Infuence of heat stress on in vitro oocyte and embryo production in high-yielding Holstein cows / Influência do estresse calórico na produção in vitro de oócitos e embriões de vacas Holandesas de alta produtividade

The objective of this study was to evaluate the influence of thermal shock on oocytes used in the production of in vitro embryos (IVP) of high productivity Holstein cows on the day of follicular aspiration (OPU; 0), 30, 60 and 90 days before the OPU. From the mean temperature on day 0 and on the previous 30, 60 and 90 days, they were classifed into comfort group (TC; up to 15°C) and heat stress (HS; above 15°C) groups.Anegative influence was observed on oocytes and viable embryos (total and grade I). The heat stress in the periods of 30 and 60 days prior to OPU resulted in lower production of viable oocytes (P=0.0028; P=0.0092, respectively). Under stress, on the day of OPU (HS-OPU), cows showed no reduction in the amount of viable oocytes (P=0.5497) and there was no influence of temperature for the group stressed 90 days before OPU (P=0.8287). For total embryos, the difference occurred only in the HS-30 group (P=0.0317), where the groups HS-OPU, HS-60, HS-90 presented, respectively, P=0. 1987, P=0.0596 and P=0.4580. Regarding the production of embryos of grade 1, there was no difference for the groups HS-OPU (P=0.2291) and HS-90 (P=0.2868), but there was a reduction for HS-30 (P=0.0143) and HS-60 (P=0.0253). In summary, heat stress had a negative impact when it occurred 30 or 60 days before follicular aspiration. In addition, 30 days seems to be the period of more susceptibility and that causes the greatest deleterious effects on oocyte viability and IVP.(AU)

Objetivou-se avaliar a infuência do estresse térmico em oócitos utilizados na produção in vitro de embriões (PIV) bovinos da raça Holandesa de alta produtividade no dia da aspiração folicular (OPU; 0), 30, 60 e 90 dias antes da OPU. A partir da temperatura média no dia 0 e aos 30, 60 e 90 dias anteriores, foram classificados nos grupos conforto (CT; até 15°C) e estresse por calor (ET -acima de 15°C). Observou-se infuência negativa em oócitos e embriões viáveis (total e grau I). A submissão ao estresse térmico nos períodos de 30 e 60 dias anteriores à OPU resultou em menor produção de oócitos viáveis (P=0,0028; P=0,0092, respectivamente). Sob estresse, no dia da OPU (ET-OPU), as vacas não apresentaram redução na quantidade de oócitos viáveis (P=0,5497) e não houve infuência da temperatura para o grupo estressado 90 dias antes da OPU (P=0,8287). Para embriões totais, a diferença ocorreu apenas no grupo ET-30 (P=0,0317), onde os grupos ET-OPU, ET-60, ET-90 apresentaram, respectivamente, P=0,1987, P=0,0596 e P=0,4580. Em relação à produção de embriões grau 1, não houve diferença para os grupos ET-OPU (P=0,2291) e ET-90 (P=0,2868), porém houve redução para ET-30 (P=0,0143) e ET- 60 (P=0,0253). Em resumo, o estresse por calor teve impacto negativo quando ocorreu 30 ou 60 dias antes da aspiração folicular. Além disso, 30 dias parece ser o período de maior suscetibilidade e que causa os maiores efeitos deletérios na viabilidade oocitária e na PIV.(AU)

Use of melatonin in the in vitro production of bovine embryos / Uso da melatonina na produção in vitro de embriões bovinos

We aimed to assess the effects of melatonin in the in vitro production of bovine embryos. Our experiment was conducted at the Laboratório de Reprodução Animal of the Universidade Estadual do Maranhão. The cumulus-oocyte complexes (COCs) were distributed among treatments at concentrations of 0, 10-1, 10-3 and 10-5 µMol/L melatonin. Our experiment was further divided into two: the first was to assess the effect of different concentrations of melatonin (treatments) on the maturation rate of COCs, and the second was to assess the effects of melatonin treatments on the in vitro production of bovine embryos. The results from the first experiment demonstrated no significant difference between the in vitro maturation rate of the cultivated COCs in treatments with melatonin. In the second experiment, however, melatonin treatments yielded statistically higher cleavage, morula and blastocyst rates in the 10-5 µM group (52.9%, 52.9%, and 35.3%, respectively), and lower rates in the 10-1 µM group (19.5%, 19.5% and 7.8%, respectively), compared to the others. The control group (no melatonin) and the 10-3 µM group showed similar results. We concluded that supplementation of melatonin in the in vitro maturation medium resulted in no improvement in the oocyte maturation rate, but in the in vitro production of embryos at different concentrations, the 10-5 µM group displayed better results, but with no improvement in the variables (P < 0.05).(AU)

Objetivou-se avaliar os efeitos da melatonina na produção in vitro de embriões bovinos. O experimento foi conduzido no Laboratório de Reprodução Animal da Universidade Estadual do Maranhão. Os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram distribuídos entre os tratamentos 0, 10-1, 10-3 e 10-5 µmol/L de melatonina. A avaliação foi dividida em dois experimentos, onde o primeiro avaliou o efeito dessas diferentes concentrações de melatonina (tratamentos) sobre a taxa de maturação dos CCOs e o segundo, o efeito desses tratamentos com melatonina sobre a produção in vitro de embriões bovinos. Os resultados no primeiro experimento demonstraram não haver diferença significativa na taxa de maturação in vitro dos CCOs cultivados no tratamento com melatonina. No entanto, o tratamento com melatonina no segundo experimento, as taxas de clivagens, mórulas e blastocistos, o grupo 10-5 µM foi estatisticamente superior (52,9%, 52,9% e 35,3%, respectivamente) e o grupo 10-1 µM inferior (19,5%, 19,5% e 7,8%, respectivamente) aos outros grupos. O grupo controle (sem melatonina) e o grupo 10-3 µM obtiveram resultados semelhantes. Concluiu-se que a suplementação da melatonina no meio de maturação in vitro não evidenciou melhoras na taxa de maturação dos oócitos, porém na produção in vitro de embriões em diferentes concentrações, o grupo 10-5 µM apresentou melhores resultados mesmo não havendo melhorias nas variáveis (P<0,05).(AU)

Use of melatonin in the in vitro production of bovine embryos / Uso da melatonina na produção in vitro de embriões bovinos

We aimed to assess the effects of melatonin in the in vitro production of bovine embryos. Our experiment was conducted at the Laboratório de Reprodução Animal of the Universidade Estadual do Maranhão. The cumulus-oocyte complexes (COCs) were distributed among treatments at concentrations of 0, 10-1, 10-3 and 10-5 µMol/L melatonin. Our experiment was further divided into two: the first was to assess the effect of different concentrations of melatonin (treatments) on the maturation rate of COCs, and the second was to assess the effects of melatonin treatments on the in vitro production of bovine embryos. The results from the first experiment demonstrated no significant difference between the in vitro maturation rate of the cultivated COCs in treatments with melatonin. In the second experiment, however, melatonin treatments yielded statistically higher cleavage, morula and blastocyst rates in the 10-5 µM group (52.9%, 52.9%, and 35.3%, respectively), and lower rates in the 10-1 µM group (19.5%, 19.5% and 7.8%, respectively), compared to the others. The control group (no melatonin) and the 10-3 µM group showed similar results. We concluded that supplementation of melatonin in the in vitro maturation medium resulted in no improvement in the oocyte maturation rate, but in the in vitro production of embryos at different concentrations, the 10-5 µM group displayed better results, but with no improvement in the variables (P < 0.05).

