Histopathology and serology reaction to an immune complex infectious bursal disease vaccine (V877 strain) in SPF and commercial birds / Reação histopatológica e sorológica a uma vacina de imunocomplexo contra gumboro (cepa V877) em aves SPF e comerciais

The purpose of this study was to investigate the effect of a new infectious bursal disease (IBD) immune complex vaccine on immune system response in both specific pathogen-free (SPF) and commercial birds. Evaluation of response to the vaccination in the two experiments was done by histopathological examination and serology. The results of this study have shown that immune complex vaccine with the V877 strain is quite safe in White Leghorn SPF birds in which there has been no participation of maternal antibodies. In commercial birds was also observed that the immune complex vaccine with the V877 strain acted synergistically with different levels of passive antibodies and the vaccine virus began to replicate as passive immunity decreased to provide the animal active immunological response.

O objetivo desse estudo foi investigar o efeito de uma nova vacina de imunocomplexo contra a doença de Gumboro sobre o sistema imune de aves SPF e comerciais. A avaliação da resposta à vacinação foi realizada por meio de exame histopatológico e sorologia. Os resultados desse estudo demonstraram que a vacina de imunocomplexo com cepa V877 contra Gumboro é muito segura mesmo em aves SPF da linhagem White Leghorn nas quais não existia a participação de imunidade materna. Em aves comerciais também foi demonstrado que a vacina de imunocomplexo com a cepa V877 atuou sinergicamente com diferentes níveis de anticorpos passivos maternais, iniciando a replicação do vírus vacinal a partir do momento que a imunidade passiva diminui, para promover uma resposta imunológica ativa.

Histopathology and serology reaction to an immune complex infectious bursal disease vaccine (V877 strain) in SPF and commercial birds / Reação histopatológica e sorológica a uma vacina de imunocomplexo contra gumboro (cepa V877) em aves SPF e comerciais

The purpose of this study was to investigate the effect of a new infectious bursal disease (IBD) immune complex vaccine on immune system response in both specific pathogen-free (SPF) and commercial birds. Evaluation of response to the vaccination in the two experiments was done by histopathological examination and serology. The results of this study have shown that immune complex vaccine with the V877 strain is quite safe in White Leghorn SPF birds in which there has been no participation of maternal antibodies. In commercial birds was also observed that the immune complex vaccine with the V877 strain acted synergistically with different levels of passive antibodies and the vaccine virus began to replicate as passive immunity decreased to provide the animal active immunological response.(AU)

O objetivo desse estudo foi investigar o efeito de uma nova vacina de imunocomplexo contra a doença de Gumboro sobre o sistema imune de aves SPF e comerciais. A avaliação da resposta à vacinação foi realizada por meio de exame histopatológico e sorologia. Os resultados desse estudo demonstraram que a vacina de imunocomplexo com cepa V877 contra Gumboro é muito segura mesmo em aves SPF da linhagem White Leghorn nas quais não existia a participação de imunidade materna. Em aves comerciais também foi demonstrado que a vacina de imunocomplexo com a cepa V877 atuou sinergicamente com diferentes níveis de anticorpos passivos maternais, iniciando a replicação do vírus vacinal a partir do momento que a imunidade passiva diminui, para promover uma resposta imunológica ativa.(AU)

AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIVIRAL DE DUAS FRAÇÕES DE SAPONINAS DE QUILLAJA SPP. FRENTE À ARBOVÍRUS E FORMULAÇÃO DE MATRIZES ISCOM

