunensi, 1(0,7%) S. auricularis, 1(70%) S. saprophyticus subsp. bovis, 1(0.7%) S. capitis. And among the 150 CoPS were identified respectively: 105 (70%) S. aureus, 21(14%), S. hyicus, 19(13%) S. intermedius e 5(3%) S. schleiferi subsp coagulans. Considering the 150 CoNS isolates, the identifications performed by phenotypic and genotypic tests presented 96.7% of concordance, kappa coefficient of agreement = 0.933, SE (standard error) of kappa=0.021 (95% confidence interval: 0.893 to 0.974), Pearsons correlation coefficient (r) = 0.9977, (confidence interval 95%: 0.9938 a 0.9992) and [...](AU)

Além de Staphylococcus aureus atualmente outros estafilococos coagulase positiva (SCP) e estafilococos coagulase-negativos (SCN), anteriormente considerados de menor relevância, são reconhecidos como importantes patógenos para humanos e animais. O envolvimento desses micro-organismos na etiologia da mastite bovina e a possibilidade da sua transmissão através do leite aos humanos justifica a utilização de métodos confiáveis para a identificação das espécies mais frequentes. O objetivo deste estudo foi comparar as técnicas fenotípicas com o método genotípico realizada por sequenciamento do gene rpoB na identificação de espécies do gênero Staphylococcus spp. isolados de mastite bovina. Um total de 300 estafilococos isolados de casos de mastite bovina em diferentes rebanhos leiteiros brasileiros foram estudados por técnicas fenotípicas e genotípicas, respectivamente: 150 linhagens de SCP e 150 linhagens de SCN. Foram identificados um total de 18 espécies de SCN e 4 espécies SCP. Entre os SCN as seguintes espécies identificadas: 48 (32%) Staphylococcus warneri, 22 (15%) S. epidermidis, 20 (13%) S. hyicus, 10 (7%) S. xylosus, 7 (5%) S. haemolyticus, 6 (4%) S. simulans, 6 (4%) S. schleiferi subsp schleiferi, 6 (4%) S. hominis, 5 (3%) S. pasteuri, 4 (2,7%) S. cohnii, 3 (2%) S. saprophyticus subsp. saprophyticus, 3 (2%) S. chromogenes, 3 (2%) S. sciuri, 2 (1%) S. saccharolyticus, 2 (1%) S. lugdunensi, 1 (0,7%) S. auricularis, 1 (70 %) S. saprophyticus subsp. bovis, 1 (0,7%) S. capitis. E entre as 150 SCP foram identificados, 105 (70%) S. aureus, 21 (14%), S. hyicus, 19 (13%) S. intermedius e 5 (3%) S. schleiferi subsp coagulans. Considerando-se os 150 SCN isolados, as identificações realizadas por testes fenotípicos e genotípicos apresentaram 96,7% de concordância, coeficiente de concordância kappa = 0,933, SE (erro padrão) de [...](AU)

ETIOLOGIA E RESISTÊNCIA DE BACTÉRIAS ISOLADAS DE OTITE EXTERNA EM CÃES

A otite externa canina é uma enfermidade relevante na clínica veterinária. Considerando a elevada frequência de atendimentos de cães com otite externa bacteriana, objetivou-se identificar a frequência etiológica da otopatia e traçar o perfil de resistência dos Staphylococcus Meticilina Resistentes (SMR) e enterobactérias produtoras de BetaLactamases de Espectro Estendido (ESBL) em pacientes ambulatoriais e de internamento. As amostras foram submetidas a isolamento primário, testes de susceptibilidade à antimicrobianos e de resistência bacteriana. Para os Staphylococcus sp. aplicou-se o Teste D (Disk Test) e o teste de Resistência à Meticilina (Met-25). Nas cepas positivas para o Met-25 foi feita Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detecção do gene mecA. Para estirpes positivas na PCR foi determinada a Concentração Bactericida Mínima (CBM) do gluconato de clorexidina. Os grupos bacterianos isolados das 140 amostras coletadas foram: Staphylococcus sp. (122 49,38%), Pseudomonas sp. (22 8,91%), enterobactérias (19 7,69%), Enterococcus sp. (17 6,88%) e Acinetobacter sp. (12 4,86%). Foram isoladas 14 cepas de SMR (11,47%) e todas continham o gene mecA. Observou-se que 14 Staphylococcus sp. foram Teste D positivo. Para os Staphylococcus coagulase positiva (SCP) a CBM foi de 500.000µg/mL (0,5%) enquanto que para os Staphylococcus coagulase negativa (SCN) o valor da CBM foi de 62.500µg/mL (0,0625%). Detectou-se 3 cepas de enterobactérias ESBL. Os antimicrobianos mais efetivos para Staphylococcus sp. foram: Linezolida (100%), Rifampicina (94,26%) e Cloranfenicol (92,62%). Para Pseudomonas sp.: Cefepime (100%), Imipenem (100%) e Meropenem (100%). Para as enterobactérias: Ertapenem (100%), Imipenem (100%) e Cefotaxima (84,21%). Para Enterococcus sp.: Cloranfenicol (100%), Linezolida (94,12%) e Vancomicina (88,24%). Para Acinetobacter sp.: Imipenem (100%), Meropenem (100%) e Ticarcilina com Clavulanato (91,67%). Apesar do gene mecA e de enterobactérias produtoras de ESBL terem baixa ocorrência neste estudo, existe a necessidade de um monitoramento constante em cepas isoladas de animais domésticos. Cultura bacteriológica e os testes de suscetibilidade aos agentes antimicrobianos são de grande importância na rotina clínica veterinária para garantir o sucesso do tratamento de infecções otológicas caninas.

The canine external otitis is a relevant disease regarding veterinary clinic. Considering the high frequency of treatment of dogs with external bacteria otitis, this research aims to identify the etiological frequency of otopathy and trace the resistance profile of the Methicillin Resistant Staphylococcus (MRS) and enterobacteria that produce Extended Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) in outpatients and internment patients. The samples were submitted to primary isolation, tests of antimicrobial susceptibility and bacterial resistance. For the Staphylococcus sp. the Disk Test was applied along with the resistance test to Methicillin (Met-25). In the positive strains for Met-25, a Polimerase Chain Reaction (PCR) was applied to detect the mecA gene. For the PCR positive strains, a Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of chlorhexidine gluconate was determined. The isolated bacterial groups of the 140 samples collected were: Staphylococcus sp. (122 49.38%), Pseudomonas sp. (22 8.91%), enterobacteria (19 7.69%), Enterococcus sp. (17 6.88%) and Acinetobacter sp. (12 4.86%). 14 MRS strains (11.47%) were observed and all off them had the mecA gene. 14 Staphylococcus sp. were Disk Test positive. Concerning the positive Staphylococcus coagulase, the MBC was 500.00µg/mL (0.5%) whereas for the negative Staphylococcus coagulase the MBC value was 62.500µg/mL (0.0625%). 3 ESBL enterobacteria strains were detected. The more effective antimicrobial for the Staphylococcus sp. were: Linezolid (100%), Rifampicin (94.26%) and Chloramphenicol (92.62%). Regarding the Pseudomonas sp.: Cefepime (100%), Imipenem (100%) and Meropenem (100%). Regarding the enterobacteria: Ertapenem (100%), Imipenem (100%) and Cefotaxime (84.21%). Regarding the Enterococcus sp.: Chloramphenicol (100%), Linezolid (94.12%) and Vancomycin (88.24%). Regarding the Acinetobacter sp.: Imipenem (100%), Meropenem (100%) and Ticarcillin with Clavulanate (91.67%). Although the mecA gene and the enterobacteria that produce ESBL are briefly presented in this research, there is a need for constant monitoring of isolated strains in domestic animals. The bacteriological growth and the susceptibility tests in the antimicrobial agents are of great importance in the veterinary clinic routine in order to insure the success in treating canine otological infections.