Objetivou-se avaliar os efeitos da melatonina na produção in vitro de embriões bovinos. O experimento foi conduzido no Laboratório de Reprodução Animal da Universidade Estadual do Maranhão. Os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram distribuídos entre os tratamentos 0, 10-1, 10-3 e 10-5 µmol/L de melatonina. A avaliação foi dividida em dois experimentos, onde o primeiro avaliou o efeito dessas diferentes concentrações de melatonina (tratamentos) sobre a taxa de maturação dos CCOs e o segundo, o efeito desses tratamentos com melatonina sobre a produção in vitro de embriões bovinos. Os resultados no primeiro experimento demonstraram não haver diferença significativa na taxa de maturação in vitro dos CCOs cultivados no tratamento com melatonina. No entanto, o tratamento com melatonina no segundo experimento, as taxas de clivagens, mórulas e blastocistos, o grupo 10-5 µM foi estatisticamente superior (52,9%, 52,9% e 35,3%, respectivamente) e o grupo 10-1 µM inferior (19,5%, 19,5% e 7,8%, respectivamente) aos outros grupos. O grupo controle (sem melatonina) e o grupo 10-3 µM obtiveram resultados semelhantes. Concluiu-se que a suplementação da melatonina no meio de maturação in vitro não evidenciou melhoras na taxa de maturação dos oócitos, porém na produção in vitro de embriões em diferentes concentrações, o grupo 10-5 µM apresentou melhores resultados mesmo não havendo melhorias nas variáveis (P<0,05).

Substituição parcial do soro fetal bovino durante cultivo in vitro reduz a concentração de fosfolipídios em embriões bovinos produzidos in vitro / Partial replacement of fetal bovine serum during in vitro culture decreases phospholipid content in in vitro produced bovine embryos

Soro fetal bovino (SFB) e albumina sérica bovina (BSA) são componentes importantes do cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos, porém são frequentemente associados ao acúmulo excessivo de lipídios, podendo prejudicar o desenvolvimento embrionário. Este estudo teve como objetivo substituir parcialmente o SFB por BSA V FAF durante o CIV de embriões bovinos, avaliar a produção embrionária e quantificar os lipídios dos embriões, SFB e dos meios de cultivo. Para isto, os embriões desenvolveram em meios de cultivo suplementados com 10% de SFB (SFB10%) ou 5% de SFB e 0.03g de BSA V FAF (SFB5%/BSA). O conteúdo lipídico foi avaliado por UHPLC-MS/MS. A análise estatística foi feita utilizando teste t e ANOVA. A substituição parcial de SFB por BSA V FAF não alterou a produção embrionária. Nos dois grupos foram identificados 10 fosfolipídios e três deles, DOPC (p=0,037), POPG (p=0,046) e C24: 1-SM (p=0,009), apresentaram menores concentrações no meio SFB5%/BSA. Os fosfolipídios identificados nos embriões coincidem com os encontrados no SFB e meios de cultivo e quatro deles DOPC (p=0,013), DPPC (p=0,004), POPG (p=0,05) e C24:1-SM (p=0,003) diminuíram a concentração com a redução do SFB. A substituição parcial do SFB diminui a concentração de fosfolipídios sem prejudicar a produção embrionária, sugerindo uma melhora nas técnicas relacionadas ao cultivo in vitro.(AU)

Fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) are important components during bovine embryo in vitro culture (IVC), but they are associated with excess of embryonic lipid, which might impair embryo development. This study aimed to partially replace FBS by BSA V FAF during bovine IVC, evaluate embryo production and quantify the phospholipid content in produced embryos, SFB and IVC medium. The embryos were in vitro cultured in medium supplied with 10% of FBS (FBS10%) or with 5% of FBS plus 0.03 g BSA V FAF (FBS5%/BSA). The lipid content was evaluated using UHPLC-MS/MS and statistical analysis was performed using t-test and ANOVA. The partial replacement of FBS by BSA V FAF did not alter embryo production. Ten phospholipids were identified in both groups and three of them, DOPC (p=0.037), POPG (p=0.046) and C24: 1-SM (p=0.009) presented lower concentration in FBS5%/BSA culture medium. The phospholipids identified on embryos matches with those found on SFB and culture medium and four of them DOPC (p=0.013), DPPC (p=0.004), POPG (p=0.05) and C24:1- SM (p=0.003) reduced its concentration when FBS was reduced. Theses founds shown that the FBS partial replacement reduces phospholipids content in embryos but do not decrease embryo production, suggesting a technical improvement.(AU)

Substituição parcial do soro fetal bovino durante cultivo in vitro reduz a concentração de fosfolipídios em embriões bovinos produzidos in vitro / Partial replacement of fetal bovine serum during in vitro culture decreases phospholipid content in in vitro produced bovine embryos

Soro fetal bovino (SFB) e albumina sérica bovina (BSA) são componentes importantes do cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos, porém são frequentemente associados ao acúmulo excessivo de lipídios, podendo prejudicar o desenvolvimento embrionário. Este estudo teve como objetivo substituir parcialmente o SFB por BSA V FAF durante o CIV de embriões bovinos, avaliar a produção embrionária e quantificar os lipídios dos embriões, SFB e dos meios de cultivo. Para isto, os embriões desenvolveram em meios de cultivo suplementados com 10% de SFB (SFB10%) ou 5% de SFB e 0.03g de BSA V FAF (SFB5%/BSA). O conteúdo lipídico foi avaliado por UHPLC-MS/MS. A análise estatística foi feita utilizando teste t e ANOVA. A substituição parcial de SFB por BSA V FAF não alterou a produção embrionária. Nos dois grupos foram identificados 10 fosfolipídios e três deles, DOPC (p=0,037), POPG (p=0,046) e C24: 1-SM (p=0,009), apresentaram menores concentrações no meio SFB5%/BSA. Os fosfolipídios identificados nos embriões coincidem com os encontrados no SFB e meios de cultivo e quatro deles DOPC (p=0,013), DPPC (p=0,004), POPG (p=0,05) e C24:1-SM (p=0,003) diminuíram a concentração com a redução do SFB. A substituição parcial do SFB diminui a concentração de fosfolipídios sem prejudicar a produção embrionária, sugerindo uma melhora nas técnicas relacionadas ao cultivo in vitro.

Fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) are important components during bovine embryo in vitro culture (IVC), but they are associated with excess of embryonic lipid, which might impair embryo development. This study aimed to partially replace FBS by BSA V FAF during bovine IVC, evaluate embryo production and quantify the phospholipid content in produced embryos, SFB and IVC medium. The embryos were in vitro cultured in medium supplied with 10% of FBS (FBS10%) or with 5% of FBS plus 0.03 g BSA V FAF (FBS5%/BSA). The lipid content was evaluated using UHPLC-MS/MS and statistical analysis was performed using t-test and ANOVA. The partial replacement of FBS by BSA V FAF did not alter embryo production. Ten phospholipids were identified in both groups and three of them, DOPC (p=0.037), POPG (p=0.046) and C24: 1-SM (p=0.009) presented lower concentration in FBS5%/BSA culture medium. The phospholipids identified on embryos matches with those found on SFB and culture medium and four of them DOPC (p=0.013), DPPC (p=0.004), POPG (p=0.05) and C24:1- SM (p=0.003) reduced its concentration when FBS was reduced. Theses founds shown that the FBS partial replacement reduces phospholipids content in embryos but do not decrease embryo production, suggesting a technical improvement.