Saponinas são moléculas anfifílicas que apresentam versatilidade no que diz respeito a suas propriedades biológicas. Uma das propriedades biológicas mais estudadas remete à atividade imunoadjuvante, sendo a fração comercial Quil-A®, obtida a partir das cascas de Quillaja saponaria amplamente pesquisada frente ao sistema imune. O principal limitante quanto ao seu uso em humanos é a toxicidade. Uma alternativa para atenuar a citotoxicidade é a complexação com colesterol, fosfatidilcolina e um antígeno, originando complexos imunoestimulantes (ISCOMs). Também é descrita a atividade antiviral para saponinas frente a vírus envelopados e não envelopados de DNA e RNA. Uma questão pertinente ao estudo das saponinas de Q. saponaria remete à depredação da espécie, uma vez que as cascas constituem a principal fonte de obtenção. Neste contexto, a espécie congênere Q. brasiliensis vem sendo estudada como uma alternativa, uma vez que as folhas são ricas em saponinas. O presente trabalho propôs-se a avaliar o potencial antiviral de uma fração purificada de saponinas de Q. brasiliensis denominada Fração B e de uma fração comercial de Q. saponaria denominada Quil-A® frente ao vírus da Febre Amarela (YFV) e ao vírus Chikungunya (CHIKV), bem como realizar um estudo de formulação de matrizes ISCOM. Para tanto, foi avaliada a citotoxicidade da Fração B e de Quil-A® em células VERO (por serem permissivas à replicação viral) por meio do ensaio de MTT. A avaliação da atividade antiviral foi realizada pelos ensaios de inibição do efeito citopático e por redução no número de placas de lise. A formação de matrizes ISCOM foi realizada através da técnica de injeção de etanol, sendo caracterizadas posteriormente por microscopia eletrônica de transmissão (MET), espalhamento de luz dinâmico e potencial zeta. A Fração B se mostrou ligeiramente menos citotóxica que Quil-A® em todos os tempos de exposição testados. As saponinas demonstraram ausência de atividade frente ao YFV, a qual foi confirmada através do ensaio de inibição do efeito citopático. Por outro lado, as saponinas foram eficazes ao bloquear a replicação viral do CHIKV, atingindo percentuais de inibição de 95% para Quil-A® e 97% para Fração B. Quanto às matrizes ISCOMs, foram elaboradas sete formulações, sendo uma utilizando Quil-A® (controle positivo) e as demais Fração B. A proporção descrita na literatura como otimizada à formulação dos complexos para Quil-A®, 63:12:24, também resultou em mais estruturas típicas para Fração B. Mesmo não apresentando ação frente ao YFV, as saponinas mostraram-se promissores agentes antivirais. Desta forma, a avaliação dos mecanismos pode auxiliar no entendimento de como estas atuam no bloqueio da replicação viral. No que diz respeito às matrizes ISCOM, com base na proporção otimizada para formulação pode-se realizar a avaliação das propriedades biológicas das estruturas com ou sem antígenos.

Saponins are amphiphilic molecules that exhibit versatility regarding their biological properties. One of the most studied biological properties refers to immunoadjuvant activity. Quil-A® fraction is a commercially available fraction obtained from the barks of Quillaja saponaria and it is extensively researched about its immunostimulatory activity. The main limiting factor for its use in humans is toxicity. An alternative to attenuate cytotoxicity is the complexation with cholesterol, phosphatidylcholine and an antigen, forming immunostimulating complexes (ISCOMs). Another biological property refers to the antiviral activity, and it is known that they act against enveloped and nonenveloped DNA and RNA viruses. A concern involving the study of the saponins from Q. saponaria refers to the depredation of the specie, since the barks are the main source of saponins. In this context, the congener specie Quillaja brasiliensis has been studied as an alternative once the leaves are rich in saponins. The present work aimed to evaluate the antiviral potential of a purified fraction of saponins from Q. brasiliensis named Fraction B against Yellow Fever Virus (YFV) and Chikungunya Virus (CHIKV), as well as to perform a formulation study of ISCOM matrices. The cytotoxicity of Fraction B and Quil-A® was evaluated in VERO cells (permissive to viral replication) using the MTT assay. The antiviral screening was performed by the cytopathic effect inhibition assay and by plaques reduction assay. ISCOM matrices were formulated by ethanol injection technique. Structures were characterized by transmission electron microscopy (TEM), dynamic light scattering and zeta potential. Fraction B was slightly less cytotoxic than Quil-A® in all exposure times tested. Saponins demonstrated absence of activity against YFV, which was confirmed by the cytopathic effect inhibition assay. On the other hand, they were effective blocking CHIKV replication, reaching 95% inhibition percentages for Quil-A® and 97% for Fraction B. As for the ISCOMs matrices, seven formulations were prepared, one using Quil- A® (positive control) and the remaining using Fraction B. The optimized proportion related for Quil-A® 63:12:24 also resulted in the highest number of typical ISCOM structures for Fraction B. Though they did not inhibit viral replication for YFV, saponins were promising antiviral agents for CHIKV. The evaluation of the antiviral mechanisms may help understanding how they act in blocking viral replication. Regarding the ISCOM matrices, the biological properties of the structures with or without an antigen can be determined based on the optimized formulation ratios.

