Evolution of Avian coronavirus (AvCoV) in BHK-21 and VERO cells / Evolução de Coronavírus aviário (AvCoV) em células BHK-21 e VERO

Avian coronavirus (AvCoV) infects a range of tissues in chickens and several other avian species. Although the virus can be isolated in chicken embryos, only a few strains of the 6 genotypes/33 lineages can grow in cell lines, with the Beaudette strain (GI-1 lineage) being the most used for in vitro studies. Considering the differences between cell lines and chicken embryos as habitats for AvCoV, this study aimed to assess the diversity of the genes coding for the nonstructural protein 3 (nsp3) and spike envelope protein (S) after serial passages in BHK-21 and Vero cells. After 14 passages of an embryo-adapted Beaudette strain, the virus loads fluctuated in both cell lines, with the highest loads being 8.72 log genome copies/µL for Vero and 6.36 log genome copies/µL for BHK-21 cells. No polymorphisms were found for nsp3; regarding S, not only aa substitutions (Vero: 8th passage A150S, and 14th S150A; BHK-21: 4th S53F, 8th F53Y, and 8th S95R), but also minor variants could be detected on chromatograms with fluctuating intensities. As the regions of these aa substitutions are within the receptor-binding domain of S, it can be speculated that differences in cell receptors between Vero and BHK-21 cells and the speed of cell death led to the selection of different dominant strains, while the stability of nsp3 supports its function as a protease involved in AvCoV replication. In conclusion, AvCoV quasispecies evolution is influenced by the biological model under consideration, and a gradual transition is seen for minor and major variants.(AU)

O Coronavírus aviário AvCoV infecta uma variedade de tecidos de galinhas e de outras espécies aviárias. Apesar de este vírus poder ser isolado em ovos embrionados de galinha, apenas alguns dos 6 genótipos / 33 linhagens podem crescer em cultivo celular, sendo a cepa Beuadette (linhagem GI-11) a mais utilizada para estudos in vitro. Considerando as diferentes linhagens celulares e ovos embrionados como habitats para o AvCoV, este estudo teve por objetivo estudar a diversidade de genes que codificam para a proteína não-estrutural 3 (nsp3) e espícula (S) após passagens seriadas em células BHK-21 e VERO. Após 14 passagens, de uma amostra Beuadette adaptada a ovos embrionados, os títulos virais variaram em ambas as células, com os maiores títulos sendo de 8,72 log cópias genômicas/µL para Vero e 6,36 cópias genômicas/µL para BHK-21. Nenhum polimorfismo foi encontrando para nsp3. Considerando a proteína S, não somente foram encontradas substituições de aminoácidos (Vero: 8a passagem A150S e 14a passagem S150A; BHK-21: 4a passagem S53F, 8a passagem F53Y e S95R), mas também, variantes subconsensuais foram detectadas pelos cromatogramas com intensidades flutuantes. Uma vez que as regiões destes aa se encontram no domínio de ligação de receptor de S, pode-se especular que diferenças em receptores celulares entre Vero e BHK-21, além da velocidade da morte celular, levaram à seleção de diferentes cepas dominantes, enquanto que a estabilidade de nsp3 concorda com sua função como protease com papel na replicação de AvCoV. Como conclusão, a evolução de quase-espécies de AvCoV é influenciada pelo modelo biológico sob consideração e uma transição gradual é vista para variantes dominantes e subdominantes.(AU)

Evolution of Avian coronavirus (AvCoV) in BHK-21 and VERO cells / Evolução de Coronavírus aviário (AvCoV) em células BHK-21 e VERO

Avian coronavirus (AvCoV) infects a range of tissues in chickens and several other avian species. Although the virus can be isolated in chicken embryos, only a few strains of the 6 genotypes/33 lineages can grow in cell lines, with the Beaudette strain (GI-1 lineage) being the most used for in vitro studies. Considering the differences between cell lines and chicken embryos as habitats for AvCoV, this study aimed to assess the diversity of the genes coding for the nonstructural protein 3 (nsp3) and spike envelope protein (S) after serial passages in BHK-21 and Vero cells. After 14 passages of an embryo-adapted Beaudette strain, the virus loads fluctuated in both cell lines, with the highest loads being 8.72 log genome copies/µL for Vero and 6.36 log genome copies/µL for BHK-21 cells. No polymorphisms were found for nsp3; regarding S, not only aa substitutions (Vero: 8th passage A150S, and 14th S150A; BHK-21: 4th S53F, 8th F53Y, and 8th S95R), but also minor variants could be detected on chromatograms with fluctuating intensities. As the regions of these aa substitutions are within the receptor-binding domain of S, it can be speculated that differences in cell receptors between Vero and BHK-21 cells and the speed of cell death led to the selection of different dominant strains, while the stability of nsp3 supports its function as a protease involved in AvCoV replication. In conclusion, AvCoV quasispecies evolution is influenced by the biological model under consideration, and a gradual transition is seen for minor and major variants.(AU)

O Coronavírus aviário AvCoV infecta uma variedade de tecidos de galinhas e de outras espécies aviárias. Apesar de este vírus poder ser isolado em ovos embrionados de galinha, apenas alguns dos 6 genótipos / 33 linhagens podem crescer em cultivo celular, sendo a cepa Beuadette (linhagem GI-11) a mais utilizada para estudos in vitro. Considerando as diferentes linhagens celulares e ovos embrionados como habitats para o AvCoV, este estudo teve por objetivo estudar a diversidade de genes que codificam para a proteína não-estrutural 3 (nsp3) e espícula (S) após passagens seriadas em células BHK-21 e VERO. Após 14 passagens, de uma amostra Beuadette adaptada a ovos embrionados, os títulos virais variaram em ambas as células, com os maiores títulos sendo de 8,72 log cópias genômicas/µL para Vero e 6,36 cópias genômicas/µL para BHK-21. Nenhum polimorfismo foi encontrando para nsp3. Considerando a proteína S, não somente foram encontradas substituições de aminoácidos (Vero: 8a passagem A150S e 14a passagem S150A; BHK-21: 4a passagem S53F, 8a passagem F53Y e S95R), mas também, variantes subconsensuais foram detectadas pelos cromatogramas com intensidades flutuantes. Uma vez que as regiões destes aa se encontram no domínio de ligação de receptor de S, pode-se especular que diferenças em receptores celulares entre Vero e BHK-21, além da velocidade da morte celular, levaram à seleção de diferentes cepas dominantes, enquanto que a estabilidade de nsp3 concorda com sua função como protease com papel na replicação de AvCoV. Como conclusão, a evolução de quase-espécies de AvCoV é influenciada pelo modelo biológico sob consideração e uma transição gradual é vista para variantes dominantes e subdominantes.(AU)

Serum concentrations of acute phase proteins in goats and ewes with naturally acquired Staphylococcus aureus mastitis / Concentração de proteínas de fase aguda em cabras e ovelhas com mastite de ocorrência natural causada por Staphylococcus aureus

Serum protein concentrations, including acute phase proteins (APPs), of goats and ewes with naturally acquired Sthaphylococcus aureus mastitis were determined by means of SDS-PAGE electrophoresis to evaluate the relevance of these APPs as biomarkers of the disease in these species. Fifteen healthy goats and 5 goats with naturally acquired staphylococci mastitis, as well as fifteen healthy ewes and 5 ewes with staphylococci mastitis were submitted to daily blood sampling during 7 days. In goats, an increase of 570%, 125%, 621%, and 279% in serum concentrations of ceruloplasmin, fibrinogen, haptoglobin and α1-acid glycoprotein, respectively, was observed. In sheep the increase in serum concentrations of ceruloplasmin, fibrinogen, haptoglobin and α1-acid glycoprotein was of 337%, 90%, 461%, and 225%, respectively. Our results indicate that these APPs have considerable potencial as early and sensible biomarkers of mastitis caused by S. aureus in goats and sheep.(AU)

