Ação in vivo de Lactococcus lactis subsp. lactis com potencial probiótico na estabilização de células cancerígenas no epitélio colorretal / In vivo action of Lactococcus lactis subsp. lactis with probiotic potential in the stabilization of cancer cells in the colorectal epithelium

Na última década, a ciência contribuiu significativamente para inúmeros avanços em relação ao tratamento e prevenção do câncer colorretal (CCR), porém, a prevalência global e a taxa de mortalidade permanecem elevadas. Há relatos sobre efeitos benéficos de espécies de Bifidobacterium e Lactobacillus com potencial probiótico na prevenção de CCR. No entanto, a bactéria probiótica Lactococcus lactis subps. lactis é comumente utilizada para fins industriais, não havendo comprovações in vivo sobre seu potencial anticarcinogênico. Visto o interesse emergente dos efeitos benéficos dos probióticos a fim de prevenir ou tratar o CCR, o presente estudo objetivou explorar os efeitos de L. lactis subsp. lactis sobre o CCR. Ratos Wistar receberam doses subcutâneas de 1,2 dimetilhidrazina (DMH) e suspensão de L. lactis subsp. lactis por via oral. Após 20 semanas, os tecidos intestinais foram analisados e de acordo com o resultado, o isolado demonstrou potencial anticarcinogênico contra CCR.

Effects of heme oxygenase-1 recombinant Lactococcus lactis on the intestinal barrier of hemorrhagic shock rats

This study aimed to investigate the effects of heme oxygenase-1 recombinant Lactococcus lactis (LL-HO-1) on the intestinal barrier of rats with hemorrhagic shock. One hundred Sprague-Dawley male rats (280–320 g) were randomly divided into healthy control group (N group) and hemorrhagic shock group (H group). Each group was subdivided into HO1t, HO2t, HO3t, PBS and LL groups in which rats were intragastrically injected with LL-HO-1 once, twice and three times, PBS and L. lactis (LL), respectively. The mortality, intestinal myeloperoxidase (MPO) activity, intestinal contents of TNF-α, IL-10 and HO-1, and intestinal Chiu's score were determined. Results showed that in N group, the HO-1 content increased after LL-HO-1 treatment, and significant difference was observed in HO1t group and HO2t group (P<0.05). In H groups, MPO activity and Chiu's score decreased, but IL-10 content increased in LL-HO-1-treated groups when compared with PBS and LL groups (P<0.05). When compared with N group, the MPO activity reduced dramatically in LL-HO-1-treated groups. Thus, in healthy rats (N group), intragastrical LL-HO-1 treatment may increase the intestinal HO-1 expression, but has no influence on the intestinal barrier. In hemorrhagic shock rats, LL-HO-1 may significantly protect the intestinal barrier, and repeating the intragastrical LL-HO-1 treatments twice has the most obvious protection.

Produção biotecnológica de biossurfactante por Lactococcus lactis CECT-4434 a partir de resíduos agroindustriais e avaliação de suas propriedades / Biotechnological production of biosurfactant by Lactococcus lactis CECT- 4434 from agroindustrial residues and evaluation of its properties

A bactéria Lactococcus lactis subsp. lactis CECT-4434 foi empregada para investigar o efeito da composição do meio de cultivo na produção biotecnológica de biossurfactante e, adicionalmente bacteriocina. Utilizou-se resíduos agroindustriais, tais como soro de leite e vinhaça de uva, para formular meios de cultivos mais econômicos e naturais, suplementados sacarose e extrato de levedura. Um planejamento fatorial fracionado 24, com adição de três ensaios nos pontos centrais foi empregado para avaliar a influência destas variáveis. A produção de biossurfactante foi influenciada positivamente pela concentração soro de leite, onde 15 % deste demonstrou melhor resultado reduzindo a tensão superficial em cerca de 18,1 mN/m, alcançando produção máxima de biossurfactante equivalente em surfactina de 11,02 mg/L. Em relação à síntese de bacteriocina, a fonte de carbono adicional (sacarose) interferiu de forma antagonista, ou seja, quanto menor a concentração de sacarose, maior a síntese de bacteriocina (com aumento da zona de inibição em 14,2% contra Staphylococcus aureus CECT-239). Observou-se que o ensaio conduzido em biorreator, sob microaeração com 5% de oxigênio dissolvido, promoveu maior produção de biossurfactante (11,6 mg/L) quando comparados aos estudos conduzidos com maior concentração de oxigênio entre 30 a 100%, com produção em média de 2,3 mg/mL. Destaca-se que nenhum estudo da influência do oxigênio dissolvido, principalmente em microaerofilia, para a produção de biossurfactante por bactérias láticas já havia sido realizado. Ademais, o biossurfactante produzido se mostrou altamente estável frente a valores extremos de pH e temperatura, além de demonstrar notável propriedade antimicrobiana e antiadesiva, inibindo Listeria monocytogenes NADC 2045 e Salmonella entérica CECT-724 em mais de 90%.

Lactococcus lactis subsp. lactis CECT-4434 was used to investigate the effect of the composition of the culture media on the biotechnological production of biosurfactant and bacteriocin additionally. Agroindustrial residues, such as whey and grape vinasse, were used to formulate more economical and natural culture media, supplemented with sucrose and yeast extract. A fractional factorial design 24, with addition of three runs at the central points was used to evaluate the influence of these variables. The biosurfactant production was positively influenced by the concentration of whey, where 15% showed a better result reducing the surface tension by 18.1 mN/m, reaching a maximum production of biosurfactant equivalent in surfactin of 11.02 mg/L. In relation to bacteriocin synthesis, the sucrose interfered in an antagonistic way, that is, the lower the sucrose concentration, the greater the bacteriocin synthesis (with an increase in the zone of inhibition in 14.2% against Staphylococcus aureus CECT-239). It was observed that the bioreactor conducted under microaeration with 5% dissolved oxygen promoted a higher biosurfactant production (11.6 mg/L) when compared to studies conducted with a higher concentration of oxygen between 30 and 100%, with production on average 2.3 mg/mL. It is noteworthy that no study of the influence of dissolved oxygen, mainly in microaerophilic, for the biosurfactant production by lactic acid bacteria had already been carried out. In addition, the biosurfactant produced proved to be highly stable against extreme values of pH and temperature, and demonstrated remarkable antimicrobial and antiadhesive properties, inhibiting Listeria monocytogenes NADC 2045 and Salmonella entérica CECT-724 in more than 90%.