Use of a colloid to optimize centrifugation in the selection of bovine sperm for IVF / Uso de um coloide para otimizar a centrifugação na seleção de espermatozoides bovinos para FIV

This study aimed to evaluate the effect of the force and duration of centrifugation and the impact of cushioned centrifugation on sperm selection by Percoll gradient, on sperm quality and development kinetics of in vitro produced bovine embryos. Two experiments were performed. In Experiment I, a pool of semen was selected by Percoll gradients and the pellet was divided into four groups and distributed in a 2 × 2 factorial, with two forces (2200 × g or 9000 × g) and two durations (1 min or 3 min) of centrifugation. In Experiment II, semen was divided into two groups and selected by Percoll gradient with Cushion Fluid (CF) or without CF (Control) in the second centrifugation. The morphofunctionality, biochemical characteristics and fertilizing capacity of the selected sperms were evaluated. In addition, the development of the resulting bovine embryos was monitored for 48 h post-insemination. Duncan and Chi-square tests (P < 0.05) were used to compare the means. In Experiment I, there was a significant increase in sperm vigor (P < 0.05) after sperm selection in all treatments. The force and duration of centrifugation did not have any effect on sperm motility, vigor, and recovery rate among the different treatments (P > 0.05). In Experiment II, the recovery rate and reactive oxygen species (ROS) production in semen were similar among treatments (P > 0.05) although a higher ROS production was observed in the CF fertilization medium. Total fertilization rate was superior in the CF group (65.4 ± 5.3%) compared to that in Control (39.6 ± 4.9%). However, the normal fertilization and cleavage rate did not differ between the Control (94 ± 6.3% and 58.3 ± 8.3%) and CF (89 ± 7.1% and 75.0 ± 7.3%) groups. The reduction in the force and duration of centrifugation did not decrease the sperm recovery during selection by the Percoll gradient and the use of CF in the second centrifugation did not affect the normal fertilization and development of bovine IVF embryos up to 48 h.(AU)

Esse estudo objetivou avaliar o efeito da força e duração da centrifugação, e o impacto da centrifugação amortecida na seleção espermática por gradientes de Percoll, na qualidade espermática e cinética do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro. Dois experimentos foram realizados. No experimento I, um pool de sêmen foi selecionado por gradientes de Percoll e o pellet dividido em quatro grupos e distribuído em um fatorial 2 x 2, com duas forças (2200 e 9000 X g) e dois tempos (1 e 3 min) de centrifugação. No Experimento II, o sêmen foi dividido em dois grupos e selecionado com (CF) ou sem CushionFluid (Controle) na segunda centrifugação. A morfofuncionalidade, características bioquímicas e capacidade fecundante dos espermatozoides selecionados foram avaliadas. Além disso, o desenvolvimento dos embriões bovinos resultantes foi monitorado por 48 horas pós-inseminação. Os testes Duncan e Qui-quadrado (P<0,05) foram usados para comparar as médias. No Experimento I, houve um aumento significativo no vigor após a seleção espermática para todos os tratamentos. A força e a duração da centrifugação não tiveram nenhum efeito na motilidade, vigor e recuperação espermática entre os diferentes tratamentos (P > 0.05). No Experimento II, a taxa de recuperação e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) no sêmen foram similares entre os tratamentos (P>0,05), embora a maior produção de EROs foi observada no meio de fecundação do grupo CF. A taxa de fecundação total, foi superior no grupo CF (65.4±5.3%) comparada com o Controle (39.6±4.9%). Entretanto a fecundação normal e a taxa de clivagem não diferiram entre os grupos Controle (94±6.3% e 58.3±8.3%) e CF (89±7.1% and 75.0±7.3%). A redução na força e duração da centrifugação não diminuiu a recuperação espermática durante a seleção por gradientes de Percoll e o uso de CF na segunda centrifugação não influenciou a fecundação normal e o desenvolvimento de embriões bovinos PIV até 48 horas.(AU)

Change in energy metabolism of in vitro produced embryos: an alternative to make them more cryoresistant? / Alteração no metabolismo energético de embriões produzidos in vitro: uma alternativa para torná-los mais criotolerantes?

For the development of in vitro produced (IVP) as well as in vivo produced bovine embryos, it is extremely important that their energy metabolism works properly because the embryo must be able to metabolize energy substrates that are necessary for producing energy. Lipids play an important role in early embryonic development, acting as source of energy for oocytes and embryos. However, it is known that oocytes and embryos, mainly IVP, accumulate large amounts of lipids in the cytoplasm. Although they are extremely important in embryonic development, lipids have been associated with the reduced survival of bovine embryos following cryopreservation. There is evidence that at least four different categories of lipids affect embryo survival after cryopreservation, including triglycerides (TAG), free fatty acids, cholesterol and phospholipids. Thus, many studies are being conducted to improve the resistance of IVP embryos to the cryopreservation process by reducing the concentration or removing the source of serum from the medium or by reducing oocyte/embryo lipids using mechanical or chemical means. Regarding the use of delipidating agents that reduce the uptake and synthesis of fatty acids (FA) by cells, substances such as phenazine ethosulfate (PES), forskolin, L-carnitine and isomers of conjugated linoleic acid (CLA) have been utilized. This review aims to address important issues related to embryonic energy metabolism, the importance of lipid metabolism and its relation tothe cryopreservation of IVP bovine embryos by summarizing the latest research in this field.(AU)

Para o desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) e in vivo, é extremamente importante que o metabolismo energético funcione de maneira adequada, pois o embrião precisa ser capaz de metabolizar os substratos energéticos necessários para a produção de energia. Os lipídios desempenham papel importante no desenvolvimento embrionário inicial, atuando como fonte de energia para oócitos e embriões. Entretanto, sabe-se que oócitos e embriões bovinos, principalmente os PIV, acumulam grande quantidade de lipídios no citoplasma. Apesar de serem extremamente importantes no desenvolvimento embrionário, os lipídios têm sido associados com a reduzida sobrevivência após a criopreservação de embriões bovinos. Existem evidências de que pelo menos quatro classes de lipídios afetam a sobrevivência embrionária pós-criopreservação, sendo os triglicerídeos (TAG), ácidos graxos livres, colesterol e os fosfolipídios. Sendo assim, vários estudos estão sendo realizados com o intuito de melhorar a resistência dos embriões PIV ao processo de criopreservação, realizando a redução ou retirada do soro do meio ou a redução mecânica ou química de lipídios. Com relação ao uso de agentes delipidantes que diminuam a captação e síntese de ácidos graxos (AG) pelas células, substâncias como fenazina etossulfato (PES), forskolin, L-carnitina e isômeros do ácido linoleico conjugado (CLA) tem sido utilizadas. O objetivo desta revisão foi abordar aspectos importantes relacionados ao metabolismoenergético embrionário, a importância dos lipídios no metabolismo e sua relação com a criopreservaçãode embriões bovinos PIV sumarizando os estudos mais recentes nessa área.(AU)

Produção in vitro (PIV) de embriões em bovinos / In vitro embryo production in cattle

A produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotécnica importante para exploração do potencialgenético de fêmeas bovinas e tem sido utilizada em escala comercial no Brasil e no mundo. A PIV envolve asetapas de coleta, maturação, fecundação e cultivo in vitro sendo que a eficiência das etapas de maturação efecundação in vitro não difere daquela obtida in vivo. No entanto, o cultivo in vitro continua sendo a etapa queapresenta a menor eficiência sendo que, em média, apenas 30% dos oócitos maturados in vitro se desenvolvemao estádio de blastocisto. Adicionalmente, os blastocistos produzidos in vitro diferem daqueles produzidos invivo, apresentando menores taxas de prenhez e sendo menos tolerantes à criopreservação. Portanto, o objetivo destarevisão é realizar uma abordagem atualizada das principais etapas da produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

The in vitro embryo production (IVP) is a major tool for exploration of the genetic potential of cowsand has been used in commercial scale in Brazil and worldwide. The IVP technique involves the steps ofcollecting, maturation, fertilization and in vitro culture and the efficiency of the steps of maturation andfertilization in vitro does not differ from that obtained in vivo. However, the in vitro culture continues to be thestep that has the lowest efficiency and, on average, only 30% of in vitro matured oocytes develop to blastocyststage. In addition, in vitro produced blastocysts differ from those produced in vivo, with lower pregnancy ratesand are less tolerant to cryopreservation. Therefore, the aim of this review is to perform an updated approach tothe main steps of in vitro production of bovine embryos.(AU)

Produção in vitro (PIV) de embriões em bovinos / In vitro embryo production in cattle

A produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotécnica importante para exploração do potencialgenético de fêmeas bovinas e tem sido utilizada em escala comercial no Brasil e no mundo. A PIV envolve asetapas de coleta, maturação, fecundação e cultivo in vitro sendo que a eficiência das etapas de maturação efecundação in vitro não difere daquela obtida in vivo. No entanto, o cultivo in vitro continua sendo a etapa queapresenta a menor eficiência sendo que, em média, apenas 30% dos oócitos maturados in vitro se desenvolvemao estádio de blastocisto. Adicionalmente, os blastocistos produzidos in vitro diferem daqueles produzidos invivo, apresentando menores taxas de prenhez e sendo menos tolerantes à criopreservação. Portanto, o objetivo destarevisão é realizar uma abordagem atualizada das principais etapas da produção in vitro de embriões bovinos.