Saponinas de Quillaja brasiliensis: potencial imunoadjuvante e mecanismos celulares e moleculares de ação

A formulação de vacinas efetivas frequentemente requer a adição de adjuvantes capazes de otimizar as respostas imunes humoral e celular. Com o objetivo principal de contribuir para o desenvolvimento de novos adjuvantes, este trabalho foi desenvolvido buscando aprofundar o conhecimento do mecanismo de ação imunoadjuvante de preparações de saponinas de Quillaja brasiliensis e suas formulações em complexos imunoestimulantes do tipo ISCOM. Como a toxicidade das saponinas é um fator crítico para seu uso em preparações vacinais, inicialmente foram realizados ensaios visando comparar a toxicidade in vitro e in vivo de saponinas extraídas de Quillaja brasiliensis com saponinas de ação imunoestimulante reconhecidas, extraídas de Quillaja saponaria (Quil A). O potencial imunoadjuvante das saponinas solúveis de Q. brasiliensis foi avaliado utilizando preparações com dois antígenos: ovalbumina (OVA) e vírus da diarreia viral bovina (BVDV). Numa etapa seguinte, a atividade imunoadjuvante de ISCOMs preparados com saponinas de Q. brasiliensis foram avaliadas em duas vias de administração. O potencial imunomodulador dessas saponinas foi verificado em experimentos de recrutamento celular in vivo e expressão de genes relacionados ao sistema imune. Os resultados mostraram que saponinas de Q. brasiliensis são menos tóxicas que as de Quil A e apresentam atividade adjuvante similar, caracterizada por um perfil Th1/Th2 balanceado. Q. brasiliensis promoveu uma forte resposta imune celular do tipo Th1 caracterizada por uma robusta reação de hipersensibilidade celular tardia (DTH) e pela produção de IFN- e IL-2. A resposta imune induzida pelos ISCOMs produzidos a partir de saponinas de Q. brasiliensis foram superiores às respostas induzidas pelas saponinas solúveis. Os testes in vivo mostraram que as saponinas de Q. brasiliensis promovem um ambiente imunocompetente no local da inoculação e nos linfonodos drenantes. Esse ambiente foi caracterizado pelo intenso influxo celular (neutrófilos, células NK, células dendríticas, linfócitos T e B), além da expressão diferencial de genes relacionados à ativação do sistema imune. Em suma, os resultados mostraram que saponinas de Q. brasiliensis são seguras e seus potencial adjuvante foi equivalente a saponinas com ação imunoadjuvante conhecida de Q. saponaria.