Efeito da composição de bactérias láticas e da suplementação do soro de leite na cinética de acidificação, crescimento celular e produção de nisina / Effect of lactic acid bacteria composition and the supplementation of milk whey on acidification kinetics, cell growth and nisin production

As bactérias ácido-láticas (BAL) são micro-organismos que auxiliam nas características organolépticas, funcionais e de bioconservação de produtos fermentados. A utilização do soro de leite como meio de cultivo natural enaltece o conceito da produção de biomoléculas de alto valor agregado, como bacteriocinas, já que é um subproduto gerado por indústrias de laticínios e considerado um agente poluidor. A inulina é um ingrediente prebiótico que promove seletivamente o crescimento de culturas probióticas. Nesse âmbito, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da composição da cultura de Lactococcus lactis (LL) em cocultura com Streptococcus thermophilus (ST) e da suplementação da base de soro de leite com inulina: (i) nos parâmetros cinéticos de acidificacão, (ii) no crescimento celular, (iii) na viscosidade do produto e (iv) na atividade antimicrobiana da nisina. A fermentação do soro de leite com Lactococcus lactis em cocultura com Streptococcus thermophilus proporcionou a maior taxa de acidificação (Vmax=7,93x10-3 upH/min), assim como apresentou o menor tempo para atingir a velocidade máxima de acidificação (Tvmax=1,13 h). A adição de 2% de inulina ao soro de leite fermentado pela cocultura binária fez com que o tempo para completar o cultivo fosse o mais curto (TpH4,5=4,43 h) quando comparado aos demais ensaios. Quanto ao crescimento celular, pode-se observar que a inulina não afetou significativamente a contagem microbiológica, quando as cepas ST e LL foram utilizadas separadamente no processo fermentativo. Em particular, a adição de 4% de inulina reduziu em 1,2 LogUFC/mL e 0,92 LogUFC/mL a contagem de ST e LL (em monocultura), respectivamente. Por outro lado, em coculturas binárias (ST-LL), percebeu-se ganho na contagem microbiológica nos ensaios que receberam suplementação do ingrediente prebiótico, ou seja, quando adicionados 2% e 4% de inulina, houve aumento de 1 LogUFC/mL e de 1,34 LogUFC/mL na contagem de ST, respectivamente. No caso da cepa LL em cocultura com ST, a suplementação de 2% e 4% do prebiótico aumentou em 0,31 LogUFC/mL e 0,75 LogUFC/mL, respectivamente. A concentração de ácido lático também foi mais elevada nos cultivos realizados com a cocultura binária, sendo 4,56 g/L (na ausência de inulina), 5,28 g/L (com adição de 2% de inulina) e 5,71 g/L (com suplementação de 4% de inulina). A viscosidade foi influenciada tanto pela adição de inulina como pelo efeito sinérgico da cocultura, sendo que o maior valor (7,38 mPas) foi obtido pela cocultura ST-LL e pela adição de 4% do ingrediente prebiótico. Quanto à produção de nisina, observou-se que, no cultivo em cocultura (ST-LL), a concentração de 2% de inulina aumentou em 102% a atividade antimicrobiana quando comparada com a cultura pura LL. Vale ressaltar que ambas as cepas satisfizeram os requisitos tecnológicos relativos à produção de laticínios funcionais

Lactic acid bacteria (LAB) are microorganisms that help in the organoleptic and functional characteristics and in the biopreservation of fermented products. The use of milk whey as a culture medium extols the concept of the production of high value-added biomolecules, such as bacteriocins, since it is a by-product generated by the dairy industry and considered a pollutant. Inulin is a prebiotic ingredient that promotes selectively the growth of probiotic cultures. In this context, the aim of this study was to evaluate the effect of culture composition Lactococcus lactis (LL) in co-culture with Streptococcus thermophilus (ST) and the supplementation of milk whey with inulin on: (i) the acidification kinetic parameters, (ii) the cell growth, (iii) the product viscosity, and (iv) the antimicrobial activity of nisin. The fermentation of milk whey by Lactococcus lactis in coculture with Streptococcus thermophilus provided the highest acidification rate (Vmax = 7.93x10-3 upH/min) and the shortest time to reach the maximum acidification rate ( TVmax = 1.13 h). The addition of 2% inulin in the binary coculture binary led to the shorter time to complete the fermentation (TpH4,5 = 4.43) compared to the other tests. With regard to cell growth, it can be observed that the addition of inulin did not affect the microbiological count of pure cultures of ST and LL strains in the fermentation process. In particular, the addition of 4% inulin reduced by 1.2 Log CFU/mL and 0.92 Log CFU/mL the counts of ST and LL (monoculture), respectively. In the other hand, the binary co-cultures cultivations (ST-LL) with the addition of 2% and 4% inulin increased by 1 LogCFU/mL and 1.34 Log CFU/mL in the case of the ST counts and 0.31 log CFU/mL and 0.75 log CFU/mL the counts of LL, respectively. Lactic acid concentration was higher in cultivations carried out by binary cocultures, thus being 4.56 g/L (in the absence of inulin), 5.28 g/L (with addition of 2% inulin) and 5.71g/L (supplemented with 4% inulin). The viscosity was influenced by the addition of prebiotic ingredient and by the synergistic effect of binary coculture, being the highest value (7.38 mPas) obtained by the addition of 4% inulin. Finally, as regards the production of nisin noted that in the binary coculture cultivations (ST-LL), the concentration of 2% inulin increased at 102% the antimicrobial activity when compared to the pure culture LL. It is worth mentioning that both strains met the technological requirements as regards the production of functional dairy products