The in vitro embryo production (IVP) is a major tool for exploration of the genetic potential of cowsand has been used in commercial scale in Brazil and worldwide. The IVP technique involves the steps ofcollecting, maturation, fertilization and in vitro culture and the efficiency of the steps of maturation andfertilization in vitro does not differ from that obtained in vivo. However, the in vitro culture continues to be thestep that has the lowest efficiency and, on average, only 30% of in vitro matured oocytes develop to blastocyststage. In addition, in vitro produced blastocysts differ from those produced in vivo, with lower pregnancy ratesand are less tolerant to cryopreservation. Therefore, the aim of this review is to perform an updated approach tothe main steps of in vitro production of bovine embryos.

Efeitos da suplementação com anetol durante a MIV e CIV na maturação oocitária e na produção e qualidade de embriões bovinos

A produção in vitro de embriões (PIV) vem apresentando um crescimento significativo, representando 73,7% dos embriões produzidos mundialmente em 2019. Apesar de sua viabilidade comercial, a PIV necessita de aprimoramento para expandir ainda mais seu potencial. Desta forma, o aumento nas taxas de produção e qualidade embrionária proporcionaria ganhos substanciais na pecuária. Objetivou-se avaliar o efeito do anetol na MIV, nas doses de 300 e 3000µg/mL (Experimento 1) e avaliar o efeito do anetol na MIV e/ou CIV, na dose de 300µg/mL, na produção e qualidade de embriões bovinos (Experimento 2). Foram coletados ovários provenientes de frigoríficos utilizados nos dois experimentos. Folículos de 2 a 8mm foram puncionados e submetidos à maturação com meio maturação in vitro (MIV) suplementado com SFB 10%. No experimento 1, foram divididos em 3 grupos experimentais, sendo o Grupo Controle composto por (meio base); Grupo M300 (meio base suplementado com 300 µg/ml de anetol) e Grupo M3000 (3000 µg/ml). Após a MIV, a maturação nuclear foi avaliada por meio da técnica de análise da configuração da cromatina para obtenção dos resultados de metáfase II. No experimento 2, a MIV foi realizada com meio base (Grupo Controle) ou suplementado com (300 µg/ml de anetol). Posteriormente, os oócitos foram submetidos à fecundação in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV), sendo divididos em 04 grupos: Grupo Controle M0-C0 maturados e cultivados em meio sem adição de anetol, Grupo M0-C300 maturados sem anetol e cultivados em meio com 300 µg/ml, Grupo M300-C0 µg/ml maturados com 300 µg/ml de anetol e cultivados sem anetol e o Grupo M300-C300 com meio contendo 300 µg/ml de anetol na maturação e no cultivo. No 3º dia do cultivo (D3), após a FIV foi avaliado a clivagem, no 7º dia após a FIV (D7), foi avaliado a produção de blastocistos e no 8º dia (D8) foi avaliado e classificado os blastocistos por meio de analise morfológica em estereomicroscópico. Como análise estatística foi utilizado a análise de variância, com on way ANOVA, utilizando o software GraphPad Prism versão 6.0 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA), e testes de Tukey (dados paramétricos). Observou-se que 300 µg/mL de anetol no meio MIV não promoveu diferença nas taxas de MII quando comparado ao grupo controle. Entretanto, a adição de 3000 µg/mL de anetol reduziu significativamente a porcentagem de CCOs que chegaram à metáfase II em relação aos demais grupos (P0,05). Em relação ao índice de clivagem, observamos que a adição de 300 µg/ml de anetol durante a MIV e a CIV aumentou a porcentagem de embriões clivados quando comparado aos demais grupos experimentais (P 0,05). Entretanto, nenhuma diferença foi encontrada entre os grupos quanto a produção embrionária, avaliada pela taxa de formação de blastocistos no D8 (P>0,05), nem sobre a qualidade embrionária, obtida por meio da contagem do número total de células embrionárias (P>0,05). Apesar das evidencias dos efeitos antioxidantes do anetol, encontradas na literatura, neste estudo o teste de TBARS realizado no meio de produção de embriões não apresentou significância estatística. Os genes SOD 1, CAT e GST relacionados a resistência ao estresse oxidativo, apresentaram aumento em sua abundancia nas células da granulosa quando foi utilizado o anetol. Alem disso, os genes COX2 e HAS também se apresentaram elevados, ressaltando o efeito benéfico do anetol sobre o metabolismo das CCs. Os embriões produzidos com ócitos maturados em presença de anetol também apresentaram elevação de transcritos do gene GPX1 que está envolvido na metabolização do peróxido de hidrogenio. A elevação da abundancia destes transcritos demonstra a contribuição do anetol para a neutralização do efeito das EROS. Por outro lado, apesar do alto número de embriões produzido no grupo maturado e cultivado com anetol, os genes IFNT2 e HASPA1A se encontravam diminuídos. Conclui se que a adição de 300 µg/mL de anetol durante a MIV e a CIV melhora a clivagem embrionária sem comprometer o desenvolvimento posterior do blastocisto.

INTRODUCTION: In vitro embryo production (IVP) has shown significant rise, reaching 68.7% of the embryos produced worldwide in 2018. Despite its commercial viability, IVP needs improvement to further expand its potential. Thus, livestock would benefit with substantial gains from increased production rates and embryo quality. OBJECTIVE: The objective was to evaluate the effect of anethole on in vitro maturation (IVM) at doses of 300 µg/mL and 3,000 µg/mL (Experiment 1) and to evaluate the effect of anethole on IVM and/or in vitro culture (IVC) at a dose of 300 µg/mL on the production and quality of bovine embryos (Experiment 2). MATERIAL AND METHODS: A total of 700 oocytes from ovaries from slaughterhouses were collected to be used in the two experiments. The 2 to 8 mm follicles were punctured and submitted to maturation with IVM medium supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS). In Experiment 1, a total of 300 oocytes were used and divided into 3 experimental groups: the Control Group, composed of basal medium; Group M300 (basal medium supplemented with 300 µg/ml anethole); and Group M3000 (basal medium supplemented with 3,000 µg/ml). After IVM, nuclear maturation was evaluated using chromatin configuration analysis technique to obtain the results of metaphase II (MII) with the best concentration, which was used in Experiment 2. In Experiment 2, IVM was performed either with basal medium only (Control Group) or with supplementation (Group M300 300 µg/ml anethole). Subsequently, 400 oocytes were subjected to in vitro fertilization (IVF) and IVC, and then divided into four groups: Control Group M0-C0: matured and cultivated in medium without addition of anethole; Group M0-C300: matured without anethole and cultivated in medium with 300 µg/ml anethole; Group M300-C0: matured with 300 µg/ml anethole and cultivated without anethole; and Group M300-C300: matured and cultivated in medium containing 300 µg/ml anethole. On the 3rd day of culture (D3), cleavage was evaluated after IVF; on the 7th day after IVF (D7), blastocyst production was evaluated; and on the 8th day (D8), blastocysts were evaluated and classified through morphological analysis in a stereomicroscope. Statistical analysis was carried out by using the one-way analysis of variance (one-way ANOVA), as well as Tukey tests for parametric data. RESULTS: When 300 µg/mL anethole were added to the MIV medium, there was no difference in MII rates in comparison to the control group. However, the addition of 3,000 µg/mL anethole significantly reduced the percentage of cumulus-oocyte complex (COC) that reached MII in relation to the other groups (P 0.05). Regarding the cleavage index, the addition of 300 µg/ml anethole during IVM and IVC was observed to increase the percentage of cleaved embryos when compared to the other experimental groups (P 0.05). Nevertheless, no difference was found between the groups regarding embryo production, which was assessed by blastocyst formation rate on D8 (P > 0.05), nor related to embryo quality, which was obtained by counting the total number of embryonic cells (P > 0.05). In spite of the evidence of antioxidant effects of anethole pointed out in the literature, the TBARS test performed in this study in the embryo production medium did not show any statistical significance. The SOD1, CAT, and GST genes related to resistance to oxidative stress presented increased abundance in granulosa cells when anethole was used. In addition, the COX2 and HAS genes were also elevated, highlighting the beneficial effect of anethole on the metabolism of COCs. Similar to in embryos produced with cells matured in the presence of anethole, a rise was detected in transcripts of the GPX1 gene, which is involved in the metabolization of hydrogen peroxide. The increased abundance of these transcripts demonstrates the role of anethole in neutralizing the effect of ROS. On the other hand, regardless of the large number of embryos produced in the group matured and cultivated with anethole, the IFNT2 and HASPA1A genes were decreased. CONCLUSION: The addition of 300 µg/mL anethole during IVM and IVC improves embryonic cleavage without compromising blastocyst development.

