Real-time PCR quantification and histopathological findings of Mycoplasma hyopneumoniae infection in the lungs of pigs slaughtered in São Luís, Maranhão, Brazil / Quantificação por PCR em tempo real e achados histopatológicos da infecção por Mycoplasma hyopneumoniae em pulmão de suínos abatidos na cidade de São Luís, Maranhão, Brasil

ABSTRACT: Porcine enzootic pneumonia (PES), mainly caused by the bacteria Mycoplasma hyopneumoniae, is the main cause of respiratory problems in pigs. Infection by M. hyopneumoniae leads to production losses and the predisposition of affected animals to secondary infections, which may result in the condemnation of carcasses and organs due to lung lesions at the time of slaughter. The objective of the research was to evaluate the infection by M. hyopneumoniae in pigs submitted to slaughter in São Luís Island/MA, using molecular and histopathological diagnostic methods. One hundred fifty lung samples were collected from inspected (n=65) and non-inspected (n=85) slaughter pigs on São Luís Island, Maranhão, from July 2019 to August 2021. Of the 150 DNA samples collected, 121 showed an amplified product for Cyt B in the PCR assay. Thus, 121 samples were submitted to qPCR of M. hyopneumoniae, of which 44 (36.36%) showed positive results. The mean amount of bacterial load ranged from 1.20 × 101 to 7.20 × 104, with a mean of 1.73 × 104 copies. Of the reagent samples, 81.81% (36 samples) were obtained from non-inspected slaughter, while 18.18% (8 samples) were obtained from slaughterhouses. In the histopathological analysis, 44 positive qPCR samples were evaluated, of which 28 (63.63%) presented results compatible with the main inflammatory process associated with the presence of M. hyopneumoniae, that is, bronchial-associated lymphoid tissue hyperplasia (BALT). Three samples that showed the highest bacterial load (qPCR: 5.63 × 10³, 2.19 × 104 and 7.23 × 104) showed more evident lesions in this study. The microscopic findings associated with the quantifications indicated a relationship between the amount of bacterial load and the presence of microscopic lesions; higher bacterial load in lung tissue is associated with increased histopathologic staining for BALT hyperplasia. In conclusion, the results point to the circulation of the etiological agent in the sampled animals and the need for preventive measures on pig farms in Maranhão with the involvement of producers, sanitary defense and inspection agencies.

RESUMO: A pneumonia enzoótica suína (PES), causada principalmente pela bactéria Mycoplasma hyopneumoniae, é a principal causa de problemas respiratórios em suínos. A infecção por M. hyopneumoniae leva a perdas produtivas e a predisposição dos animais acometidos a infecções secundárias, o que pode resultar em condenação de carcaças e órgãos por lesões pulmonares no momento do abate. O objetivo da pesquisa foi avaliar a infecção por M. hyopneumoniae em suínos submetidos ao abate na Ilha de São Luís, por meio de métodos diagnósticos moleculares e histopatológicos. Para isso, foram coletadas 150 amostras de pulmão de suínos de abate inspecionado (n=65) e não inspecionado (n=85) na Ilha de São Luís/Maranhão, no período de julho de 2019 a agosto de 2021. Das 150 amostras de DNA coletadas, 121 apresentaram produto amplificado para Cyt B no ensaio de PCR. Assim, 121 amostras foram submetidas à qPCR de M. hyopneumoniae, das quais 44 (36,36%) apresentaram resultados positivos. A quantidade média de carga bacteriana variou de 1,20 × 101 a 7,20 × 104, com média de 1,73 × 104 cópias. Das amostras reagentes, 81,81% (36 amostras) foram obtidas de abate não inspecionado, enquanto 18,18% (8 amostras) foram obtidas em abatedouro. Na análise histopatológica, foram avaliadas 44 amostras positivas para qPCR, das quais 28 (63,63%) apresentaram resultados compatíveis com o principal processo inflamatório associado à presença de M. hyopneumoniae, ou seja, hiperplasia do tecido linfóide associado ao brônquio (BALT). Três amostras que apresentaram maior carga bacteriana (qPCR: 5,63 × 10³, 2,19 × 104 e 7,23 × 104) foram mais evidentes neste estudo. Os achados microscópicos associados às quantificações indicaram uma relação entre a quantidade de carga bacteriana e a presença de lesão microscópica; a maior carga bacteriana no tecido pulmonar está associada a maior alteração histopatológica para hiperplasia BALT. Em conclusão, os resultados obtidos sinalizam para a circulação do agente etiológico nos animais amostrados e a necessidade de medidas preventivas nas criações de suínos do estado do Maranhão com envolvimento dos produtores, órgãos de defesa sanitária e inspeção.

Evaluation of two DNA extraction techniques in the detection of Mycoplasma hyopneumoniae by PCR in lungs samples of pigs with and without pneumonia / Avaliação de duas técnicas de extração de DNA na detecção de Mycoplasma hyopneumoniaepor PCR em amostras de pulmões de suínos com e sem lesão de pneumonia

Swine Enzootic Pneumonia (PES) has as the primary etiologic agent the Mycoplasma hyopneumoniae. The diagnosis of PES involves clinical manifestations on farms, macroscopic lesions visualized in the slaughterhouse and laboratory techniques, such as isolation by culture, histopathology, immunohistochemistry, ELISA and other serological tests and PCR. This work aimed to establish the comparison between PCR results and typical macroscopic findings in lungs with PES and to evaluate the efficacy of PCR results with extraction by phenol-chloroform and commercial kit in fragments of swine lungs. The efficacy of PCR was evaluated by comparing the classic method of DNA extraction by phenol-chloroform and by commercial Kit. Fragments of lungs of 18 pigs with characteristic lesions of PES and 17 without lesions were subjected to DNA extraction and posterior PCR. The pulmonary lesions with PES were PCR-positive in 94.44%, compared to 76.47% of the non-PES lungs. Kappa concordance between macroscopic and PCR was 18%, which was not significant (P > 0.05). Of the 35 lung fragments processed by phenol-chloroform, 85.71% were positive by PCR, compared to 28.57% by the commercial kit. Kappa agreement between DNA extraction methods was 57%, which was statistically significant (p <0.05), but Odds ratio was 15 (CI 4.52 to 49.68), which means that the probability of PCR positivity by the phenol-chloroform method was 15 times higher than that by the commercial kit. Macroscopy and PCR results were discordant, with phenol-chloroform extraction being the best between both procedures.

A Pneumonia Enzoótica Suína (PES) tem como agente etiológico primário a bactéria Mycoplasma hyopneumoniae. O diagnóstico da PES envolve manifestações clínicas na granja, lesões macroscópicas visualizadas no frigorífico e técnicas laboratoriais, tais como isolamento por cultura, histopatologia, imunoistoquímica, ELISA e outros testes sorológicos e PCR. O objetivo deste trabalho foi estabelecer a comparação entre resultados da PCR e achados macroscópicos típicos em pulmão com PES e avaliar a eficácia dos resultados da PCR com extração por fenol-clorofórmio e kit comercial, em fragmentos de pulmão de suínos. A eficácia da PCR foi avaliada pela comparação entre o método clássico de extração de DNA por fenol-clorofórmio e por Kit comercial. Fragmentos de pulmões de 18 suínos com lesões características de PES e 17 sem lesões foram submetidos a extração de DNA e posterior PCR. As lesões pulmonares com PES foram PCR positivas na PCR em 94.44%, contra 76.47% dos pulmões sem PES. A concordância por Kappa entre macroscopia e PCR foi 18%, não significativo, (p>0.05). Dos 35 fragmentos de pulmões processados por fenol-clorofórmio, 85.71% foram positivos por PCR, contra 28.57% pelo kit comercial. A concordância por Kappa entre os métodos de extração de DNA foi 57%, estatisticamente significativa (p<0,05), mas, o Odds ratio foi 15 (CI 4.52 to 49.68), o que significa dizer que a probabilidade de positividade por PCR pelo método de fenol-clorofórmio foi 15 vezes maior do que pelo kit comercial. Os resultados da macroscopia e PCR foram discordantes, sendo a extração por fenol-clorofórmio o melhor entre ambos os procedimentos usados.