Bacteriocinogenic Lactococcus lactis subsp. lactis DF04Mi isolated from goat milk: Application in the control of Listeria monocytogenes in fresh Minas-type goat cheese

Listeria monocytogenes is a pathogen frequently found in dairy products. Its control in fresh cheeses is difficult, due to the psychrotrophic properties and salt tolerance. Bacteriocinogenic lactic acid bacteria (LAB) with proven in vitro antilisterial activity can be an innovative technological approach but their application needs to be evaluated by means of in situ tests. In this study, a novel bacteriocinogenic Lactococcus lactis strain (Lc. lactis DF4Mi), isolated from raw goat milk, was tested for control of growth of L. monocytogenes in artificially contaminated fresh Minas type goat cheese during storage under refrigeration. A bacteriostatic effect was achieved, and counts after 10 days were 3 log lower than in control cheeses with no added LAB. However, this effect did not differ significantly from that obtained with a non-bacteriocinogenic Lc. lactis strain. Addition of nisin (12.5 mg/kg) caused a rapid decrease in the number of viable L. monocytogenes in the cheeses, suggesting that further studies with the purified bacteriocin DF4Mi may open new possibilities for this strain as biopreservative in dairy products.

Metabolitos de bacterias lácticas antagónicos al crecimiento de microorganismos cariogénicos / Antagonistic activity of lactic acid bacteria metabolites toward cariogenic microorganisms growth

Aislar, purificar y conservar cepas de Streptococcus spp. y lactobacillus spp. de la cavidad bucal y enfrentarlas "in vitro" a bacterias lácticas. Materiales y métodos: se seleccionaron individuos con caries y se recolectaron muestras de saliva. Para recuperar Streptococcus spp. se empleó el medio Mitis Salivarius (Difco, Detroit, MI, Estados Unidos) y para Lactobacillus spp. se usó Rogosa (Blokar Diagnostics, Beauvais, Francia). Como cepas productoras de bacteriocinas se utilizaron 7 cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis, 2 de Leuconostoc mesenteroides y 1 de Lactococcus lactis subsp. diacetylactis. La actividad antagónica de las bacterias lácticas al crecimiento in vitro de bacterias cariogénicas se determinó con el método de difusión en agar. Resultado: el desarrollo y la multiplicación de las cepas de Streptococcus spp. de origen bucal ensayadas se vieron afectados por la presencia de metabolitos generados por las cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis. Conclusión: el crecimiento de las cepas de Streptococcus subsp. fue inhibido por efecto de L. lactis subsp. lactis...

Bacteriocinogenic Lactococcus lactis subsp. lactis DF04Mi isolated from goat milk: characterization of the bacteriocin

Lactic acid bacteria capable of producing bacteriocins and presenting probiotic potential open innovative technological applications in the dairy industry. In this study, a bacteriocinogenic strain (Lactococcus lactis subsp. lactis DF4Mi) was isolated from goat milk, and studied for its antimicrobial activity. The bacteriocin presented a broad spectrum of activity, was sensitive to proteolytic enzymes, resistant to heat and pH extremes, and not affected by the presence of SDS, Tween 20, Tween 80, EDTA or NaCl. Bacteriocin production was dependent on the components of the culture media, especially nitrogen source and salts. When tested by PCR, the bacteriocin gene presented 100% homology to nisin Z gene. These properties indicate that this L. lactis subsp. lactis DF4Mi can be used for enhancement of dairy foods safety and quality.

Bacteriocinogenic Lactococcus lactis subsp: lactis DF04Mi isolated from goat milk: Evaluation of the probiotic potential

Lactic acid bacteria capable of producing bacteriocins and presenting probiotic potential open innovative technological applications in the dairy industry. In this study, a bacteriocinogenic strain (Lactococcus lactis subsp. lactis DF4Mi) was isolated from goat milk, and studied for its probiotic potential. Lc. lactis DF4Mi was resistant to acidic pH and oxbile, presented co-aggregation with Listeria monocytogenes, and was not affected by several drugs from different generic groups, being sensitive to most tested antibiotics. These properties indicate that this Lc. lactis strain can be used for enhancement of dairy foods safety and quality, in combination with potential probiotic properties.

Obtención de microcápsulas de tamaño controlado conteniendo Lactococcus lactis, utilizando mezclas de gelanos de alto y bajo acilo / Obtaining size-controlled microcapsules by ionic gelation with high and low acyl gellans containing Lactococcus lactis

Control the diameter of microcapsules obtained with functional biopolymer is a crucial parameter in the success of food applications, since it affects the protection of microencapsulated microorganism and also in the texture of the final product. The aim of this study was to assess the obtaining of controlled size microcapsules containing Lactococcus lactis, using mixtures of high acyl gellan (HA) and low acyl gellan (LA). A concentration of 0.2% (w/w) gellan was employed using a simple design, generating the following mixtures: 100HA/0.0LA, 0.0HA/100LA, 25HA/75LA, 50HA/50LA and 75HA/25LA. The diameter of the microcapsules, efficiency of microencapsulation and viability of the microencapsulated microorganism were studied in function of the speed of agitation (400-800 rpm) and surfactant concentration (sorbitan monooleate) (0.0-0.2%)v/v. The results indicated that mixtures with concentration equal or greater than 50% of HA gellan are not efficient for obtaining microcapsules, only the LA gellan and the mixture 25HA/75LA gave acceptable results. The viability of the microorganism and the efficiency of microencapsulation were descending function of the stirring speed and surfactant concentration. The microcapsules obtained had diameters not greater than 80 µm when the highest concentrations of surfactant (0.2% v/v) and stirring speed (800 rpm) were used, suggesting that the ionic gelation can be used to obtain microcapsules of controlled size (15-75 µm) containing Lactococcus lactis with high viability (83.32%) and high efficiency of microencapsulation (82.4%), which makes it feasible for use in food applications.