Pre-incubation of porcine semen reduces the incidence of polyspermy on embryos derived from low quality oocytes / Pré-incubação dos espermatozoides suínos diminui polispermia e aumenta a produção embrionária em oócitos de baixa qualidade

The main cause of low efficiency of in vitro produced porcine embryos is the high polyspermic penetration rates at fertilization, which is aggravated in low quality oocytes. Experiment 1 evaluated the embryo development in high and low quality oocytes. Experiment 2 evaluated the embryo development and quality of low quality oocytes fertilized with sperm pre-incubated during 0h (control), 0.5h, 1h and 1.5h. Experiment 3 investigated fertilization and monospermic rates of the same groups of Experiment 2. Experiment 4 evaluated embryo development, cell density, fertilization and monospermic rates of high quality oocytes using semen pre incubated during the best time observed in the previous experiments. Cleavage and blastocyst rates were analyzed by chi-square test, and remaining data by ANOVA and Tukey test (P0.05). The cleavage (74.8 vs 51.7%) and blastocyst (33.7 vs 9.8%) rates were greater in oocytes of high versus low quality, with no differences in cell density. Fertilization rates (65.6 to 79.5%) were not influenced by pre-incubation time. However, semen pre-incubation during 1.5h increased monospermic penetration (53.3%) and cleavage rates (92.5%) in low quality oocytes. Blastocyst rate was improved with 1.5h of semen pre incubation; however they were still lower than that observed with high quality control oocytes. Ultimately, pre-incubation did not influence fertilization, monospermic penetration, embryo development rates, nor cell density in oocytes of high quality. Low-quality porcine oocytes resulted in better rates of embryo development if in vitro fertilized with sperm pre-incubated for 1.5 hour.(AU)

A principal causa da baixa eficiência na PIV de embriões suínos é a elevada taxa de polispermia, que é exacerbada em oócitos de baixa qualidade. O experimento 1 avaliou o desenvolvimento embrionário de oócitos de baixa e alta qualidade. O experimento 2 avaliou a qualidade e o desenvolvimento embrionário de oócitos de baixa qualidade fecundados com sêmen pré-incubado por 0h (controle), 0,5h, 1h e 1,5h. O experimento 3 investigou a fecundação e as taxas de monospermia dos mesmos grupos do experimento 2. O experimento 4 avaliou o desenvolvimento embrionário, a densidade celular, a fecundação e as taxas de monospermia de oócitos de alta qualidade, fecundados com sêmen pre-incubado com o melhor tempo observado nos experimentos anteriores. As taxas de clivagem e de blastocistos foram submetidas ao teste de Qui-quadrado e os demais dados submetidos à ANOVA e teste de Tukey (P0,05). As taxas de clivagem (74,8 vs 51,7%) e de blastocistos (33,7 vs 9,8%) foram superiores nos oócitos de alta qualidade, comparados aos de baixa qualidade, não havendo diferenças na quantidade de células embrionárias. As taxas de fecundação (65,6 vs 79,5%) não foram influenciadas pelo tempo de pré-incubação. Todavia, a pré-incubação do sêmen por 1,5h aumentou a penetração monospérmica (53,3%) e a taxa de clivagem (92,5%), nos oócitos de baixa qualidade. As taxas de blastocisto aumentaram com sêmen pré-incubado por 1,5h, que foram ainda inferiores às obtidas dos oócitos de alta qualidade do grupo controle. Finalmente, a pré-incubação do sêmen não influencia na fecundação, na penetração monospérmica, no desenvolvimento embrionário, nem na quantidade de células embrionárias com oócitos de alta qualidade. Oócitos suínos de baixa qualidade produzem melhores taxas de desenvolvimento embrionário se fecundados in vitro com sêmen pré-incubado por 1,5 horas.(AU)

Produção in vitro de embriões bovinos oriundos de fêmeas previamente tratadas com somatotropina recombinante bovina (rbST) / In vitro production of bovine embryos derived from females previously treated with recombinant bovine somatotropin (rbST)

This study aimed to evaluate the effect of rbST on in vitro production of Girolanda female embryos.Ovum Pick-Up (OPU) was performed to obtain the cumulus-oocyte complexes (COCs) were subjected to thePIV. Pretreatment of rbST in cows Girolando did not influence the embryo development rate in vitro production.(AU)

Produção in vitro de embriões bovinos oriundos de fêmeas previamente tratadas com somatotropina recombinante bovina (rbST) / In vitro production of bovine embryos derived from females previously treated with recombinant bovine somatotropin (rbST)

This study aimed to evaluate the effect of rbST on in vitro production of Girolanda female embryos.Ovum Pick-Up (OPU) was performed to obtain the cumulus-oocyte complexes (COCs) were subjected to thePIV. Pretreatment of rbST in cows Girolando did not influence the embryo development rate in vitro production.

Hydrallantois in Jersey cow: case report / Hidroalantóide em vaca Jersey: relato de caso

Hydrallantois is an uncommon gestational disease caused by abnormal accumulation of fluid in one compartments of the placenta, whose incidence has increased in cattle with the diffusion of modern reproduction techniques like in vitro embryo production (IVP) and cloning. Since it still remains the difficulty of early diagnosis and treatment to preserve the life of the female and allow a rapid return to uterine and ovarian conditions prior to the pregnancy, this report aims to describe its occurrence in a Jersey cow contributing to the study of its puerperal and surgical treatment.

Hidroalantóide é uma patologia gestacional incomum causada pelo acúmulo anormal de fluido em um dos compartimentos da placenta, cuja incidência tem aumentado em bovinos com a difusão de modernas técnicas de reprodução como produção in vitro de embriões (PIV) e clonagem. Visto que ainda hoje persiste a dificuldade de um diagnóstico precoce e de tratamentos que preservem a vida da fêmea e permitam um rápido retorno às condições uterinas e ovarianas anteriores à prenhez, o presente relato tem por objetivo descrever sua ocorrência em uma vaca Jersey contribuindo para o estudo de seu tratamento cirúrgico e puerperal.