QUALIDADE DO LEITE DE CABRA IN NATURA PELA DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS, SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA, PARÂMETROS FÍSICOS-QUÍMICOS, CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS, CONTAGEM TOTAL BACTERIANA E RESÍDUO ANTIMICROBIANO.

A caprinocultura leiteira vem ganhando destaque nos últimos anos impulsionado por incentivos governamentais e privados. Em contrapartida, a mastite acarreta representa grandes perdas econômicas no segmento leiteiro tanto na quantidade como na qualidade do leite produzido. Foi realizado um estudo da mastite subclínica em nove rebanhos de cabras leiteiras localizadas no Estado do Rio de Janeiro, totalizando 140 amostras de leite (uma amostras por animal), com o objetivo de avaliar a qualidade do leite de cabra pelo cultivo microbiológico e reação em cadeia da polimerase (PCR) do leite in natura para pesquisa de Staphylococcus aureus, contagem de células somáticas (CCS), contagem bacteriana total (CBT), análises físico-química, verificação do perfil de resistência antimicrobiana in vitro de Staphylococcus spp., detecção de genes de resistência a beta-lactâmicos e a presença de resíduos antimicrobianos. Houve crescimento bacteriano em 64 amostras (48%), dentre essas 10 obtiveram isolamento de dois microrganismos associados. Dos 77 isolados encontrados, 58,4% foram identificados como Staphylococcus coagulase negativa (SCN), 11,58% Staphylococcus Coagulase Positiva, 14,16% bastonetes gram negativos da família das enterobactérias (incluindo E. coli e Serratia sp.), 6,49% Bacillus spp., 5,19% Streptococcus spp. e 3,89% Enterococcus spp. A associação de SCN e bastonete gram negativo apresentou o maior número, com 50%, seguido de 20% Staphylococcus Coagulase Positiva + Enterococcus sp. e 10% SCN + Bacillus spp., Streptococcus spp. + Bacillus spp. e Streptococcus spp. + Bastonete Gram Negativo. No teste de difusão em disco realizado com 54 isolados de Staphylococcus spp., o antimicrobiano mais efetivo foi o florfenicol (1,7%) e as maiores resistências foram para ampicilina e penicilina (50%), seguida da oxacilina (32,70% ), tetraciclina (8,60%), cefoxitina( 6,89%), norfloxacina (5%), gentamicina e cefalotina (3,40%). A múltipla re¬sistência a dois ou mais antimicrobianos foi observada em 57,40% dos isolados. Nenhuma amostra de leite obteve positividade para Staphylococcus aureus no cultivo e na PCR. A média de CCS de 2.152.000 células/mL está acima do recomendado pela literatura. Não houve associação significativa entre o isolamento bacteriano e os valores obtidos na contagem de células somáticas (t-Student p > 0,05). A média de CBT de 842.000 UFC/mL de leite foi acima do preconizado pela legislação. As análises físico-químicas realizadas no leite foram: porcentagens de gordura, proteína e lactose por absorção infravermelha, bem como de sólidos totais, por soma dos valores dos componentes anteriores. A acidez, pela titulação de leite por solução alcalina (NaOH 0,1N), utilizando-se como indicador a fenolftaleína e o resultado expresso em graus Dornic (°D). A determinação de cloretos pelo método mercurométrico e densidade a 15°C em aparelho eletrônico. Alguns rebanhos não atenderam aos padrões físico-químicos exigidos pela legislação. A acidez apresentou diferença significativa quando associada ao isolamento bacteriano (p<0,05). O risco (odds ratio) de detecção bacteriana em caso de acidez elevada aumentado em 1,15 vezes quando comparado a amostras com acidez normal. A contribuição de todos os fatores físico-químicos a CBT somou 41,08%, sendo a lactose o fator que mais contribuiu isoladamente (p<0,05). Em dezenove amostras isoladas de mastite caprina subclínica dos mesmos rebanhos estudados, foi realizada a técnica proteômica MALDI-TOF para identificação das espécies; detecção fenotípica de resistência aos beta-lactâmicos pela difusão em disco simples de oxacilina, cefoxitina, penicilina G e amoxacilina + ácido clavulânico, ágar screen de oxacilina e microdiluição em caldo (MIC) de cefoxitina, e a detecção de genes de resistência à oxacilina de Staphylococcus spp. através da PCR para amplificação dos genes: mecA (MURAKAMI et al. 1991), mecA variante (MELO et al. 2014), mecI (LENCASTRE; OLIVEIRA 2002), mecRI (ROSATO et al. 2003), mecC (STEEGER et al. 2012) e blaZ (ROSATO et al. 2003). Foram identificadas como Staphylococcus epidermidis 47,36%, 15,78% como Staphylococcus warneri, 10,52% como Staphylococcus caprae e Staphylococcus aureus e 5,26% tanto para Staphylococcus lugdunensis, como para Staphylococcus simulans e Staphylococcus cohnii. Os isolados caracterizados pelo MALDI-TOF foram confirmados como Staphylococcus spp. pela PCR para o gene 16rRNA. O teste de difusão em disco demonstrou resistência de 58% para penicilina G e 26,31% tanto para cefoxitina como para oxacilina. Todas as amostras foram sensíveis a amoxicilina + ácido clavulânico e ao ágar screen de oxacilina. À MIC, 63,15% das amostras foram resistentes a cefoxitina, sendo que 52,63% com MIC 8,0 µg/ml e 10,52% com MIC 16 µg/ml. Duas amostras de Staphylococcus epidermidis apresentaram o gene mecA proposto por Murakami et al. (1991). Todos os isolados foram negativos para o gene mecA variante (MELO et. al, 2014), mecl, mecRI mecC e blaZ. Nenhuma amostra apresentou resíduo acima dos limites máximos permitidos. SCN foi o agente bacteriano isolado com maior frequência e a resistência antimicrobiana dessas cepas frente a ampicilina, penicilina e oxacilina, alertam para alterações do perfil de sensibilidade destes patógenos ao longo dos anos. A elevada taxa de resistência fenotípica acompanhada por uma baixa detecção genotípica nos isolados de Staphylococcus spp., pode estar relacionada a alterações nos genes desencadeadas por mutações, fagos, plasmídeos e transposons. Tais achados reforçam a importância deste grupo de microrganismos na etiologia da mastite subclínica em caprinos e abre perspectivas para futuras pesquisas para a investigação da epidemiologia da doença. A CCS não se correlaciona com os resultados do isolamento bacteriano, devendo ser avaliada com cautela em estudos sobre mastite subclínica em cabras. Esse estudo demonstra a importância e a necessidade de um monitoramento constante por parte dos órgãos responsáveis e por instituições de pesquisa quanto a qualidade e a integridade do leite de cabra que é fornecido a população.