Evaluation of two DNA extraction techniques in the detection of Mycoplasma hyopneumoniae by PCR in lungs samples of pigs with and without pneumonia / Avaliação de duas técnicas de extração de DNA na detecção de Mycoplasma hyopneumoniaepor PCR em amostras de pulmões de suínos com e sem lesão de pneumonia

Swine Enzootic Pneumonia (PES) has as the primary etiologic agent the Mycoplasma hyopneumoniae. The diagnosis of PES involves clinical manifestations on farms, macroscopic lesions visualized in the slaughterhouse and laboratory techniques, such as isolation by culture, histopathology, immunohistochemistry, ELISA and other serological tests and PCR. This work aimed to establish the comparison between PCR results and typical macroscopic findings in lungs with PES and to evaluate the efficacy of PCR results with extraction by phenol-chloroform and commercial kit in fragments of swine lungs. The efficacy of PCR was evaluated by comparing the classic method of DNA extraction by phenol-chloroform and by commercial Kit. Fragments of lungs of 18 pigs with characteristic lesions of PES and 17 without lesions were subjected to DNA extraction and posterior PCR. The pulmonary lesions with PES were PCR-positive in 94.44%, compared to 76.47% of the non-PES lungs. Kappa concordance between macroscopic and PCR was 18%, which was not significant (P > 0.05). Of the 35 lung fragments processed by phenol-chloroform, 85.71% were positive by PCR, compared to 28.57% by the commercial kit. Kappa agreement between DNA extraction methods was 57%, which was statistically significant (p <0.05), but Odds ratio was 15 (CI 4.52 to 49.68), which means that the probability of PCR positivity by the phenol-chloroform method was 15 times higher than that by the commercial kit. Macroscopy and PCR results were discordant, with phenol-chloroform extraction being the best between both procedures.(AU)

A Pneumonia Enzoótica Suína (PES) tem como agente etiológico primário a bactéria Mycoplasma hyopneumoniae. O diagnóstico da PES envolve manifestações clínicas na granja, lesões macroscópicas visualizadas no frigorífico e técnicas laboratoriais, tais como isolamento por cultura, histopatologia, imunoistoquímica, ELISA e outros testes sorológicos e PCR. O objetivo deste trabalho foi estabelecer a comparação entre resultados da PCR e achados macroscópicos típicos em pulmão com PES e avaliar a eficácia dos resultados da PCR com extração por fenol-clorofórmio e kit comercial, em fragmentos de pulmão de suínos. A eficácia da PCR foi avaliada pela comparação entre o método clássico de extração de DNA por fenol-clorofórmio e por Kit comercial. Fragmentos de pulmões de 18 suínos com lesões características de PES e 17 sem lesões foram submetidos a extração de DNA e posterior PCR. As lesões pulmonares com PES foram PCR positivas na PCR em 94.44%, contra 76.47% dos pulmões sem PES. A concordância por Kappa entre macroscopia e PCR foi 18%, não significativo, (p>0.05). Dos 35 fragmentos de pulmões processados por fenol-clorofórmio, 85.71% foram positivos por PCR, contra 28.57% pelo kit comercial. A concordância por Kappa entre os métodos de extração de DNA foi 57%, estatisticamente significativa (p<0,05), mas, o Odds ratio foi 15 (CI 4.52 to 49.68), o que significa dizer que a probabilidade de positividade por PCR pelo método de fenol-clorofórmio foi 15 vezes maior do que pelo kit comercial. Os resultados da macroscopia e PCR foram discordantes, sendo a extração por fenol-clorofórmio o melhor entre ambos os procedimentos usados.(AU)

Occurrence of Mycoplasma hyopneumoniae in slaughter pigs from Southern Brazil / Ocorrência de Mycoplasma hyopneumoniae em amostras de pulmão de suínos obtidas de frigorífico do sul do Brasil

Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of enzootic pneumonia (EP), a disease that is highly prevalent and globally distributed, causing significant economic losses to the swine industry. Disease progression is characterized by reduced feed conversion and the development of lung lesions. Considering the limited information about the epidemiology of EP in Southern Brazil, the main objective of this study was to determine the occurrence of M. hyopneumoniae in swine lung samples and to evaluate the scores of lung lesions caused by local strains. A total of 120 samples was randomly collected and processed. DNA was extracted from lung tissue to perform nested-PCR and lungs were inspected to evaluate the presence of the pneumonia-like gross lesions of M. hyopneumoniae. The results showed 95.8% positive samples, while the lung lesion score analysis showed suggestive lesions in 60% of samples. The detection of positive samples in nested-PCR was associated with the presence of pneumonia-like gross lesions (P < 0.01). The results demonstrate a high occurrence of EP in slaughter pigs from southern Brazil.(AU)

O Mycoplasma hyopneumoniae é o agente causador da Pneumonia Enzoótica Suína (PES), doença altamente prevalente e mundialmente distribuída, causando grandes perdas econômicas para a indústria suinícola. A progressão da doença é caracterizada pela redução das taxas de conversão alimentar e o desenvolvimento de lesões pulmonares. Visto que há informação limitada sobre a epidemiologia da PES no sul do Brasil, o objetivo do presente trabalho foi determinar a prevalência de M. hyopneumoniae em amostras de pulmão suíno e avaliar o score de lesões pulmonares causadas pelas cepas locais. Um total de 120 amostras foram coletadas aleatoriamente, processadas e analisadas. O DNA foi extraído do tecido pulmonar para realização de Nested-PCR e os pulmões foram inspecionados para presença de lesões macroscópicas sugestivas de M. hyopneumoniae. Os resultados demonstraram 95,8% das amostras positivas para o patógeno. A análise do score pulmonar mostrou lesões sugestivas da PES em 60% das amostras. A detecção de amostras positivas no Nested-PCR foi associada com a presença de lesões sugestivas (P < 0.01). Os dados obtidos neste trabalho demonstram a alta prevalência da PES em granjas do RS.(AU)

Occurrence of Mycoplasma hyopneumoniae in slaughter pigs from Southern Brazil / Ocorrência de Mycoplasma hyopneumoniae em amostras de pulmão de suínos obtidas de frigorífico do sul do Brasil

Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of enzootic pneumonia (EP), a disease that is highly prevalent and globally distributed, causing significant economic losses to the swine industry. Disease progression is characterized by reduced feed conversion and the development of lung lesions. Considering the limited information about the epidemiology of EP in Southern Brazil, the main objective of this study was to determine the occurrence of M. hyopneumoniae in swine lung samples and to evaluate the scores of lung lesions caused by local strains. A total of 120 samples was randomly collected and processed. DNA was extracted from lung tissue to perform nested-PCR and lungs were inspected to evaluate the presence of the pneumonia-like gross lesions of M. hyopneumoniae. The results showed 95.8% positive samples, while the lung lesion score analysis showed suggestive lesions in 60% of samples. The detection of positive samples in nested-PCR was associated with the presence of pneumonia-like gross lesions (P < 0.01). The results demonstrate a high occurrence of EP in slaughter pigs from southern Brazil.(AU)

O Mycoplasma hyopneumoniae é o agente causador da Pneumonia Enzoótica Suína (PES), doença altamente prevalente e mundialmente distribuída, causando grandes perdas econômicas para a indústria suinícola. A progressão da doença é caracterizada pela redução das taxas de conversão alimentar e o desenvolvimento de lesões pulmonares. Visto que há informação limitada sobre a epidemiologia da PES no sul do Brasil, o objetivo do presente trabalho foi determinar a prevalência de M. hyopneumoniae em amostras de pulmão suíno e avaliar o score de lesões pulmonares causadas pelas cepas locais. Um total de 120 amostras foram coletadas aleatoriamente, processadas e analisadas. O DNA foi extraído do tecido pulmonar para realização de Nested-PCR e os pulmões foram inspecionados para presença de lesões macroscópicas sugestivas de M. hyopneumoniae. Os resultados demonstraram 95,8% das amostras positivas para o patógeno. A análise do score pulmonar mostrou lesões sugestivas da PES em 60% das amostras. A detecção de amostras positivas no Nested-PCR foi associada com a presença de lesões sugestivas (P < 0.01). Os dados obtidos neste trabalho demonstram a alta prevalência da PES em granjas do RS.(AU)

Lesões pulmonares em suínos abatidos no matadouro Público Municipal de Esperança, Paraíba / Pulmonary lesions of slaughtered pigs at the municipal public slaughterhouse of Esperança, Paraíba

O objetivo do presente estudo foi avaliar as lesões macroscópicas e histológicas em pulmões de suínos abatidos no abatedouro público de Esperança, Paraíba. Foram inspecionados pulmões de 180 suínos entre julho e dezembro de 2013. Destes, 34 (18,8%) apresentaram lesões. Na análise anatomopatológica dos fragmentos coletados, 82,3% (28/34) exibiram lesões sugestivas de Pneumonia Enzoótica Suína (PES). Seis (17,7%) amostras apresentaram alterações causadas pela distribuição irregular de sangue. Casos sugestivos de PES crônica foram observados em 57,1% (16/28) dos fragmentos coletados. Em 42,9% (12/28) das amostras foram definidos como sugestivos de PES subaguda. Nenhum pulmão apresentou lesões sugestivas de PES aguda. A pesquisa demonstrou que lesões pulmonares em suínos são frequentemente detectadas no abatedouro de Esperança, Paraíba, sendo a maioria destas lesões sugestivas de PES.(AU)

The objective of the present study was to evaluate the macroscopic and histological lesions in the lungs of slaughtered pigs at the public slaughterhouse of Esperança, Paraíba. Lungs from 180 pigs were inspected between July and December 2013. Lesions were observed in 34 (18.8%) lungs. In the anatomopathological analysis of the collected fragments, 82.3% (28/34) presented suggestive lesions of Swine Enzootic Pneumonia (SEP). Six (17.7%) samples presented alterations caused by irregular blood distribution. Suggestive cases of chronic SEP were observed in 57.1% (16/28) of the collected fragments. In 42.9% (12/28) of the samples were defined as suggestive of subacute SEP. No lungs presented lesions suggestive of acute PES. The research showed that lung lesions in pigs are frequently detected in the Esperança, Paraíba slaughterhouse, with the majority of these lesions suggestive for SEP.(AU)

Lesões pulmonares em suínos abatidos no matadouro Público Municipal de Esperança, Paraíba / Pulmonary lesions of slaughtered pigs at the municipal public slaughterhouse of Esperança, Paraíba

O objetivo do presente estudo foi avaliar as lesões macroscópicas e histológicas em pulmões de suínos abatidos no abatedouro público de Esperança, Paraíba. Foram inspecionados pulmões de 180 suínos entre julho e dezembro de 2013. Destes, 34 (18,8%) apresentaram lesões. Na análise anatomopatológica dos fragmentos coletados, 82,3% (28/34) exibiram lesões sugestivas de Pneumonia Enzoótica Suína (PES). Seis (17,7%) amostras apresentaram alterações causadas pela distribuição irregular de sangue. Casos sugestivos de PES crônica foram observados em 57,1% (16/28) dos fragmentos coletados. Em 42,9% (12/28) das amostras foram definidos como sugestivos de PES subaguda. Nenhum pulmão apresentou lesões sugestivas de PES aguda. A pesquisa demonstrou que lesões pulmonares em suínos são frequentemente detectadas no abatedouro de Esperança, Paraíba, sendo a maioria destas lesões sugestivas de PES.

The objective of the present study was to evaluate the macroscopic and histological lesions in the lungs of slaughtered pigs at the public slaughterhouse of Esperança, Paraíba. Lungs from 180 pigs were inspected between July and December 2013. Lesions were observed in 34 (18.8%) lungs. In the anatomopathological analysis of the collected fragments, 82.3% (28/34) presented suggestive lesions of Swine Enzootic Pneumonia (SEP). Six (17.7%) samples presented alterations caused by irregular blood distribution. Suggestive cases of chronic SEP were observed in 57.1% (16/28) of the collected fragments. In 42.9% (12/28) of the samples were defined as suggestive of subacute SEP. No lungs presented lesions suggestive of acute PES. The research showed that lung lesions in pigs are frequently detected in the Esperança, Paraíba slaughterhouse, with the majority of these lesions suggestive for SEP.

IMUNIZAÇÃO ORAL PARA INCREMENTO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA NO CONTROLE DA INFECÇÃO POR Mycoplasma hyopneumoniae EM SUÍNOS

Mycoplasma (M.) hyopneumoniae é o principal patógeno da pneumonia enzoótica suína (PES). Seu controle é desafiador e requer estratégias alternativas à vacinação convencional. Este estudo teve como objetivo desenvolver uma vacina oral contra M. hyopneumoniae utilizando uma sílica mesoporosa nanoestruturada (SBA-15) como adjuvante, e comparar seu efeito com uma vacina comercial intramuscular (IM) (CV). Cinquenta leitões livres de M. hyopneumoniae, com 24 dias de idade, constituíram cinco grupos iguais para diferentes protocolos de imunização, consistindo de uma imunização CV e/ou oral (OI). Os leitões controle não receberam nenhuma forma de imunização. Todos os leitões foram desafiados com M. hyopneumoniae cepa 232 no D49 pela via traqueal. Semanalmente, foram avaliadas a resposta de anticorpos IgA no trato respiratório e a quantificação de DNA bacteriano excretado pela via nasal, e quinzenalmente avaliou-se a IgG sérica. Os leitões foram eutanasiados aos 28 (D77) e 56 (D105) dias pós-infecção. Lesões pulmonares foram avaliadas macroscopicamente; fragmentos de pulmão e fluido broncoalveolar (BALF) foram coletados para estimativa das cargas bacterianas por qPCR e exame histopatológico. Todos os protocolos de imunização induziram redução nas lesões pulmonares macroscópicas Mycoplasma-like. Respostas de IgA anti-M. hyopneumoniae, a expressão da citocina IL-4 e uma expressão mais baixa de IL-8 foram induzidas por vacinas CV e OI, enquanto IgG foi induzida apenas por CV. A imunização oral usando sílica como um carreador adjuvante pode ser viável no controle da infecção por M. hyopneumoniae.