Hydrallantois in Jersey cow: case report / Hidroalantóide em vaca Jersey: relato de caso

Hydrallantois is an uncommon gestational disease caused by abnormal accumulation of fluid in one compartments of the placenta, whose incidence has increased in cattle with the diffusion of modern reproduction techniques like in vitro embryo production (IVP) and cloning. Since it still remains the difficulty of early diagnosis and treatment to preserve the life of the female and allow a rapid return to uterine and ovarian conditions prior to the pregnancy, this report aims to describe its occurrence in a Jersey cow contributing to the study of its puerperal and surgical treatment.(AU)

Hidroalantóide é uma patologia gestacional incomum causada pelo acúmulo anormal de fluido em um dos compartimentos da placenta, cuja incidência tem aumentado em bovinos com a difusão de modernas técnicas de reprodução como produção in vitro de embriões (PIV) e clonagem. Visto que ainda hoje persiste a dificuldade de um diagnóstico precoce e de tratamentos que preservem a vida da fêmea e permitam um rápido retorno às condições uterinas e ovarianas anteriores à prenhez, o presente relato tem por objetivo descrever sua ocorrência em uma vaca Jersey contribuindo para o estudo de seu tratamento cirúrgico e puerperal.(AU)

EFEITO DA ANGIOTENSINA (1-7) NA MATURAÇÃO E EMBRIÕES IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS

A produção in vitro (PIV) está inclusa na terceira geração das tecnologias de reprodução assistida e consiste na interação entre o espermatozoide e o oócito fora do trato reprodutivo da fêmea, com a formação de um novo indivíduo. Entretanto vários fatores intraovarianos que regulam as etapas de desenvolvimento, maturação folicular e ovulação são ainda desconhecidos e podem ser responsáveis por alguns insucessos de tais biotécnicas. Os peptídeos do Sistema Renina-Angiotensina, tais como a angiotensina (1-7), que já tiveram sua presença, produção e alguns efeitos descritos nos ovários) mas que apresentam ainda funções pouco esclarecidas. Novas perspectivas sobre os fatores que influenciam a qualidade dos embriões produzidos e os mecanismos envolvidos na maturação a partir da adição de diferentes concentrações de Angiotensina (1-7) na PIV da espécie bovina. Folículos ovarianos foram aspirados e os CCOs foram distribuídos entre quatro tratamentos: Controle (C), 10-1 (T1), 10-3 (T2), 10-5 M (T3) de angiotensina (1-7) no meio de maturação in vitro para verificar os estágios de meiose e desenvolvimento embrionário. A adição do peptídeo angiotensina (1-7) no meio de maturação in vitro não proporcionou taxas superiores de metáfase II em relação ao grupo Controle. No desenvolvimento embrionário, a angiotensina (1-7) não melhorou a clivagem nem a quantidade de embriões totais, o grupo 10-1µM proporcionou quantitativo superior de blastocistos iniciais. No entanto, mais análises são necessárias para elucidar as ações realizadas pela angiotensina (1-7) na produção in vitro de embriões bovinos.

In vitro production (IVP) is included in the third generation of assisted reproduction technologies and consists of the interaction between sperm and oocyte outside the female reproductive tract, with the formation of a new individual. However, several intraovarian factors that regulate the stages of development, follicular maturation and ovulation are still unknown and may be responsible for some failures of such biotechniques. Renin-Angiotensin System peptides, such as angiotensin (1-7), which have had their presence, production and some effects described in the ovaries) but still have poorly understood functions. New perspectives on the factors that influence the quality of the embryos produced and the mechanisms involved in the maturation from the addition of different angiotensin (1-7) concentrations in the bovine IVP. Ovarian follicles were aspirated and the COCs were distributed among four treatments: Control (C), 10-1 (T1), 10-3 (T2), 10-5 M (T3) angiotensin (1-7) in the maturation medium. in vitro to verify the stages of meiosis and embryonic development. The addition of angiotensin peptide (1-7) in the in vitro maturation medium did not provide higher metaphase II rates than the Control group. In embryonic development, angiotensin (1-7) did not improve cleavage or the amount of total embryos, the 10-1µM group provided superior amount of initial blastocysts. However, further analysis is needed to elucidate the actions performed by angiotensin (1-7) in the in vitro production of bovine embryos.

CARACTERÍSTICAS DO SÊMEN CAPRINO DESCONGELADO APÓS A ADIÇÃO DE RINGER LACTATO, CITRATO DE SÓDIO E SOLUÇÃO TRIS

Cryopreservation of semen is of great importance for various reproductive biotechnologies such as artificial insemination (IA), In Vitro Embryo Production (PIV) and Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI). The objective of this work was to evaluate the stability and persistence of motility and strength of sperm, as well as changes in the plasma membrane after the addition of Ringer Lactate, sodium citrate 2.92% or TRIS solution in thawed goat semen. Semen was collected from two Alpine Brown goats, and standard procedures for cryopreservation and seminal analysis were performed. After thawing the semen, the extenders Ringer Lactate, sodium citrate 2.92% and TRIS solution were added and Thermoresistance (TTR), Supravital and Morphology Tests were carried out. In TTR, only the group received TRIS solution presented motility and strength for a longer period (90 minutes; P 0,05). No influence of the addition of the solutions was found in the morphological analysis, as well as in the Supravital Test, which showed values close to those found for motility (P> 0.05). We concluded that the addition of the solutions does not allow a large persistence of motility and strength of thawed sperm, but TRIS solution could be used for expansion of seminal doses used in vitro reproductive biotechnology.

A criopreservação do sêmen é de grande importância para diversas biotecnologias da reprodução, como Inseminação Artificial (IA), Produção de Embriões In Vitro (PIV) e Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI). Avaliou-se a estabilidade e persistência da motilidade e vigor dos espermatozoides, assim como alterações da membrana plasmática, após a adição de Ringer com Lactato, citrato de sódio 2,92% ou solução TRIS ao sêmen caprino descongelado. O sêmen foi coletado de dois bodes da raça Parda Alpina, realizando-se os procedimentos padrões de análise e criopreservação seminal. Após a descongelação do sêmen, foram adicionados os diluentes Ringer Lactato, citrato de sódio 2,92% ou solução TRIS, realizando-se os Testes de Termorresistência (TTR), Supravital e Morfológico. No TTR, somente o grupo a que foi adicionada a Solução TRIS obteve motilidade e vigor por maior período (90 minutos; P 0,05). Não foi encontrada influência da adição das soluções na análise morfológica, assim como no teste Supravital, o qual apresentou valores próximos aos encontrados para motilidade (P> 0,05). Concluiu-se que a adição das soluções não permite uma grande persistência da motilidade e vigor dos espermatozoides descongelados, porém a solução TRIS poderia ser utilizada para expansão de doses seminais utilizadas em biotecnologias reprodutivas in vitro.

ENALAPRILATO NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES E GEL DE ENALAPRIL POR VIA INTRAVAGINAL EM BOVINOS

A reprodução é vista como um dos principais pilares da cadeia produtiva da carne bovina, pois ela é responsável pela produção do bezerro, considerado a matéria prima dessa indústria. Entretanto, ainda persistem inúmeros pontos de estrangulamento no processo reprodutivo dos bovinos, que podem ser amenizados com a utilização das biotécnicas reprodutivas dentre estas a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e a produção in vitro de embriões (PIV). Os protocolos de indução e sincronização da ovulação baseiam-se no conhecimento dos hormônios, parácrinos e autócrinos que interagem na função ovariana e dentre esses o Sistema Renina Angiotensina (SRA) ovariano. O enalapril, após administração por via oral, é rapidamente absorvido e, então, hidrolisado no fígado a enalaprilato, que é um inibidor específico da ECA, de longa ação, com meia vida efetiva de 11 horas. Pesquisas realizadas pelo nosso grupo, com caprinos, têm demostrado que a adição do enalapril a protocolo IATF, aumentou as taxas de prenhez, parição e gemelaridade. Na forma de óvulos vaginais, o enalapril aumentou a percentagem de inseminações intrauterinas por facilitar o relaxamento cervical. Diante desses resultados, o objetivo do trabalho foi estudar alternativas complexação do enalapril com outras substâncias, visando sua aplicabilidade prática nos protocolos de biotecnologia da reprodução em animais, além de verificar os efeitos do enalaprilato na maturação oocitária, fertilização e cultivo de embriões in vitro. Os resultados para o experimento de avaliação da dosagem de enalapril para bovinos administrado por via intravaginal utilizando as concentrações 0,4 mg/kg, 0,6 mg/kg e 0,8 mg/kg não apresentaram diferença significativa (p>0,05) na avaliação da variável pressão arterial média, assim como não houve alteração nos níveis de ureia, creatinina, TGO, TGP e aldosterona. Em relação a utilização do enalaprilato nas concentrações 1 µM, 2 µM e 4 µM em todas as fases da produção in vitro de embriões os resultados demostram que não houve diferença significativa (p>0,05) entre os tratamentos para a taxa de clivagem e para a taxa de blastocisto. Para os tratamentos com A-779 a 2 µM Enalaprilato a 2 µM e Enalaprilato a 2 µM + A-779 a 2 µM não apresentaram diferença significativa (p>0,05) na taxa de clivagem e para a taxa de blastocisto. Com relação à qualidade avaliada por meio das massas celulares interna (MCI), total de células do trofoblasto (TE) e a proporção entre elas, verificou-se em relação ao número de células do trofoblasto (TE) e TC que os tratamentos com A-779, enalaprilato e associação entre eles apresentaram maior número de células em relação ao controle. Quando foi analisada a proporção entre MCI e TC observou-se que 100% dos embriões do tratamento Enal+A779, 65% dos ratados com Enal , 50% do tratados com A-779 e apenas 33,3% do grupo controle estavam dentro da faixa de 20 a 40% de células da MCI, considerada de melhor qualidade. Conclui-se que o enalaprilato não influenciou na produção de embriões bovinos in vitro, quando avaliados pelas técnicas convencianais, porém quando se avalia pelo número de células embrionárias e a proporção entre elas, os tratamentos com o enalaprilato, A-779 e enalaprilato associado com A-779 apresentaram efeito proliferativo para as células embrionárias, em especial para a massa celular interna, e efeito positivo para a qualidade embrionária avaliada pela proporção de células.