Dairy goat is growing in recent years driven by government and private incentives. In contrast, mastitis leads is great economic losses in the dairy segment in both the quantity and quality of milk produced. A study of subclinical mastitis in nine herds of dairy goats in the state of Rio de Janeiro, totaling 140 samples of milk, in order to assess the quality of goat milk by microbiological culture and polymerase chain reaction (PCR) was performed of fresh milk for Staphylococcus aureus research, somatic cell count (SCC), total bacterial count (TBC), physico-chemical analysis, check in antimicrobial resistance profile vitro Staphylococcus spp., detection of beta-resistance genes lactam and the presence of antimicrobial residues. Bacterial growth in 64 samples (48%), of these 10 were obtained isolating two associated micro-organisms. Of the 77 isolates found, 58.4% were identified as coagulase negative Staphylococcus (CNS), 11.58% coagulase positive Staphylococcus, 14.16% negative rods gram of the Family Enterobacteriaceae (including E. coli and Serratia sp.), 6 49% Bacillus spp., Streptococcus spp 5.19%. and 3.89% Enterococcus spp. he combination of CNS and gram negative rod had the highest number with 50%, followed by 20% Staphylococcus coagulase positive + Enterococcus sp. SCN + 10% Bacillus spp., Streptococcus spp. + Bacillus spp. and Streptococcus spp. + Gram Negative Bacillus. In the disc diffusion test with 54 Staphylococcus spp., more effective antibiotic florfenicol was (1.7%) and the greatest resistance to ampicillin and penicillin were (50%), followed by oxacillin (32.70%), tetracycline (8.60%), cefoxitin (6.89%), norfloxacin (5%), gentamicin and cephalothin (3.40%). Multiple resistência to two or more antibiotics was observed in 57.40% of the isolates. No milk sample obtained positive for Staphylococcus aureus in culture and PCR. The SCC average of 2,152,000 cells/mL is above the recommended by the literature. There was no significant association between bacterial isolation and the values obtained in the SCC (Student t p> 0.05). The average TBC 842,000 CFU/ml of milk was higher than recommended by law. The physico-chemical analyzes in milk were: percentage of fat, protein and lactose infrared absorption, as well as total solids, by summing the values of the above components. The acidity by titration milk alkaline solution (0.1N NaOH), using phenolphthalein as an indicator and Dornic result expressed in degrees (°D). The determination of chloride by method mercurométrico and density at 15°C in electronics. Some herds did not meet the physical and chemical standards required by law. Acidity significant difference when associated with bacterial isolation (p <0.05). The risk (odds ratio) of bacterial detection in case of high acidity increased by 1.15 times as compared to samples with normal acidity. The contribution of all physicochemical factors TBC amounted to 41.08%, the lactose factor that contributed alone (p <0.05). In nineteen samples isolated from subclinical mastitis goat herds of the same study, proteomics technique MALDI-TOF was performed to identify the species; Phenotypic detection of resistance to beta-lactams by diffusion in simple disk oxacillin, cefoxitin, penicillin G and amoxicillin plus clavulanic acid, agar "screen" oxacillin and microdilution (MIC) of cefoxitin, and detection of resistance genes oxacillin of Staphylococcus spp. by PCR amplification of genes: mecA (MURAKAMI et al 1991.), mecA variant (MELO et al 2014.) mecI (LANCASTEr; OLIVEIRA 2002), mecRI (ROSATO et al., 2003), mecC (STEEGER et al. 2012) and blaZ (ROSATO et al. 2003). They were identified as Staphylococcus epidermidis 47.36% 15.78% as Staphylococcus warneri, Staphylococcus caprae as 10.52% and 5.26% Staphylococcus aureus and Staphylococcus lugdunensis so as Staphylococcus simulans and Staphylococcus cohnii. Isolates characterized by MALDI-TOF were confirmed as Staphylococcus spp. by PCR for 16S rRNA gene. The disk diffusion test demonstrated resistance to penicillin G, 58% and 26.31% for both the cefoxitin and for oxacillin. All strains were susceptible to amoxicillin + clavulanic acid and agar "screen" oxacillin. The MIC, 63.15% of the samples were resistant to cefoxitin, and 52.63% with MIC 8.0 g / ml and 10.52% with MIC 16 mg / ml. Two samples of Staphylococcus epidermidis mecA gene had proposed by Murakami et al. (1991). All isolates were negative for the mecA gene variant (MELO et al., 2014), mecl, mecRI mecC and blaZ. No samples showed residue above the maximum allowable limits. CNS was isolated bacterial agent with greater frequency and antimicrobial resistance across these strains to ampicillin, penicillin and oxacillin, warn sensitivity profile of these pathogens changes over the years. The high phenotypic resistance rate accompanied by a low genotypic detection in Staphylococcus spp., may be related to alterations in gene triggered by mutation, phage, plasmids and transposons. These findings reinforce the importance of this group of microorganisms in the etiology of subclinical mastitis in goats and opens perspectives for future research to investigate the epidemiology of the disease. The SCC is not correlated with the results of bacteriological isolation, and must be carefully evaluated in studies of subclinical mastitis in goats. This study demonstrates the importance and the need for constant monitoring by the responsible agencies and research institutions and the quality and integrity of goat milk that the population is provided.

