Biomarker testing for advanced lung cancer by next-generation sequencing; a valid method to achieve a comprehensive glimpse at mutational landscape

Background: Next-generation sequencing (NGS) based assay for finding an actionable driver in non-small-cell lung cancer is a less used modality in clinical practice. With a long list of actionable targets, limited tissue, arduous single-gene assays, the alternative of NGS for broad testing in one experiment looks attractive. We report here our experience with NGS for biomarker testing in hundred advanced lung cancer patients. Methods: Predictive biomarker testing was performed using the Ion AmpliSeq™ Cancer Hotspot Panel V2 (30 tumors) and Oncomine™ Solid Tumor DNA and Oncomine™ Solid Tumor Fusion Transcript kit (70 tumors) on IonTorrent sequencing platform. Results: One-seventeen distinct aberrations were detected across 29 genes in eighty-six tumors. The most commonly mutated genes were TP53 (43% cases), EGFR (23% cases) and KRAS (17% cases). Thirty-four patients presented an actionable genetic variant for which targeted therapy is presently available, and fifty-two cases harbored non-actionable variants with the possibility of recruitment in clinical trials. NGS results were validated by individual tests for detecting EGFR mutation, ALK1 rearrangement, ROS1 fusion, and c-MET amplification. Compared to single test, NGS exhibited good agreement for detecting EGFR mutations and ALK1 fusion (sensitivity- 88.89%, specificity- 100%, Kappa-score 0.92 and sensitivity- 80%, specificity- 100%, Kappa-score 0.88; respectively). Further, the response of patients harboring tyrosine kinase inhibitor (TKI) sensitizing EGFR mutations was assessed. The progression-free-survival of EGFR positive patients on TKI therapy, harboring a concomitant mutation in PIK3CAmTOR and/or RAS-RAF-MAPK pathway gene and/or TP53 gene was inferior to those with sole-sensitizing EGFR mutation (2 months vs. 9.5 months, P = 0.015). Conclusions: This is the first study from South Asia looking into the analytical validity of NGS and describing the mutational landscape of lung cancer patients to study the impact of co-mutations on cancer biology and treatment outcome. Our study demonstrates the clinical utility of NGS testing for identifying actionable variants and making treatment decisions in advanced lung cancer

Triiodothyronine (T3) upregulates the expression of proto-oncogene TGFA independent of MAPK/ERK pathway activation in the human breast adenocarcinoma cell line, MCF7

ABSTRACT Objective: To verify the physiological action of triiodothyronine T3 on the expression of transforming growth factor α (TGFA) mRNA in MCF7 cells by inhibition of RNA Polymerase II and the MAPK/ERK pathway Materials and methods: The cell line was treated with T3 at a physiological dose (10−9M) for 10 minutes, 1 and 4 hour (h) in the presence or absence of the inhibitors, α-amanitin (RNA polymerase II inhibitor) and PD98059 (MAPK/ERK pathway inhibitor). TGFA mRNA expression was analyzed by RT-PCR. For data analysis, we used ANOVA, complemented with the Tukey test and Student t-test, with a minimum significance of 5%. Results: T3 increases the expression of TGFA mRNA in MCF7 cells in 4 h of treatment. Inhibition of RNA polymerase II modulates the effect of T3 treatment on the expression of TGFA in MCF7 cells. Activation of the MAPK/ERK pathway is not required for T3 to affect the expression of TGFA mRNA. Conclusion: Treatment with a physiological concentration of T3 after RNA polymerase II inhibition altered the expression of TGFA. Inhibition of the MAPK/ERK pathway after T3 treatment does not interfere with the TGFA gene expression in a breast adenocarcinoma cell line.

Expression of the c-MET, HGF and VEGF biomarkers in intestinal and diffuse gastric cancer in the Brazilian population: a pilot study for the standardization of the quantitative PCR technique