O proteinograma, incluindo proteínas de fase aguda (PFAs), de cabras e ovelhas com mastite de origem natural causada por Staphylococcus aureus, foi determinado por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) a fim de avaliar a importância destas PFAs como biomarcadores da enfermidade nestas espécies. Amostras de sangue foram colhidas diariamente de cinco cabras e cinco ovelhas com mastite estafilocócica naturalmente adquirida, bem como de quinze cabras e quinzes ovelhas saudáveis durante 6 dias consecutivos. Nas fêmeas caprinas, foi verificado aumento dos teores séricos de ceruloplasmina (570%), fibrinogênio (125%), haptoglobina (621%), e α1-glicoproteína ácida (279%). Nas fêmeas ovinas as concentrações de ceruloplasmina, fibrinogênio, haptoglobina e α1-glicoproteína ácida elevaram-se em 337%, 90,9%, 461% e 225%, respectivamente. Os resultados permitem inferir que estas PFAs são marcadores sensíveis e precoces de mastite causada por S. aureus em cabras e ovelhas.(AU)

Serum concentrations of acute phase proteins in goats and ewes with naturally acquired Staphylococcus aureus mastitis / Concentração de proteínas de fase aguda em cabras e ovelhas com mastite de ocorrência natural causada por Staphylococcus aureus

Serum protein concentrations, including acute phase proteins (APPs), of goats and ewes with naturally acquired Sthaphylococcus aureus mastitis were determined by means of SDS-PAGE electrophoresis to evaluate the relevance of these APPs as biomarkers of the disease in these species. Fifteen healthy goats and 5 goats with naturally acquired staphylococci mastitis, as well as fifteen healthy ewes and 5 ewes with staphylococci mastitis were submitted to daily blood sampling during 7 days. In goats, an increase of 570%, 125%, 621%, and 279% in serum concentrations of ceruloplasmin, fibrinogen, haptoglobin and α1-acid glycoprotein, respectively, was observed. In sheep the increase in serum concentrations of ceruloplasmin, fibrinogen, haptoglobin and α1-acid glycoprotein was of 337%, 90%, 461%, and 225%, respectively. Our results indicate that these APPs have considerable potencial as early and sensible biomarkers of mastitis caused by S. aureus in goats and sheep.(AU)

O proteinograma, incluindo proteínas de fase aguda (PFAs), de cabras e ovelhas com mastite de origem natural causada por Staphylococcus aureus, foi determinado por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) a fim de avaliar a importância destas PFAs como biomarcadores da enfermidade nestas espécies. Amostras de sangue foram colhidas diariamente de cinco cabras e cinco ovelhas com mastite estafilocócica naturalmente adquirida, bem como de quinze cabras e quinzes ovelhas saudáveis durante 6 dias consecutivos. Nas fêmeas caprinas, foi verificado aumento dos teores séricos de ceruloplasmina (570%), fibrinogênio (125%), haptoglobina (621%), e α1-glicoproteína ácida (279%). Nas fêmeas ovinas as concentrações de ceruloplasmina, fibrinogênio, haptoglobina e α1-glicoproteína ácida elevaram-se em 337%, 90,9%, 461% e 225%, respectivamente. Os resultados permitem inferir que estas PFAs são marcadores sensíveis e precoces de mastite causada por S. aureus em cabras e ovelhas.(AU)

USO DA KIM-1 NA DETECÇÃO DE LESÃO RENAL PRECOCE EM CÃES COM LEPTOSPIROSE

DIAS, C. S. Uso da KIM-1 na detecção de lesão renal precoce em cães com leptospirose. Salvador, 2020. 81pg. Dissertação (Mestre em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade Federal da Bahia. Leptospirose é uma zoonose de ampla distribuição mundial e relevante impacto para a saúde pública. Clinicamente, a injúria renal é um aspecto importante na leptospirose canina, podendo desencadear nefrite intersticial tubular, glomerulonefrite, vasculite e reduzida perfusão renal. A azotemia tem caráter tardio para diagnóstico de injúria renal precoce, enquanto a identificação de lesão renal em estágios iniciais permite pronta intervenção terapêutica com o objetivo de desacelerar a progressão da injúria. A Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1) é uma glicoproteína transmembrana não expressa na ausência de lesão tecidual ou endotelial, cuja concentração urinária encontra-se elevada em estágios iniciais de injúria tubular. Objetivou-se avaliar a utilização da KIM-1 urinária (uKIM-1) para detecção de injúria renal precoce (antes do surgimento de azotemia) na leptospirose canina, após caracterização da infecção em cães naturalmente infectados por Leptospira sp. O grupo de estudo envolveu 25 cães diagnosticados com leptospirose através de isolamento bacteriano e/ou Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e/ou Teste de Aglutinação Microscópica (MAT 800). O grupo controle foi formado por 5 animais clinicamente saudáveis. Os animais estudados foram caracterizados em fases agudas e subagudas de infecção com início de sintomas entre três e sete dias. Níveis de uKIM-1 encontraram-se significativamente diferentes (p < 0,01) entre os grupos estudados, principalmente entre cães não azotêmicos infectados e cães saudáveis (p= 0,0042). O biomarcador mostrou sensibilidade de 88% para diagnóstico de leptospirose com ponto de corte > 1,49 ng/ml. KIM-1 urinária encontrou-se negativamente correlacionada com a densidade urinária, porém acompanhou evidências histopatológicas de degeneração, necrose e regeneração renais. A aplicação deste biomarcador permitiu a detecção de lesão renal precoce em casos em que a injúria permaneceu não detectada através do uso de marcadores de função renal aplicados na rotina clínica.

DIAS, C. S. Use of KIM-1 to detect early kidney injury in canine leptospirosis. Salvador, 2020. 81pg. Dissertação (Mestre em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade Federal da Bahia. Leptospirosis is a widespread zoonosis of significance for public health. Clinically, renal injury is an important aspect in canine leptospirosis and involves different segments of nephrons, which can result in tubular interstitial nephritis, glomerulonephritis, vasculitis and reduced renal perfusion. Azotemia has low sensitivity in diagnosing early renal injury, whilst early detection of kidney injury enables prompt therapeutic intervention aiming at slowing injury progress. Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1) is a transmembrane protein not expressed in the absence of tissue or endothelial injury; its urinary concentration is rapidly elevated in the early stages of tubular injury. This study aimed to evaluate the use of urinary KIM-1 to detect early kidney injury (before the onset of azotemia) in canine leptospirosis after infection characterizing the infection in naturally affected dogs. The study group involved 25 dogs diagnosed with leptospirosis by Microscopic Agglutination Test (MAT; 800), Polymerase Chain Reaction (PCR) and bacterial isolation. The control group enrolled 5 clinically healthy animals. Infection was characterized in acute and subacute phases with onset of clinical symptoms from three to seven days. uKIM-1 levels were statistically different (p < 0,01) between the studied groups, especially in non-azotemic dogs (p= 0,0042). The biomarker showed 88% sensibility to diagnosis of leptospirosis at >1,49 ng/ml cut-off. Urine KIM-1 was negatively correlated with urine specific gravity but accompanied histopathological evidence of renal degeneration, necrosis and regeneration processes. This biomarker allowed the detection of early kidney injury in cases where the damage remained undetected using renal function markers applied in the clinical routine.

