A L-arginina na produção in vitro de embriões bovinos: perspectivas para o futuro / L-arginine in the in vitro production of bovine embryos: perspectives for the future

A L-arginina (L-arg) é o principal precursor da síntese do NO, contudo, é precursora também da síntese de creatina, agmatina, ureia, síntese proteica, L-ornitina, poliaminas, L-prolina e L-glutamato. Nesta breve revisão, vamos falar de alguns resultados que estão sendo obtidos sobre o papel da L-arg na capacitação de espermatozoides bovinos e seu impacto na produção in vitro de embriões. Estudos in vitro mostraram que a adição de L-arg ao meio de capacitação espermática está associada a um aumento na produção de NO, que se correlaciona com aumento da motilidade e vigor, integridade da membrana plasmática e acrossomal, atividade mitocondrial, capacitação espermática, peroxidação lipídica, bem como com a produção de blastocistos. Além disso, a adição da L-arg ao meio de capacitação in vitro, altera o perfil de proteínas importantes ligadas ao processo de capacitação, fertilização e desenvolvimento embrionário inicial. Estes efeitos da L-arg são GMPc dependentes e independentes. Na maturação in vitro, entretanto, embora já tenham sido encontrados bons resultados com o uso do L-arg, mais estudos são necessários para determinar a concentração ideal a ser adicionada ao meio de maturação in vitro e seu impacto na produção de blastocistos. Visto que a pré-capacitação de espermatozoides induzida pela heparina em presença de L-arg foi o método mais eficiente na produção in vitro de embriões, sugerimos sua utilização. Mais pesquisas sobre o metabolismo da L-arg no espermatozoide e CCOs de bovinos durante eventos ligados à fertilização são necessários para se identificar novas vias que atuem nestas etapas in vitro visando o aumento da percentagem e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro.

L-arginine (L-arg) is the main source of NO synthesis; however, it is also a precursor of the synthesis of creatine, agmatine, urea, protein synthesis, L-ornithine, polyamines, L-proline, and Lglutamate. In this brief review, we will discuss some results obtained previously about the role of L-arg in the capacitation of bovine sperm and its impact on in vitro embryo production. In vitro studies have shown that the addition of L-arg to the sperm capacitation medium is associated with an increase in NO production, which in controlled levels is related to an increased motility and vigor, plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial activity, sperm capacitation, peroxidation lipids, as well as with the blastocyst production. Furthermore, the addition of L-arg to the in vitro capacitation medium alters the profile of important proteins linked to the capacitation process, fertilization, and early embryonic development. These effects of L-arg are cGMP dependent and independent. In in vitro maturation, however, although good results have already been found with the use of L-arg, further studies are needed to determine the ideal concentration to be added to the in vitro maturation medium and its impact on the production of blastocysts. Since heparin-induced pre-capacitation of spermatozoa in the presence of L-arg was the most efficient method for in vitro embryo production, we suggest its use. More research on L-arg metabolism in bovine sperm and OCCs during events related to fertilization is needed to identify new pathways that act in these in vitro steps aiming to increase the percentage and quality of bovine embryos produced in vitro.

Nitric oxide and immune response in infection control of Caseous Lymphadenitis / Óxido nítrico e resposta imune no controle de infecção da Linfadenite Caseosa