DETECÇÃO DE GENES CODIFICADORES DE ENTEROTOXINAS E RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS FENOTÍPICA E GENOTÍPICA, mesA E vanA E EXPRESSÃO GÊNICA EM ESTAFILOCOCOS SCP E SCN ISOLADOS DE MASTITE BOVINA

Foram estudados 300 estafilococos isolados de casos de mastite bovina de diferentes propriedades do estado de São Paulo: 150 Staphylococcus coagulase positiva (SCP) e 150 Staphylococcus coagulase negativa (SCN). A presença de genes para produção de enterotoxinas foi detectada pela Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) e a expressão gênica pela PCR transcriptase reversa (RT-PCR). Os isolados foram submetidos ao perfil de sensibilidade correlacionada com a detecção dos genes mecA e vanA, pela técnica de PCR. Os 150 SCN isolados foram identificados como sendo: 48 (32%) S. warneri, 22(15%) S. epidermidis, 20(13%) S. hyicus, 10(7%) S. xylosus, 7(5%) S. haemolyticus, 6(4%) S. simulans, 6(4%) S. schleiferi subsp schleiferi, 6(4%) S. hominis, 5(3%) S. pasteuri, 4(2,7%) S. cohnii, 3(2%) S. saprophyticus subsp. saprophyticus 3(2%) S. chromogenes 3(2%) S. sciuri, 2(1%) S. saccharolyticus, 2(1%) S. lugdunensi, 1(0,7%) S. auriculares, 1(0,7%) S. saprophyticus subsp. bovis e 1(0,7%) S. capitis. Entre os SCP foram isolados: 105 (70%) S. aureus, 21(14%), S. hyicus, 19(13%), S. intermedius e 5(3%) S. schleiferi subsp coagulans. A concordância entre a identificação fenotípica e genotípica do total de linhagens de SCN e SCP foi de 96,7% e 98,7%, respectivamente. Foram detectados genes codificadores para enterotoxinas clássicas (sea, seb, sec, sed) e outras enterotoxinas (see, seg, seh, sei, sej, sek, sel, sem, sen, seo, sep, seq) em 175 (58%) dos 300 Staphylococcus spp. pesquisados. Estes genes foram detectados em 109 (73%) dos SCN isolados, resultado significantemente maior que entre SCP 66 (44%), P<0,0001. Entre os 109 SCN foram detectados genes codificadores de enterotoxinas nas seguintes espécies: 37(33,9%) S. warneri, 17(15,6%) S. epidermidis, 16(14,7%) S. hyicus, 5(4,6%) S. xylosus, 5(4,6%) S. haemolyticus, 4(3,7%) S. simulans, 4(3,7%) S. schleiferi subsp schleiferi, 4(3,7%) S. homini, 4(3,7%) S. pasteuri, 3(2,7%) S. saprophyticus subsp. saprophyticus, 3(2,7%) S. cohnii, 3(2,7%) S. chromogenes, 2(1,8%) S. sciuri, 1(0,9%) S. lugdunensis e 1(0,9%) S. capitis. Nos 66 SCP estes genes foram encontrados nas seguintes espécies: 48 (73 %) S. aureus, 10(15%) S. hyicus, 7(11%) S. intermedius e 2(3%) S. schleiferi subsp coagulans. As espécies S. aureus e S. warneri foram as que mais apresentaram genes codificadores de enterotoxinas. Entre os genes codificadores de enterotoxinas clássicas sea foi predominante entre os isolados: 61 SCN (56%) e 29 SCP (44%). Entre SCN a presença dos seguintes genes codificadores de enterotoxina foi observada: sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sem, sen, seo. Entre SCP foram evidenciados: sea, seb, sec, sed, see, seg, sen, sei, sem, sen, seo. Foi detectada tanto a presença de apenas um destes genes como de outros concomitantemente. Verificou-se simultaneamente em um isolado de S. warneri cinco diferentes genes (sec,sed,sem,sen,seo) e em outro isolado de S. aureus cinco genes (see, seg, sem, sen, seo). Nos SCP a principal resistência foi observada aos betalactâmicos, à penicilina em 54 (36 %) isolados, à ampicilina em 51 (34%), à oxacilina 25 (16,7%) enquanto nos foi obesrvada SCN resitência à penicilina em 37 (24,7%), à ampicilina 34 (22,7%) e à oxacilina 20 (13,3%) dos isolados. O gene mecA foi detectado em 17(11%) SCN isolados, em 44(29%) nos SCP, somente em S. aureus. A resistência dos isolados de origem bovina à oxacilina, antibiótico de primeira escolha na terapia de infecções estafilocócicas em humanos, é preocupante em saúde pública e, quando há insucesso no tratamento, a vancomicina é o antibiótico preconizado. O gene vanA, que codifica a resistência à vancomicina não foi detectado nos isolados avaliados. A avaliação da concentração inibitória mínima (CIM), pelo E-test não demonstrou resistência à vancomicina entre os isolados. Entretanto foi verificada resistência intermediária a este antimicrobiano. O presente estudo contribuiu para evidenciar o potencial risco à segurança alimentar dos consumidores do leite e derivados ao avaliar fatores de virulência e resistência em SCP e SCN isolados da mastite bovina.

A total of 300 isolates of bovine mastitis cases from several Brazilian dairy herds were studied, respectively: 150 CPS and 150 CNS strains. The isolates were analyzed to enterotoxins codifying genes by Polymerase Chain Reaction (PCR). Gene expression was evaluated by reverse transcription PCR (RT-PCR). The isolates were subjected to sensitivity profile correlated with the detection of mecA and vanA gene by PCR. Among the CNS the following species were identified: 48 (32%) S. warneri, 22(15%) S. epidermidis, 20(13%) S. hyicus, 10(7%) S. xylosus, 7(5%) S. haemolyticus, 6(4%) S. simulans, 6(4%) S. schleiferi subsp schleiferi, 6(4%) S. hominis, 5(3%) S. pasteuri, 4(2.7%) S. cohnii, 3(2%) S. saprophyticus subsp. saprophyticus 3(2%) S. chromogenes 3(2%) S. sciuri, 2(1%) S. saccharolyticus, 2(1%) S. lugdunensi, 1(0,7%) S. auriculares, 1(70%) S. saprophyticus subsp. bovis and 1(0.7%) S. capitis. Among the 150 CPS: 105 (70%) S. aureus, 21(14%), S. hyicus, 19(13%), S. intermedius and 5(3%) S. schleiferi subsp coagulans. The identification by phenotypic and genotypic tests showed a concordance of 96.7% in the CNS isolates, and 98.7% in the CPS. The codifying genes to enterotoxins production were detected to classical and enterotoxin-like in 175 (58%) out of 300 staphylococci isolates. These genes were detected significantly higher among the CNS (73%) in relation to CPS (44%), P<0.0001. In 109 CNS codifying genes to enterotoxins were detected in the following species: 37(33.9%) S. warneri, 17(15.6%) S. epidermidis, 16(14.7%) S. hyicus, 5(4.6%) S. xylosus, 5(4.6%) S. haemolyticus, 4(3.7%) S. simulans, 4(3.7%) S. schleiferi subsp schleiferi, 4(3.7%) S. homini, 4(3.7%) S. pasteuri, 3(2.7%) S. saprophyticus subsp. saprophyticus, 3(2.7%) S. cohnii, 3(2.7%) S. chromogenes, 2(1.8%) S. sciuri, 1(0.9%) S. lugdunensis and 1(0.9%) S. capitis. Among the 66 CPS, the enterotoxin genes were observed in the following species: 48(73 %) S. aureus, 10(15%) S. hyicus, 7(11%) S. intermedius and 2(3%) S. schleiferi subsp coagulans. The species S. aureus and S. warneri showed the highest presence of these genes whereas it was not detected statistical difference. The major enterotoxin codifying gene observed was sea 61(56%) in the CNS and 29 (44%) in the CPS. In the CNS the presence of the following enterotoxin genes were verified: sea, seb,sec, sed, see,seg,seh, sem, sen, seo. This genes were found alone. as well as, concomitantly with others enterotoxin codifying genes. In the CPS the presence of the following enterotoxin genes were observed: sea, seb, sec, sed, see, seg, sen, sei, sem, sen, seo. In one S. warneri isolate were detected five different genes (sec, sed, sem, sen, seo) and, another S. aureus isolate showed concomitantly five genes (see, seg, sem, sen, seo). The main xv antimicrobial resistance observed in the CPS were toward the betalactamics: penicilin 54 (36%); ampicillin 51(34%); oxacillin 25 (16.7%). Also, among the CNS were toward the betalactamics: penicillin 37(24.7%), ampicillin 34(22.7%), and oxacillin 20(13.3%). The gene mecA was detected in 17(11%) SCN isolates and among the SCP 44(29%), it were verified only in S.aureus isolates. The resistance os strains to oxacillin, is a Public Health concern, since this antimicrobial is first choice to human therapy in the staphylococcical infection cases. The vancomycin is the second choice to human therapy. The gene vanA, that codify vancomycin resistance was researched among the isolates, whereas it was not detected. The E-test vancomycin MIC did not showed vancomycin resistance, nevertheless, the intermediate resistance were observed in some isolates. The main contribution of the present study was the detection of virulence factors among CPS and CNS isolates from mastitis cases, emphasizing the potential risk to the consumers of milk and dairies.