Background: Gastric carcinoma (GC) is the third leading cause of death among malignant tumors worldwide, causing approximately 900,000 deaths/year. Changes in oncogenes that encode tyrosine kinase receptors play an important role in the pathogenesis of GC. MET gene is a proto-oncogene that encodes a tyrosine kinase receptor c-MET and it is required for embryonic development and tissue repair. The hepatocyte growth factor (HGF) is the only known ligand for c-Met receptor. The MET oncogene activation suppresses apoptosis and promotes the survival, proliferation, migration, differentiation and angiogenesis of cells. Among the angiogenic factors, VEGF is the main regulator. Its biological function includes the promotion of endothelial cells mitosis to stimulate cells proliferation. These biomarkers expression in GC is relatively recent and population-based studies are required to define the expression pattern. The aim of this study was to determine qPCR technical standardization to evaluate quantitatively, in paraffin tissue samples, the presence of gene 23 expression of the MET, HGF and VEGF in diffuse and intestinal GC types. Methods: Twenty GC patients were studied, 10 patients were intestinal-type GC (average age 72.1 years) and 10 diffuse-type (average age 50.1 years). In all patients, tissue samples were analyzed from the tumor and distant areas of the tumor tissue. The relative expressions of the tumor markers c-Met, HGF and VEGF were performed by qPCR technique by comparing tumor and non-tumoral samples and they were normalized with the GAPDH constitutive gene. Statistical analysis was performed through T-test. Results: For c-Met, 18/20 (90%) patients expressed the marker and 9/20 (45%) overexpressed this gene, in which three were intestinal-type GC and six were diffuse-type GC. For HGF, only 7/20 (35%) patients expressed this gene and it was overexpressed in 4/20 (20%), in which two were intestinal-type GC and two were diffuse-type GC. For VEGF, 20/20 (100%) patients expressed this marker and in 12/20 (60%) were observed overexpression, in which eight patients had diffuse-type GC and four had intestinal-type GC. Conclusions: qPCR technique was standardized and suitable for expression analysis of the three biomarkers using paraffin embedded tissue samples. Further studies should be carried out to characterize the expression pattern of these biomarkers in GC in the Brazilian population (AU)

Perfil de expressão de microRNAs regulados por C-MYC no linfoma de Burkitt / [Expression profile of C-MYC-regulated microRNAs in Burkitt's lymphoma]

O Linfoma de Burkitt (LB), subtipo de linfoma não Hodgkin B mais frequente na infância, é uma neoplasia hematológica altamente agressiva. A assinatura molecular é a translocação (8;14) ou suas variantes: t(2;8) e t(8;22). Ambas as translocações envolvem o proto-oncogene c-MYC que quando translocado é expresso constitutivamente, caracterizando a principal alteração conhecida no LB. Atualmente, tem sido demonstrado que c-MYC regula a expressão de vários miRNAs, dentre eles o cluster de miR-17-92 e a família miR-34, entreoutros. Neste contexto, o balanço entre c-MYC e miRNAs parece ser crítico para a patogênese do LB e necessita ser melhor elucidado. Nesse estudo avaliamos a expressão dos miRNAs regulados por c-MYC (cluster 17-92: miR-17, miR-19a/b, miR-20a, miR-92a e da família miR-34) em 57 amostras tumorais de LB pediátrico. Adicionalmente, avaliamos a correlação entre os níveis de miR-17, miR-19a/b, miR-20a e miR-92a e a expressão de um dos seus principais alvos, a proteína pró-apoptótica BIM. Foi observado que níveis elevados do miR-17 e miR-20a estavam associados com a ausência da expressão de BIM (p<0,001). Em sequência, observamos que o aumento do miR-17 estava fortemente correlacionado com uma sobrevida global (SG) inferior (p=0,007). A análise multivariada revelou também que miR-17 foi um preditor significativo de SG encurtada. A inibição do miR-17 em linhagem de LB resultou em aumento da proteína BIM, reforçando o papel deste miRNA na regulação deBIM...

Burkitt lymphoma (BL) is highly aggressive subtype of B-non-Hodgkin more frequent in childhood and associated with the translocation (8, 14) or its variations: t(2, 8) or t(8, 22). The proto-oncogene c-MYC is involved in all translocations and it is juxtaposed to Igs gene enhancers being expressed constitutively. It has been demonstrated that c-MYC regulates alarge number of miRNAs, including the cluster miR-17-92 and miR-34 family. Thus, the balance between Myc and miRNAs may be critical to the BL pathogenesis and needs furtherelucidation. In this study, we investigated miR-17, miR-19a, miR-19b, miR-20 and miR-92a expression levels in a series of 57 BL tumor samples. In addition, pro-apoptotic BIM proteinexpression was evaluated and then compared to miR-17, miR-19a, miR-19b, miR-20 and miR-92a levels, and patient outcomes. We found that upregulated expression of miR-17, andmiR-20a correlates with lack of pro-apoptotic BIM protein expression (p<0.001). Patients bearing tumors with upregulated miR-17 displayed decreased overall survival (OS) (p=0.007). Moreover, the multivariate analysis revealed that miR-17 was a significant predictor of shortened OS. Using hairpin inhibitor we showed that inhibition of miR-17 resulted inenhanced BIM expression in a BL cell line, suggesting the involvement of this miRNA in the regulation of BIM protein. Besides, low expression levels of miR-34a/b/c were observed in BL tumor samples. Next, we evaluated whether these miRNAs were suppressed by DNAmethylation. So, we analyzed the effect of demethylant agent 5-aza-2-deoxycytidine (decitabine) on miR-34 expression levels in BL cell lines. We observed an increase of miR-34b levels in BL41, Daudi and Raji cell lines in all decitabine concentrations. Then, we also detected that the treatment with higher concentration of decitabine resulted in the c-MYCmRNA reduction in Daudi and Raji (0.83 and 1.4 times, respectively)...