This study aimed to evaluate aspects of host immune response using an experimental infection model of Corynebacterium pseudotuberculosis (CP) in C57/Black6 wild-type and knockout for nitric oxide (KO-NO) mice. 28 mice were evaluated: 4 wild-type controls; 10 wild-type infected with CP; 4 KO-NO controls; 10 KO-NO infected with CP. Infection procedures were carried out by intraperitoneal inoculation using 107. Infected C57/Black6 KO-NO mice began to die after the 5° day post-inoculation, up until the 14º day. Neutrophils were found in increased numbers in the infiltrate of KO-NO murine peritoneal cavities. Examination of splenic tissue revealed an accumulation of lymphocytes, predominantly CD8 T-cells, in experimental animal groups. KO-NO animals were found to have a predominance of granulomas 7 days post-inoculation, primarily in the lymph nodes. In addition, greater amounts of bacteria were recovered from the mesenteric lymph nodes of KO-NO mice. There was no statistically significant difference in the levels of total IgG and its subclasses 14 days post-inoculation between KO-NO and wild groups. The results suggest the importance of nitric oxide in the process of controlling CP infection, as KO-NO animals were observed to be markedly more affected by infection with this bacterium.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar os aspectos da resposta imune do hospedeiro, mediante o uso de um modelo experimental de infecção de Corynebacterium pseudotuberculosis (CP) em camundongos C57/Black6 do tipo selvagem e em C57/Black6 knockout para o óxido nítrico (KO-NO). Foram avaliados 28 camundongos: quatro controles de tipo selvagem; 10 do tipo selvagem infectados com CP; quatro controles KO-NO; e 10 KO-NO infectados com CP. A infecção foi realizada via intraperitoneal, usando-se 107. Os animais C57/Black6 KO-NO infectados começaram a vir a óbito no quinto dia pós-inoculação, o que aconteceu até o 14º dia. Um número maior de neutrófilos foi encontrado na sua cavidade peritoneal. O exame do baço revelou um acúmulo de linfócitos, predominantemente células T CD8, nos grupos de animais experimentais. Nos animais KO-NO, foi observada a presença de granulomas, sete dias pós-inoculação, principalmente nos gânglios linfáticos. Além disso, uma maior quantidade de bactérias foi detectada dos linfonodos mesentéricos desses animais. Não houve diferença estatisticamente significante nos níveis séricos IgG total e em suas subclasses aos 14 dias pós-inoculação nos grupos KO-NO e selvagem. Os resultados obtidos sugerem a importância do óxido nítrico no processo de controle da infecção por CP.(AU)

Nitric oxide and immune response in infection control of Caseous Lymphadenitis

ABSTRACT This study aimed to evaluate aspects of host immune response using an experimental infection model of Corynebacterium pseudotuberculosis (CP) in C57/Black6 wild-type and knockout for nitric oxide (KO-NO) mice. 28 mice were evaluated: 4 wild-type controls; 10 wild-type infected with CP; 4 KO-NO controls; 10 KO-NO infected with CP. Infection procedures were carried out by intraperitoneal inoculation using 107. Infected C57/Black6 KO-NO mice began to die after the 5° day post-inoculation, up until the 14º day. Neutrophils were found in increased numbers in the infiltrate of KO-NO murine peritoneal cavities. Examination of splenic tissue revealed an accumulation of lymphocytes, predominantly CD8 T-cells, in experimental animal groups. KO-NO animals were found to have a predominance of granulomas 7 days post-inoculation, primarily in the lymph nodes. In addition, greater amounts of bacteria were recovered from the mesenteric lymph nodes of KO-NO mice. There was no statistically significant difference in the levels of total IgG and its subclasses 14 days post-inoculation between KO-NO and wild groups. The results suggest the importance of nitric oxide in the process of controlling CP infection, as KO-NO animals were observed to be markedly more affected by infection with this bacterium.

RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar os aspectos da resposta imune do hospedeiro, mediante o uso de um modelo experimental de infecção de Corynebacterium pseudotuberculosis (CP) em camundongos C57/Black6 do tipo selvagem e em C57/Black6 knockout para o óxido nítrico (KO-NO). Foram avaliados 28 camundongos: quatro controles de tipo selvagem; 10 do tipo selvagem infectados com CP; quatro controles KO-NO; e 10 KO-NO infectados com CP. A infecção foi realizada via intraperitoneal, usando-se 107. Os animais C57/Black6 KO-NO infectados começaram a vir a óbito no quinto dia pós-inoculação, o que aconteceu até o 14º dia. Um número maior de neutrófilos foi encontrado na sua cavidade peritoneal. O exame do baço revelou um acúmulo de linfócitos, predominantemente células T CD8, nos grupos de animais experimentais. Nos animais KO-NO, foi observada a presença de granulomas, sete dias pós-inoculação, principalmente nos gânglios linfáticos. Além disso, uma maior quantidade de bactérias foi detectada dos linfonodos mesentéricos desses animais. Não houve diferença estatisticamente significante nos níveis séricos IgG total e em suas subclasses aos 14 dias pós-inoculação nos grupos KO-NO e selvagem. Os resultados obtidos sugerem a importância do óxido nítrico no processo de controle da infecção por CP.