Expression of P-glycoprotein, multidrug resistance-associated protein, glutathione-S-transferase pi and p53 in canine transmissible venereal tumor / Expressão da glicoproteína-P, proteína associada à múltiplas drogas, glutationa-S-transferase pi e p53 no tumor venéreo transmissível canino

The overexpression of proteins P-glycoprotein (P-gp), multidrug resistance-associated protein (MRP1), mutant p53, and the enzyme glutathione-S-transferase (GSTpi) are related to resistance to chemotherapy in neoplasms. This study evaluated the expression of these markers by immunohistochemistry in two groups of canine TVT, without history of prior chemotherapy (TVT1, n=9) and in TVTs presented unsatisfactory clinical response to vincristine sulfate (TVT2, n=5). The percentage of specimens positively stained for P-gp, MRP1, GSTpi and p53 were, respectively 88.8%, 0%, 44.5% and 22.2% in TVT1 and 80%, 0%, 80% and 0% in TVT2. In TVT1, one specimen presented positive expression for three markers and four specimens for two markers. In TVT2, three specimens expressed P-gp and GSTpi. In conclusion, the canine TVTs studied expressed the four markers evaluated, but just P-gp and GSTpi were significantly expressed, mainly at cytoplasm and cytoplasm and nuclei, respectively, either before chemotherapy as after vincristine sulfate exposure. Future studies are needed to demonstrate the function of these two markers in conferring multidrug resistance (MDR) or predict the response to chemotherapy in canine TVT.(AU)

A superexpressão das proteínas glicoproteína-P (Gp-P), proteína associada à resistência à múltiplas drogas 1 (MRP1) e p53 mutante e a enzima glutationa-S-transferase pi (GSTpi) está relacionada com resistência à quimioterapia em neoplasias humanas e caninas. Este estudo avaliou a expressão, por meio da imuno-histoquímica desses marcadores em espécimes de TVT caninos sem histórico de quimioterapia prévia (TVT1, n=9) e em TVT caninos que apresentaram resposta clínica insatisfatória ao sulfato de vincristina (TVT2, n=5). A porcentagem de espécimes positivos para Gp-P, MRP1, GSTpi e p53 foram, respectivamente 88,8%, 0%, 44,5% e 22,2% no grupo TVT1 e 80%, 0%, 80% e 0% no grupo TVT2. No TVT1, um espécime apresentou expressão positiva para três marcadores e quatro para dois marcadores. No TVT2, três espécimes expressaram a Gp-P e GSTpi. Em conclusão, os TVTs caninos estudados expressaram os quatro marcadores avaliados, no entanto apenas a Gp-P e GSTpi foram significativamente expressas, principalmente no citoplasmas e no citoplasma e no núcleo, respectivamente, tanto antes da quimioterapia quanto após à exposição ao sulfato de vincristina. Estudos futuros são necessários para demonstrar a função desses dois marcadores em conferir resistência à multiplas drogas (RMD) ou predizer a resposta a quimioterapia no TVT canino.(AU)

Isolamento, caracterização molecular e análise filogenética do gene da glicoproteína S de coronavírus bovino associado à doença respiratória

O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus com duplo tropismo (entérico e respiratório) e desencadeia manifestações clínicas entéricas e respiratórias nos bovinos, em doenças como a disenteria de inverno (winter dysentery) em bovinos adultos, diarreia neonatal em bezerros e doença respiratória. O presente trabalho reporta a detecção de BCoV associado à doença respiratória em animais jovens e descreve a análise molecular e filogenética do isolado respiratório (BOV19-NS) com base em fragmentos parciais (1447 nt e 438 nt) do gene S. O trabalho também descreve o sucesso do isolamento da BOV19-NS em células da linhagem HRT-18 e compara molecularmente as sequências do gene da glicoproteína S do BCoV obtidas diretamente da amostra clínica e do isolado adaptado ao longo das passagens celulares. A matriz de identidade do fragmento maior (1447 nt) demonstrou maior identidade (98,2%) da amostra BOV19-NS com isolados brasileiros de BECoV, coletados em 2004, no estado de Minas Gerais (BRUEL-1, BRUEL-2 e BRUEL-3), enquanto do fragmento menor (438) a maior identidade (98,4%) foi observada com um isolado brasileiro de BECoV coletado em 2014 no Rio de Janeiro (PD1).  A árvore filogenética demonstrou uma tendência de separação filogeográfica dos isolados de BCoV. Comparando com o protótipo ancestral de BCoV, cepa Mebus, foram identificadas 33 substituições nucleotídicas, das quais 15 resultaram em mutações não sinônimas (9 transições e 6 transversões). Uma alteração de aa inédita foi detectada no resíduo 528 (Ala528Val) da região hipervariável da S1 em um isolado selvagem. Em comparação com a amostra selvagem, foi identificada apenas uma substituição nucleotídica na posição de nt 2428 (AATàTAT) a partir da 7ª passagem, que resultou na transversão, carga neutra-neutra, Asn810Tyr. Este é o primeiro relato de isolamento de BCoV em cultivo celular associado à doença respiratória no Brasil. Além disso é pioneiro na caracterização molecular do isolado selvagem e do respectivo adaptado em cultivo após sucessivas passagens.

Bovine coronavirus (BCoV) is a dual tropism virus (enteric and respiratory), which triggers enteric and respiratory clinical manifestations in cattle, with diseases such as winter dysentery in adult cattle, neonatal diarrhea in calves and respiratory disease. The present work reports the detection of BCoV associated with respiratory disease in young animals and describes the molecular and phylogenetic analysis of the respiratory isolate (BOV19-NS) based on partial fragments (1447 nt and 438 nt) of the S gene. Also, it reports the success of BOV19-NS isolation in HRT-18 cells lineage; molecular comparison of the BCoV sequences obtained directly from the clinical sample and the adaptation of the isolate along the cell passages. The biggest identity matrix (1447 nt) demonstrated greater identity (98.2%) of the BOV19-NS sample with Brazilian isolates of enteric BCoV, collected in 2004 in Minas Gerais (BRUEL-1, BRUEL-2 and BRUEL-3), while the smaller fragment showed the highest identity (98.4%) with a Brazilian isolate of enteric BCoV, collected in 2014 in Rio de Janeiro (PD1). The phylogenetic tree showed a tendency of phylogeographic separation of BCoV isolates. Comparing with the ancestral prototype of BCoV, Mebus strain, 33 nucleotide substitutions were identified, of which 15 resulted in non-synonymous mutations (9 transitions and 6 transversions). A new aa change was detected at residue 528 (Ala528Val) of the hypervariable region of S1 in a wild type isolate. Compared to the wild type isolate, only one nucleotide substitution at nt position 2428 (AATàTAT) was identified from the 7th passage, which resulted in the Asn810 Tyr transversion, neutral-neutral. This is the first report of BCoV isolation in cell culture associated with respiratory disease in Brazil. It is also pioneer in the molecular characterization of the wild isolate and its adapted culture after successive passages.

EFEITOS DA OSTEOPONTINA NO SÊMEN SEXADO BOVINO

Tem sido relatado que altas concentrações de osteopontina (OPN) no plasma seminal de diversar espécies esta correlacionada com animais de alta fertilidade, identificando-a como bio marcador reprodutivo. De igual maneira estudos mostram uma maior taxa de fertilização in vitro quando é implementada nos meios para fertilização. Visto que a OPN pode ter funções antagônicas, o presente estudo visou identificar se suas funções são dose dependente, adicionando 4 diferentes concentrações de OPN sobre o sêmen sexado bovino por 30 minutos e avaliar por (i) citometria de fluxo a viabilidade, integridade de membrana e capacitação espermática; (ii) teste de ligação a células epiteliais da tuba uterina bovina (BOECs), para quantificar o numero de espermatozoides ligados às células epiteliais, formando o que seria in vivo o reservatório espermático e (iii) avaliar a produção de embriões in vitro. Na avaliação por citometria não foi observada uma interação da adição de OPN com os espermatozoides sexados e não sexados, diferente dos outros dois testes onde se evidenciou que independente da dose a OPN diminuiu a ligação dos espermatozoides às BOECs e a concentração de 0.5g/1x106 espermatozoides aumento a taxa de clivagem e formação de blastocistos. Isto ratifica o poder capacitante da OPN de 60KDa sobre os espermatozoides e confirma que esta, pode ter associações diretas com ambos gametos, gerando melhores taxas de fertilização in vitro e, por tanto, melhor desenvolvimento embrionário nos bovinos. No entanto, pelos resultados obtidos nos dois primeiros testes, acreditamos que a OPN precisa de um tempo de incubação superior a uma hora para conseguir saturação da glicoproteína nos espermatozoides e assim observar um efeito.