Effective vaccine formulations frequently require addition of adjuvants able to optimize the cellular and humoral immune responses. With the goal to contribute to the development of new classes of adjuvants, this work was developed in order to achieve deep knowledge on the imunoadjuvant mode of action for Quillaja brasiliensis saponins incorporated into immunostimulant complex (ISCOM). The toxicity of saponins is a critical factor for its usage as vaccine preparations. At first, in vivo and in vivo citoxicity assays were carried out to compare to the effects between saponins extracted from Quillaja brasiliensis and the immunostimulant saponins already known from Quillaja saponaria (Quil A). Imunoadjuvant potential of soluble saponins from Q. brasilienis was evaluated using preparations of two antigens: ovoalbumin (OVA) and bovine viral diarrhea (BVD). As a next step, imunoadjuvant activity of ISCOMS prepared with Q. brasiliensis saponins was evaluated using two routes of administration. The immunomodulatory potential of these saponins was tested during in vivo cell recruitment assays and gene expression related to immune system. Our results demonstrated that Q. brasilienis saponins are less toxic than those from Quil A and presenting similar adjuvant activity, characterized by a Th1/Th2 balance profile. Q.brasiliensis induced a strong Th1 cell-mediated immune responses indicated by a robust delayed type hypersensitivity (DTH) as well as IFN- and IL-2 production. The immune response induced by ISCOMs from Q. brasiliensis saponins was higher than the one induced by soluble saponins. In vivo experiments indicated that saponins from Q. brasiliensis generate an immunocompetent environment at the injection site and draining lymph nodes. This environment was characterized by an intense cell influx (neutrophils, NK cells, dendritic cells, B and T cells) as well as differential gene expression related to immune system activation. In essence, the results showed that saponins from are safe and their adjuvant potential was equivalent to saponins with imunoadjuvant activity of Q. saponaria.

Vaccination of pigs with Toxoplasma gondii antigens incorporated in immunostimulating complexes (iscoms) / Vacinação de suínos com antígenos de Toxoplasma gondii incorporados a complexos imunoestimulantes (iscoms)

Immunity to Toxoplasma gondii was studied in pigs, after vaccination with T. gondii antigens incorporated into immunostimulating complexes. Nine pigs (group 1 - G1) were inoculated subcutaneously with T. gondii iscoms (LIV-5 sample) and three doses were given at 21 and 13 day-intervals. The results were compared in other three groups of nine pigs each: animals in group 2 (G2) were immunized with the LIV-5 antigens without Quil A, animals in group 3 (G3) were inoculated with tachyzoites of RH T. gondii isolate, and animals in group 4 (G4) received no vaccination. Four animals were neither vaccinated nor challenged with T. gondii (group 5 - G5). Thirty days after vaccination, pigs were challenged orally with 5x10(4) oocysts at AS-28 T. gondii isolate. Euthanasia was carried out 47 days after challenge and specimens of the heart, muscle, brain, liver, tongue and retina were inoculated into mice. Three out of nine pigs from G2 and one out of nine pigs from G4 showed hypertermia after the challenge. Antibody response was analysed by indirect fluorescent antibody test. The first iscom immunization (G1) induced low antibody levels, the second and third produced high antibody levels, similarly to the RH isolate infection (G3). Western blotting analysis indicated that the antibody response in animals in G1, after challenge, was more intense than in animals in the non-vaccinated group. T. gondii was not isolated by bioassays from tissues of iscom vaccinated pigs, while recovery was obtained from four animals in G4, one in G2 and one in G3.(AU)

A imunidade ao Toxoplasma gondii foi estudada em suínos, após a vacinação com antígenos de T. gondii incorporados a complexos imunoestimulantes (iscoms). Nove animais (grupo 1-G1) foram inoculados, via subcutânea, com três doses de iscoms (amostra LIV-5) em intervalos de 21 e 13 dias. Para comparar os resultados obtidos, outros três grupos com nove suínos cada foram formados: o grupo 2 (G2) foi imunizado com os antígenos da amostra LIV-5 sem o iscom, o grupo 3 (G3) foi inoculado com taquizoítas da amostra RH de T. gondii e o grupo 4 (G4) não foi imunizado. Quatro animais não receberam a vacina nem o desafio com o T. gondii (grupo 5-G5). Trinta dias após as imunizações os suínos foram desafiados, via oral, com 5x10(4) oocistos da amostra AS-28 de T. gondii. Os animais foram sacrificados 47 dias após o desafio e fragmentos de coração, músculo, cérebro, fígado, língua e retina foram colhidos para a inoculação experimental em camundongos. Três dos nove suínos do G2 e um dos nove suínos do G4 apresentaram temperatura elevada após o desafio. A resposta humoral (IgG) foi analisada pela reação de imunofluorescência indireta. A primeira vacinação com o iscom induziu baixos níveis de anticorpos, a segunda e a terceira resultaram em altos níveis, semelhantes aos encontrados na infecção com a amostra RH (G3). O Western blotting indicou que a resposta humoral do G1, após o desafio, foi mais intensa que a dos animais não vacinados. O T. gondii não foi isolado no bioensaio das amostras de tecido dos suínos vacinados com iscom, mas foram recuperados em quatro suínos do G4, um suíno do G2 e um do G3.(AU)