Nitric oxide and immune response in infection control of Caseous Lymphadenitis / Óxido nítrico e resposta imune no controle de infecção da Linfadenite Caseosa

This study aimed to evaluate aspects of host immune response using an experimental infection model of Corynebacterium pseudotuberculosis (CP) in C57/Black6 wild-type and knockout for nitric oxide (KO-NO) mice. 28 mice were evaluated: 4 wild-type controls; 10 wild-type infected with CP; 4 KO-NO controls; 10 KO-NO infected with CP. Infection procedures were carried out by intraperitoneal inoculation using 107. Infected C57/Black6 KO-NO mice began to die after the 5° day post-inoculation, up until the 14º day. Neutrophils were found in increased numbers in the infiltrate of KO-NO murine peritoneal cavities. Examination of splenic tissue revealed an accumulation of lymphocytes, predominantly CD8 T-cells, in experimental animal groups. KO-NO animals were found to have a predominance of granulomas 7 days post-inoculation, primarily in the lymph nodes. In addition, greater amounts of bacteria were recovered from the mesenteric lymph nodes of KO-NO mice. There was no statistically significant difference in the levels of total IgG and its subclasses 14 days post-inoculation between KO-NO and wild groups. The results suggest the importance of nitric oxide in the process of controlling CP infection, as KO-NO animals were observed to be markedly more affected by infection with this bacterium.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar os aspectos da resposta imune do hospedeiro, mediante o uso de um modelo experimental de infecção de Corynebacterium pseudotuberculosis (CP) em camundongos C57/Black6 do tipo selvagem e em C57/Black6 knockout para o óxido nítrico (KO-NO). Foram avaliados 28 camundongos: quatro controles de tipo selvagem; 10 do tipo selvagem infectados com CP; quatro controles KO-NO; e 10 KO-NO infectados com CP. A infecção foi realizada via intraperitoneal, usando-se 107. Os animais C57/Black6 KO-NO infectados começaram a vir a óbito no quinto dia pós-inoculação, o que aconteceu até o 14º dia. Um número maior de neutrófilos foi encontrado na sua cavidade peritoneal. O exame do baço revelou um acúmulo de linfócitos, predominantemente células T CD8, nos grupos de animais experimentais. Nos animais KO-NO, foi observada a presença de granulomas, sete dias pós-inoculação, principalmente nos gânglios linfáticos. Além disso, uma maior quantidade de bactérias foi detectada dos linfonodos mesentéricos desses animais. Não houve diferença estatisticamente significante nos níveis séricos IgG total e em suas subclasses aos 14 dias pós-inoculação nos grupos KO-NO e selvagem. Os resultados obtidos sugerem a importância do óxido nítrico no processo de controle da infecção por CP.(AU)

Increased nitric oxide plasma concentration in dogs with naturally acquired chronic renal disease / Aumento da concentração plasmática de óxido nítrico em cães com doença renal crônica naturalmente adquirida

This study aimed to determine the amount of plasma nitric oxide in clinically stable dogs at different stages of chronic kidney disease (CKD). Five groups of dogs were studied, aged from 4 to 18, comprising of a control group composed of healthy animals (control n=17), group CKD stage 1 (DRC-1, n=12), group CKD stage 2 (CKD-2, n=10) group, CKD stages 3 (CRD-3, n=13) and Group CKD stage 4 (DRC-4, n=10). Dogs with CKD were clinically stable and received no treatment. Two blood samples were collected at 24 hours intervals (repeated measures) to obtain serum and plasma. The serum creatinine values were used to classify dogs as CG, CKD-1, CKD-2, CKD-3 and CKD-4, and were (1.02±0.02mg/dL), (1.07±0.04mg/dL), (1.81±0.03mg/dL), (3.40±0.15mg/dL) and (6.00±0.20mg/dL) respectively. The determination of nitric oxide (NO) was performed by dosing nitrate/nitrite indirectly, and used for measurement of nitrate according to the NO/ozone chemiluminescence. The data were submitted to ANOVA for nonparametric analysis(Kruskal-Wallis) (P<0.05). The concentration of plasmatic NO did not differ significantly among GC (10.81±0.51µM), CKD-1 (15.49±1.97µM) and CKD-2 (19.83±3.31µM) groups. The plasma concentration of CKD-3 (17.02±1.73µM) and CKD-4 (83.56±13.63µM) was significantly higher compared with healthy dogs. In conclusion, the NO plasma concentration can increase in dogs with CKD and become significantly higher in stage 3 and 4 dogs.(AU)