It has been reported that high concentrations of osteopontin (OPN) in the seminal plasma of diverse species is correlated with high fertility animals, identifying it as a bio-reproductive marker. Likewise studies show a higher rate of in vitro fertilization when it´s implemented in fertilization media. Since OPN may have antagonistic functions, the present study aimed to identify if its functions are dose-dependent, adding four different concentrations of OPN on the sex-sorted and non-sorted bovine sperm for 30 minutes. The samples were evaluated by means of (i) flow cytometry the viability, membrane integrity and sperm capacitation; (ii) sperm-binding assay to BOECs, to quantify the number of sperm attached to the epithelial cells, forming what would be in vivo the spermatic reservoir and (iii) to evaluate the in vitro embryo production. In flow cytometry an interaction of the addition of OPN with the sex-sorted and non-sorted sperm was not observed, different from the other two tests where it was evidenced that regardless of the dose, the OPN decreased the sperm binding to the BOECs and the concentration of 0.5 µg /1 x 106 spermatozoa increased the rate of cleavage and formation of blastocysts. This corroborates the capacitive power of the OPN of 60KDa on the spermatozoa, and confirm that it can have direct associations with both gametes, generating better rates of in vitro fertilization and, therefore, better embryonic development in cattle. However, from the results obtained in the first two tests, we believe that the OPN needs an incubation time of more than one hour to achieve saturation of the glycoprotein in spermatozoa and thus observe an effect.

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E EFEITO NA INIBIÇÃO DE BIOFILME BACTERIANO DE UMA LECTINA PRESENTE NA ESPONJA MARINHA Chondrilla caribensis. FORTALEZA-CE 2017

As esponjas estão incluídas no filo Porífera, são animais sésseis, filtradores e multicelulares. Elas possuem um grande potencial biotecnológico e farmacológico. Vários compostos têm sido descobertos nesses animais, tais como metabolitos com atividade anti-inflamatória, atividade antimicrobiana, atividade antitumoral, atividade anti-incrustante, atividade citotóxica e lecinas. As lectinas podem ser definidas como proteínas ou glicoproteínas que se ligam reversivelmente aos carboidratos e são capazes de aglutinar eritrócitos e outros tipos de células e/ou precipitar polissacarídeos. As esponjas marinhas são consideradas uma rica fonte de lectinas, com grande potencial biotecnológico. Dessa forma, objetivo do presente trabalho foi purificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar o efeito na inibição do biofilme bacteriano de uma lectina isolada na esponja marinha Chodrilla caribensis do litoral do Ceará. CCL (Chodrilla caribensis lectin) foi purificada a partir da combinação de cromatografia de troca iônica e cromatografia de afinidade. A nova lectina é uma glicoproteina, com um teor de 5,2% de carboidratos e com um tamanho de aproximadamente 15 kDa. CCL apresentou afinidade por lactose, sua atividade foi melhor em pH na faixa neutro-alcalina e a perdeu sua atividade completamente quando aquecida a 100°C. A estrutura teórica secundária de CCL consistiu em 10,4% de hélice, 73,4% de estrutura e 16,2 % de região desestruturada. Além disso, a CCL foi cristalizada, através do ensaio preliminar de cristalização. A proteína foi altamente tóxica contra naúplios de Artemia sp., apresentando um LC50 = 6,3 g.mL-1 e foi eficaz na inibição da formação de biofilme das bactérias Gram-positivas, S. aureus e S. epidermidis. Em relação ao número de células viáveis, CCL foi eficaz no tratamento com S. epidermidis, em todas as concentrações.

The sponges are included in the phylum Porífera, are sessile, filtering and multicellular animals. They have great biotechnological and pharmacological potential. Several compounds have been discovered in these animals, such as metabolites with anti-inflammatory activity, antimicrobial activity, antitumor activity, antifouling activity, cytotoxic activity and lectin. Lectins can be defined as proteins or glycoproteins that bind reversibly to carbohydrates and are capable of binding erythrocytes and other cell types and / or precipitating polysaccharides. Marine sponges are considered a rich source of lectins, with great biotechnological potential. Thus, the objective of the present work was to purify, characterize biochemically and evaluate the effect on bacterial biofilm inhibition of an isolated lectin in the marine sponge Chodrilla caribensis from the coast of Ceará. CCL (Chodrilla caribensis lectin) was purified from the combination of ion exchange chromatography and affinity chromatography. The new lectin is a glycoprotein, with a content of 5.2% carbohydrate and a size of approximately 15 kDa. CCL showed affinity for lactose, its activity was better at pH in the neutral-alkaline range and the protein only lost its activity completely when heated to 100 ° C. The theoretical secondary structure of CCL consisted of 10.4% of -helix, 73.4% of -structure and 16.2% of unstructured region. In addition, the CCL was crystallized through the preliminary crystallization test. The protein was highly toxic against Artemia sp. Nauplii, presenting an LC 50 = 6.3 g.mL-1 and was effective in inhibiting the biofilm formation of Gram-positive bacteria, S. aureus and S. epidermidis. Regarding the number of viable cells, CCL was effective only in treatment with S. epidermidis, at all concentrations.

ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE LECTINAS PRESENTES NAS ALGAS MARINHAS VERDES Udotea flabellum (J. Ellis & Solander) M. A. Howe 1904 E Codium isthmocladum Vickers 1905 (CIL-3) E AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE E ATIVIDADE ANTIBACTERIANA

O estudo de lectinas de algas marinhas aponta para a possibilidade de se isolar substâncias com características ímpares, que poderiam contribuir para os estudos da aplicação de substâncias com atividades biológicas nas áreas das ciências biomédicas. O presente estudo constou da purificação e caracterização parcial de duas novas lectinas presentes nas algas marinhas verdes Udotea flabellum, aqui denominada de UFL e da Codium isthmocladum, denominada de CiL-3, respectivamente. Além da avaliação da toxicidade em naúplios de Artemia e das atividades antibacterianas de crescimento planctônico, formação de biofilmes e a agregação de bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus e S. epidermidis e a Gramnegativa Escherichia coli. O isolamento de lectinas foi obtido por uma combinação de diferentes técnicas de purificação. UFL mostrou especificidade para eritrócitos de coelho tratados com enzimas proteolíticas, tripsina e papaína. Aglutinou eritrócitos humanos do sistema ABO e não foi inibida por açúcares simples, apenas pelas glicoproteínas mucina de estômago de porco (PSM) e tiroglobulina. Exibiu uma única banda com massa molecular aparente de 60 kda e duas distintas bandas protéicas com massa molecular de 29 e 20 kDa. Termoestável, os valores mais altos de atividade hemaglutinante foram no pH 6, não dependente de cátions divalentes, sem glicolisações, atóxica contra naúplios de Artemia sp. Não foi capaz de inibir o crescimento planctônico e diminuir a biomassa do biofilme de S. aureus, no entanto, mostrou uma fraca inibição para S. epidermidis, não apresentou redução significativa no número de células viáveis das bactérias Gram-positivas e também não causou aglutinação nas bactérias. No que diz respeito a lectina isolada de Codium, a atividade hemaglutinante da CiL-3 mostrou ser ativa apenas para eritrócitos de coelho tratados com enzimas proteolíticas, não sendo capaz de aglutinar eritrócitos de coelho nativo e humanos do sistema ABO, foi inibida pelo açúcar simples rafinose e a glicoproteína mucina, apresentou como uma única banda de aproximadamente 20 kDa. Relativamente termoestável, a atividade hemaglutinante foi mais elevada em pH 5, não dependência de cátions divalentes. Todas as lectinas isoladas de Codium isthmocaldum (CiL-1, CiL-2 e CiL-3) foram capazes de diminuir a biomassa do biofilme de S. aureus, somente a CiL-2 apresentou inibição para S. epidermidis e foi capaz de apresentar redução no número de células viáveis. Embora a CiL-3 não tenha apresentado aglutinação para as células de Escherichia coli, a lectina foi capaz de aglutinar células formadora do biofilmes de S. aureus e S. epidermidis.