Mycoplasma (M.) hyopneumoniae is the main pathogen of porcine enzootic pneumonia (PEP). Its controlling is challenging, and requires alternative strategies. This study aimed to develop an oral vaccine against M. hyopneumoniae using a nanostructured mesoporous silica (SBA-15) as an adjuvant, and compare its effect with an intramuscular (IM) commercial vaccine (CV). Fifty 24 day-old M. hyopneumoniae-free piglets composed five equal groups for different immunization protocols, consisting of a CV and/or oral immunization (OI). Control piglets did not receive any form of immunization. All piglets were challenged with M. hyopneumoniae strain 232 on D49 by tracheal route. IgA antibody response in the respiratory tract, bacterial shedding and serum IgG were evaluated. The piglets were euthanized on 28 (D77) and 56 (D105) days post-infection. Lung lesions were macroscopically evaluated; lung fragments and bronchoalveolar fluid (BALF) were collected for estimation of bacterial loads by qPCR and/or histopathology examination. All immunization protocols induced reduction on Mycoplasma-like macroscopic lung lesions. IgA Ab responses anti-M. hyopneumoniae, the expression of IL-4 cytokine and a lower expression of IL-8 were induced by CV and OI vaccines, while IgG was induced only by CV. Oral immunization using silica as a carrier-adjuvant can be viable in controlling M. hyopneumoniae infection

DESENVOLVIMENTO DE UM TESTE SOROLÓGICO BASEADO EM UM ANTÍGENO ORIENTADO POR ANTICORPO MONOCLONAL PARA DIAGNÓSTICO DE Mycoplasma hyopneumoniae

Autor: Rafaela Luiza Klein Orientador: Rafael Frandoloso A pneumonia enzoótica suína (PES) é uma doença infectocontagiosa que há longa data é destaque na cadeia suinícola. A PES é causada pelo Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), uma bactéria específica de suínos que pode ser transmitida através de contato direto e indireto. A doença acomete suínos de todas as idades, porém a clínica é comumente observada na fase de crescimento e terminação de suínos. Mhyo pode produzir doença pulmonar de forma independente, no entanto, sua infecção facilita a ocorrência de inúmeras outras infecções secundárias causadoras de pneumonias e de doenças sistêmicas. O diagnóstico da circulação de Mhyo é realizada através de testes sorológicos em combinação com técnicas moleculares, e a prevenção, mediante o uso de vacinas clássicas aplicadas pela via intramuscular ou intradérmica. Em razão do diagnóstico sorológico ser de vital importância para o posicionamento correto de vacinas a partir do entendimento da cinética de anticorpos naturais adquiridos através do colostro, ou mesmo, desenvolvidos após um processo de infecção, desenvolver insumos imunológicos genuínos e capazes de detectar indiretamente ou diretamente o Mhyo são indispensáveis para o Brasil. Nesta dissertação, apresentamos o desenvolvimento e a caracterização de um anticorpo monoclonal (AcMo) contra Mycoplasma hyopneumoniae. Posteriormente, o AcMo foi utilizado para desenvolver um ELISA moderno, baseado em células inteiras de M. hyopneumoniae corretamente orientadas no interior da placa de ELISA pelo AcMo. Brevemente, células de mieloma murino P3x63Ag8.653 foram fusionadas com esplenócitos obtidos de camundongos BALB/c imunizados com uma suspensão de M. hyopneumoniae cepa ATCC25095. O AcMo obtido, nomeado de MAb 4A2, foi caracterizado por meio de Western Blot, Dot Assay, Citometria de Fluxo e Teste de Avidez. O MAb 4A2 é uma imunoglobulina da subclasse IgG1 com duas cadeias leves do tipo lambda que reconhece um epitopo linear comum presente na estrutura de duas proteínas superficiais de M. hyopnuemoniae, as quais possuem pesos moleculares de 46 e 100 kDa. O índice de avidez do MAb 4A2 foi de 0.5 M de tiocionato de amônia e reações cruzadas com Glaesserella parasuis não foram evidenciadas pelo ensaio de Dot Assay. A análise de citometria de fluxo mostrou a capacidade do MAb 4A2 de reconhecer três diferentes cepas de M. hyopneumoniae, no entanto, a cepa ATCC®25617TM foi significativamente (p<0.01) menos reconhecidas que as cepas ATCC®25095TM e ATCC 25088. Posteriormente, utilizamos o MAb 4A2 para desenhar um moderno ELISA baseado em antígenos corretamente orientados para detectar IgG de suínos contra M. hyopneumoniae. Nossos resultados preliminares monstraram que este ELISA tem maior sensibilidade em comparação com um ELISA comercial globalmente utilizado para a detecção sorológia de IgGs anti M. hyopneumoniae; consequentemente, nosso ELISA possui melhor capacidade de detectar animais com baixos niveis de IgG reativas ao microrganismo. Este novo ELISA consiste numa promissora plataforma de diagnóstico ultra-sensível para detectar anticorpos contra Mycoplasma hyopneumoniae.

Development of a novel antigen-oriented ELISA for Mycoplasma hyopneumoniae diagnosis Author: Rafaela Luiza Klein Advisor: Rafael Frandoloso Swine enzootic pneumonia (EP) is an infectious disease globally disseminated in the pig industry. EP is caused by Mycoplasma hyopneumoniae, a pig-specific bacterium that can be transmitted through direct and indirect. The disease affects pigs of all ages, but the clinical manifestation is commonly observed in the pig growth and finishing phase. M. hyopnuemoniae can produce pulmonary disease independently, however, its infection facilitates the occurrence of other secondary infections that can causing pneumonia and systemic diseases. The diagnosis of M. hyopneumoniae circulation is performed through serological tests in combination with molecular techniques, and the its prevention is carrying out mainly by the use of classic vaccines applied by the intramuscular or intradermal route. Serological diagnosis has a pivotal role for the correct positioning of vaccines based on the understanding of the kinetics of natural antibodies acquired through colostrum, or even, developed after an infection process. So, develop a genuine immunological test capable of detecting M. hyopenumoniae is essential for Brazil. In this dissertation, we present the development, characterization and use of a new monoclonal antibody to design a novel ELISA based on oriented-antigen to detect antibodies reactive to Mycoplasma hyopneumoniae. Monoclonal antibody (MAb) against Mycoplasma hyopneumoniae was obtained by the fusion of P3x63Ag8.653 murine myeloma cells and spleen cells from BALB/c mice immunized with a suspension of M. hyopneumoniae strain ATCC®25095TM. One MAb showed strong reactivity in ELISA and was further characterized using Western blot, Dot Assay, Flow Cytometry and Avidity test. MAb 4A2 is an IgG1 paired with a lambda light chain molecule that recognize a common linear epitope displayed on the structure of two proteins with a molecular mass of 46 and 100 kDa expressed on the surface of M. hyopneumoniae. The avidity index of MAb 4A2 was 0.5 M of ammonium thiocyanate and cross-reactivity with Glaesserella parasuis by Dot Assay was not observed. Flow cytometry analysis showed the capacity of MAb to recognize three different strains of M. hyopneumoniae, however, the strain ATCC®25617TM was significantly less recognized than ATCC®25095TM and ATCC 25088. Further we used the MAb 4A2 to designing a novel antigen-oriented ELISA to detect pig IgG against M. hyopneumoniae. Our preliminary results showed that this ELISA has higher sensitivity than a current commercial ELISA Kit and consequently, better capacity to detect animals with low level of IgG against this microorganism. This novel ELISA is a promising and reliable serological diagnostic for M. hyopneumoniae.