Controlar el diámetro de microcápsulas obtenidas con biopolímeros funcionales es un parámetro crucial en el éxito de aplicaciones alimentarias, ya que influye en la protección del microorganismo microencapsulado y también en la textura del producto final. El objetivo de este trabajo fue evaluar la obtención de microcápsulas de tamaño controlado conteniendo Lactococcus lactis, utilizando mezclas de gelana de alto (HA) y bajo acilo (LA). Se empleó una concentración de gelana de 0.2% p/p usando un diseño de mezclas simple, generando las siguientes mezclas, 100HA/0.0LA, 0.0HA/100LA, 25HA/75LA, 50HA/50LA, 75HA/25LA. El diámetro de las microcápsulas, la eficiencia de microencapsulación y la viabilidad del microorganismo microencapsulado fueron estudiadas en función de la velocidad de agitación (400-800 rpm) y concentración de surfactante (sorbitan monooleate) (0.0-0.2%)v/v. Los resultaron indicaron que las mezclas con concentración igual o superior al 50% de gelana de HA, no son eficientes para obtener microcápsulas; solamente dieron resultados aceptables la gelana de LA y la mezcla 25HA/75LA. La viabilidad del microorganismo y la eficiencia de microencapsulación variaron en función descendente de la velocidad de agitación y concentración de surfactante. Las microcápsulas obtenidas no presentaron diámetros superiores a 80 µm cuando se emplearon las mayores concentraciones de surfactante (0.2%) y velocidad de agitación (800 rpm), sugiriendo que la gelación iónica puede ser utilizada para obtener microcápsulas de tamaño controlado (15-75 µm) conteniendo Lactococcus lactis con alta viabilidad (83.32%) y eficiencia de microencapsulación (82.4%), cuando se utiliza la mezcla 25HA/75LA a 800 rpm y 0.2% v/v de surfactante, lo cual la hace factible para su uso en aplicaciones alimentarias.

Antimicrobial activity of the Nisin Z producer Lactococcus lactis subsp. lactis Lc08 against Listeria monocytogenes in skim milk / Atividade antimicrobiana de Lactococcus lactis subsp. lactics Lc08 produtor de Nisina Z contra Listeria monocytogenes em leite desnatado

The presented study aimed to verify the effect of different pH values, enzyme solutions and heat treatments on the antimicrobial activity of the bacteriocinogenic strain Lactococcus lactis subsp. lactis Lc08 and to test their antimicrobial activity against Listeria monocytogenes in reconstituted skim milk at refrigeration temperatures. This strain was previously described as a nisin Z producer and capable of inhibiting L. monocytogenes growth in in vitro tests. The antimicrobial activity of the bacteriocin cell-free supernatant of Lc08 was sensitive to enzyme treatments (except papain). The pH values and heating (65ºC for 30min, 75ºC for 15s) had no apparent effect on the antimicrobial activity of the bacteriocin produced by Lc08. Only treatment at autoclave conditions result in loss of their antimicrobial activity. Lc08 presented antimicrobial activity against L. monocytogenes in the milk system after 12h at 25ºC. No effect was found at 7ºC. The results show the application viability of the Lc08 in food systems as a biopreservative against L. monocytogenes.

O presente estudo teve como objetivo verificar o efeito de diferentes valores de pH, soluções enzimáticas e tratamentos térmicos na atividade antimicrobiana da cepa bacteriocinogênica Lactococcus lactis subsp. lactis Lc08 e testar sua atividade antagonista contra Listeria monocytogenes em leite desnatado reconstituído em diferentes temperaturas de estocagem. Essa cepa já foi descrita como produtora de nisina Z e capaz de inibir o desenvolvimento de L. monocytogenes em testes in vitro. A atividade antimicrobiana do sobrenadante de Lc08 contendo a bacteriocina produzida e livre de células foi sensível ao tratamento pelas enzimas testadas (exceto papaína). A aplicação de diferentes valores de pH e o tratamento térmico (65ºC por 30 min, 75ºC por 15s) não influenciaram na atividade antimicrobiana da bacteriocina produzida por Lc08. Apenas o tratamento em autoclave resultou em perda da sua capacidade em inibir o desenvolvimento de L. monocytogenes. A cepa Lc08 apresentou atividade antagonista contra L. monocytogenes em leite após período de estocagem de 12h a 25ºC. Não foi observado efeito a 7ºC. Os resultados mostram a viabilidade de aplicação da cultura Lc08 ou de sua bacteriocina em produtos lácteos como bioconservador contra L. monocytogenes.

Phenotypic and genotypic characterization of lactic acid bacteria isolated from cow, ewe and goat dairy artisanal farmhouses

Lactic acid bacteria collected from artisanal farmhouses were characterized using a polyphasic approach. Phenotypic methods including biochemical assays, ribosomal DNA restriction analysis and 16S rDNA sequence analysis were performed. This approach provides accuracy for identification, and helps to avoid the loss of natural biodiversity including potentially valuable strains.

Effect of pH and salt gradient on the autolysis of Lactococcus lactis strains

The aim of this work was to assess in-vitro the effect of pH and salt concentration on the rate of autolysis in L. lactis strains. Regardless autolysis variation among L. lactis strains, statistical analysis showed evidence of increase of autolysis in L. lactis under low salt concentration and acidic conditions.