Clonagem molecular do oncogene EZH2 de leucemiamieloide crônica e perspectivas terapêuticas / Molecular cloning of EZH2 oncogene in chronic myeloid leukemia andtherapeutic prospects

A Leucemia Mieloide Crônica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa originada, em 95% dos casos, por uma anormalidadecitogenética que se caracteriza pela translocação recíproca entre os cromossomos 9 e 22 t(9; 22) (q34; q11), resultandono cromossomo Philadelphia (Ph). Considerando que a cura da LMC só é possível com um transplante de medulaóssea bem-sucedido e que existem casos de resistência ao inibidor de tirosina quinase Mesilato de Imatinibe, fármacode primeira escolha para o tratamento, é importante que se conheça detalhadamente os genes e proteínas alterados naLMC, favorecendo a efetividade de estratégias terapêuticas, a otimização do diagnóstico e a detecção de doença residualmínima. Dentre as novas abordagens terapêuticas para a LMC está a terapia gênica, que dependendo do gene alvo, podetambém ser eficiente para o tratamento de outras neoplasias. Dentro deste contexto, os objetivos do trabalho foram:realizar a clonagem molecular de um fragmento de DNA do gene EZH2, alvo promissor da terapia gênica, que provocaalteração epigenética na LMC e em diversas neoplasias; bem como contribuir para outros trabalhos de manipulação gênicainterespécies, os quais tem grande contribuição para a área da saúde. Para isso, o gene EZH2 foi isolado a partir do DNAgenômico de sangue periférico de pacientes com LMC e posteriormente clonado em sistemas procariotos. Dessa forma,foram realizados, definidos e comprovados os procedimentos de manipulação gênica interespécies e discutido o futuro dabiotecnologia no auxílio a pesquisas e a tratamentos, com foco na LMC.

Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative neoplasia, caused in 95 % of the cases by a cytogenetic abnormalitycharacterized by the reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22 t(9; 22) (q34; q11), resulting in Philadelphiachromosome (Ph).Considering that CML cure is only possible with a successful bone marrow transplantation and that thereare resistance cases to the tyrosine kinase inhibitor Imatinib Mesylate, prescribed in first line drug treatment; it is importantto know in detail the genes and proteins that are possibly altered in CML, favoring effective therapeutic strategies, optimizeddiagnosis and minimal residual disease detection. Among the new therapeutic approaches to CML is gene therapy, which,depending on the target gene, can be efficient to other neoplasms treatment. In this context, the aims of this work were:to proceed the molecular cloning of a DNA fragment from EZH2 gene, potential target for gene therapy, that promotesepigenetic alteration in CML and in many neoplasms; as well as to contribute to studies related to interspecies gene transferthat have high contribution to health. For this reason, the EZH2 gene was isolated from peripheral blood genomic DNAfrom CML patients and cloned in prokaryotic systems. Therefore, in this study, we proceed, defined and proved the interspeciesgene transfer procedures and discussed the future of biotechnology in researches and treatments, especially in CML.

Analysis of EGFR and HER-2 expressions in ductal carcinomas in situ in canine mammary glands / Análise da expressão de EGFR e HER-2 em carcinomas ductais in situ da glândula mamária canina

Biomolecular evidence has shown that ductal carcinoma in situ (DCIS) may develop into invasive carcinoma of the canine mammary gland, and mutations in proto-oncogenes HER2 and EGFR; two members of the family of epidermal growth factor receptors, may be involved in this process. The purpose of this study was the characterization of the immunohistochemical expression of the EGFR and HER2 proteins in the process of neoplastic transformation, supposedly present in ductal carcinomas in situ in canine mammary glands. Fifteen cases of DCIS were evaluated, with a higher expression of HER2 and EGFR being observed in low-grade carcinomas when compared with high-grade neoplasms, and with a high positive statistical correlation in the latter. Results suggest that aggressive tumors tend to lose the expression of EGFR and HER2 simultaneously. The loss of the expression of these markers may be related to the process of neoplastic progression in canine mammary tumors...

Evidências biomoleculares sugerem que o carcinoma ductal in situ (CDIS) pode progredir para carcinoma invasor na mama canina e que mutações nos proto-oncogenes HER-2 e EGFR, dois membros da família de receptores para fatores de crescimento epidérmicos, podem estar envolvidas neste processo. A partir disso, este trabalho teve por objetivo caracterizar a expressão imuno-histoquímica das proteínas EGFR e HER-2 no processo de transformação neoplásica supostamente presente em carcinomas ductais in situ da glândula mamária canina. Foram avaliados 15 casos de CDIS, sendo observada maior expressão de HER-2 e EGFR em carcinomas de baixo grau em comparação às neoplasias de alto grau, com correlação estatística positiva alta nestes últimos. Os resultados sugerem que tumores mais agressivos tendem a perder, simultaneamente, a expressão de EGFR e HER-2. A perda na expressão desses marcadores pode estar envolvida no processo de progressão neoplásica em tumores mamários caninos...