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL EM CAMUNDONGOS BALB/C À PROTEÍNAS PRINCIPAIS DE SUPERFÍCIES (MSPs) RECOMBINANTES DE Anaplasma marginale AGREGADAS À DIFERENTES ADJUVANTES

Anaplasmose é uma doença febril e hemolítica de bovinos, causada pelo Anaplasma marginale (Família Anaplasmataceae). A doença acomete principalmente bovinos das regiões tropicais e subtropicais, podendo provocar anemia, febre, perda de peso, aborto e morte. A membrana externa do A. marginale inclui seis proteínas principais de superfície (MSPs) bem caracterizadas, designadas de MSP1, MSP2, MSP3, MSP4 e MSP5. Os objetivos deste trabalho foram a clonagem e caracterização da proteína MSP4 recombinante (rMSP4) e a avaliação da resposta imune humoral de camundongos Balb/c contra as proteínas recombinantes MSP1a, MSP1b, MSP4 e MSP5 agregadas a diferentes adjuvantes. O gene msp4 de um isolado Paranaense de A. marginale apresentou 99% de homologia com outros isolados brasileiros. A clonagem do gene msp4 no vetor pET102/D-TOPO? resultando na construção recombinante (msp4+6xHis-V5-HP tireodoxina), expressou a rMSP4 na Escherichia coli BL21 (DE-3). A rMSP4 purificada em grande quantidade foi utilizada para imunizar coelhos. A rMSP4 e a MSP4 nativa foram reconhecidas pelo soro pós-imune dos coelhos, mostrando que a rMSP4 apresenta epítopos coservados e sua antigenicidade preservada. ISCOMs são complexos coloidais estáveis e carreadores efetivos de vacinas de subunidade, podendo reconstituir a disposição natural das proteínas recombinantes. As vacinas ISCOM/rMSPs e ISCOMATRIX/rMSPs foram produzidas pela técnica de liofilização e utilizadas na imunização de camundongos Balb/C. A avaliação da resposta imune humoral foi realizada pelo ELISA indireto e Western blotting. A presença de estruturas típicas do ISCOM/rMSPs e ISCOMATRIX foi evidenciada por microscopia eletrônica e a presença das rMSPs demonstrada por Western blotting. Os grupos controle negativo (0,1 mL de salina) e o controle do ISCOMATRIX adjuvante não produziram IgG e IgG2a. Os animais imunizados com ISCOM/rMSPs e vacina ISCOMATRIX/rMSPs produziram IgG total e IgG2a, e a maior resposta foi de IgG2a sugerindo uma resposta celular. O soro dos animais imunizados com A. marginale e com as rMSPs agreagadas aos diferentes adjuvantes reagiram com as rMSPs especificamente pelo Western blotting, evidenciando a rMSP1a (60 a 105 kDa), rMSP1b (100 kDa), rMSP4 (47 kDa) e rMSP5 (29 kDa). Futuros estudos nos permitirão a avaliação humoral e celular destas vacinas de subunidade em bovinos e sua magnitude como vacina protetora contra cepas homólogas e heterólogas