Produção de nisina em leite desnatado diluído por Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454 em biorreator / Nisin production in diluted skimmed milk utilizing Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454 in bioreactor

Nisina é um peptídeo antimicrobiano natural produzido por Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454 durante a fase exponencial de crescimento. A bacteriocina é usada como conservante natural de alimentos, uma vez que mostra atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e esporos. Tem potencial aplicação em inúmeros campos (farmacêutico, veterinário e cosméticos). O objetivo deste trabalho foi estudar a cinética de crescimento bacteriano e a produção de nisina em biorreator, utilizando leite desnatado diluído, como um meio de cultura a baixo custo. Também foram avaliados os consumos de açúcar e proteína, formação de ácido lático e adsorção de nisina nas células produtoras durante os processos de produção de nisina. Pré-cultivos com 107 UFC.mL-1 de Lactococcus lactis foram cultivados em biorreator de 2 L contendo 25 por cento de leite desnatado diluído em água (1,5 L, pH 6,7). Os ensaios foram esenvolvidos a 30°C por 52 horas, variando a agitação e aeração: (i) 200 rpm (0,0, 0,5, 1,0 e 2,0 L.min-1) e (ii) 100 rpm (0,0 e 0,5 L.min-1). A atividade de nisina foi avaliada pelo método de difusão em ágar, utilizando Lactobacillus sakei ATCC 15521 como microrganismo sensível à ação de nisina. A melhor concentração de nisina (62,68 mg.L-1 ou 2511,89 AU.mL-1), foi obtida em 16 horas, 200 rpm e sem aeração (kLa = 5,29 x 10-3 h-1). A adsorção de nisina nas células produtoras foram baixas (6,8 - 15,1 por cento), quando comparadas com a atividade do sobrenadante. Estes resultados mostraram que o meio de cultivo composto por leite desnatado diluído favoreceu o crescimento celular e produção associada ao crescimento da nisina. Foram realizados estudos preliminares de liofilização (bioconservação) e purificação por cromatografia da nisina produzida em biorreator. A liofilização apresentou perda da atividade de nisina (24,8 por cento), enquanto a purificação por cromatografia de interação hidrofóbica com resina Butyl-Sepharose,...

Nisin is a natural antimicrobial peptide produced by Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454 during its exponential growth phase. The bacteriocin is used as natural food preservative due to its antimicrobial activity against Gram-positive bacteria and outgrowth of spores. This property allows its application in numerous fields (pharmaceutical, veterinary and cosmetic). The aim of this work was to study the bacterial growth kinetics of L. lactis and respective nisin production in bioreactor, using diluted skimmed milk as an inexpensive medium. During the production, the consumption of sugar and protein, lactic acid formation and nisin adsorption on the producer strain cells were evaluated. Pre-cultivation with 107 UFC.mL-1 of L. lactis were expanded in a 2 L bioreactor containing 25 percent diluted skimmed milk in water (1.5 L, pH 6.7). The assays were performed at 30°C for 52 hours, varying agitation and airflow rate: (i) 200 rpm (0.0, 0.5, 1.0 and 2.0 L.min-1) and (ii) 100 rpm (0.0, 0.5 L.min-1). Nisin activity was evaluated through diffusion assays using Lactobacillus sakei ATCC 15521 as sensitive strain. The best nisin concentration (62.68 mg.L-1 or 2511.89 AU.mL-1), was achieved at 16 hours, 200 rpm and with no airflow rate (kLa = 5.29 x 10-3 h-1). The quantity of nisin adsorbed by the producer cells were low (6.8 -15.1 percent) when compared to the quantity released in the supernatant. These results showed that diluted skimmed milk supported cell growth and growth-associated nisin. Preliminary assays of lyophilization (biopreservation) and purification by chromatography of nisin produced in bioreactor were performed. Lyophilization presented a loss of nisin activity (24.8 percent) while purification by hydrophobic interaction chromatography with Butyl-Sepharose column recovered 40 percent of the activity, showing that both processes can be applied to the bacteriocin.

Caracterização da bacteriocina produzida por Lactococcus lactis subsp. lactis MK02R isolado de rúcula (Euruca sativa Mill.) e avaliação do seu potencial probiótico utilizando o modelo dinâmico TIM-1 / Characterization of the bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp. lactis isolated MK02R rocket salad (Euruca sativa Mill.) and evaluation of its potential probiotic using the dynamic model TIM-1

Após a constatação da escassez de estudos realizados com vegetais crus na busca por novas estirpes de bactérias láticas (BAL) produtoras de bacteriocinas e diante do potencial tecnológico da aplicação destas cepas tanto como agentes de conservação em alimento, bem como cultura probiótica em alimentos funcionais, este estudo objetivou isolar e identificar cepas de bactérias láticas potencialmente bacteriocinogênicas de amostras de rúcula obtidas no comércio local de São Paulo, SP - Brasil, identificar e caracterizar as bacteriocinas produzidas pelos isolados e avaliar o potencial probiótico dos isolados testando sua sobrevivência no modelo dinâmico do trato gastrointestinal TNO gastro-Intestinal Model - TIM-1 disponível no TNO (The Netherlands Organization for Applied Scientific Research) divisão Quality of Life (Zeist, Holanda). A produção de bacteriocinas neste modelo também foi avaliada, comparando-se com L. sakei 2a, também produtora de bacteriocinas e ainda avaliou-se a interferência na viabilidade de E. faecium LMA1. A cepa Lactococcus lactis subsp. lactis MK02R de rúcula produziu uma bacteriocina sensível à enzimas proteolíticas, termoestável e não influenciada pelo pH, sendo capaz de inibir Enterococcus faecium, Lactobacillus sakei, Listeria innocua, Lactobacillus delbrueckii e Listeria Monocytogenes de diferentes grupos sorológicos. Os ensaios genéticos utilizando primers Nisf e Nisr confirmaram que a bacteriocina MK02R é uma nisina, apresentando uma alteração dos aminoácidos no peptídeo líder em relação às nisinas A, Z, Q, F e U, porém com a estrutura do peptídeo maduro idêntica ao da nisina F. Estes resultados foram confirmados por espectrometria de massas de amostras purificadas por HPLC. L. lactis MK02R resistiu à passagem no modelo dinâmico TIM-1, apresentando uma alta capacidade de sobreviver nas condições simuladas do trato gastrointestinal humano. Entretanto, não foi capaz de causar a redução no número de E. faecium LMA1. Em contrapartida, L. sakei 2a, mesmo apresentando uma sobrevivência menor, foi capaz de causar uma redução de 70% na população de E. faecium LMA1 no ambiente simulado do TGI. Não foi detectada atividade residual da ação antimicrobiana das bacteriocinas produzidas por L. lactis MK02R ou L. sakei 2a após a passagem pelo modelo dinâmico TIM-1. Estes resultados evidenciam a possível aplicação de L. lactis MK02R como um agente de controle biológico na conservação de alimentos e também como uma cultura potencialmente probiótica