Alteraciones del gen c-Myc en la oncogénesis / C-Myc gene alterations in oncogenesis

La familia de protooncogenes MYC (c-Myc, N-Myc y L-Myc) se relaciona con el origen de diversas neoplasias en seres humanos. Estos genes actúan como factores de transcripción y participan en la regulación del ciclo celular, la proliferación y diferenciación celulares, la apoptosis y la inmortalización. Los genes MYC se expresan en diferentes tejidos y responden a diversas señales internas y externas; codifican para la síntesis de factores de transcripción que se unen al ADN para regular la expresión de múltiples genes. El gen más ampliamente estudiado de esta familia es c-Myc, que se expresa en las células con mayor tasa de proliferación. C-Myc se encuentra alterado en un gran número de tumores sólidos, leucemias y linfomas. Las alteraciones de c-Myc encontradas con mayor frecuencia en células cancerosas son las amplificaciones, translocaciones, mutaciones y reordenamientos cromosómicos que involucran el locus de este gen y conducen a que se desregule su expresión en diversas neoplasias humanas. La amplificación de c-Myc es una alteración común en los cánceres de mama, pulmón, ovario y próstata, así como en leucemias y linfomas, mientras que la pérdida de su regulación es común en el cáncer de colon, en tumores ginecológicos y melanoma. En neoplasias con defectos de c-Myc los estudios actuales están dirigidos al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

The family of MYC proto-oncogenes (c-Myc, N-Myc and L-Myc) is related to various types of cancer in humans. These genes act as transcription factors and are involved in cell cycle regulation as well as in the immortalization, apoptosis, proliferation and cell differentiation. They are expressed in different tissues and respond to various internal and external signals. They code for the synthesis of transcription factors that bind to DNA to modulate the expression of different genes. The most widely studied gene in this family is c-Myc, which expresses in cells with higher rate of proliferation. This gene shows alterations in many solid tumors, leukemias, and lymphomas. The most widely found alterations of c-Myc in cancer cells are amplifications, translocations, point mutations, and chromosomal rearrangements that involve its locus and lead to dys-regulation of its expression in different human malignancies. Amplification of c-Myc is frequent in breast, lung, ovarian and prostate cancers, as well as in leukemias and lymphomas. Loss of its regulation is common in colon cancer, gynecological tumors and melanoma. In tumors with c-Myc deffects present studies aim at the development of new therapeutic strategies.

Tumores estromais gastrointestinais (GIST): revisão da literatura / Gastrointestinal stromal tumors (GIST): a literature review

Os tumores estromais gastrointestinais (GIST) são os tumores mesenquimais mais comuns do trato gastrointestinal (TGI) e representam cerca de 1% de todos os tumores do TGI. Estes tumores teriam origem nas células precursoras das células intersticiais de Cajal. 95% dos GIST expressam a proteína CD117, receptor transmembrana, que sofre várias mutações e ativações, proporcionadas pelo proto - oncogene KIT e irá desenvolver finalmente a neoplasia. Eles se desenvolvem com a mesma prevalência em homens e mulheres, geralmente acima de 50 anos. A maior incidência é observada entre a quinta e a sexta década de vida, podendo-se desenvolver em qualquer parte do TGI, contudo o estômago é a localização mais comum... A avaliação do prognóstico vai depender principalmente do tamanho do tumor e o índice mitótico. A adequada compreensão e utilização dos critérios diagnósticos e classificação dos GISTs é fundamental para o tratamento do paciente.

Importância da identificação das mutações do protooncogene RET e sua atuação no desenvolvimento dos diversos fenótipos das neoplasias endócrinas múltiplas tipo 2 / Importance of RET proto-oncogene mutations identification and its performance in thedevelopment of the multiples endocrines neoplasias type 2 several phenotypes

A hereditariedade autossômica dominante da neoplasia endócrina múltipla tipo 2 (NEM 2) relaciona-se à ativação do proto-oncogene RET, através de mutações missense. As mutações do RET são encontradas em 95% dos casos índices de NEM 2 e apresentam relação direta entre sua localização codon específica e os diversos fenótipos desenvolvidos, dentre eles, carcinoma medular datireóide, feocromocitoma e/ou hiperparatireoidismo. Baseando-se em análises bioquímicas e genéticas, é possível efetuar um diagnósticoprematuro, viabilizando a intervenção cirúrgica em tempo hábil. A periodicidade da monitorização bioquímica é ditada pelo fenótipopresente, pelas manifestações clínicas familiares e pelo genótipo RET. A recomendação da análise genética deve ser feita a todos indivíduos afetados e também a seus ascendentes e descendentes diretos, caso alguma mutação esteja presente; permitindo identificar os portadores de mutações RET, previamente ao início da sintomatologia. Neste trabalho, serão discutidos os aspectos molecularesdos diversos fenótipos da NEM 2, bem como a importância da identificação genotípica do proto-oncogene RET e sua interação com os testes bioquímicos visando o diagnóstico precoce, prevenção, monitorização, screening familiar e, portanto, maior sobrevidado paciente.