The lectins study seaweed points to the possibility to isolate substances with unique characteristics, which could contribute to the studies of the application of substances with biological activities in the fields of biomedical sciences. This study consisted of purification and partial characterization of two new lectin present in the green algae Udotea flabellum, here called UFL and Codium isthmocladum called CiL-3, respectively. In the evaluation of toxicity in Artemia nauplii and antibacterial activities of planktonic growth, biofilm formation and aggregation of Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus and S. epidermidis, and Gram-negative Escherichia coli. The isolation of lectins was obtained by a combination of different purification techniques. UFL showed specificity for rabbit erythrocytes treated with proteolytic enzymes, trypsin and papain. Agglutinates human erythrocytes of ABO system and was not inhibited by simple sugars, only the mucin glycoproteins from pig stomach (PSM) and thyroglobulin. Exhibited a single band with an apparent molecular mass of 60 kDa and two distinct protein bands with molecular mass of 29 and 20 kDa. Thermostable, the highest values of hemagglutination activity was at pH 6, not dependent on divalent cations without glicolisações, not toxic against Artemia sp. We were able to inhibit planktonic growth and reduce the biomass of biofilm of S. aureus, however, it showed poor inhibition of S. epidermidis showed no significant reduction in the number of viable cells of Gram-positive bacteria and also caused no agglutination in bacteria. As regards the lectin from Codium, the hemagglutinating activity of the CiL-3 proved to be active only for rabbit erythrocytes treated with proteolytic enzymes not being able to agglutinate native rabbit erythrocytes and human ABO system was inhibited by the simple sugar raffinose and mucin glycoprotein, presented as a single band of approximately 20 kDa. Relatively thermostable, the hemagglutination activity was higher at pH 5, not dependence on divalent cations. All the isolated lectin Codium isthmocaldum (CiL-1 and CiL-2 CiL-3) were capable of reducing the biomass from the biofilm of S. aureus, only CiL-2 showed inhibition of S. epidermidis and was able to show reduction the number of viable cells. Although CiL-3 agglutination has not presented to cells of Escherichia coli, the lectin was able to agglutinate cells forming the biofilm of S. aureus and S. epidermidis.

PERFIL BIOQUÍMICO DOS SOROS LÁCTEO E SANGUÍNEO DE CABRAS COM MASTITE DE OCORRÊNCIA NATURAL

O estudo teve como objetivo avaliar as alterações da secreção láctea de cabras com mastite mediante o uso do teste da caneca de fundo escuro, California Mastitis Test (CMT), contagem de células somáticas (CCS) e perfil microbiológico, bem como determinar o perfil bioquímico, em especial de proteínas de fase aguda, do soro sanguíneo e soro lácteo de cabras com mastite clínica ou subclínica, de ocorrência natural. Foram constituídos três grupos experimentais compostos de 30 metades mamárias de cabras sadias, com secreção láctea negativa na prova da caneca de fundo escuro, CMT e no exame microbiológico (grupo controle - G1), 30 metades mamárias com secreção láctea negativa ao teste da caneca de fundo escuro, reação moderada (2+) ou intensa (3+) no CMT e positividade no exame microbiológico (Grupo mastite subclínica - G2) e 12 metades mamárias com secreção láctea positiva na prova da caneca de fundo escuro e no exame microbiológico (grupo mastite clínica G3). Após antissepsia dos tetos foram colhidas amostras de leite para CCS, cultura microbiológica e determinação do perfil bioquímico do soro lácteo, inclusive o proteinograma mediante fracionamento em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), e amostras de sangue venoso para determinação do perfil bioquímico sérico. A contagem automática de células somáticas (CCS) e por contagem microscopia direta foi maior nas amostras de secreção láctea das cabras com mastite subclínica (G2: 4.500.000 células/mL e 20.830.000 células/mL, respectivamente) e com mastite clínica (G3: 7.500.000 células/mL e 39.100.000 células/mL, respectivamente). Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase negativa (SCN), Staphylococcus coagulase positiva (SCP), Corynebacterium spp. e Streptococcus spp. foram os microrganismos isolados nas amostras de leite das cabras do G2 e G3. As amostras de soro lácteo das cabras do G2 e G3 apresentaram maiores atividades das enzimas fosfatase alcalina (G2: 122 U/L e G3: 207 U/L) e gamaglutamiltransferase (G2: 483 U/L e G3: 571 U/L) e maiores concentrações de albumina (G2: 0,18 g/dL e G3: 0,29 g/dL), proteína total (G2: 1,50 g/dL e G3: 1,67 g/dL), cloretos (G2: 190 mEq/L e G3: 202 mEq/L), ferro (G2: 13,4 µg/dL e G3: 19,6 µg/dL), sódio (G2: 152 mMol/L e G3: 181 mMol/L), IgA (G2: 3,26 mg/dL e G3: 3,65 mg/dL), lactoferrina (G2: 111 mg/dL e G3: 127 mg/dL), IgG de cadeia pesada IgG-CP (G2: 94,9 mg/dL e G3: 144 mg/dL), IgG de cadeia leve IgG-CL (G2: 73,0 mg/dL e G3: 98,4 mg/dL), -caseína (G2: 2,13 mg/dL e G3: 3,89 mg/dL) e -lactoglobulina (G2: 693 mg/dL). As amostras de soro sanguíneo das cabras do G2 e do G3 apresentaram menores concentrações séricas de ureia (G2: 56,2 mg/dL e G3: 44,2 mg/dL) e de cloretos (G2: 110 mEq/L e G3: 109 mEq/L), e maiores concentrações de IgA (G3: 49,4 mg/dL), ceruloplasmina (G2: 30,1 mg/dL e G3: 46,9 mg/dL), transferrina (G2: 497 mg/dL), IgG-CP (G2: 1.307 mg/dL e G3: 1,152 mg/dL), IgG-CL (G2: 805 mg/dL e G3: 723 mg/dL), haptoglobina (G2: 52,5 mg/dL e G3: 40,2 mg/dL) e 1-glicoproteína ácida (G2: 37,7 mg/dL). Conclui-se que a utilização de ferramentas diagnosticas como o uso da caneca de fundo escuro, CMT e a CCS devem ser usadas em conjunto para a avaliação adequada da secreção láctea caprina e sempre que possível junto com o exame microbiológico. O S. aureus é o microorganismo mais isolado neste estudo sendo o 63,3% na secreção láctea das cabras do G2 e 75% do G3, predominando assim os agentes infecciosos contagiosos nas cabras avaliadas. O perfil bioquímico em especial de proteínas de fase aguda (PFA) do soro lácteo se mostrou melhor indicador clínico nos quadros de mastites clínica é subclínica que o perfil químico sanguíneo. Finalizando, ressalta-se que as proteínas de peso molecular 39.000 Da e 19.000 Da, foram identificadas somente no soro lácteo de cabras do G3, podendo ser considerado como um marcador de mastite clínica.