Given the scarcity of studies performed with raw vegetables addressing the search for new bacteriocinogenic strains of lactic acid bacteria (LAB) and considering the technological application of these strains as food preservatives and probiotic cultures in functional foods, this study was aimed at isolation and identification of bacteriocinogenic LAB strains from samples of rocket salad obtained in the local market of São Paulo, SP - Brazil, subsequent characterization of the bacteriocins produced by these LABs and evaluation of their probiotic potential by testing their survival in the dynamic gastrointestinal model TNO gastro- Intestinal-Model - TIM-1, available at the TNO (Netherlands Organization for Applied Scientific Research) Quality of Life division (Zeist, Netherlands). The studies in the TIM-1 model were also done with another bacteriocinogenic strain L. sakei 2a for comparison, evaluating their interference on the viability of E. faecium LMA1. The bacteriocin produced by strain Lactococcus lactis subsp. lactis MK02R isolated from rocket salad was sensitive to proteolytic enzymes, heat-stable and not influenced by the pH. The bacteriocin inhibited the growth of Enterococcus faecium, Lactobacillus sakei, Listeria innocua, Lactobacillus delbrueckii the primers Nisf and Nisr indicated that the bacteriocin produced by the strain MK02R is a nisin, with a change in the amino acid sequence of the leader peptide when compared to nisin A, Z, Q, U and F, but with the structure of the mature peptide homologous to that of nisin F. These results were confirmed by mass spectrometry of purified samples obtained by HPLC. L. lactis MK02R withstood the test in the dynamic model TIM-1, presenting capability to survive in the simulated conditions of the human gastrointestinal tract. However, the strain was not able to cause a reduction in the number of E. faecium LMA1. On the other hand, L. sakei 2a, even presenting lower survival, was able to cause 70% reduction in the population of E. faecium LMA1 in the gut simulated environment. No residual antimicrobial activity of bacteriocin produced by L. lactis MK02R or L. sakei 2a was detected after the transit through the dynamic model TIM-1. These results demonstrate the possible application of L. lactis MK02R both as a biocontrol agent in food preservation and as a potentially probiotic culture

Atividade antimicrobiana de bactérias lácticas isoladas de queijo de baixa umidade frente a Staphylococcus aureus ATCC6538 e Listeria monocytogenes ATCC7644 / Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from cheese, low moisture against Staphylococcus aureus ATCC6538 and Listeria monocytogenes ATCC7644

Há uma crescente preocupação na indústria de alimentos com o desenvolvimento de métodos para o controle de microrganismos indesejáveis na tentativa de satisfazer os consumidores que estão mais exigentes e atentos aos conservadores contidos nos alimentos. As bactérias láticas (BAL) despertam interesse devido ao seu potencial de utilização no biocontrole em alimentos, pois podem exercer atividade inibitória frente a outras bactérias. No presente trabalho o isolamento de BAL foi realizado em 60 amostras de queijo de baixa umidade. Das 66 linhagens isoladas, 10 foram identificadas baseando-se na coloração de Gran, reação com KOH, teste de catalase e fermentação de 49 carboidratos (API 50 CH). (...)

Produção e purificação de nisina produzida por Lactococcus lactis em leite desnatado e soro de leite / Nisin production and purification utilizing Lactococcus lactis is skimmed milk and milk whey

O peptideo antimicrobiano retratado neste trabalho é a nisina, produzido pela bacteria Lactococcus lactis subsp. lactis, urn peptideo estruturalmente composto por 34 aminoácidos, mostra urn vasto espectro de atividade inibitória em microrganismos Gram-positivos, Gram-negatios e esporo formadores. O objetivo deste trabalho foi produzir a nisina a partir de células de Lactococcus lactis utilizando soro de leite e leite desnatado como meio de cultivo. Para tanto as células de L. lactis foram desenvolvidas em agitador rotacional (30°C/36 h/100 rpm) e a atividade de nisina, os parâmetros de crescimento e os componentes do meio de cultivo foram analisados. Em leite desnatado, contendo 2,27 g de sólidos totais, a atividade de nisina foi 20077,05 AU.mLˉ¹ sendo 3 vezes maior em relação ao leite desnatado corn 4,54 g sólidos totais, 8739,77 AU.nnLˉ¹ ; e foi 73 vezes major em relacão ao leite desnatado corn 1,14 g sólidos totais, 273,21 AU.mLˉ¹ . 0 soro de leite utilizado foi doado por uma inc:Istria de lacticínios, em laboratório parte do soro foi tratada de duas formas: (i) filtrado e (ii) esterilizado, e ambos foram utilizados para cultivo das células produtoras de nisina em agitador rotacional 30°C/36 h/100 rpm. Os resultados mostraram que o meio de cultivo composto por soro de leite não filtrado forneceu uma adaptação ao L. lactis, sendo a concentração de nisina obtida 1628 vezes maior que do soro de leite filtrado, 11120,13 e 6,83 mg.Lˉ¹ respectivamente. Em relação atividade de nisina contra Gram-negativos, aumentou-se o efeito bactericida quando adicionada ao EDTA. O comportamento da nisina no sistema micelar de duas fases aquosas foi investigado experimentalmente, demonstrando que a biomolécula alvo pode ser extraída tanto do meio fermentado complexo quanto das impurezas presentes na nisina comercial. Nos testes corn o sistema micelar de duas fases aquosas, a nisina particionou, preferencialmente, para a fase rica em micelas...