Diagnóstico comparativo de Mycoplasma hyopneumoniae em amostras de pulmão de suínos

A produção de suínos é um dos setores da agropecuária brasileira de grande importância. Contudo, doenças como a Pneumonia Enzoótica Suína (PES) causam grandes perdas econômicas. A PES é causada pelo Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) sendo caracterizada como uma doença contagiosa que afeta rebanhos de suínos no mundo todo. Atualmente, o diagnóstico pode ser realizado por meio de diferentes técnicas, no entanto alguns ensaios não tem demonstrado bons resultados. Considerando que esta doença apresenta grande prevalência e dificuldades no isolamento da bactéria, este trabalho tem como objetivo associar técnicas de diagnóstico como análises macroscópicas e histopatológicas, teste de PCR convencional e hibridização fluorescente in situ (FISH). Foram utilizadas 266 amostras de pulmão de suínos, sendo todas avaliadas macroscopicamente, 100 amostras avaliadas quanto ao seu grau de lesão na histopatologia, 266 amostras foram avaliadas pela PCR convencional e 91 amostras foram avaliadas pela FISH. Adicionalmente, foi realizada uma PCR convencional de genes individuais, onde foram selecionados sete genes que relacionados a proteínas imunogênicas: p97, nrfd, p42, mhp372, mhp199, p46, mhp0461. As amostras avaliadas foram enviadas para sequenciamento. Ao comparar as técnicas realizadas na primeira parte do experimento a FISH apresentou menor índice de detecção. Ao avaliar a PCR de genes individuais com a similaridade entre cepas foi observado que o gene p42 apresentou melhor resultado, sendo considerado o melhor alvo para a produção de ferramentas de diagnostico. Diante dos resultados encontrados este estudo demonstrou que as técnicas quando realizadas em associação possui maior confiabilidade para o diagnóstico de Mhyo.

Pig production is a sector of great importance in the Brazilian agriculture. However, diseases such as Enzootic Pneumonia (PE) cause great economic losses. PE is caused by Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) being characterized by a contagious disease that affects swine herds around the world. Currently, the diagnosis can be made through different techniques, however, some tests have not demonstrated its results. Considering that this disease presents a high prevalence as well as difficulties in the isolation of the bacteria, this work aims to associate diagnostic techniques as macroscopic and histopathological analyzes, conventional PCR test with the Fluorescent in situ hybridization (FISH). A total of 266 pig lung samples were used, all of which being evaluated macroscopically. One hundred samples were evaluated for histopathology degree, 266 samples for conventional PCR and 91 samples evaluated by FISH. In addition, a conventional PCR of individual genes was performed, when seven genes expressing immunogenic proteins were selected: p97, nrfd, p42, mhp372, mhp199, p46, mhp0461. The evaluated samples were sent for sequencing. In comparison with the techniques performed in the first part of the experiment, the FISH had a lower detection rate. When evaluating the PCR of individual genes with the similarity between strains, it was observed that the p42 gene presented better results, being considered the best target for the creation of diagnostic tools. Given the results found, this study demonstrated that, when performed in association, the techniques are more reliable for the diagnosis of Mhyo.

DETECÇÃO E VARIABILIDADE GENÉTICA DE Mycoplasma hyopneumoniae EM AMOSTRAS DE PULMÃO DE SUÍNOS DO ESTADO DE MINAS GERAIS, BRASIL

A suinocultura é um setor agropecuário de grande importância para a economia brasileira. Os diversos sistemas de produção enfrentam grandes perdas econômicas causadas pelas doenças respiratórias, sendo a Pneumonia Enzoótica Suína (PES) uma das principais doenças respiratórias. A PES é causada pela bactéria Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) e a doença se caracteriza por uma tosse seca e crônica que afeta suínos de qualquer faixa etária. Sabemos que Mhyo possui grande diversidade genômica e proteômica, além de diferenças na virulência entre as cinco cepas conhecidas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade genética de Mhyo baseado em genes que codificam proteínas antigênicas. Foram avaliadas 148 amostras de pulmão de suínos provenientes de duas regiões do estado de Minas Gerais, 133 (89.9 %) amostras foram positivas no PCR de identificação de Mhyo. As amostras positivas foram submetidas a PCRs dos genes selecionados: mhp 0043, mhp 0660, mhp 0099, mhp 0360, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0272, mhp 0487 e mhp 0580. Além disso, algumas amostras foram selecionadas para realizar o sequenciamento parcial dos genes específicos. Os resultados mostraram variações na frequência de distribuição dos nove genes em amostras de campo. Os genes mhp 0043, mhp 0660, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0487 e mhp 0580 apresentaram frequência maior que 90%. Analisando o resultado do sequenciamento parcial de cada gene, observamos que as sequencias destes nove genes são bem conservadas nas cepas analisadas. Foi possível observar que Mhyo possui grande diversidade genética, no que se refere ausência ou presença destes genes. Com base nestes resultados, o estudo sugere que os genes mhp 0043, mhp 0660, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0487 e mhp 0580 devem ser investigados como candidatos a produção de vacinas.

Pig farming is an agricultural sector of great importance to Brazilian economy. The systems of production pigs face great economic losses resulting from respiratory diseases, Swine Enzootic Pneumonia (PES) is the major respiratory diseases.PES is caused by Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) and the disease is characterized by a dry and chronic cough that affects pigs of any age. It is known that Mhyo has genomic and proteomic diversity, as well as differences in virulence among the five known strains. The objective of this work was to evaluate the genetic diversity of Mhyo based on genes encoding antigenic proteins. A total of 148 pig lung samples from two regions of the state of Minas Gerais were evaluated. 133 (89.9 %) samples were positive in PCR of Mhyo. Positive samples were submitted to PCR of nine genes selected: mhp 0043, mhp 0660, mhp 0099, mhp 0360, mhp 0107, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0272, mhp 0487 and mhp 0580. In addition, some samples were selected to partial sequencing of specific genes. These results showed variations in the distribution frequency in field samples of nine genes. Genes mhp 0043, mhp 0660, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0487 and mhp 0580 showed a frequency greater than 90%. Analyzing the result of the partial sequencing of each gene, we observed that the sequences of these nine genes are well conserved in the analyzed field strains. We observed that Mhyo possesses great genetic diversity, regarding the absence or presence of these genes. Based on these results, our study suggests that the genes mhp 0043, mhp 0660, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0487 and mhp 0580 should be investigated as candidates to produce vaccines, however, future studies that determine the antigenicity of the proteins expressed by these genes should be realized.

