Resumo
cooling device to stabilize equine straws before freezing. The samples were diluted in Botu-Sêmen® extender and centrifuged at 600xg for 10 minutes. Then, the pellets were ressuspended with Botucrio® cryopreservation extender, loaded into 0.5 mL straws and divided into three groups. On Group M, straws were placed horizontally in a Minitub® refrigerator at 5 C for 20 minutes. For groups B and E, the straws were placed in Botutainer® and Equitainer® devices, respectively. Both systems were previously stabilized at 5 C and straws were maintained for 20 minutes, and then frozen. The straws were thawed at 46 C for 20 seconds. Sperm samples were evaluated by CASA for Total Motility (TM) and Progressive Motility (PM) and by fluorescent microscopy for Plasma Membrane Integrity (MPI). Statistical differences were not observed (p>0.05) for Total Motility (GM=67.1%; GB=65.2% and GE= 63.4%) and Progressive Motility (GM=32.1%; GB=31.9% and GE=30.4%). Although MPI percentages were not different between groups M and B, group E showed a decrease in comparison to the other groups (GM=49.4%, GB= 48.7%, GE= 44.9%). These results demonstrate that passive cooling devices can be used to stabilize equine straws before freezing, being an alternative for replacing refrigerators, making easier the cryopreservation in the field. KEYWORDS: Equine, semen, stabilization, cryopreservation.
Com este estudo objetivou-se analisar a eficiência da utilização de sistemas de transporte de sêmen refrigerado na estabilização das palhetas previamente à congelação de sêmen equino. Os ejaculados foram diluídos em meio diluente Botu-Sêmen®, e centrifugados por dez minutos a 600xg e; os pellets foram ressuspendidos no diluente para criopreservação Botucrio®, envasados em palhetas de 0,5 ml e divididos em três grupos. No Grupo M, as palhetas foram dispostas horizontalmente em geladeira Minitub®, a 5 C, por vinte minutos. Nos Grupos B e E, as palhetas foram colocadas respectivamente nos sistemas Botutainer® e Equitainer®, previamente equilibrados na temperatura interna de 5 C, e mantidas nesses sistemas também por vinte minutos. A congelação seguiu-se da mesma maneira para os três grupos. As palhetas foram descongeladas em banho-maria a 46 C, por vinte segundos, e analisadas quanto às motilidades total (MT) e progressiva (MP) (CASA) e integridade de membrana por microscopia de fluorescência (IMP). Não se observaram diferenças estatíscas (P>0,05) para os valores de MT (GM = 67,1%a; GB = 65,2%a e GE = 63,4%a) e MP (GM = 32,1%a; GB = 31,9%a e GE = 30,4%a). Para os valores de IMP não foram observadas diferenças estatísticas entre os Grupos M e B; no entanto, o Grupo E apresentou um valor significativamente inferior (P 0,05) em comparação com os demais (GM = 49,4%a, GB = 48,
Resumo
The purpose of this study was to evaluate the motility and viability of stallion semen cryopreserved with 5% dimethyl-formamyde as cryoprotectant and posterior dilution to 2.5 and 1.25% as final concentration of cryoprotectant. After thawing, samples were diluted with two commercial extenders (FR4® and Botucrio® ) in two moments: initial (Ti) and final (Tf). A total of 15 distinct ejaculates from five stallions of national breeds were analysed. Motility was observed using a computer assistant system analysis and viability was analyzed using fluorescent probes. A significant (P0.05) on membrane integrity between treatments was not observed.KEY WORDS: Cryoprotectant, diluent, equine, freezing, thawing.
O presente estudo teve por objetivo avaliar parâmetros de motilidade e viabilidade in vitro na diluição do crioprotetor dimetil-formamida a 5% pós-descongelação para concentrações de 2,5% e 1,25%, mediante utilização de dois diluentes comerciais adicionados junto ao sêmen. Após a descongelação, as amostras foram diluídas com a finalidade de manter as concentrações finais (2,5% e 1,25%) de crioprotetor, utilizando-se dois diluentes comerciais (FR4® e Botu-Crio®) em dois tempos: inicial (Ti) e final (Tf). Empregaram-se quinze amostras de ejaculados distintos de cinco garanhões de raças nacionais. Os parâmetros de motilidade foram observados através da análise computadorizada e os de integridade de membrana plasmática pela microscopia de epifluorescência. Verificou-se melhora nos parâmetros de motilidade total e progressiva dos espermatozóides, no tempo final (P 0,05) com o diluente Botu-Crio® em relação ao FR4®. Não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos quanto à integridade de membrana plasmática.PALAVRAS-CHAVES: Crioprotetor, congelação, descongelação, diluente, equino.