A reprodução é vista como um dos principais pilares da cadeia produtiva da carne bovina, pois ela é responsável pela produção do bezerro, considerado a matéria prima dessa indústria. Entretanto, ainda persistem inúmeros pontos de estrangulamento no processo reprodutivo dos bovinos, que podem ser amenizados com a utilização das biotécnicas reprodutivas dentre estas a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e a produção in vitro de embriões (PIV). Os protocolos de indução e sincronização da ovulação baseiam-se no conhecimento dos hormônios, parácrinos e autócrinos que interagem na função ovariana e dentre esses o Sistema Renina Angiotensina (SRA) ovariano. O enalapril, após administração por via oral, é rapidamente absorvido e, então, hidrolisado no fígado a enalaprilato, que é um inibidor específico da ECA, de longa ação, com meia vida efetiva de 11 horas. Pesquisas realizadas pelo nosso grupo, com caprinos, têm demostrado que a adição do enalapril a protocolo IATF, aumentou as taxas de prenhez, parição e gemelaridade. Na forma de óvulos vaginais, o enalapril aumentou a percentagem de inseminações intrauterinas por facilitar o relaxamento cervical. Diante desses resultados, o objetivo do trabalho foi estudar alternativas complexação do enalapril com outras substâncias, visando sua aplicabilidade prática nos protocolos de biotecnologia da reprodução em animais, além de verificar os efeitos do enalaprilato na maturação oocitária, fertilização e cultivo de embriões in vitro. Os resultados para o experimento de avaliação da dosagem de enalapril para bovinos administrado por via intravaginal utilizando as concentrações 0,4 mg/kg, 0,6 mg/kg e 0,8 mg/kg não apresentaram diferença significativa (p>0,05) na avaliação da variável pressão arterial média, assim como não houve alteração nos níveis de ureia, creatinina, TGO, TGP e aldosterona. Em relação a utilização do enalaprilato nas concentrações 1 µM, 2 µM e 4 µM em todas as fases da produção in vitro de embriões os resultados demostram que não houve diferença significativa (p>0,05) entre os tratamentos para a taxa de clivagem e para a taxa de blastocisto. Para os tratamentos com A-779 a 2 µM Enalaprilato a 2 µM e Enalaprilato a 2 µM + A-779 a 2 µM não apresentaram diferença significativa (p>0,05) na taxa de clivagem e para a taxa de blastocisto. Com relação à qualidade avaliada por meio das massas celulares interna (MCI), total de células do trofoblasto (TE) e a proporção entre elas, verificou-se em relação ao número de células do trofoblasto (TE) e TC que os tratamentos com A-779, enalaprilato e associação entre eles apresentaram maior número de células em relação ao controle. Quando foi analisada a proporção entre MCI e TC observou-se que 100% dos embriões do tratamento Enal+A779, 65% dos ratados com Enal , 50% do tratados com A-779 e apenas 33,3% do grupo controle estavam dentro da faixa de 20 a 40% de células da MCI, considerada de melhor qualidade. Conclui-se que o enalaprilato não influenciou na produção de embriões bovinos in vitro, quando avaliados pelas técnicas convencianais, porém quando se avalia pelo número de células embrionárias e a proporção entre elas, os tratamentos com o enalaprilato, A-779 e enalaprilato associado com A-779 apresentaram efeito proliferativo para as células embrionárias, em especial para a massa celular interna, e efeito positivo para a qualidade embrionária avaliada pela proporção de células.

Efeito da insulina na criopreservação do sêmen bovino sobre a produção in vitro de embriões

Resumo: A insulina é um hormônio anabólico capaz de atuar na proteção das células espermáticas para minimizar os insultos da criopreservação, também atua na produção de embriões in vitro (PIV) trazendo benefícios no desenvolvimento embrionário devido ao seu efeito antiapoptótico e mitogênico. Desta forma, o presente trabalho visa avaliar os efeitos da adição de insulina ao meio de criopreservação de sêmen sobre o potencial da PIV de embriões. Para isso, foram utilizados dois ejaculados de seis touros (n=12), sendo que cada ejaculado foi distribuído em dois tratamentos para a criopreservação: Grupo controle (CO): sêmen diluído em meio Triladyl (n=12) e Grupo Insulina (IN): sêmen diluído em meio Triladyl suplementado com insulina (150 µUI/mL, n=12). Duas palhetas de sêmen de cada partida de cada tratamento foram descongeladas, homogeneizadas e submetidas à seleção em gradiente de Percoll®. Os espermatozoides obtidos após Percoll® foram avaliados quanto a motilidade, vigor, integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial mitocondrial e fragmentação de DNA e, após foram utilizados para a fertilização in vitro (FIV) de embriões. Para a PIV foram feitas quatro repetições, sendo aspirados folículos de ovários provenientes de abatedouro comercial e selecionados os complexos cumulus-oócito que apresentavam camadas de células do cumullus compactas e oócito com citoplasma homogêneo. Os oócitos foram submetidos ao processo de maturação in vitro (MIV) (22h/38,5oC/5%CO2) e realizada a FIV logo após a maturação. Os oócitos maturados foram distribuídos em dois grupos, sendo que um grupo recebeu o sêmen CO (n=1587) e o outro o sêmen IN (n= 1580). Após a fertilização os oócitos foram incubados (18h/38,5oC/5%CO2) e os zigotos presumíveis foram transferidos para o cultivo in vitro seguindo a ordem dos tratamentos e incubados por 8 dias (38,5ºC/5%CO2/5%O2/90%N2). A resposta da FIV foi determinada pela taxa de clivagem no terceiro dia do cultivo. No dia 8, avaliou-se o número de blastocisto e a taxa de desenvolvimento em relação aos zigotos presumíveis. Os dados foram submetidos à análise de variância pelo procedimento misto (PROC MIXED) do programa SAS versão 9.3. Em todas as análises estatísticas, o nível de significância considerado foi de P0,05. A taxa de clivagem não foi afetada pela adição de insulina ao diluidor de criopreservação do sêmen (64,21±2,04 x 63,62±1,69%), mas foi notada que a insulina causou redução nas taxas de blastocisto (CO: 24,06±2,69% x IN: 20,04±2,54%) e de desenvolvimento embrionário (CO: 35,81±3,23% x IN: 30,21±3,37%). Por outro lado, foram encontrados efeitos de touro para as taxas de clivagem (variando de 54,19±2,34 a 71,91±2,39%), de blastocisto (variando de 6,76±0,97 a 36,18±2,22%) e de desenvolvimento embrionário (variando de 12,32±1,53 a 50,12±2,04%), mas estas alterações não foram relacionadas com variações na qualidade espermática. Em conclusão, a insulina não apresenta efeito benéfico sobre as taxas de produção de embriões in vitro.