Monitoramento da presença de Mycoplasma hyopneumoniae em granjas de suínos durante a implementação de programas de erradicação

The aim of this study was to monitor the presence of M. hyopneumoniae in pig farms during the implementation of eradication programs using different diagnostic techniques focusing on PCR. They worked with a company owner of three farms, a farrow-to-finish (390 sows), a multiple-site (4100 sows) and a new one that was populated its new facility. In the first two were developed a partial depopulation program to eradicate swine enzootic pneumonia, the latter one was populated with pigs after the previous eradication. In the three farms, the pigs were monitored by: serology (ELISA), PCR, macroscopic and microscopic lung lesions and the presence of non-productive cough. The absence of cough, low percentage of seropositive pigs in the finishing stage and the low proportion of lung lesions at slaughter suggest that swine enzootic pneumonia was eradicated, but not the causative agent -M. hyopneumoniae- whose DNA was detected by PCR showing different behaviors according to the herd.

O objetivo deste estudo foi monitorar a presença de M. hyopneumoniae em granjas suínas durante a implementação de programas de erradicação utilizando diferentes técnicas de diagnóstico focalizando no PCR. Trabalhou-se com uma empresa que possuía três granjas, uma parto-terminação (390 matrizes), uma múltiplo-sítio (4100 matrizes) e uma nova granja que povoava suas novas instalações. Nas duas primeiras, foi desenvolvido um programa de despovoamento parcial para erradicar a pneumonia enzoótica suína, a última foi povoada pelos suínos dos anteriores após a erradicação. Nos três rebanhos, os suínos foram monitorados por: sorologia (ELISA), PCR, lesões pulmonares macro e microscópicas e a presença de tosse não produtiva. A ausência de tosse, a baixa porcentagem de suínos soropositivos na fase de terminação e a baixa proporção de lesões pulmonares no abate sugerem que a pneumonia enzoótica suína foi erradicada, mas não o agente causativo -M. hyopneumoniae- cujo DNA foi detectado pela PCR, mostrando diferentes comportamentos de acordo com o rebanho.

Monitoramento da presença de Mycoplasma hyopneumoniae em granjas de suínos durante a implementação de programas de erradicação

The aim of this study was to monitor the presence of M. hyopneumoniae in pig farms during the implementation of eradication programs using different diagnostic techniques focusing on PCR. They worked with a company owner of three farms, a farrow-to-finish (390 sows), a multiple-site (4100 sows) and a new one that was populated its new facility. In the first two were developed a partial depopulation program to eradicate swine enzootic pneumonia, the latter one was populated with pigs after the previous eradication. In the three farms, the pigs were monitored by: serology (ELISA), PCR, macroscopic and microscopic lung lesions and the presence of non-productive cough. The absence of cough, low percentage of seropositive pigs in the finishing stage and the low proportion of lung lesions at slaughter suggest that swine enzootic pneumonia was eradicated, but not the causative agent -M. hyopneumoniae- whose DNA was detected by PCR showing different behaviors according to the herd.

O objetivo deste estudo foi monitorar a presença de M. hyopneumoniae em granjas suínas durante a implementação de programas de erradicação utilizando diferentes técnicas de diagnóstico focalizando no PCR. Trabalhou-se com uma empresa que possuía três granjas, uma parto-terminação (390 matrizes), uma múltiplo-sítio (4100 matrizes) e uma nova granja que povoava suas novas instalações. Nas duas primeiras, foi desenvolvido um programa de despovoamento parcial para erradicar a pneumonia enzoótica suína, a última foi povoada pelos suínos dos anteriores após a erradicação. Nos três rebanhos, os suínos foram monitorados por: sorologia (ELISA), PCR, lesões pulmonares macro e microscópicas e a presença de tosse não produtiva. A ausência de tosse, a baixa porcentagem de suínos soropositivos na fase de terminação e a baixa proporção de lesões pulmonares no abate sugerem que a pneumonia enzoótica suína foi erradicada, mas não o agente causativo -M. hyopneumoniae- cujo DNA foi detectado pela PCR, mostrando diferentes comportamentos de acordo com o rebanho.

Monitoramento da presença de Mycoplasma hyopneumoniae em granjas de suínos durante a implementação de programas de erradicação

The aim of this study was to monitor the presence of M. hyopneumoniae in pig farms during the implementation of eradication programs using different diagnostic techniques focusing on PCR. They worked with a company owner of three farms, a farrow-to-finish (390 sows), a multiple-site (4100 sows) and a new one that was populated its new facility. In the first two were developed a partial depopulation program to eradicate swine enzootic pneumonia, the latter one was populated with pigs after the previous eradication. In the three farms, the pigs were monitored by: serology (ELISA), PCR, macroscopic and microscopic lung lesions and the presence of non-productive cough. The absence of cough, low percentage of seropositive pigs in the finishing stage and the low proportion of lung lesions at slaughter suggest that swine enzootic pneumonia was eradicated, but not the causative agent -M. hyopneumoniae- whose DNA was detected by PCR showing different behaviors according to the herd.

O objetivo deste estudo foi monitorar a presença de M. hyopneumoniae em granjas suínas durante a implementação de programas de erradicação utilizando diferentes técnicas de diagnóstico focalizando no PCR. Trabalhou-se com uma empresa que possuía três granjas, uma parto-terminação (390 matrizes), uma múltiplo-sítio (4100 matrizes) e uma nova granja que povoava suas novas instalações. Nas duas primeiras, foi desenvolvido um programa de despovoamento parcial para erradicar a pneumonia enzoótica suína, a última foi povoada pelos suínos dos anteriores após a erradicação. Nos três rebanhos, os suínos foram monitorados por: sorologia (ELISA), PCR, lesões pulmonares macro e microscópicas e a presença de tosse não produtiva. A ausência de tosse, a baixa porcentagem de suínos soropositivos na fase de terminação e a baixa proporção de lesões pulmonares no abate sugerem que a pneumonia enzoótica suína foi erradicada, mas não o agente causativo -M. hyopneumoniae- cujo DNA foi detectado pela PCR, mostrando diferentes comportamentos de acordo com o rebanho.

PERFIL GENÉTICO E EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE Mycoplasma hyopneumoniae NO ESTADO DE MINAS GERAIS, BRASIL

Pneumonia Enzoótica Suína (PES) é uma doença infecto-contagiosa, caracterizada por uma broncopneumonia catarral que se manifesta por tosse seca e tem como agente primário Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyop). O controle da PES consiste em adoção de medidas de biosseguridade e vacinação. Porém, há falhas na vacinação devido a diferença entre a cepa vacinal e a cepa de campo. Através de diversas técnicas moleculares, vários estudos tem demonstrado a diversidade genética de Mhyop. Diante disso, o objetivo do presente estudo foi pesquisar a diversidade genética de amostras de campo de Mhyop, oriundas de pulmões de suínos do estado de Minas Gerais. Foram coletadas 266 amostras, sendo 97 amostras positivas (36,5%) para Mhyop. Todas essas amostras foram submetidas ao PCR de genes específicos. Foram selecionados oito genes que expressam proteínas imunogênicas: p97, mhp 0461, nrdf, p42, mhp 418, mhp 372, mhp 199 e p46. Através das análises de bioinformática, as amostras foram caracterizadas em 30 grupos genéticos com ampla distribuição nas regiões estudas. Além do PCR, a histopatologia foi realizada e todas as amostras analisadas tiveram lesões sugestivas de PES. Sendo assim, os resultados sugerem a existência de vários perfis genéticos de Mhyop, assim como a diversidade de Mhyop em uma mesma região. Não foi observada a relação entre os perfis genéticos e distribuição geográfica. Também não foi evidenciada associação entre a severidade das lesões histopatológicas e grupo genético. Este estudo demonstra a diversidade genética de Mhyop presentes em rebanhos do estado de Minas Gerais, bem como a necessidade de novos estudos a respeito da caracterização genética da bactéria.