Resumo
The objective of this study was to evaluate the efficiency of the modified Karras staining technique (KA) to analyze domestic cat sperm morphology by comparing it with the Fast Green FCF/ Rose Bengal staining (FR), previously used for this species. Four adult cats were used, from which sperm samples were collected four times in alternate days for each tom using an artificial vagina (n=16 ejaculates). Both staining techniques were performed for each ejaculate. For the FR staining technique, the semen in natura was diluted in 2.9% sodium citrate and, afterwards, in the staining solution. After 70 seconds, smears were made onto slide and dried at 37ºC. For the KA staining technique, previously made and formol saline fixed slides were sequentially immersed in Rose Bengal solution, Tannin solution, and Victoria Blue B solution, and dried at room temperature. For sperm evaluation, 200 sperm cells were assessed for each staining technique in all ejaculate samples using a bright field microscope at 1000X magnification. Statistical analysis used the non-parametric Wilcoxon test, establishing significance at p 0.05. For the KA staining technique, higher percentage of distal cytoplasmic droplets and lower percentage of sperm head defects were obtained when compared to the FR staining technique. This way, both staining techniques were not totally efficient for the assessment of morpholo
O objetivo do estudo foi avaliar a eficiência do método de coloração Karras modificado (KA) para a análise da morfologia espermática no gato doméstico através da comparação com a coloração Fast Green FCF/Rosa Bengala (FR), previamente utilizada para esta espécie. Utilizaram-se quatro gatos adultos, colhendo-se quatro vezes amostras de sêmen em dias alternados para cada animal através de vagina artificial (n=16 ejaculados). Para cada ejaculado, realizaram-se duas colorações. Para a coloração FR, o sêmen in natura foi diluído em citrato de sódio 2,9% e, posteriormente, em solução de coloração. Após setenta segundos, procedeu-se a esfregaços em lâminas, as quais foram secas a 37ºC. Para a coloração KA, os esfregaços previamente confeccionados e fixados em formol salino foram imersos seqüencialmente nas soluções de Rosa Bengala, Tanino e Azul Vitória e secas em temperatura ambiente. Avaliaram-se duzentas células para cada tipo de coloração em todos os ejaculados, usando-se microscópio de luz em aumento de 1.000X. Efetuou-se análise estatística mediante o teste não-paramétrico de Wilcoxon, estabelecendo diferença significativa quando p 0,05. Para a coloração de KA, obtiveram-se maior porcentagem de gota citoplasmática distal e menor porcentagem de defeitos de cabeça quando comparada à coloração FR. Assim, nenhuma das colorações mostrou-se totalmente eficiente na identificação dos
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The use of equine cooled transported semen is increasing significantly in the whole world; this is in consequence of the advantages and improvement of the cooling semen technology. The aim of the present study was to compare three commercial extenders for cooling equine semen (Botusemen®; Botu-Turbo® e INRA 96®) using two Brazilian commercial containers (Botu-Box® e Botutainer®) for cooling and storage. Three ejaculates from four stallions from different breeds were used. The samples were evaluated at 0, 6, 12 and 24 hours using CASA for estimate the total and progressive motility and the plasma membrane integrity assessed using fluorescent probes. According to the results, there was no difference on sperm parameters (P>0.05) when comparing both the cooling/storage containers and the extenders used. Thus, is possible to conclude that the extenders and the containers were efficient on maintaining the motility and viability of semen cooled/stored during 24 hours, being a new proposal for equine cooled semen technology.KEY WORDS: Container, cooled semen, equine, extender.
A utilização da biotecnologia de sêmen eqüino refrigerado e transportado tem apresentado um crescimento significativo na eqüideocultura mundial, no tocante às inúmeras vantagens e inovações que a técnica tem proporcionado. O presente experimento teve como objetivo avaliar diferentes meios de refrigeração (Botu-Semen®; Botu-Turbo® e INRA 96®) em dois sistemas de transporte de sêmen refrigerado (Botu-Box® e Botutainer®). Foram utilizados três ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, submetidos à análise computadorizada da motilidade total e progressiva, bem como da integridade da membrana plasmática, pela técnica de epifluorescência, nos momentos 0, 6, 12 e 24 horas após a colheita. De acordo com os resultados obtidos para os parâmetros espermáticos, não se observaram diferenças significativas entre os sistemas de refrigeração e os meios testados, concluindo-se que tanto os sistemas de refrigeração como os diluentes foram eficazes na manutenção da motilidade e viabilidade espermática, apresentando-se como alternativas à biotecnologia de transporte de sêmen eqüino refrigerado.PALAVRAS-CHAVES: Diluente, eqüino, refrigeração de sêmen, sistema de transporte.