The dominant autossomic hereditarity of the multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN 2) is related to RET proto-oncogene activation, through mutations missense. RET mutations are found in 95% of MEN 2 index cases and present direct relation between its specific localization codon and the diverse developed phenotypes, among them, medullary thyroid carcinoma, pheochromocytoma and/or hyperparathyroidism. Being based on biochemists and genetics analyses, it is possible to perform a premature diagnosis, making possible a surgical intervention in the right time. The biochemist monitoring regularity is determined by present phenotype, the familiar clinical manifestations and RET genotype. The recommendation of the genetic analysis must be made to all affected individuals and also their ascendants and descendants, in case some mutation is present, allowing to identify the RET mutations carriers previously to the beginning of the symptomatology. In this work, the molecular aspects of MEN 2 diverse phenotypes will be discussed, as well as the importance of the RET proto-oncogene genotypic identification and its interaction with the biochemists tests aiming the precocious diagnosis, prevention, monitoring, familiar screening e, therefore, the patient’s longer survival.

Regulação do Proto-oncogene c-myc pelo Fator de Transcrição NFAT1

A família de fatores de transcrição NFAT (Fator Nuclear de Células T ativadas) tem diferentes funções regulatórias no ciclo celular, apoptose, diferenciação celular e angiogênese. O proto-oncogene c-myc, que está envolvido em todos estes mecanismos, é reprimido em alguns modelos, em resposta à Ciclosporina A, que inibe a ativação das proteínas NFAT. Dados anteriores de nosso laboratório mostraram que os linfócitos de camundongos NFAT1-/- sensibilizados com ovalbumina, apresentaram níveis aumentados de c-MYC quando comparados com os linfócitos dos camundongos NFAT1+/+. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar se o NFAT1 regula diretamente a expressão de c-MYC. Este estudo mostrou que linfócitos T de camundongos NFAT1-/- naives superexpressam c-MYC em relação aos linfócitos NFAT1+/+, através de ensaios de PCR em tempo real. Uma análise de bioinformática encontrou sete supostos sítios de ligação para NFAT no promotor de c-myc, conservados em humanos e camundongos. Três desses sítios foram confirmados por um ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, incluindo o sítio proximal, que é regulado por NFAT2. Além disso, um ensaio de imunoprecipitação de cromatina com linfócitos murinos demonstrou que o NFAT1 se liga diretamente ao promotor de c-myc in vivo. Estes resultados sugerem que o NFAT1 tem um importante papel na regulação do promotor de c-myc, aparentemente regulando negativamente sua expressão.

The Nuclear Factor of Activated T Cells (NFAT) family of transcription factors has different regulatory functions in the cell cycle, apoptosis, cell differentiation and angiogenesis. The c-myc proto-oncogene, which is also involved in those mechanisms, is repressed, in some models, in response to Cyclosporine A that inhibits NFAT activation. Previous data of our laboratory found that lymphocytes from NFAT1-/- mice sensitized with ovalbumin presented higher levels of c-MYC mRNA when compared with the NFAT1+/+. Hence, the aim of this work was to evaluate whether the NFAT1 directly regulates the c-MYC expression. This study showed that T lymphocytes from NFAT1-/- naive mice overexpress c-MYC mRNA when compared with the NFAT1+/+ mice assessed by Real Time PCR. A bioinformatic analysis found seven putative NFAT binding sites in the c-myc promoter, conserved in human and mouse. Three of them were confirmed by an Eletrophoretic Mobility Shift Assay, including the proximal site, which is upregulated by NFAT2. Additionally, a Chromatin Immunoprecipitation Assay with mouse T lymphocytes demonstrated that NFAT1 directly binds to c-myc promoter in vivo. These findings suggest that NFAT1 plays an important role in the regulation of c-myc promoter apparently through the inhibition of this expression.