Enzootic Pneumonia (EP) is an infectious disease characterized by a catarrhal bronchopneumonia manifested by dry cough and have as a primary agent Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyop). The EP control consists of adoption of biosecurity measures and vaccination. However, there are gaps in the vaccination because of the difference between the vaccine strain and the field strain. Through various molecular techniques, several studies have demonstrated the genetic diversity of Mhyop. Thus, the aim of this study was to investigate the genetic diversity of Mhyop field samples collected in the state of pig lungs of Minas Gerais. 266 samples were collected, and 97 positive samples (36.5%) to Mhyop. All these samples were subjected to PCR of specific genes. Eight genes were selected that express immunogenic proteins: p97, 0461 mhp, nrdf, p42, mhp 418, 372 mhp, mhp 199 and p46. Through bioinformatics analysis, the samples were characterized in 30 genetic groups with wide distribution in the regions studied. In the PCR, and histopathology was performed on all samples had lesions suggestive of EP. Thus, the results suggest the existence of several genetic profiles of Mhyop, as well as the diversity of Mhyop in the same region. There was no relationship between genetic profiles and geographic distribution. There was also no evidence of association between the severity of the histopathological lesions and genetic group. This study demonstrates the genetic diversity of Mhyop present in farms of Minas Gerais, as well as the need for new studies on the genetic characterization of bacteria.

Influência da imunidade de matrizes suinas na resposta à vacinação de leitões contra mycoplasma hyopneumoniae

A suinocultura está amplamente difundida no Brasil, o quarto maior produtor mundial de carne suína. Seu efetivo está concentrado em maior parte na região Sul, com 48,8% dos suínos. Porém, a intensificação e o confinamento das criações expõem os animais a agentes patogênicos, como o Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), causador da Pneumonia Enzoótica Suína (PES). A doença é caracterizada pela ocorrência de tosse seca não produtiva e lesões pulmonares de consolidação, denominadas hepatização. A vacinação de leitões é uma importante ferramenta empregada no controle da PES. Contudo, é relatado que a imunidade passiva adquirida pelos leitões através do colostro das matrizes suínas pode interferir na sua resposta à vacinação contra o Mhyo. Desta forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a influência da imunidade materna na resposta à imunização de leitões contra Mhyo ao desmame. Dez matrizes foram divididas em dois grupos baseado na Razão S/P de um teste ELISA comercial , um com baixo nível de anticorpos (Ac) anti-Mhyo (BAc, Razão S/P <0,75) e outro com alto nível (AAc, Razão S/P 0,75). De cada fêmea, dois leitões eram controles (contr) e nove vacinados (vac) contra Mhyo. Estes grupos e tratamentos foram comparados entre si quanto a parâmetros de imunidade humoral, celular e comprometimento pulmonar ao abate. Após a ingestão de colostro, os leitões das fêmeas AAc mantiveram os maiores níveis de Ac, até os 56 dias de idade. Quando avaliados através do teste ELISA, dos 13 aos 99 dias depois de vacinados os leitões BAc-vac apresentaram níveis de Ac mais estáveis, com um aumento significativo aos 113 dias pós-vacinação. Os parâmetros celulares não diferiram entre grupos e tratamentos, com exceção dos linfócitos T CD4 + CD8 +, com menores percentuais entre os vacinados. Independente do grupo, os vacinados tiveram menor comprometimento pulmonar, porém os BAc-vac tiveram menos lesões que os AAc-vac. Os resultados demonstraram que a vacinação dos leitões contra Mhyo ao desmame os protege contra o agente, levando ao menor comprometimento pulmonar, principalmente quando a imunização ocorre na presença de baixos níveis de Ac passivos.

Swine production is widespread in Brazil, being the fourth largest producer of pork meat. Swinesare concentrated in the Southern region, comprising 48.8%of pig population. However, due to confinement system, pigs are exposed to pathogens such as the bacteria Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), responsible for swine enzootic pneumonia (SEP). The disease is characterized by a dry, nonproductive cough, and macroscopic areas of consolidation in the lung. The piglet vaccination is an important practice to SEP control. However, it is reported that passive immunity acquired by the piglets through the colostrum of sows may affect their response to vaccination against Mhyo. The objective of this study was to evaluate the influence of maternal immunity in the pig vaccination against Mhyo after weaning. Ten sows were divide in two groups according with the ELISAs S/P Ratio, with low (LAb, S/P Ratio <0.75) or high (HAb, S/P Ratio 0.75) level of antibodies (Ab). From each sow, two piglets were controls (contr) and nine vaccinated (vac) against Mhyo. Piglets' humoral and cellular immunity and pulmonary lesions were compared between the treatments and groups of sows.The Ab level after colostrum intake was higher in piglets from HAb group of sows until 56 days of age. When evaluated by ELISA, LAb-vac piglets showed a more stable Ab levels from 13 to 99 days post-vaccination, with a significant increase at 113 days post-vaccination. No differences were detected between groups and treatments according with cellular parameters, except T CD4 + CD8+ lymphocytes percentages, that were lower in vaccinated piglets. Regardless of the group, vaccinated pigs had lower pulmonary lesions, but the LAb-vac piglets had less damage than the HAb-vac. These results demonstrated that piglet vaccination against Mhyo at weaning protects them against the pathogen and provides lower pulmonary lesions, especially when the immunization occurs in the presence of low levels of maternal Ab

Etiopatogenia e imunoprofilaxia da pneumonia enzoótica suína

Swine Enzootic Pneumonia (SEP), caused by fastidious bacterium Mycoplasma hyopneumoniae, is the most important respiratory disease of swines, responsible for high losses to Brazilian and worldwide swine breeding. The high prevalence and the fact to predis-pose the swines to secondary pathogens make this disease the central target of a herd health program to respiratory diseases. The knowledge of the characteristics and pathogenicity factors of etiologic agent could help in the development of new strategies to control SEP. The aim of this review was to discuss some aspects of the etiopathogenesis of the SEP that have implications in the immunoprofilaxis of disease and the main results obtained with new generation vaccines evaluated experimentally.

A Pneumonia Enzoótica Suína (PES), causada pela bactéria fastidiosa Mycoplasma hyopneumoniae, é a doença respiratória mais importante dos suínos, responsável por enormes prejuízos à suinocultura brasileira e mundial. A elevada prevalência e o fato de pré-dispor os suínos à patógenos oportunistas tornam esta doença o alvo central de um programa de saúde de rebanho para doenças respiratórias. O conhecimento das características do agente etiológico bem como dos seus fatores de patogenicidade pode ajudar na elaboração de novas estratégias de controle da PES. O objetivo desta revisão foi discutir alguns aspectos da etiopatogenia da PES que têm implicação na imunoprofilaxia da doença e os principais resultados obtidos com vacinas de última geração avaliadas experimentalmente.