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cooling device to stabilize equine straws before freezing. The samples were diluted in Botu-Sêmen® extender and centrifuged at 600xg for 10 minutes. Then, the pellets were ressuspended with Botucrio® cryopreservation extender, loaded into 0.5 mL straws and divided into three groups. On Group M, straws were placed horizontally in a Minitub® refrigerator at 5 C for 20 minutes. For groups B and E, the straws were placed in Botutainer® and Equitainer® devices, respectively. Both systems were previously stabilized at 5 C and straws were maintained for 20 minutes, and then frozen. The straws were thawed at 46 C for 20 seconds. Sperm samples were evaluated by CASA for Total Motility (TM) and Progressive Motility (PM) and by fluorescent microscopy for Plasma Membrane Integrity (MPI). Statistical differences were not observed (p>0.05) for Total Motility (GM=67.1%; GB=65.2% and GE= 63.4%) and Progressive Motility (GM=32.1%; GB=31.9% and GE=30.4%). Although MPI percentages were not different between groups M and B, group E showed a decrease in comparison to the other groups (GM=49.4%, GB= 48.7%, GE= 44.9%). These results demonstrate that passive cooling devices can be used to stabilize equine straws before freezing, being an alternative for replacing refrigerators, making easier the cryopreservation in the field. KEYWORDS: Equine, semen, stabilization, cryopreservation.
Com este estudo objetivou-se analisar a eficiência da utilização de sistemas de transporte de sêmen refrigerado na estabilização das palhetas previamente à congelação de sêmen equino. Os ejaculados foram diluídos em meio diluente Botu-Sêmen®, e centrifugados por dez minutos a 600xg e; os pellets foram ressuspendidos no diluente para criopreservação Botucrio®, envasados em palhetas de 0,5 ml e divididos em três grupos. No Grupo M, as palhetas foram dispostas horizontalmente em geladeira Minitub®, a 5 C, por vinte minutos. Nos Grupos B e E, as palhetas foram colocadas respectivamente nos sistemas Botutainer® e Equitainer®, previamente equilibrados na temperatura interna de 5 C, e mantidas nesses sistemas também por vinte minutos. A congelação seguiu-se da mesma maneira para os três grupos. As palhetas foram descongeladas em banho-maria a 46 C, por vinte segundos, e analisadas quanto às motilidades total (MT) e progressiva (MP) (CASA) e integridade de membrana por microscopia de fluorescência (IMP). Não se observaram diferenças estatíscas (P>0,05) para os valores de MT (GM = 67,1%a; GB = 65,2%a e GE = 63,4%a) e MP (GM = 32,1%a; GB = 31,9%a e GE = 30,4%a). Para os valores de IMP não foram observadas diferenças estatísticas entre os Grupos M e B; no entanto, o Grupo E apresentou um valor significativamente inferior (P 0,05) em comparação com os demais (GM = 49,4%a, GB = 48,
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The use of equine cooled transported semen is increasing significantly in the whole world; this is in consequence of the advantages and improvement of the cooling semen technology. The aim of the present study was to compare three commercial extenders for cooling equine semen (Botusemen®; Botu-Turbo® e INRA 96®) using two Brazilian commercial containers (Botu-Box® e Botutainer®) for cooling and storage. Three ejaculates from four stallions from different breeds were used. The samples were evaluated at 0, 6, 12 and 24 hours using CASA for estimate the total and progressive motility and the plasma membrane integrity assessed using fluorescent probes. According to the results, there was no difference on sperm parameters (P>0.05) when comparing both the cooling/storage containers and the extenders used. Thus, is possible to conclude that the extenders and the containers were efficient on maintaining the motility and viability of semen cooled/stored during 24 hours, being a new proposal for equine cooled semen technology.KEY WORDS: Container, cooled semen, equine, extender.
A utilização da biotecnologia de sêmen eqüino refrigerado e transportado tem apresentado um crescimento significativo na eqüideocultura mundial, no tocante às inúmeras vantagens e inovações que a técnica tem proporcionado. O presente experimento teve como objetivo avaliar diferentes meios de refrigeração (Botu-Semen®; Botu-Turbo® e INRA 96®) em dois sistemas de transporte de sêmen refrigerado (Botu-Box® e Botutainer®). Foram utilizados três ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, submetidos à análise computadorizada da motilidade total e progressiva, bem como da integridade da membrana plasmática, pela técnica de epifluorescência, nos momentos 0, 6, 12 e 24 horas após a colheita. De acordo com os resultados obtidos para os parâmetros espermáticos, não se observaram diferenças significativas entre os sistemas de refrigeração e os meios testados, concluindo-se que tanto os sistemas de refrigeração como os diluentes foram eficazes na manutenção da motilidade e viabilidade espermática, apresentando-se como alternativas à biotecnologia de transporte de sêmen eqüino refrigerado.PALAVRAS-CHAVES: Diluente, eqüino, refrigeração de sêmen, sistema de transporte.