Nisin is a natural antimicrobial peptide used as food preservative produced by Lactococcus lactis, that inhibits the outgrowth of spores, the growth of a variety of Gram-positive and Gram-negative bacteria. Applications of this bacteriocin include dental care products pharmaceutical products such as stomach ulcers and colon infection treatment and potencial birth control. This study aims to evaluate growth conditions for L. lactis as well as the effect in nisin production when utilizing milk whey and skimmed milk. Lactococcus lactis ATCC 11454 was developed in a rotatory shaker (30°C/36 h/100 rpm) in diluted skimmed milk and nisin expression, growth parameters and media components were also studied. Nisin expression in skimmed milk 2.27 g total solids (20077.05 AU.mLˉ¹ ) was up to 3-fold higher than transfers in skimmed milk 4.54 g total solids (8739.77 AU.mLˉ¹ ) and was up to 85-fold higher than transfers in skimmed milk 1.14 g total solids (273.21 AU.mLˉ¹ ). Milk whey, a byproduct from dairy industries, was utilized in two different ways (i) without filtration, autoclaved at 121°C for 30 min and (ii) filtrated (1.20 pm and 0.22 vim membrane filter), L. lactis was developed in a rotary shaker (30°C/36 h/100 rpm) and these cultures were transferred five times using 5 mL aliquots of broth culture for each new volume of the respective media. The results showed that culture media composed by milk whey without filtration was better for L. lactis in its adaptation than milk whey without filtration. Nisin titers, in milk whey without filtration, was 11120.13 mg.Lˉ¹ in 2nd transfer, and up to 1628-fold higher than the filtrated milk whey, 6.83 mg.Lˉ¹ in 1 St transfer. Nisin activity was assayed by the agar diffusion method using Lactobacillus sakei ATCC 15521 and a recombinant Escherichia coli DH5a expressing the recombinant green fluorescent protein (GFPuv) as the nisin-susceptible test organisms. Combining EDTA with nisin increased the bactericidal effect of...

Meningitis bacteriana por Lactococcus lactis cremoris / Bacterial meningitis caused by Lactococcus lactis cremoris

Introducción: Lactococcus lactis cremoris es una bacteria perteneciente a la familia Streptococcaceae que normalmente puede aislarse como parte de la microbiota transitoria o residente del tracto gastrointestinal en el ser humano. Se considera esencial en la industria alimenticia donde se emplea en la fermentación de la leche para la obtención de productos derivados como el queso, yogur, mantequilla, entre otros. Objetivos: este caso constituye el primer reporte de un paciente adulto sin evidencias anteriores de inmunodepresión con una meningitis bacteriana por L. lactis. Métodos: se estudió la evolución del caso de una paciente de 73 años de edad, que llegó al cuerpo de guardia del hospital con un cuadro clínico sobreagudo dado por trastornos de la conducta como irritabilidad con inmediata evolución a estado de obnubilación y desorientación. Se realizó el diagnóstico microbiológico utilizando las técnicas convencionales de identificación y los estudios de sensibilidad antimicrobiana. Resultados: se diagnosticó una meningitis bacteriana por L. lactis, bacteria asociada a procesos infecciosos fundamentalmente en pacientes pediátricos e inmunodeprimidos. Conclusiones: el modo de transmisión de la infección es indirecto por vía oral. No se determinó el foco primario de infección a partir del cual se produjo la diseminación dentro del organismo, la cual se considera fue por vía hematógena según la localización anatómica de los sitios donde se encontraron signos de sepsis. En los datos referidos en la historia clínica de la paciente no se encontró ningún antecedente de compromiso de su inmunidad antes del cuadro clínico que motivó el ingreso.

Background: Lactococcus lactis cremoris is a bacteria from Streptococcaceae family that may usually be isolated as part of transient or residing microbiota in the human gastrointestinal tract. It is considered essential element in the food industry where it is used as milk fermenter to obtain byproducts such as cheese, yoghurt, butter and others. Objectives: this is the first report of an adult patient with bacterial meningitis by L. lactis, without a previous history of immunosuppresion. Methods: the evolution of a 73 years-old female patient, who came to the Emergency Department with a very acute clinical picture of behavioural disorders like irritability, immediately evolving into obnulation condition and lack of proper orientation. The conventional identification techniques together with the antimicrobial sensitivity studies allowed making the microbiological diagnosis. Results: bacterial meningitis caused by L. lactis was diagnosed. This bacterium is linked to infectious processes mainly in pediatric and inmmunosuppresed patients. Conclusions: the mode of transmission is indirect and orally. The primary focus of infection from which the virus disseminated inside the body was not found. It was considered then that it occurred according to the anatomical location of the sites where sepsis signs were found. According to the data provided by the patient´s medical history, not a single antecedent of compromised immunity was found before appearing the above-mentioned clinical picture.

Predicción del crecimiento de la Lactococcus lactis subsp. lactis en leche descramada estéril en función a la temperatura / Growth prediction of Lactococcus lactis subsp. lactis in sterile skimed milk as a function of temperature