Detecção e rastreamento de mutações no proto-oncogene rET em pacientes com neoplasia endócrina múltipla tipo 2 por meio de eletroforese em gel sensível à conformação / RET prot-oncogene mutations screening and detection in patients with multiple endocrine neoplasia type 2 using conformation sensitive gel electrophoresis

A neoplasia endócrina múltipla tipo 2 é uma síndrome tumoral hereditária, onde o RET apresenta mutações germinativas causadoras da patologia. Com o diagnóstico genético, a tireoidectomia total tornou-se curativa para indivíduos assintomáticos portadores de mutações. Nosso objetivo é validar a metodologia de eletroforese em gel sensível à conformação (CSGE) no rastreamento de mutações do RET, comparativamente ao polimorfismo conformacional de cadeia simples (SSCP) e seqüenciamento genético em famílias portadoras das mutações: Cys620Arg (NEM-2A + HSCR e CMT-F); Cys634Arg (NEM-2A); Cys634Tyr (CMT-F); Val648Ile (NEM-2A); Val804Met (CMT-F) e Met918Thr (NEM-2B). Os polimorfismos rastreados foram: Gly691Ser, Leu769Leu e Ser904Ser. Ambas metodologias de rastreamento demonstraram-se sensíveis para alterações genéticas do RET exceto para a mutação Val804Met e polimorfismo Ser904Ser.

Multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN-2) is inherited tumor syndrome, presenting RET germline mutations as causing-disease. With genetic diagnosis, prophylactic total thyroidectomy became curative for asymptomatic individuals carrying RET mutations. Our objective is to validate conformation sensitive gel electrophoresis (CSGE) methodology for RET genetic screening mutation, comparatively to single-strand conformation polymorphism (SSCP) and automatic sequencing in mutations carrying families: Cys620Arg (MEN-2A + HSCR and FMTC); Cys634Arg (MEN-2A); Cys634Tyr (FMTC); Val648Ile (MEN-2A); Val804Met (FMTC) and Met918Thr (MEN-2B). Polymorphisms were also screened: Gly691Ser, Leu769Leu and Ser904Ser. Both screening methodologies were sensible for RET genetic alterations except for Val804Met mutation and Ser904Ser polymorphism.

Interação entre o receptor AT1 da angiotensina II e o mas protoc-oncogene / Interation between the protooncogene mas product and the angiotensin II AT1 receptor

1. Em vista de evidências de que o mas proto-oncogene pode modular as respostas do receptor AT1 à angiotensina II (AngII), o objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de técnicas de biologia molecular e ensaios farmacológicos, a possível interação entre os receptores AT1 e o mas. Para isso foram construídos mutantes do AT1 com alterações de resíduos com possível participação num hipotético heterodímero: (a) os resíduos Cys18 e Lys20 do domínio N-terminal, sugeridos como estabilizadores de um sítio regulador na região extracelular do receptor AT1 (Santos e cols, 2004) são portanto possíveis mediadores do processo de dimerização. (b) a Lys102, cuja substituição por alanina promoveu a formação de um dímero funcional com o mutante K199A (Monnot e cols. 1996). 2. O receptor AT1 selvagem e os seus mutantes K102A, C18F/K20A, bem como o mas proto-oncogene, foram expressos e co-expressos de forma correta como planejado para o desenvolvimento deste trabalho. 3. Mutações simultâneas (C18F/K20A), mas não isoladas, dos resíduos Cys18 e Lys20 comprometem a ligação do receptor AT1 à AngII. 4. Células CHO expressando o receptor mas ou os mutantes C18F/K20A (da região N-terminal) e K102A (da terceira hélice transmembranar) do receptor AT1, não apresentam ligação e resposta funcional significativa quando estimuladas com AngII. 5. A co-expressão dos receptores AT1 selvagem+mas em boa afinidade pelo agonista AngII porém em deficiência na ativação funcional, em comparação com AT1 selvagem. 6. Células CHO co-expressando receptores K102A+mas não apresentaram ligação nem ativação funcional quando estimuladas pela AngII. 7. A co-expressão dos receptores C18F/K20A+mas promove ligação e ativação funcional próximas às observadas para o receptor AT1 selvagem em resposta ao agonista AngII. 8. A região N-terminal do receptor AT1 de AngII é um importante ponto de interação com o agonista e com outros receptores, possivelmente através da formação de heterodímeros

Aumento da expressäo do proto-oncogene ras no bócio multinodular: possível envolvimento na patogênese / Proto-oncogene ras expression in multinodular goiter

A transformaçäo neoplásica resulta de uma série de alterações genéticas, envolvendo ativaçäo de proto-oncogenes e inativaçäo de genes supressores tumorais. Ativaçäo do proto-oncogene ras por mutações em ponto é a alteraçäo genética mais freqüente em tumores espontâneos da tireóide. Avaliamos a expressäo do gene ras no bócio nodular. Fragmentos de tecido tireoidiano normal e neoplásico foram coletados durante o ato cirúrgico, sendo que 79 pacientes tiveram diagnóstico histopatológico de bócio colóide e foram incluídos no estudo. O RNA total foi extraído pelo método de Trizol e o cDNA sintetizado através do Reverse Trancriptidase. Os genes H-ras e K-ras foram amplificados através de PCR com primers específicos. Do total da amostra, 62 por cento apresentaram aumento da expressäo de um dos genes ras estudados. Evidenciou-se aumento da expressäo do H-ras em 9 dos 29 (31 por cento) casos e do K-ras em 12 dos 32 (37,5 por cento) tumores estudados. Os resultados demonstraram aumento da expressäo do ras na doença nodular da tireóide e sugerem um papel importante desses genes na transformaçäo neoplásica da tireóide.