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The purpose of this study was to evaluate the motility and viability of stallion semen cryopreserved with 5% dimethyl-formamyde as cryoprotectant and posterior dilution to 2.5 and 1.25% as final concentration of cryoprotectant. After thawing, samples were diluted with two commercial extenders (FR4® and Botucrio® ) in two moments: initial (Ti) and final (Tf). A total of 15 distinct ejaculates from five stallions of national breeds were analysed. Motility was observed using a computer assistant system analysis and viability was analyzed using fluorescent probes. A significant (P0.05) on membrane integrity between treatments was not observed.KEY WORDS: Cryoprotectant, diluent, equine, freezing, thawing.
O presente estudo teve por objetivo avaliar parâmetros de motilidade e viabilidade in vitro na diluição do crioprotetor dimetil-formamida a 5% pós-descongelação para concentrações de 2,5% e 1,25%, mediante utilização de dois diluentes comerciais adicionados junto ao sêmen. Após a descongelação, as amostras foram diluídas com a finalidade de manter as concentrações finais (2,5% e 1,25%) de crioprotetor, utilizando-se dois diluentes comerciais (FR4® e Botu-Crio®) em dois tempos: inicial (Ti) e final (Tf). Empregaram-se quinze amostras de ejaculados distintos de cinco garanhões de raças nacionais. Os parâmetros de motilidade foram observados através da análise computadorizada e os de integridade de membrana plasmática pela microscopia de epifluorescência. Verificou-se melhora nos parâmetros de motilidade total e progressiva dos espermatozóides, no tempo final (P 0,05) com o diluente Botu-Crio® em relação ao FR4®. Não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos quanto à integridade de membrana plasmática.PALAVRAS-CHAVES: Crioprotetor, congelação, descongelação, diluente, equino.
Resumo
The objective of this study was to evaluate the efficiency of the modified Karras staining technique (KA) to analyze domestic cat sperm morphology by comparing it with the Fast Green FCF/ Rose Bengal staining (FR), previously used for this species. Four adult cats were used, from which sperm samples were collected four times in alternate days for each tom using an artificial vagina (n=16 ejaculates). Both staining techniques were performed for each ejaculate. For the FR staining technique, the semen in natura was diluted in 2.9% sodium citrate and, afterwards, in the staining solution. After 70 seconds, smears were made onto slide and dried at 37ºC. For the KA staining technique, previously made and formol saline fixed slides were sequentially immersed in Rose Bengal solution, Tannin solution, and Victoria Blue B solution, and dried at room temperature. For sperm evaluation, 200 sperm cells were assessed for each staining technique in all ejaculate samples using a bright field microscope at 1000X magnification. Statistical analysis used the non-parametric Wilcoxon test, establishing significance at p 0.05. For the KA staining technique, higher percentage of distal cytoplasmic droplets and lower percentage of sperm head defects were obtained when compared to the FR staining technique. This way, both staining techniques were not totally efficient for the assessment of morpholo
O objetivo do estudo foi avaliar a eficiência do método de coloração Karras modificado (KA) para a análise da morfologia espermática no gato doméstico através da comparação com a coloração Fast Green FCF/Rosa Bengala (FR), previamente utilizada para esta espécie. Utilizaram-se quatro gatos adultos, colhendo-se quatro vezes amostras de sêmen em dias alternados para cada animal através de vagina artificial (n=16 ejaculados). Para cada ejaculado, realizaram-se duas colorações. Para a coloração FR, o sêmen in natura foi diluído em citrato de sódio 2,9% e, posteriormente, em solução de coloração. Após setenta segundos, procedeu-se a esfregaços em lâminas, as quais foram secas a 37ºC. Para a coloração KA, os esfregaços previamente confeccionados e fixados em formol salino foram imersos seqüencialmente nas soluções de Rosa Bengala, Tanino e Azul Vitória e secas em temperatura ambiente. Avaliaram-se duzentas células para cada tipo de coloração em todos os ejaculados, usando-se microscópio de luz em aumento de 1.000X. Efetuou-se análise estatística mediante o teste não-paramétrico de Wilcoxon, estabelecendo diferença significativa quando p 0,05. Para a coloração de KA, obtiveram-se maior porcentagem de gota citoplasmática distal e menor porcentagem de defeitos de cabeça quando comparada à coloração FR. Assim, nenhuma das colorações mostrou-se totalmente eficiente na identificação dos