Abstract: Insulin is an anabolic hormone capable of acting in the protection of sperm cells to minimize cryopreservation insults, also acts in the production of in vitro embryos (PIV) bringing benefits in embryonic development due to its effect antiapoptotic and mitogenic. Thus, the present study aims to evaluate the effects of insulin addition to the means of cryopreservation of semen on the potential of PIV of embryos. For this, two ejaculates of six bulls (n=12) were used, each ejaculate was distributed in two treatments for cryopreservation: Control group (CO): semen diluted in Triladyl medium (n = 12) and Insulin Group (IN): semen diluted in Triladyl medium supplemented with insulin (150 µIU / mL, n = 12).Two semen reeds from each match of each treatment were thawed, homogenized and submitted to percoll gradient selection®. Sperm obtained after Percoll® were evaluated for motility, vigor, (acridine orange), plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial potential and DNA fragmentation, and after they were used for in vitro fertilization (IVF) of embryos. For PIV, four replications were performed, and ovaries follicles from commercial slaughterhouse were aspirated and the cumulative-oocyte complexes that presented layers of compact and oocyte cumullus cells with homogeneous cytoplasm were selected The oocytes were submitted to the maturation process in vitro (IVM) (22h/38.5oC/5%CO2) and IVF performed shortly after maturation. Matured oocytes were distributed into two groups, one group received semen CO (n=1587) and the other semen IN (n= 1580). After fertilization the oocytes were incubated (18h/38.5oC/5%CO2) and the presumed zygotes were transferred to in vitro cultivation following the order of treatments and incubated for 8 days (38.5ºC/5%CO2/5%O2/90%N2). The IVF response was determined by the cleavage rate on the third day of cultivation. On day 8, the number of blastocyst and the development rate were evaluated in relation to presumed zygotes. The data were submitted to variance analysis by the mixed procedure (PROC MIXED) of the SAS version 9.3 program. In all statistical analyses, the significance level considered was P0.05. Cleavage rate was not affected by the addition of insulin to the cryopreservation dilution of semen (64.21±2.04 x 63.62±1.69%), but insulin was noted to have caused a reduction in blastocyst rates (CO: 24.06±2.69% x IN: 20.04±2.54%) and embryonic development (CO: 35.81±3.23% x IN: 30.21±3.37%). On the other hand, bull effects were found for cleavage rates (ranging from 54.19±2.34 to 71.91±2.39%), blastocyst (ranging from 6.76±0.97 to 36.18±2.22%) and embryonic development (ranging from 12.32±1.53 to 50.12±2.04%), but these changes were not related to variations in sperm quality. In conclusion, insulin has no beneficial effect on embryo production rates in vitro.

EFEITOS DO FSH, AMPc, hCG E COMBINAÇÕES, NO MEIO DE MATURAÇÃO E INFLUÊNCIA NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

A maturação oocitária é um complexo bem orquestrado que culmina na liberação de um oócito capaz de ser fertilizado, permitindo assim, o desenvolvimento embrionário. A maturação in vitro (MIV) é uma das etapas determinantes para o sucesso da produção in vitro de embriões (PIVE) e a não competência oocitária nesta fase altera drasticamente a taxa de produção embrionária. Apesar de todos os esforços para a melhoria da PIVE, apenas uma parcela de 35 a 40% dos oócitos bovinos maturados in vitro, desenvolvem-se até o estádio de blastocisto. Acredita-se que a falta de sincronia existente entre a maturação nuclear e a maturação citoplasmática oocitária seja um fator limitante na qualidade da PIVE. Dessa forma, o uso de reguladores durante a MIV, tem se destacado e melhorado a sincronia da maturação nuclear e citoplasmática dos oócitos, e consequentemente, a taxa de produção embrionária. Nesse contexto, o presente estudo teve como finalidade avaliar a influência dos reguladores de maturação - hormônio folículo estimulante (FSH), monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) e gonadotrofina coriônica humana (hCG), e suas combinações - na presença de albumina sérica bovina (BSA) como fonte protéica, sobre a MIV de oócitos bovinos, comparados ao grupo controle, com soro fetal bovino (SFB) sem adição dos reguladores. Foram formados dez grupos experimentais (T1: SFB, T2: FSH, T3: AMPc, T4: hCG, T5: FSH+AMPc, T6: FSH+hCG, T7: AMPc+hCG, T8: FSH+AMPc+hCG e T9: (FSH+AMPC) por 12 horas + hCG nas outras 12 horas, T10: BSA). Foram avaliadas as taxas de maturação nuclear e citoplasmática, de acordo com a presença de metáfase II (MII), migração dos grânulos corticais e mitocôndrias, capacidade em produzir embriões e acúmulo lipídico embrionário. Os resultados demonstraram que o uso do BSA durante a MIV provocou atraso na retomada da meiose em todos os grupos experimentais analisados, comparados à maturação com SFB (p < 0,05). Porém, a distribuição de grânulos corticais e de mitocôndrias no ooplasma, bem como a taxa de produção embrionária, apresentaram melhores resultados quando o SFB foi utilizado (p < 0,05). Além disso, a substituição do SFB pelo BSA na MIV não reduz os níveis lipídicos dos embriões produzidos in vitro (PIV) (p > 0,05). Conclui-se que, o uso do BSA durante a MIV de oócitos bovinos, permite o atraso da reativação da meiose, contudo, a presença do SFB nessa etapa é de suma importância para a maturação das organelas citoplasmáticas e na produção in vitro de embriões bovinos.

Oocyte maturation is a well-orchestrated complex that culminates in the release of an oocyte capable of being fertilized, thus allowing embryonic development. In vitro maturation (IVM) is one of the determining steps for the success of in vitro production of embryos (IVPE) and the lack of oocyte competence in this phase dramatically changes the rate of embryonic production. Despite all efforts to improve IVPE, only a portion of 35 to 40% of bovine oocytes matured in vitro, develop until the blastocyst stage. It is believed that the lack of synchrony between nuclear maturation and oocyte cytoplasmic maturation is a limiting factor in the quality of IVPE. Thus, the use of regulators during IVM, has highlighted and improved the synchrony of oocyte nuclear and cytoplasmic maturation, and consequently, the rate of embryonic production. In this context, the present study aimed to evaluate the influence of maturation regulators - follicle stimulating hormone (FSH), cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and human chorionic gonadotropin (hCG), and their combinations - in the presence of bovine serum albumin (BSA) as a protein source, on the bovine oocyte IVM, compared to the control group, with fetal bovine serum (FBS) without the addition of regulators. Ten experimental groups were formed (T1: FBS, T2: FSH, T3: cAMP, T4: hCG, T5: FSH + cAMP, T6: FSH + hCG, T7: cAMP + hCG, T8: FSH + cAMP + hCG and T9: (FSH + cAMP) for 12 hours + hCG in the other 12 hours, T10: BSA). Nuclear and cytoplasmic maturation rates were evaluated according to the presence of metaphase II (MII), migration of cortical granules and mitochondrias, ability to produce embryos and embryonic lipid accumulation. The results demonstrated that the use of BSA during IVM caused a delay in the resumption of meiosis in all experimental groups analyzed, compared to maturation with FBS (p < 0,05). However, the distribution of cortical granules and mitochondrias in the ooplasm, as well as the rate of embryonic production, showed better results when FBS was used (p < 0,05). In addition, the replacement of FBS by BSA in IVM does not reduce the lipid levels of embryos produced in vitro (IVP) (p> 0.05). It is concluded that the use of BSA during IVM of bovine oocytes allows the delay of meiosis reactivation, however, the presence of FBS in this stage is of paramount importance for the maturation of cytoplasmic organelles and in vitro production of embryos bovine.