Carcinoma medular de tireóide: da definiçäo às bases moleculares / Medullary thyroid carcinoma: from definition to genetic bases

O carcinoma medular de tireóide (CMT) é um tumor maligno raro com origem nas células parafoliculares da tireóide, tendo como principal produto secretório a calcitonina. Representa 3 a 10 por cento de todos os tumores tireoidianos e é responsável por um grande número de mortes em portadores de câncer de tireóide. Em 75-90 por cento dos pacientes, o CMT ocorre de forma esporádica e, nos demais casos, é uma doença hereditária autossômica dominante com alto grau de penetrância e variabilidade de expressäo, podendo fazer parte de 3 síndromes distintas: neoplasia endócrina múltipla (NEM) 2A, NEM 2B ou CMT familiar. As diferentes formas clínicas do CMT, principalmente as hereditárias, estäo relacionadas com mutações no proto-oncogene RET, as quais resultam em ativaçäo constitutiva do receptor de membrana tirosina-quinase RET. A distinçäo entre estas formas é de extrema relevância clínica por causa das diferenças apresentadas entre elas em termos de prognóstico e pela necessidade de um rastreamento familiar, aconselhamento genético e seguimento das formas hereditárias. A eficiência do rastreamento genético, pela pesquisa de mutações no proto-oncogene RET, está bem estabelecida no diagnóstico e na identificaçäo de portadores assintomáticos das formas hereditárias de CMT, permitindo uma intervençäo cirúrgica precoce e efetiva, reduzindo a morbidade e a mortalidade associadas a esta doença.

Descrição de uma nova mutação de ponto no oncogene Ret, exon 8(GLY533CYS) em uma família com carcinoma medular de tiróide / A novel germ line point mutation in Ret exon 8(GLY533CYS) in familial medullary thyroid carcinoma

O Carcinoma medular da tiróide (CMT) ocorre em 5-10 por cento dos tumores da tiróide e origina-senas células parafoliculares ou células-C da glândula tiroidiana. Pode ocorrer na forma esporádica ou hereditária com padrão de herança autossômico dominante, com alto grau de penetrância e variabilidade de expressão. O CMT pode fazer parte de 3 síndromes distintas que são definidas em função da combinação dos tecidos afetados e da presença ou ausência de anormalidades do desenvolvimento, sendo classificadas em MEN2A, MEN2B ou CMT Familiar (FMTC). A análise genética demonstrou que o oncogene RET encontra-se mutado em 79-98 por cento dos casos de CMT da forma familial e, que, diferentes mutações estão associadas às diferentes manifestações clínicas do MTC nas diferentes síndromes. O International RET Mutation Consortium, através do estudo de várias famílias ao redor do mundo, estabeleceu parâmetros para a indicação da tiroidectomia total em diferentes idades nas diversas mutações. Neste trabalho, utilizando as técnicas de PCR e seqüenciamento direto dos exons 1-19 do oncogene RET, identificamos uma nova mutação no exon 8, códon 533 (15976>T) onde uma glicina é substituída por uma cisteína na proteína. Estudamos 230 indivíduos de uma família brasileira os quais 76 indivíduos são portadores da mutação em heterozigose e 154 indivíduos são normais para esta mutação. Identificamos também 4 polimorfismos, dois previamente descritos no exon 13 e 15 e dois novos polimorfismos no intron 8...

Estudio del protooncogen RET en neoplasia endocrina multiple 2A y en carcinoma medular de tiroides familiar. Hallazgos clinico-patologicos en portadores asintomaticos / Study of RET protooncogene in multiple endocrine neoplasm 2A and in familial medullary thyroid carcinoma. Clinical pathological findings in asymptomatic carriers

Twenty five percent of the medullary thyroid carcinoma (MTC) is hereditary and 5% is familiar (FMTC), or considered as multiple endocrine neoplasia (MEN) type 2A (17%) or 2B (3%). These diseases are the result of the autosomic dominant inheritance of a mutation in the RET protooncogene, in one out of 12 different known codons. We analyzed 7 families (2 MEN 2A and 5 FMTC). Six mutations were detected in the most frequent codon, 634 (2 MEN 2A y 4 FMTC) and one family with FMTC presented a novel mutation: a transition T > C at codon 630, resulting a C630A change. Among 57 individuals studied, 25 (43.85%) presented the mutation. Seven (28%) were asymptomatic carriers, including 5 children aged 11 +/- 3.2 years. The children underwent total thyroidectomy. The histopathologic examination showed C cells hyperplasia and microcarcinoma focus in both lobes, even in the presence of normal, basal or pentagastrine stimulated, calcitonine levels. In conclusion, we describe a germine novel mutation in the RET protooncogene: C630A; and the corresponding findings of C-cell disease in gene mutated carriers that emphasize the importance of prophylactic thyroidectomy as soon as the molecular diagnosis is confirmed