The study aimed to evaluate the changes in milk from goats with mastitis by using the strip cup test, California Mastitis Test (CMT), somatic cell count (SCC) and microbiological profile as well as to determine the biochemical profile, especially acute phase proteins, in blood serum and whey from goats with naturally occurring clinical or subclinical mastitis. Three experimental groups were formed by 30 mammary glands from healthy goats with milk samples negative to strip cup test, CMT and microbiological examination (control group G1); 30 mammary glands with milk samples negative to strip cup test but with moderate (2+) or intense (3+) reaction in CMT and microbiological examination (group with subclinical mastitis G2), and 12 mammary glands with positive results to strip cup test and microbiological examination (group with clinical mastitis G3). After asepsis of the teats milk samples were collected for SCC, microbiological culture, and to determine the biochemical profile in whey, including proteinogram by fractionation in poliacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). At the same time, blood samples were obtained to determine the serum biochemical profile. Automatic and microscopic methods were higher in milk samples from goats with subclinical mastits (G2: 4,500.000 cells/mL e 20,830,000 cells/mL, respectively) e with clinical mastitis (G3: 7,500,000 células/mL e 39,100,000 cells/mL, respectively). Staphylococcus aureus, Coagulase-negative Staphylococcus (CNS), Coagulase-positive Staphylococcus (CPS), Corynebaterium spp. and Streptococcus spp. were the microorganisms isolated in milk samples from goats of G2 and G3. Whey samples from goats of G2 and G3 showed higher activity of alkaline phosphatase (G2: 122 U/L and G3: 207 U/L) and gamma-glutamyltransferase (G2: 483 U/L and G3: 571 U / L), and higher concentrations of albumin (G2: 0.18 g/dL and G3: 0.29 g/dL), total protein (G2: 1.50 g/dL and G3: 1.67 g/dL), chlorides (G2 190 mEq/L and G3: 202 mEq/L), iron (G2: 13.4 mg/dL and G3: 19.6 mg/dL), sodium (G2: 152 mMol/L and G3: 181 mMol/L), IgA (G2: 3.26 mg/dL and G3: 3.65 mg/dL), lactoferrin (G2: 111 mg/dL and G3: 127 mg/dL), IgG heavy chain IgG - IgG-HC (G2 : 94.9 mg/dL and G3: 144 mg/dL), IgG light chain - IgG-LC (G2: 73.0 mg/dL and G3: 98.4 mg/dL), -casein (G2: 2.13 mg/dL and G3: 3.89 mg/dL) and -lactoglobulin (G2: 693 mg/ dL). Blood samples from goats of G2 and G3 had lower serum concentrations of urea (G2: 56.2 mg/dL and G3: 44.2 mg/dL) and chlorides (G2: 110 mEq/L and G3: 109 mEq/L), and higher concentrations of IgA (G3: 49.4 mg/dL), ceruloplasmin (G2: 30.1 mg/dL and G3: 46.9 mg/dL), transferrin (G2: 497 mg/dL), IgG-HC (G2: 1,307 mg/dL and G3: 1,152 mg / dL), IgG-LC (G2: 805 mg/dL and G3: 723 mg/dL), haptoglobin (G2: 52.5 mg/dL and G3: 40.2 mg/dL) and acid 1-glycoprotein (G2: 37.7 mg/dL). In conclusion, The use of diagnostic tools such as the strip cup test, CMT and SCC should be used together for proper evaluation of goat milk secretion and whenever possible with the microbiological exam to aid the diagnostic . S. aureus was the most isolated microorganism in this study being 63.3 % and 75 % respectively from milk secretions from goats from G2 and G3 , being the predominating infectious contagious agents. The biochemical profile, in particular of acute phase proteins (APP ) of whey serum is a best clinical indicator of clinical and subclinical mastitis than the blood chemical profile . Finally, it is noteworthy that the proteins of molecular weight of 39,000 Da and 19,000 Da, were only identified in whey serum from G3 goats and can be considered as a marker of clinical mastitis .

Proteinograma e teores de cobre, ferro e zinco no soro sanguíneo de ovelhas da raça Santa Inês com mastite experimental por Staphylococcus aureus / Proteinogram and serum concentrations of copper, iron and zinc in Santa Inês ewes with Staphylococcus aureus experimentally induced mastitis

Este estudo teve por objetivo avaliar o proteinograma e os teores de cobre, ferro e zinco no soro sangüíneo de ovelhas com mastite induzida por cepa de campo de Staphylococcus aureus. Foram utilizadas 10 ovelhas da raça Santa Inês, primíparas, recém-paridas, com aproximadamente dois anos de idade e bom estado nutricional. Inoculou-se na metade direita da glândula mamária 1,0x10(4) UFC/mL da bactéria, enquanto que a metade esquerda serviu como controle. Os animais foram acompanhados diariamente e a partir do diagnóstico clínico de mastite, procedeu-se colheita do material para realização do proteinograma sérico em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e para determinação do teor plasmático de fibrinogênio e das concentrações séricas de cobre, ferro e zinco em 16 momentos a saber: antes da inoculação (controle) e 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h, 108h, 120h, 132h, 168h, 180h, 288h e 336h após a inoculação (p.i.). Todas as ovelhas apresentaram quadro clínico de mastite, com perda da funcionalidade da glândula mamária. O proteinograma permitiu a identificação de 23 proteínas, cujos pesos moleculares (PM) variaram de 26.000 a 185.000 dáltons (Da), incluindo proteínas de fase aguda, IgG e IgA. Notou-se aumento significativo nas concentrações de haptoglobina e ceruloplasmina, assim como de IgG e IgA. Não se constatou alteração nos teores de antitripisina e de glicoproteína ácida .Verificou-se diminuição nos teores de ferro e zinco e elevação na concentração de cobre. Constatou-se correlação positiva entre o teor plasmático de fibrinogênio e as concentrações séricas de ceruloplasmina (r=0,74), a haptoglobina (r=0,62) e IgA(r=0,62). Estes resultados mostram a importância das proteínas de fase aguda ceruloplasmina e haptoglobina como indicadores auxiliares da infecção intramamária de ovelhas, assim como ratifica a relevância do fibrinogênio como marcador inflamatório em razão de sua alta correlação com as proteínas ...(AU)

The aim of the present study was to evaluate the effect of Staphylococcus aureus experimentally induced mastitis on proteinogram and serum concentrations of cupper, iron and zinc levels of Santa Ines primiparous ewes . The right mammary gland of ten healthy ewes was inoculated with 1,0x10(4) UFC/mL of S. aureus. Clinical examination and determination of serum concentrations of proteins by electrophoresis in polyacrylamide gel (SDS-PAGE), cupper, iron and zinc, as well plasma level of fibrinogen were measured before the inoculation (control) and 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h, 108h, 120h, 132h, 168h, 180h, 288h and 336h after bacteria inoculation. All animals experimentally infected presented clinical mastitis and subsequent loss of mammary gland function. The electrophoretogram allowed the identification of 23 proteins with molecular weights (MW) ranged from 26.000 to 185.000 daltons (Da) including acute-phase proteins, IgG and IgA. A significant increase (P<0,05) in haptoglobin, ceruloplasmin, IgG and IgA concentrations was observed. Antitrypsin and acid glicoprotein concentrations did not alter. The levels of iron and zinc decreased and the cupper concentration increased . A positive correlation between plasma fibrinogen and serum ceruloplasmin (r=0.74), haptoglobin (r=0.62) and IgA (r=0.62) was also identified. Results showed the importance of ceruloplasmin and haptoglobin as acute-phase proteins in ewes with intramammary infections and confirms fibrinogen as an inflammatory marker because its high correlation with specific proteins. The alterations in the serum levels of Cu, Fe and Zn suggest the action of inflammatory mediators triggered by S. aureus.(AU)

Estudo das concentrações séricas de amilóide A, alpha-1 glicoproteína ácida e proteína C reativa em felinos com linfoma durante a quimioterapia / Study of amyloid A, alpha-1 acid glycoprotein and C-reactive protein concentrations in feline lymphoma during chemotherapy