Contagem de Células Somáticas e isolamento bacteriano em leite de ovelhas no Estado do Rio Grande do Sul - Brasil

A mastite um dos grandes problemas relacionados com criação de ovinos de leite devido às perdas econômicas decorrentes da redução na produção, gastos com medicamento e perdas de animais. A Contagem de Células Somáticas (CCS) e o isolamento bacteriano são ferramentas diagnósticas indicativas da saúde da glândula mamária que pode ser determinada através de método automatizado e por método manual, através de contagem celular em microscópio, sobre o qual existem discussões quanto à coloração adequada ao leite de ovelhas devido a celularidade diferenciada nesta espécie. Esta tese compreende três estudos que visam realizar o diagnóstico de mastite subclínica em ovelhas leiteiras do Estado Rio Grande do Sul Brasil em um total de 315 amostras de leite oriundos de casos desta enfermidade em ovelhas de leite. [Capítulo 2] Foram utilizadas 116 amostras com o objetivo de identificar e validar uma metodologia de CCS microscópica adequada à espécie ovina. Assim foram confeccionadas lâminas de esfregaços de 10 µL de leite em 1 cm 2 , onde foram testados os fixadores de xilol e solução de Carnoy e as colorações de May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wrigth (W) e Panótico (P). Elegeu-se a solução de Carnoy, pois esta permitiu uma melhor fixação do filme lácteo às lâminas de microscopia, e o corante BP, pois permitiu uma boa coloração e visualização das células, bem como a diferenciação dos corpúsculos citoplasmáticos. Os valores de CCS variaram de 2,6x10 4 a 4,4x10 6 células.mL -1 e de 1,9x10 4 a 8,1x10 6 células.mL -1 , respectivamente, pelos métodos automático e microscópico. [Capítulo 3] O objetivo do presente capítulo foi determinar a ocorrência de mastite subclínica em rebanho ovino leiteiro, através do isolamento bacteriano e da CCS. Determinou -se, ainda, a composição (gordura, lactose, proteína e sólidos totais) do leite e a relação entre estes parâmetros e a presença de mastite. Para tanto, coletaram-se 315 amostras de leite, individualizadas por teto, das quais 85 (27%) foram identificadas como mastite subclínica, sendo Staphylococcus coagulase negativos o agente prevalente (64,7%), seguido por Staphylococcus coagulase positivas (19,1%). A CCS variou de 2,5x10 3 a 9,3x10 6 . Verificou-se CCS significativamente maior (p<0,0001) nas amostras com isolamento bacteriano. Entretanto, o mesmo não foi observado entre os parâmetros de composição. Não foi determinada correlação entre os parâmetros de composição e a CCS. [Capítulo 4] Este capítulo teve como objetivos identificar as espécies de SCN em 32 isolados de casos de mastite subclínica em ovinos, através da técnica de PCR -RFLP e sequenciamento do gene gap, e determinar a suscetibilidade dos isolados frente a nove agentes antimicrobianos, pela técnica de disco difusão em ágar. Foram obtidos quatro perfis no sequenciamento, sendo observada a presença de três espécies de SCN: Staphylococcus epidermidis (59,4%), Staphylococcus chromogenes (34,4%) e Staphylococcus devriesei (6,2%), pela primeira vez descrita na região Sul do país em casos de mastite ovina. Todos os isolados foram suscetíveis a cefalotina, ceftiofur e penicilina+novobiocina. Vinte e um isolados (65,6%) apresentaram resistência a pelo menos um agente antimicrobiano e onze isolados (34,4%) mostraram-se suscetíveis a todos os agentes testados. Quatro isolados (12,5%) apresentaram multirresistência e, entre estes, um isolado da espécie S. epidermidis apresentou resistência à oxacilina, confirmada através da amplificação do gene mecA por PCR. Os estudos permitem concluir que os 13 SCN são os agentes etiológicos mais prevalentes relacionados com mastite subclínica em ovelhas leiteiras e sua presença tem correlação com CCS elevada . A determinação da CCS através de método manual demonstra que esta é uma ferramenta aplicável à espécie ovina. Além de se constituir em problema de sanidade animal, a mastite ovina, tem como consequência perdas econômicas ao produtor, SCN possuem potencial zoonótico, destacando a importância destes micro-organismos na saúde pública, tornando primordial a identificação destes agentes, através de ferramentas genotípicas seguras e confiáveis. 1