Diversos modelos matemáticos han sido desarrollados con el objeto de predecir el comportamiento de las poblaciones bacterianas en fase de crecimiento en condiciones controladas a nivel de laboratorio, muchos de estos han sido validados en condiciones de producción, transporte y almacenamiento de alimentos. El objetivo del presente trabajo fué adaptar un modelo matemático utilizando ecuaciones obtenidas como resultado del análisis con modelos secundarios de los coeficientes de regresión de la ecuación de Gompertz, a efectos de lograr predecir las poblaciones en crecimiento de Lactococcus lactis subsp. lactis en leche en polvo reconstituida y esterilizada, controlando la temperatura en el rango desde 9 a 39°C. Con este fin, los coeficientes “A” y “B” se analizaron con el modelo de la raíz cuadrada, obteniéndose valores de R2 = 0,819 y 0,991, respectivamente, mientras que el modelo hiperbólico se utilizó para modelar los coeficientes “D” (R2= 0,812) y “M” (R2= 0,995). Finalmente se obtuvo una expresión reparametrizada del modelo original de Gompertz, sustituyendo cada coeficiente de regresión por la ecuación que lo describe, en función a las diferentes temperaturas estudiadas, siendo este modelo utilizado para predecir directamente las poblaciones del microorganismo en estudio a cualquier temperatura dentro del rango estudiado. Se obtuvieron diferencias muy pequeñas entre la población observada experimentalmente y la ajustada según la aplicación del modelo desarrollado, observándose una distribución bastante equilibrada de los valores residuales. Se recomienda utilizar este tipo de modelo para describir el crecimiento de poblaciones combinadas en productos como leche pasteurizada comercial.

Several mathematic models have been developed to predict the behavior of bacteria populations in growing phase and controlled conditions at the laboratory. Many of these models have been validated under food production, transportation and storage conditions. The objective of this study was to adapt a mathematical model using equations obtained as a result of the analysis with secondary models of regression coefficients from the Gompertz equation, to predict population of Lactococcus lactis subsp. lactis in the growing phase in reconstituted and sterilized powder milk, controlling temperature in a range of 9 to 39°C. Prediction was done by the analysis of “A” and “B” coefficients, using the square root model, obtaining R2 values = 0.819 and 0.991, respectively. Furthermore, a hyperbolic model was used for modeling “D” (R2= 0.812) and “M” (R2= 0.995) coefficients. Finally, a reparametrized expression of the original Gompertz model was obtained replacing each regression coefficient by the described equation, in relation to the different studied temperatures. Thus, this model was used to directly predict the population of microorganism under study at any temperature in the studied range. Small differences were obtained between both, the experimental and the adjusted populations, according to the application of the developed model. A well balanced distribution of the residual values was observed. The use of this type of models is recommended to describe growth of combined microorganism populations in products such as commercial pasteurized milk.

Comparación de modelos sigmoidales aplicados al crecimiento de lactococcus lactis subsp: lactis / Comparison of sigmoid models applied to the growth of lactococcus lactis subsp: lactis

La microbiología predictiva es una herramienta útil para describir y predecir el crecimiento bacteriano en los alimentos. Para comparar la aplicación de diferentes modelos sigmoidales aplicados al crecimiento de Lactococcus lactis subsp. lactis, se analizaron muestras de leches tomadas del total del ordeño matutino de dos rebaños, bufalino (n=6) y vacuno (n=6), manejados bajo las mismas condiciones, ubicados en el municipio Mara del estado Zulia, Venezuela. Se determinaron algunos parámetros, tales como pH, acidez titulable y presencia de inhibidores. Se preparó una serie de tubos de ensayo con leche esterilizada a 110 ± 2°C por 10 min. y se inocularon con Lactococcus a 1 x 104 ufc/mL. Posteriormente, fueron incubados a 36 ± 0,5°C y cada dos horas se prepararon diluciones y siembra en placas con agar M-17. Se determinó el Log10 de ufc/mL para las 0; 2; 4; 6; 8 y 10 horas de incubación. Se realizó un análisis de regresión con los modelos de Gompertz, Logístico, Stannard y Richards, por medio del algoritmo de Marquardt. Se encontró similitud en el ajuste de los modelos aplicados. Los modelos de Stannard y Richards resultaron ser iguales en la estimación de los datos y fueron los que presentaron mayor dificultad para alcanzar el criterio de convergencia. El modelo de Gompertz de tres parámetros presentó diferencia significativa con los modelos de cuatro parámetros. Se considera los modelos de Gompertz y Logístico (con cuatro parámetros), modificados por Gibson, como los mejores para modelar y predecir el crecimiento del microorganismo en estudio.

Predictive Microbiology is a useful tool to describe and predict the bacterial growing in food. Milk samples from total morning milking of two herds, buffalo (n=6) and cattle (n=6), managed under similar conditions, located in Mara Municipality, Zulia State, Venezuela, were analyzed to compare the application of different sigmoid models to the growth of Lactococcus lactis subsp. lactis strain. Sanitary quality was determined by means of pH, acidity titration and detection of inhibitors. A series of assay tubes were prepared with sterilized milk at 110 ± 2°C for 10 min. The milk in the assay tubes was inoculated with Lactococcus at 1 x 104 ufc/mL. Then, the assay tubes were incubated at 36 ± 0.5°C and every two hours dilutions and culture were prepared in Petrie dishes with M-17 agar. Log10 of ufc/mL was determined for 0; 2; 4; 6; 8 y 10 hours post incubation. A regressions analysis with Gompertz, Logistic, Stannard and Richards models through Marquardt algorithm was used. Similarity was found when models were adjusted. The Stannard and Richards models were equal for the data estimation and they presented the greatest difficulty to reach the convergent criterion. The three parameters Gompertz model showed significant difference compare to the four parameters models. The Gompertz and Logistic models (with four parameters) modified by Gibson are considered the best to model and predict the growing of the microorganism under study.

Produção de salame tipo italiano, com bactéria lática isolada de salame artesanal / Production of italian sausage, with lactic bacteria isolated from artisanal sausage

Lactococcus lactis ssp lactis foi isolada de salame artesanal e submetida ao processo de fermentação a fim de obter a concentração desejada para sua utilização como cultivo iniciador. Porções iguais de massa de salame tipo italiano foram separadas, sendo que uma delas foi mantida como controle e a outra porção foi inoculada com Lactococcus lactis ssp lactis na concentração de 8,76 log10 UFC/g de massa cárnea. Amostras de ambos os salames foram analisadas, quanto às propriedades microbiológicas e físico-químicas, no primeiro dia de elaboração dos mesmos e com 7, 14, 21 e 28 dias de maturação.