Linfomas pertencem a um grupo de neoplasias que têm em comum a origem em células linforreticulares, manifestando-se geralmente em tecidos linfóides. Em sua evolução, há uma reação generalizada do organismo de forma não específica contra as alterações sistêmicas que comprometem a homeostase, conhecida como resposta de fase aguda, a qual leva a uma importante alteração na síntese de proteínas pelo fígado, resultando no aumento de algumas proteínas conhecidas como proteínas de fase aguda, sendo as de maior relevância a amiloide sérica A, α-1 glicoproteína ácida e proteína C reativa. Foram objetivos deste estudo, definir o perfil eletroforético do felino com linfoma e avaliar as concentrações séricas de amilóide sérica A (ASA), α-1 glicoproteína ácida (GPA) e proteína C reativa (PCR) destes animais durante a quimioterapia, avaliando-se como possíveis indicadores de remissão de doença. Os grupos de estudo foram constituídos por 20 felinos clinicamente normais (controle) e 16 felinos com linfoma (experimental). Foram excluídos pacientes que apresentavam tratamentos prévios e/ou doenças concomitantes. A eletroforese das proteínas séricas foi realizada em tiras de acetato de celulose. Para as mensurações de ASA, GPA e PCR utilizaram-se kits comerciais, sendo as mesmas determinadas no grupo controle, uma única vez e, no grupo experimental, quando do diagnóstico e a cada 2 semanas durante 3 meses de tratamento. A análise estatística foi realizada com testes paramétricos, sendo o teste t não pareado utilizado para comparações entre os grupos controle e experimental no momento do diagnóstico e análise de variância simples (ANOVA), seguida do teste de comparações múltiplas de Tukey, para comparar o grupo experimental no diagnóstico e semanas de tratamento. Foram observadas diferenças significantes entre os grupos controle e experimental no momento do diagnóstico, com relação à GPA (p<0,0001), ASA (p=0,0028), PCR (p=0,0003), globulina (p=0,0087), relação albumina: globulinas (p<0,0001) e α-2 globulinas (p=0,0082). Quando se compararam os achados do grupo experimental no diagnóstico e nas semanas de tratamento houve diferença nos resultados referente à GPA (p=0,0021) e ASA (p=0,0053), enquanto os níveis de PCR não se alteraram significativamente (p=0,4510). Concluiu-se que os felinos com linfoma apresentaram uma expressiva resposta de fase aguda, caracterizada por aumento das concentrações séricas de α-1 glicoproteína ácida, amiloide sérica A e proteína C reativa, sendo a amilóide sérica A e α-1 glicoproteína ácida potenciais indicadores de remissão de doença naqueles pacientes que estavam com suas concentrações elevadas quando do diagnóstico

Lymphoma belongs to a group of malignancies that have in common their origin in lymphoreticular cells, and is generally manifested in lymphoid tissues. In its evolution, there is a generalized reaction of the organism against a non-specific systemic conditions that compromises the homeostasis, known as acute phase response, which leads to a significant change in protein synthesis by the liver, resulting in an increase of some proteins known as acute phase proteins, and the most relevant are serum amyloid A, α-1 acid glycoprotein and C-reactive protein. This study was designed to define the electrophoretic profile of feline lymphoma and to evaluate serum concentrations of serum amyloid A (ASA), α-1 acid glycoprotein (GPA) and C-reactive protein (PCR) of these animals during chemotherapy, evaluated as possible indicators of disease remission. The study groups consisted of 20 clinically normal cats (control) and 16 cats with lymphoma (experimental). We excluded patients who had previous treatments and/or concomitant diseases. Electrophoresis of serum proteins was conducted on strips of cellulose acetate. For measurements of ASA, GPA and PCR we used commercial kits, which are then determined, in the control group, only once and, in the experimental group, at diagnosis and every 2 weeks during 3 months of treatment. Statistical analysis was performed with parametric tests, where unparied t test was used for comparisons between control and experimental groups at diagnosis and simple analysis of variance (ANOVA) test followed by Tukey/'s multiple comparisons to compare the experimental group in the diagnosis and weeks of treatment. There were significant differences between control and experimental groups at diagnosis of α-1 acid glycoprotein (p<0,0001), serum amyloid A (p=0,0028), C-reactive protein (p=0,0003), total globulin (p=0,0087), albumin: globulin (p<0,0001) and α-2 globulins (p=0,0082). When comparing the experimental group in the diagnosis and weeks of treatment was significant in the results of α-1 acid glycoprotein (p=0,0021) and serum amyloid A (p=0,0053), whereas C-reactive protein did not change significantly (p=0,4510). It is concluded that cats with lymphoma have an expressive acute phase response, characterized by increased in serum concentrations of serum amyloid A, α-1 acid glycoprotein and C-reactive protein, and the serum amyloid A and alpha-1 acid glycoprotein reference potential indicators of remission in those patients who were with their high concentrations at diagnosis

Estudo das concentrações séricas de amilóide A, alpha-1 glicoproteína ácida e proteína C reativa em felinos com linfoma durante a quimioterapia / Study of amyloid A, alpha-1 acid glycoprotein and C-reactive protein concentrations in feline lymphoma during chemotherapy

Linfomas pertencem a um grupo de neoplasias que têm em comum a origem em células linforreticulares, manifestando-se geralmente em tecidos linfóides. Em sua evolução, há uma reação generalizada do organismo de forma não específica contra as alterações sistêmicas que comprometem a homeostase, conhecida como resposta de fase aguda, a qual leva a uma importante alteração na síntese de proteínas pelo fígado, resultando no aumento de algumas proteínas conhecidas como proteínas de fase aguda, sendo as de maior relevância a amiloide sérica A, α-1 glicoproteína ácida e proteína C reativa. Foram objetivos deste estudo, definir o perfil eletroforético do felino com linfoma e avaliar as concentrações séricas de amilóide sérica A (ASA), α-1 glicoproteína ácida (GPA) e proteína C reativa (PCR) destes animais durante a quimioterapia, avaliando-se como possíveis indicadores de remissão de doença. Os grupos de estudo foram constituídos por 20 felinos clinicamente normais (controle) e 16 felinos com linfoma (experimental). Foram excluídos pacientes que apresentavam tratamentos prévios e/ou doenças concomitantes. A eletroforese das proteínas séricas foi realizada em tiras de acetato de celulose. Para as mensurações de ASA, GPA e PCR utilizaram-se kits comerciais, sendo as mesmas determinadas no grupo controle, uma única vez e, no grupo experimental, quando do diagnóstico e a cada 2 semanas durante 3 meses de tratamento. A análise estatística foi realizada com testes paramétricos, sendo o teste t não pareado utilizado para comparações entre os grupos controle e experimental no momento do diagnóstico e análise de variância simples (ANOVA), seguida do teste de comparações múltiplas de Tukey, para comparar o grupo experimental no diagnóstico e semanas de tratamento. Foram observadas diferenças significantes entre os grupos controle e experimental no momento do diagnóstico, com relação à GPA (p<0,0001), ASA (p=0,0028), PCR (p=0,0003), globulina (p=0,0087), relação albumina: globulinas (p<0,0001) e α-2 globulinas (p=0,0082). Quando se compararam os achados do grupo experimental no diagnóstico e nas semanas de tratamento houve diferença nos resultados referente à GPA (p=0,0021) e ASA (p=0,0053), enquanto os níveis de PCR não se alteraram significativamente (p=0,4510). Concluiu-se que os felinos com linfoma apresentaram uma expressiva resposta de fase aguda, caracterizada por aumento das concentrações séricas de α-1 glicoproteína ácida, amiloide sérica A e proteína C reativa, sendo a amilóide sérica A e α-1 glicoproteína ácida potenciais indicadores de remissão de doença naqueles pacientes que estavam com suas concentrações elevadas quando do diagnóstico (AU)

Lymphoma belongs to a group of malignancies that have in common their origin in lymphoreticular cells, and is generally manifested in lymphoid tissues. In its evolution, there is a generalized reaction of the organism against a non-specific systemic conditions that compromises the homeostasis, known as acute phase response, which leads to a significant change in protein synthesis by the liver, resulting in an increase of some proteins known as acute phase proteins, and the most relevant are serum amyloid A, α-1 acid glycoprotein and C-reactive protein. This study was designed to define the electrophoretic profile of feline lymphoma and to evaluate serum concentrations of serum amyloid A (ASA), α-1 acid glycoprotein (GPA) and C-reactive protein (PCR) of these animals during chemotherapy, evaluated as possible indicators of disease remission. The study groups consisted of 20 clinically normal cats (control) and 16 cats with lymphoma (experimental). We excluded patients who had previous treatments and/or concomitant diseases. Electrophoresis of serum proteins was conducted on strips of cellulose acetate. For measurements of ASA, GPA and PCR we used commercial kits, which are then determined, in the control group, only once and, in the experimental group, at diagnosis and every 2 weeks during 3 months of treatment. Statistical analysis was performed with parametric tests, where unparied t test was used for comparisons between control and experimental groups at diagnosis and simple analysis of variance (ANOVA) test followed by Tukey\'s multiple comparisons to compare the experimental group in the diagnosis and weeks of treatment. There were significant differences between control and experimental groups at diagnosis of α-1 acid glycoprotein (p<0,0001), serum amyloid A (p=0,0028), C-reactive protein (p=0,0003), total globulin (p=0,0087), albumin: globulin (p<0,0001) and α-2 globulins (p=0,0082). When comparing the experimental group in the diagnosis and weeks of treatment was significant in the results of α-1 acid glycoprotein (p=0,0021) and serum amyloid A (p=0,0053), whereas C-reactive protein did not change significantly (p=0,4510). It is concluded that cats with lymphoma have an expressive acute phase response, characterized by increased in serum concentrations of serum amyloid A, α-1 acid glycoprotein and C-reactive protein, and the serum amyloid A and alpha-1 acid glycoprotein reference potential indicators of remission in those patients who were with their high concentrations at diagnosis (AU)