The mastitis is one of the major problems related to breeding of milk sheep due to the economic losses arising from the reduction in production, expenditure on medication and loss of animals. The Somatic Cell Count (SCC) and bacterial isolation are diagnos tic tools indicative of mammary glands health that can be determined by automated method and manual method, through the counting of cell under a microscope, whereupon there are discussions concerning the appropriated staining to the ewes milk due to different cellularity in this species. This thesis comprises three studies that aim to make the diagnosis of subclinical mastitis in dairy sheep in Rio Grande do Sul - Brazil in a total of 315 milk samples originated from cases of this disease in dairy sheep. [Chapter 2] It were used 116 samples to identify and validate a method for microscopic SCC suitable for ovine specie. Therefore, were made glass slides for smear of 10 µL of milk in 1 cm2, where were tested xylol fixers and Carnoy solution and May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wright (W) and Panotic (P) dyes. Carnoy solution was elected, because this one allowed a better fixation of the milk film to the microscope slides, and BP staining as it allowed a good staining and visualization of cells and the differentiation of cytoplasmic corpuscles. The SCC values ranged from 2,6x104 to 4,4x106 cells.mL-1 and 1,9x104 to 8,1x106 cells.mL-1, respectively by automatic and microscopic methods. [Chapter 3] The purpose of this chapter was to determine the occurrence of subclinical mastitis in dairy sheep flock, by bacterial isolation and SCC. It was determined also the composition (fat, lactose, protein and total solids) of milk and the relationship between these parameters and the presence of mastitis. In order to do that, were collected 315 milk samples, individualized by teat, of which 85 (27%) were identified as subclinical mastitis and Staphylococcus coagulase negative (SCN) was the prevalent agent (64.7%), followed by Staphylococcus coagulase positive (SCP) (19. 1%). The SCC ranged from 2,5x103 to 9,3x106. There was significant higher SCC (p <0.0001) in samples with bacterial isolation. However, the same was not observed between the composition parameters. There was no correlation between the composition parameters and SCC. [Chapter 4] This chapter aims to identify the species of CNS in 32 isolated from cases of subclinical mastitis in sheep by PCR-RFLP and sequencing of the gap gene and determine the susceptibility of isolates face to nine antimicrobials, by disk agar diffusion technique. Four profiles were obtained in sequencing, revealing the presence of three species of SCN: Staphylococcus epidermidis (59.4%), Staphylococcus chromogenes (34.4%) and Staphylococcus devriesei (6.2%), first described in the south region of the country in cases of sheep mastitis. All isolates were susceptible to cephalothin, ceftiofur and penicillin + novobiocin. Twenty-one isolates (65.6%) showed resistance to at least one antimicrobial agent and eleven isolates (34.4%) were susceptible to all tested agents. Four isolates (12.5%) had multidrug resistance and, among these, an isolated of S. epidermidis was resistant to oxacillin, confirmed by amplifying the mecA gene by PCR. The studies support the conclusion that the SCN are the most prevalent etiologic agents related to subclinical mastitis in dairy sheep and their presence correlates with high SCC. The determination of SCC through manual method demonstrates that this tool is applicable to the ovine species. Besides being an animal health problem, the sheep mastitis results in a 15 a economic losses to producers, SCN have zoonotic potential, highlighting the importance of these microorganisms in public health, making it crucial t o identify these agents through secure and reliable genotypic tools. 2

Investigação da microbiota gastroentérica e desenvolvimento de IgY para fins diagnósticos em ema (Rhea americana)

IgG anti-IgY de ema (Rhea americana) foi produzida em caprino e coelho para uso como imunoferramenta diagnóstica para a espécie. A IgY de ema se mostrou mais imunogênica para o caprino que para os coelhos. Foi observado por ELISA alta especificidade desses anticorpos para a espécie estudada, sendo o antiema produzido em coelhos mais específica para fins diagnósticos na espécie. IgY de gema de ovos de ema foi isolada por precipitação por sulfato de amônia a 29% e purificação em coluna de afinidade, pelo que foi possível observar as cadeias leves e pesada da imunoglublina com aproximadamente 30 kDa e 70 kDa, respectivamente. Proteína recombinante anti-flagelina de fase dois de Salmonella enterica sv. Enteritidis PT4 (recFljB) foi eficientemente obtida utilizando as construções plasmídeal pGEX-fljB em Escherichia coli DH5 e BL21(DE3) e utilizada para imunizar emas e galinhas. A IgY específica anti-recFljB foi obtida da gema de ovos dessas aves com alto rendimento (4,82 mg/mL para galinhas e 11,68 mg/mL para emas). IgY anti-recFljB obtidas de ovos de emas e galinhas diminuiu a capacidade de aderência e invasão das cepas S. Enteritidis PT4 e Salmonella entérica sv.Typhimurium em células CACO-2 e HT-29, respectivamente. IgY anti-recFljB de emas e galinhas também foi capaz de inibir o crescimento dessas bactéria em meio líquido (BHI 0,3M de NaCl). Foram isolados 203 microrganismos de 63 emas de cativeiro clinicamente saudáveis provenientes de três criatórios diferentes entre 2012 e 2014. Sendo 132 bactérias Gram-negativas, potencialmente patogênicas e resistentes fenotipicamente a antibióticos da microbiota oral e cloacal das emas (E. coli, Escherichia fergusonii, Edwardsiella spp., Yersínia spp., Enterobacter spp., Francisella spp., Proteus mirabilis, Citrobacter spp., Klebsiella spp., Bordetella avium, Pseudomonas spp.e Acinetobacter spp.). Por PCR identificou-se 11,6% de cepas de E. coli entropatogênicas (EPEC). Genes de resistência a antibióticos -lactâmicos foram identificados em E. coli (22,1% blaCTX-M, 26,7% de blaSHV e 14% blaTEM) e em Klebsiella spp. (100% de blaSHV e 14,3% blaTEM). Foram isoladas 71 bactérias Gram-positivas, potencialmente patogênicas, e com resistência a antimicrobianos, da microbiota oral e cloacal das emas: Staphylococcus spp. coagulase negativa (SCN), Enterococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium spp., e Micrococcus spp. Por PCR identificou-se a presença do gene mecA em 44.4% dos SCN e das enterotoxinas SEA (66,7%) e SEB(8,3%) nas cepas SCN. A identificação da microbiota das emas pode auxiliar na prevenção de diferentes patologias, assim como fornecer dados para estudos da epidemiologia das bactérias. Os resultados deste estudo também podem ser utilizados para a criação de novas estratégias de profilaxia de doenças, como por exemplo, a utilização e imunoglobulinas aviárias específicas. Ainda foi discutido o fato das emas abrigarem bactérias resistentes a antibióticos e produtoras de enterotoxinas e, por isso, serem veículo de disseminação dessas linhagens de microrganismos. Nesse sentido, o presente estudo pode contribuir para o fornecimento de novas informações sobre a associação de microrganismos potencialmente patogênicos em Rhea americana, além de demonstrar a necessidade da realização de novas pesquisas focadas nas diferentes temáticas levantadas e no monitoramento de microrganismos em aves silvestres e de cativeiro.