Rastreamento genético do carcinoma medular de tireóide: identificação de mutações no proto-oncogenese Ret / Genetic screening of medullary thyroid carcinoma: identification of Ret proto-oncogene mutations

O carcinoma medular de tireóide (CMT) pode apresentar-se na forma esporádica (75 por cento) ou hereditária (25 por cento) como componente das síndromes de neoplasia endócrina múltipla (NEM2A e 2B), carcinoma medular de tireóide familiar (CMTF) ou outros. Diferentes mutações no proto-oncogene Ret foram identificadas e estudos recentes sugerem uma correlação entre o genótipo-fenótipo. O presente estudo realizou a análise molecular do Ret em indivíduos com CMT e avaliou a correlação genótipo-fenótipo nos afetados e seus familiares. Foram incluídos 48 indivíduos com diagnóstico histopatológico e imunohistoquímico de CMT, sendo 7 esporádicos e 41 hereditários, provenientes de 14 famílias independentes. DNA genômico foi extraído de leucócitos periféricos e os exons 10, 11, 13, 14 e/ou 16 do Ret amplificados por PCR. As mutações foram identificadas por SSCP, restrição enzimática, e/ou seqüenciamento. Das famílias com CMT hereditário, 7 apresentavam NEM2A, 2 NEM2A associada à líquen amilóide cutâneo (CLA), 2 NEM2B, 2 CMTF e 1 como outros. Em 6 famílias com NEM2A, a mutação estava presente no codon 634, troca de TGC-CGC ou TGC-TAC. Uma família com NEM2A apresentava mutação no codon 618 (TGC-CGC). Ambas famílias com CMTF e nos casos de NEM2A+CLA, a mutação também ocorreu no codon 634 (TGC-CGC). Nos indivíduos afetados com NEM2B foi detectada uma mutação de novo no códon 918 (ATG-ACG). Na família classificada como outros, a mutação localizava-se no códon 634 (TGC-TAC). O diagnóstico molecular identificou mutações em todos os indivíduos com história de doença hereditária, em 8 carreadores sem evidência clínica de neoplasia, e em 2 indivíduos com CMT aparentemente esporádico. Nossos resultados confirmam dados da literatura e demonstram que o rastreamento genético é fundamental na conduta terapêutica.

Mutaciones de línea germinal del proto oncogen ret en pacientes chilenos con cáncer medular tiroideo hereditario y esporádico / Germline mutations of the ret proto oncogen in chilean patients with hereditary and sporadic medullary thyroid carcinoma

Background: Medullary thyroid carcinoma (MTC) may occur either as a sporadic or familial disease. Multiple endocrine neoplasia (MEN) type 2, inherited as an autosomal dominant disease, is characterized by MTC only (FMTC) or coexistence of MTC with other endocrine neoplasia (NEM 2A, 2B). Germline mutations of the RET proto-oncogene (cRet) are found in the inherited forms and in some apparently sporadic MTC cases. Aim: To study RET mutations in 8 families with MEN 2. Material and methods: RET mutations were screened in peripheral blood DNA from 18 patients and 87 high risk carriers belonging to 8 MEN 2 families and 52 sporadic MTC. Exons 10, 11, 13, 14, 15 and 16 of the c-Ret were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and examined by direct sequencing of PCR products and/or restriction enzyme analysis. Results: Five MEN 2A and one FMTC families with a germline mutation at codon 634, one MEN 2A and one FMTC family carrying a mutation at codon 620 were identified. Mutations were found in 23 out of 87 high risk carriers. In addition, we detected a S891A (exon 15) germline mutation in a sporadic MTC patient and in one out of her three sons and V804M (exon 14) in another sporadic MTC case and in one out of his six relatives, indicating in both cases the presence of a sporadic misclassified familial disease. Conclusions: These results underscore the importance of routine application of c-Ret testing in all cases of MTC either familial or sporadic

Marcadores de utilidad en cáncer mamario / Useful markers in breast cancer

Las características histopatológicas del cáncer de mama son fundamentales y permiten determinar el tipo histológico de la neoplasia, su tamaño, compromiso linfático, así como también el grado histológico y nuclear. Esta información puede ser complementada hoy en día con una variedad de proteínas, receptores y oncogenes, cuya expresión en el tumor nos permite clarificar el pronóstico de la neoplasia. Dentro de todos ellos, los factores más importantes a la fecha son el compromiso de los ganglios axilares y la expresión de receptores de estrógeno y progesterona que son determinados a través de análisis inmunohistoquímicos