Etiopatogenia e imunoprofilaxia da pneumonia enzoótica suína

Swine Enzootic Pneumonia (SEP), caused by fastidious bacterium Mycoplasma hyopneumoniae, is the most important respiratory disease of swines, responsible for high losses to Brazilian and worldwide swine breeding. The high prevalence and the fact to predis-pose the swines to secondary pathogens make this disease the central target of a herd health program to respiratory diseases. The knowledge of the characteristics and pathogenicity factors of etiologic agent could help in the development of new strategies to control SEP. The aim of this review was to discuss some aspects of the etiopathogenesis of the SEP that have implications in the immunoprofilaxis of disease and the main results obtained with new generation vaccines evaluated experimentally.

A Pneumonia Enzoótica Suína (PES), causada pela bactéria fastidiosa Mycoplasma hyopneumoniae, é a doença respiratória mais importante dos suínos, responsável por enormes prejuízos à suinocultura brasileira e mundial. A elevada prevalência e o fato de pré-dispor os suínos à patógenos oportunistas tornam esta doença o alvo central de um programa de saúde de rebanho para doenças respiratórias. O conhecimento das características do agente etiológico bem como dos seus fatores de patogenicidade pode ajudar na elaboração de novas estratégias de controle da PES. O objetivo desta revisão foi discutir alguns aspectos da etiopatogenia da PES que têm implicação na imunoprofilaxia da doença e os principais resultados obtidos com vacinas de última geração avaliadas experimentalmente.

Occurrence of Mycoplasma hyopneumoniae in slaughter pigs from Southern Brazil / Ocorrência de Mycoplasma hyopneumoniae em amostras de pulmão de suínos obtidas de frigorífico do sul do Brasil

Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of enzootic pneumonia (EP), a disease that is highly prevalent and globally distributed, causing significant economic losses to the swine industry. Disease progression is characterized by reduced feed conversion and the development of lung lesions. Considering the limited information about the epidemiology of EP in Southern Brazil, the main objective of this study was to determine the occurrence of M. hyopneumoniae in swine lung samples and to evaluate the scores of lung lesions caused by local strains. A total of 120 samples was randomly collected and processed. DNA was extracted from lung tissue to perform nested-PCR and lungs were inspected to evaluate the presence of the pneumonia-like gross lesions of M. hyopneumoniae. The results showed 95.8% positive samples, while the lung lesion score analysis showed suggestive lesions in 60% of samples. The detection of positive samples in nested-PCR was associated with the presence of pneumonia-like gross lesions (P 0.01). The results demonstrate a high occurrence of EP in slaughter pigs from southern Brazil.

O Mycoplasma hyopneumoniae é o agente causador da Pneumonia Enzoótica Suína (PES), doença altamente prevalente e mundialmente distribuída, causando grandes perdas econômicas para a indústria suinícola. A progressão da doença é caracterizada pela redução das taxas de conversão alimentar e o desenvolvimento de lesões pulmonares. Visto que há informação limitada sobre a epidemiologia da PES no sul do Brasil, o objetivo do presente trabalho foi determinar a prevalência de M. hyopneumoniae em amostras de pulmão suíno e avaliar o score de lesões pulmonares causadas pelas cepas locais. Um total de 120 amostras foram coletadas aleatoriamente, processadas e analisadas. O DNA foi extraído do tecido pulmonar para realização de Nested-PCR e os pulmões foram inspecionados para presença de lesões macroscópicas sugestivas de M. hyopneumoniae. Os resultados demonstraram 95,8% das amostras positivas para o patógeno. A análise do score pulmonar mostrou lesões sugestivas da PES em 60% das amostras. A detecção de amostras positivas no NestedPCR foi associada com a presença de lesões sugestivas (P 0.01). Os dados obtidos neste trabalhodemonstram a alta prevalência da PES em granjas do RS.

DIAGNÓSTICO DE Mycoplasma hyopneumoniae E CIRCOVÍRUS SUÍNO TIPO 2 EM TECIDOS PULMONAR, RENAL E LINFÓIDE E DE Leptospira spp. EM SUÍNOS ABATIDOS SOB INSPEÇÃO SANITÁRIA

O Mycoplasma hyopneumoniae, associado à Pneumonia Enzoótica Suína (PES) e Circovirus Suíno Tipo 2 (PCV2) são dois patógenos causadores de significativas perdas econômicas para a indústria suinícola. Além de causar pneumonia, suspeita-se que o M. hyopneumoniae não seja exclusivo do trato respiratório, podendo estar presente em outros órgãos causando lesões, as quais podem ser confundidas com aquelas causadas pelo PCV2. Este trabalho objetivou diagnosticar a presença de M. hyopneumoniae em tecidos pulmonar e renal, de PCV2 em rins e tecido linfóide e de Leptospira spp. em tecido renal; identificar e caracterizar histologicamente as lesões presentes nestes órgãos, avaliar a concordância dos diagnósticos de PES na Inspeção post-mortem com outros métodos e verificar se as variáveis de desempenho são influenciados pela presença de lesões microscópicas pulmonares, renais e M. hyopneumoniae. Foram coletados tecidos pulmonares de 50 suínos com lesões macroscópicas de PES e de 50 suínos considerados normais, abatidos sob inspeção sanitária, além de fragmentos de rins, linfonodo e tonsila, bem como seus dados de desempenho. Parte dos fragmentos foram fixados em formol 10%, processados pelas técnicas habituais para inclusão em parafina, submetidos aos diagnósticos histopatológico e pela imunohistoquímica(IHQ). A outra parte foi congelada e submetida à Reação em Cadeia da Polimerase (“Nested-PCR”), para o diagnóstico de M. hyopneumoniae e PCV2. O M. hyopneumoniae foi detectado em 96,87% dos rins com lesões microscópicas, comprovando que este agente pode ser detectado em tecido renal de suínos com lesão. Não foi detectada a presença de Leptospira spp. em tecido renal. Houve concordância entre o diagnóstico da Inspeção Sanitária post-mortem com a histopatologia e com a IHQ e da histopatologia com a IHQ, permitindo concluir que o diagnóstico conferido pelos funcionários da Inspeção Sanitária nos matadouros não está equivocado, sendo a macroscopia um método válido para o diagnóstico de PES, porém este não confere a detecção de M. hyopneumoniae. As lesões microscópicas pulmonares influenciaram a espessura de gordura e o percentual de carne magra, porém não influenciaram o peso; as lesões microscópicas renais e a presença de M. hyopneumoniae pela IHQ não influenciaram as variáveis de desempenho, possivelmente pelo fato dos animais analisados terem sido vacinados contra este agente etiológico. Foi detectado o DNA de PCV2 em 76% dos linfonodos e em 67% das tonsilas. No entanto, quando presentes, as lesões detectadas nestes órgãos foram brandas. Este quadro reflete a mudança no cenário de saúde de suínos com relação ao PCV2 após a adoção de vacinação dos rebanhos, de forma que a manifestação clínica da enfermidade atualmente é rara. Palavras-chave: Mycoplasma hyopneumoniae. PCV2. Nested-PCR. Pneumonia Enzoótica Suína. Leptospira spp. Suínos. Histopatologia. Inspeção sanitária