IgG anti-IgY from greater rhea (Rhea americana) was produced in goat and rabbit, for use as a immunodiagnostic tool for the specie, and greater rhea's IgY was more immunogenic for the goat than for rabbits. ELISA assays show high specificity of these antibodies for this species, and the anti-greater rhea produced in rabbits were more specific for diagnostic purposes in the species. IgY greater rhea egg yolk was isolated by precipitation by ammonium sulfate at 29% and purification was performed by affinity column where it was possible to observe light and heavy chains of immunoglobulin approximately 30 kDa and 70 kDa, respectively. Recombinant Protein anti-flagellin of phase two of Salmonella enterica sv.Enteritidis PT4 (recFljB) was efficiently obtained using the constructions plasmideal pGEX-fljB in E. coli DH5 and BL21 (DE3) and used to immunize rheas and hens and a IgY specific anti-recFljB was obtained from egg yolk of these birds with high yield (4.82 mg/mL for hens and 11.68 mg/mL for rheas). IgYanti-recFljB obtained from eggs of rheas and hens decreased the adhesion and invasion of the strains S. enteritidis PT4 and Salmonella enterica sv.Typhimurium in CACO-2 and HT-29 cells, respectively. IgYanti-recFljB from rheas and hens was also able to inhibit the growth of these bacteria in liquid medium (BHI 0.3M NaCl). 203 microorganisms were isolated from 63 clinically healthy rheas kept in captivity from three different CEMAS, between 2012 and 2014. 132 bacteria were Gram-negative, potentially pathogenic and phenotypically resistant to antibiotics, from oral and cloacal microbiota of rheas (E. coli, Escherichia fergusonii, Edwardsiella spp., Yersinia spp. , Enterobacter spp., Francisella spp., Proteus mirabilis, Citrobacter spp., Klebsiella spp., Bordetella avium, Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp.). 11.6% of strains of enteropathogenic. E. coli (EPEC) was identified by PCR. Beta lactam antibiotic resistance genes were identified in E. coli (22.1% blaCTX-M, 26.7% of blaSHV and 14% blaTEM) and Klebsiella spp. (100% of blaSHV and 14.3% blaTEM). 71 Gram-positive bacteria were isolated from the oral and cloacal microbiota of rheas, all of them potentially pathogenic and with resistance to antimicrobials: coagulase negative Staphylococcus (CNS), Enterococcus spp. , Streptococcus spp. , Corynebacterium spp. , and Micrococcus spp. The presence of the mecA gene was confirmed by PCR in 44.4 % of CNS and enterotoxins SEA (66.7 %) and SEB (8.3 %) were confirmed in CNS strains. The identification of the microbiota of rheas can help in the prevention of various diseases, as well as provide data for epidemiological studies of bacteria. The results of this study may also be used for the creation of new strategies for prophylaxis diseases, such as the use and avian specific immunoglobulins. The fact that greater rheas may shelter antibiotic-resistant and enterotoxin producing bacteria has also been discussed and therefore they would act as a dissemination vehicle of these strains of microorganisms. In this sense, the present study may contribute to the provision of new information on the association of potentially pathogenic microorganisms in Rhea americana, as well as to demonstrate the need for further research focused on different themes raised and monitoring microrganisms in wild birds and in captivity.

Perfil de sensibilidade microbiana, pesquisa de gene mecA de resistência à meticilina e detecção molecular de genes codificadores de enterotoxinas, em espécies de estafilococos coagulase positiva e negativa, isolados de mastites bovinas

Alguns dos agentes patogênicos de mastite bovina são relevantes em relação à qualidade do leite, bem como, para a saúde pública. Foram estudadas dez fazendas localizadas em cinco regiões do estado de São Paulo. Foram examinadas 1.148 vacas, correspondentes a 4.592 glândulas mamárias avaliadas pelos testes de tamis e CMT. Foram colhidas 1.318 amostras de leite, das vacas positivas na triagem para avaliação microbiológica e contagem de células somáticas (CCS). A frequência dos agentes variou de 0,3 a 36,4%. Do total de isolados de Staphylococcus spp (36,4%), 48,7% corresponderam a estafilococos coagulase negativa (SCN), 34,2% S. aureus e 15,9% outros estafilococos coagulase positiva (SCP). Streptococcus spp foram isolados de 23,3% das amostras, dos quais 41,7% Streptococcus. agalactiae, 41,1% Streptococcus dysgalactiae e 17,3% Streptococcus uberis. Corynebacterium spp. foram isolados em 31,8% dos casos de mastite. As amostras de leite das glândulas mamárias infectadas apresentaram CCS significativamente mais elevada que as negativas. Dos 48,7% de SCN foram identificadas 18 espécies: S. warneri, S. epidermidis, S. hyicus, S. xylosus, S. haemolyticus, S. auriculares, S. cohnii subsp cohnii, S. lugdunensis, S. pasteuri, S. saccharolyticus, S. saprophyticus subsp bovis, S. schleiferi subsp scheleiferi, S. simulans, S. saccharolyticus, S. capitis, S. saprophyticus subsp saprophyticus, S. sciuri subsp sciuri e S. chromogenes. As fazendas, II (27,3%) e III (26,7%) apresentaram maior frequência de SCN, enquanto as fazendas I (13,3%) e X (44,4%) revelaram maior prevalência de SCP sendo as diferenças significantes. Foram avaliados por PCR 263 estafilococos para detecção de gene codificadores das enterotoxinas clássicas. Entre os SCN foram detectados: sea (35,5%) seb (7,1%), sec (6,5%), sed (1,8%) e associações destes genes. Em SCP foram detectados: sea (9,5%) seb (4,4%)...

The purpose of this study was to assess the occurrence of mastitis cases in ten Brazilian dairy herds located in five regions in São Paulo state, to characterize the main etiological agents and, to proceed staphylococcal isolates identification to species level, to perform detection by PCR assays of enterotoxin encoded genes aiming the awareness of their potential capability in producing the classical enterotoxins and, mecA a methicilin resistance gene and, evaluated resistance toward antimicrobials. A total of 4,592 mammary glands of 1,148 dairy cows were examined by strip cup and CMT. From these 1,318 milk samples were collected for microbiological exams. It was isolated 263 (19.9%) staphylococci from mastitis cases and they were identified, as being: S.aureus (34.2%), other CPS (15.9%) respectively, S. intermedius (15.2%), S.hyicus(12.9%) and, S. schleiferi subsp coagulans(3.8%), and CNS (48.7%). Among these 128 CNS isolates eighteen species were identified: S. xylosus, S. haemolyticus, S. auriculares; S. cohnii subsp cohnii, S. lugdunensis, S. pasteuri, S. saccharolyticus, S. saprophyticus subsp bovis, S. schleiferi subsp scheleiferi, S. simulans, S. capitis, S. saprophyticus subsp saprophyticus, S. sciuri subsp sciuri and, S. chromogenes. The more frequently isolated species were: S.warneri (31.3%), S. epidermidis (14.8%) and S.hyicus (12.5%). The milk samples from infected mammary glands showed higher CCS than the negatives. PCR assay was used to determine the presence of classical enterotoxin codifying genes (sea, seb, sec and sed). Among CNS the occurrence of enterotoxin classical genes was determined as: 35.1% for sea, 7.1% for seb, 6.5% for sec, 1.8% for sed) 5.3% for both sea and seb, 3.6% for both sea, sec and sed, 1.8% for both sec and sed. Whereas among CPS isolates the occurrence of enterotoxin...