Effects of budesonide and probiotics enemas on the systemic inflammatory response of rats with experimental colitis / Efeito de enemas contendo budesonida e probióticos na resposta inflamatória sistêmica de ratos com colite experimental

PURPOSE: The aim of this study was to investigate the effect of enemas containing probiotics and budesonide on the systemic inflammatory response in experimental colitis. METHODS: Fifty male Wistar rats with experimental colitis induced by 10 percent acetic acid enema were randomized to five groups (10 rats each) according to the treatment: group 1 - saline solution, group 2 - budesonide (0.75 mg/kg/day), group 3 - probiotics (1mg/day), group 4 - probiotics plus budesonide, and group 5 - control, with not-treated rats. The following variables were studied: body weight, serum levels of albumin, C-reactive protein and interleucine-6 (IL-6). RESULTS: All animals lost weight between the beginning and the end of the experiment (280+ 16 mg versus 249+21 mg, p< 0.001). There was a significant decrease in the serum albumin between the normal pre-induction level (3.45 + 0.49mg/dL) and the 1st day after colitis induction (1.61+051mg/dL, p< 0.001) in all treated groups when compared to the control group. C- reactive protein increased after induction and diminished on the 7th day in all groups. In the control group there was an increase in the IL-6 after colitis induction. None of the treated groups significantly differed from IL-6 pre-colitis status (p>0.05). Only probiotic rats presented a significant decrease of IL-6 than controls (0,30±0,08 mg/dL vs. 0,19±0,03 mg/dL; p<0.01). CONCLUSION: Probiotic associated with budesonida Probiotics are effective to diminished inflammatory status mediated by IL-6 in experimental colitis.(AU)

OBJETIVO: Investigar o efeito da administração retal de probióticos e budesonida na resposta inflamatória de ratos com colite experimental. MÉTODOS: Cinqüenta ratos Wistar com colite experimental induzida pelo acido acético à 10 por cento foram randomizados em 5 grupos (n=10 por grupo) para diferentes tratamentos: grupo 1 - solução fisiológica; grupo 2 budesonida (0,75mg/kg/dia); grupo 3 - probióticos (1 g/dia); grupo 4 - probióticos associados a budesonida; e finalmente grupo 5 - controle, composto por ratos sem tratamento. As seguintes variáveis foram estudadas: peso corporal, dosagens séricas de albumina, proteína C reativa (PCR) e interleucina-6 (IL-6). RESULTADOS: Todos os animais perderam peso entre o inicio e o fim do experimento (280±16 vs 249±21g; p<0.001). Ocorreu uma queda significativa da albumina sérica entre o normal (3,45±0,49g/dL) e o 1º dia de colite (grupo 5 = 1,61±0,51 g/dL; p <0.001) em todos grupos com tratamento em relação ao grupo controle. A PCR aumentou após a indução da colite, diminuindo no sétimo dia de colite em todos os grupos. No grupo controle houve um aumento da IL-6 após a indução da colite. Nenhum dos grupos de tratamento diferiu significantemente dos valores de IL-6 antes da indução a colite (p>0.05). As comparações entre o grupo controle (0,30±0,08 mg/dL) e outros mostraram que houve uma queda significante nos níveis de IL-6 apenas no grupo probiótico (0,19±0,03 mg/dL; p<0.01). CONCLUSÃO: Probióticos são efetivos na diminuição do estado inflamatório mediado pela IL-6 na colite experimental.(AU)

Produção dos fragmentos de anticorpos recombinantes scFv-N e scFv-S1 e suas aplicações na detecção e diferenciação do Vírus da Bronquite Infecciosa

O vírus da Bronquite infecciosa (VBI) é um Coronavírus aviário que infecta aves domésticas de corte e postura, ocasionando grandes perdas econômicas na indústria avícola. Dada a natureza altamente contagiosa e aguda da doença, há uma grande necessidade do desenvolvimento de métodos diagnósticos que possam ajudar na detecção e/ou caracterização de estirpes variantes do VBI. Sendo assim, para auxiliar no diagnostico laboratorial da infecção, foi construída uma biblioteca de fragmentos de anticorpos monoclonais pela técnica de Phage-display. Para tanto, após a imunização de galinhas com a estirpe vacinal H120, foi extraído o RNA total do baço das aves imunizadas e amplificadas as cadeias variáveis leve e pesada que foram unidas por linker, originando o fragmento gênico de cadeia única scFv. Após a realização de três ciclos de seleção foram obtidos 400 clones que foram avaliados em ensaios de ELISA e Western blotting para averiguação da especificidade dos mesmos frente às proteínas da estirpe H120. Após realização dos testes foram selecionados dois clones, um que apresentou grande reatividade para com a proteína de nucleocapsídeo (N) (scFv-N) e o outro com reatividade para com a subunidade 1 da glicoproteína de superfície (S) (scFv-S1). O anticorpo scFv-S1 quando utilizado em ensaio de vírus-neutralização em ovos embrionados mostrou titulo significativo de proteção. Já em testes de ELISA utilizando estirpes de referência e isolados brasileiros de campo do VBI, o anticorpo scFv-N foi capaz de detectar todas as estirpes (H120, M41, Arkansas, IBVPR05, IBVPR02, IBVPR01, IBVSC01), enquanto que o scFv-S1 pode discriminar as estirpes pertencentes ao sorotipo Massachusetts (H120, M41 e IBVSC01) das demais estirpes variantes avaliadas. Os fragmentos de anticorpos scFv-N e scFv-S1 também mostraram bons resultados quando utilizados na técnica...

Infectious bronchitis virus (IBV), the coronavirus of the chicken, is one of the main causes of economic loss within the poultry industry, affecting the performance of meattype and egg-laying domestic fowls. Given the highly contagious and acute nature of the disease, there is an urgent need for the development of diagnostic assays that can detect and/or characterize IBV strains. In order to improve the laboratory diagnosis of IBV infection, phage-displayed recombinant antibody library derived from splenic mRNA of chickens immunized with H120 vaccine strain of infectious bronchitis virus (IBV) was constructed as single chain variable fragments (scFv) by overlap extension polymerase chain reaction (PCR) of the individual heavy (VH) and light (VL) chain variable gene segments. After three rounds of panning selection, ten scFv phage display antibodies of 400 randomly chosen clones were demonstrated to react with IBV antigens by ELISA. The western blot analysis selected two scFv antibodies reacting strongly with nucleocapsid (N) (scFv-N) protein or subunit 1 of spike glycoprotein (S1) (scFv-S1) of IBV. The anti-S1 scFv antibody showed a significant neutralization titre in embryonating chicken egg test. In ELISA analysis using reference IBV strains and Brazilian field isolates, the anti-N scFv antibody was able to detect all strains (H120, M41, ARKANSAS, IBVPR05, IBVPR02, IBVPR01, IBVSC01), while the anti-S1 could discriminate Massachusetts serotype (H120, M41 and IBVSC01) between variant strains. A scFv-based indirect immunoperoxidase (IP) procedure was also applied to detect infectious bronchitis virus (IBV) antigens in formalin-fixed tracheal tissue sections. Thus, the results showed that scFv-N and scFv-S1 antibodies can be used for the detection and differentiation of IBV strains