Species identification, slime production and oxacillin susceptibility in coagulase-negative staphylococci isolated from nosocomial specimens

Ninety-two coagulase negative staphylococci (CNS) (forty-five of clinical origin and forty-seven of environmental origin), collected in a hospital in San Luis, Argentina, from March to June, 1999, were identified to species level by the ID 32 Staph and API Staph System (bioMérieux). Slime production was investigated by the quantitative and qualitative methods. Oxacillin susceptibility was determined by the disk diffusion test (1 µg), the agar dilution method (0.125 to 4 mg/ml) and agar screen (6 µg/ml). The presence of mecA gene was investigated by PCR. The clinical CNS species most commonly isolated were S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis and S. saprophyticus. The frequency of slime production by clinical and environmental isolates was similar (25/45 and 27/47, respectively) and the results obtained by the quantitative and the qualitative methods correlated well. The mecA gene was detected in all S. epidermidis, S. haemolyticus and S. hominis isolates, which were resistant to oxacillin by the phenotypic methods. However, this gene was not present in S. klossii, S. equorum, S. xylosus and S. capitis strains. The gene was neither found in two out of the six S. saprophyticus isolates, in two out of three S. cohnii subsp. urealyticum isolates and in two out of five S. cohnii subsp. cohnii isolates, all of which resulted oxacillin resistant according to MIC. The gene was not found in oxacillin-susceptible strains either. Most of the CNS isolates (enviromental and clinical) that were slime producers were found to be oxacillin resistant, which makes the early detection of these microorganisms necessary to prevent their dissemination in hospitals, particularly among immunocompromised patients.

Noventa e duas amostras de Staphylococcus coagulase negativo (SCN), (45 amostras clínicas e 47 ambientais), coletadas em um hospital de San Luis, Argentina, durante o período de março a junho de 1999, foram identificadas até espécies, empregando-se os sistemas ID 32 Staph e API Staph (bioMérieux). A produção de "slime" foi investigada através de métodos quantitativo e qualitativo. A susceptibilidade à oxacilina foi determinada por métodos de difusão em discos (1 µg), diluição em ágar (0,125 a 4 mg/ml) e ágar screen (6 µg/ml). A presença do gene mecA foi pesquisada por PCR. As espécies de SCN de origem clínica mais comumente isoladas foram S. epidermidis, S.saprophyticus, S.hominis e S.haemolyticus. Observou-se uma freqüência similar na produção de "slime" nas amostras de origem clínica e ambiental (25/45 e 27/47, respectivamente), tendo havido concordância nos resultados obtidos pelos métodos quantitativo e qualitativo. O gene mecA foi observado em todas as cepas de S. epidermidis, S. haemolyticus e S. hominis que foram resistentes a oxacilina pelos métodos fenotípicos, mas não foi detectado em S. klossii, S. equorum, S. xylosus e S. capitis. O gene também não foi detectado em duas das seis amostras de S.saprophyticus, duas das três S. conhii subsp. urealyticum e duas das cinco S. conhii subsp. conhii, as quais resultaram resistentes à oxacilina segundo a CIM. Esse gene não foi encontrado nas cepas sensíveis à oxacilina. A maioria das amostras de SCN (ambientais e clínicas) que foram produtoras de slime foram resistentes à oxacilina, o que obriga a uma detecção precisa desses microorganismos e ao controle de sua disseminação em hospitais, particularmente entre pacientes imunocomprometidos.

Análise de variabilidade genética em populações segregantes de soja

A variabilidade entre progênies é criada pela segregação cromossômica independente dos genes e pela recombinação genética intracromossomal durante a meiose. O objetivo deste estudo foi analisar a variabilidade derivada de crossing-overs em cruzamentos biparentais (G2 e J2), quádruplos (G4 e J4) e óctuplos (G8 e J8), avaliados em populações segregantes derivadas de parentais contrastantes para resistência ao nematóide de cisto da soja (raça 3) ? NCS ? e ao oídio - O. A análise foi realizada em populações F2, através de marcadores SSR (single sequence repeat) concentrados em uma região de 55 cM ao redor do gene rmd (resistência ao oídio) e rhg1 (resistência ao NCS). Após o teste dos marcadores, quanto ao polimorfismo, apenas marcadores polimórficos foram utilizados para detectar crossing-over. Todos os marcadores analisados foram não significativos pelo teste de qui-quadrado (P > 0,05), indicando que os valores observados se ajustam à proporção genotípica esperada em F2 (1:2:1). As maiores médias de crossing-over por genótipo foram obtidas para G4 (4,00), no grupo G, e J8 (2,91), no grupo J. Por outro lado, as maiores médias de crossing-over considerando o número de gerações para formar cada população, foram para G2 (2,02) e J8 (0,97). A recombinação entre alelos ocorreu em algumas populações, entretanto para G4 e J8 em 1,89% dos genótipos não ocorreram. Em geral, nos cruzamentos com maior número de parentais envolvidos a ocorrência de crossingover foi maior, sendo satisfatórios na criação de variabilidade. O progresso no melhoramento de soja tem sido alcançado em partes pela criação de novas combinações alélicas dentro dos cromossomos

The variability among the progenies is created by chromosome segregation, independent assortment of genes, and intra-chromosomal genetic recombination during meiosis. The objective of this study was to analyze the variability derived from crossovers in soybean biparental (G2 and J2), quadruple (G4 and J4) and octuple (G8 and J8) crosses, measured in segregant population derived from contrasting parental regarding their resistance to cist nematode (race 3) ? SCN and powdery mildew ? PM. The analyses were made in F2 population through SSR (single sequence repeat) markers located in a 55CM region around Rmd (powdery mildew) and Rhg1 (cist nematode) resistance genes. After screening makers for their polymorphism, only polymorphic markers were used to detect crossovers. All markers were not significant by chi-square test (P > 0.05), showing that observed values corroborates to genotypic inheritance ratio expected in F2 population (1:2:1). Thus, the higher average of crossovers for some populations were observed for G4 (4.00), at linkage group G and J8 (2.91), at linkage group J. On the other hand, the higher average of crossovers considering the generation number to form each population, was found for G2 (2.02) and J8 (0.97). The recombination between alleles occurred in some populations, however, to G4 and J8, in 1.89% of the genotypes not showing crossover. In general, the crosses with larger numbers of parents showed higher number of crossovers, being very satisfactory for the creation of genetic variability. Soybean breeding progress has been accomplished in part by creating on new within_chromossome allele combinations