A determinação de óxido nítrico no plasma em cães clinicamente estáveis em diferentes estágios da doença renal crônica (DRC) não foi estudada, constituindo este o objetivo do presente estudo. Foram estudados cinco grupos de cães, com idade variando entre quatro a 18 anos, compreendendo o grupo controle, composto por animais sadios (controle, n=17), grupo com DRC estágio 1 (DRC-1, n=12), grupo com DRC estágio 2 (DRC-2, n=10), grupo com DRC estágio 3 (DRC-3, n=13) e grupo com DRC estágio 4 (DRC-4, n=10). Os cães com DRC estavam com o quadro clínico estável e sem receber qualquer tipo de tratamento. Foram estudados cinco grupo de cães, com idade variando entre quatro a 18 anos, compreendendo o grupo controle, composto por animais sadios (controle, n=17), grupo com DRC estágio 1 (DRC-1, n=12), grupo com DRC estágio 2 (DRC-2, n=10), grupo com DRC estágio 3 (DRC-3, n=13) e grupo com DRC estágio 4 (DRC-4, n=10). Os animais sadios ou com DRC foram submetidos a duas coletas de sangue, com intervalo de 24 horas (amostras repetidas), para obtenção de soro e plasma. Os valores de creatinina sérica, que definiram a classificação dos pacientes do controle, DRC-1, DRC-2, DRC-3 e DRC-4, que foram 1,02±0,02mg/dL; 1,06±0,05mg/dL; 1,80±0,03mg/dL; 3,39±0,21mg/dL e 6,00±0,28mg/dL, respectivamente. A determinação plasmática indireta de óxido nítrico (NO) foi realizada por meio da dosagem de nitrato/nitrito, através da técnia de quimioluminescência NO / ozono. Os dados foram submetidos à ANOVA para análise não paramétrica (Kruskal-Wallis) (P <0,05). Os resultados das concentrações plasmáticas de NO não diferiram significativamente quando comparados os dados do controle (10,81±0,51µM), DRC-1 (15,49±1,97µM), DRC-2 (19,82±3,31µM). No entanto, o NO plasmático do grupo DRC-3 (17,01±1,73µM) e DRC-4 (83,55±13,63µM), foi significativamente maior, em relação às médias dos cães sadios. Concluímos que a concentração plasmática de NO pode aumentar em cães com DRC e torna-se significativamente mais elevada nos estágios 3 e 4 da doença.(AU)

Increased nitric oxide plasma concentration in dogs with naturally acquired chronic renal disease / Aumento da concentração plasmática de óxido nítrico em cães com doença renal crônica naturalmente adquirida

This study aimed to determine the amount of plasma nitric oxide in clinically stable dogs at different stages of chronic kidney disease (CKD). Five groups of dogs were studied, aged from 4 to 18, comprising of a control group composed of healthy animals (control n=17), group CKD stage 1 (DRC-1, n=12), group CKD stage 2 (CKD-2, n=10) group, CKD stages 3 (CRD-3, n=13) and Group CKD stage 4 (DRC-4, n=10). Dogs with CKD were clinically stable and received no treatment. Two blood samples were collected at 24 hours intervals (repeated measures) to obtain serum and plasma. The serum creatinine values were used to classify dogs as CG, CKD-1, CKD-2, CKD-3 and CKD-4, and were (1.02±0.02mg/dL), (1.07±0.04mg/dL), (1.81±0.03mg/dL), (3.40±0.15mg/dL) and (6.00±0.20mg/dL) respectively. The determination of nitric oxide (NO) was performed by dosing nitrate/nitrite indirectly, and used for measurement of nitrate according to the NO/ozone chemiluminescence. The data were submitted to ANOVA for nonparametric analysis(Kruskal-Wallis) (P<0.05). The concentration of plasmatic NO did not differ significantly among GC (10.81±0.51µM), CKD-1 (15.49±1.97µM) and CKD-2 (19.83±3.31µM) groups. The plasma concentration of CKD-3 (17.02±1.73µM) and CKD-4 (83.56±13.63µM) was significantly higher compared with healthy dogs. In conclusion, the NO plasma concentration can increase in dogs with CKD and become significantly higher in stage 3 and 4 dogs.(AU)

A determinação de óxido nítrico no plasma em cães clinicamente estáveis em diferentes estágios da doença renal crônica (DRC) não foi estudada, constituindo este o objetivo do presente estudo. Foram estudados cinco grupos de cães, com idade variando entre quatro a 18 anos, compreendendo o grupo controle, composto por animais sadios (controle, n=17), grupo com DRC estágio 1 (DRC-1, n=12), grupo com DRC estágio 2 (DRC-2, n=10), grupo com DRC estágio 3 (DRC-3, n=13) e grupo com DRC estágio 4 (DRC-4, n=10). Os cães com DRC estavam com o quadro clínico estável e sem receber qualquer tipo de tratamento. Foram estudados cinco grupo de cães, com idade variando entre quatro a 18 anos, compreendendo o grupo controle, composto por animais sadios (controle, n=17), grupo com DRC estágio 1 (DRC-1, n=12), grupo com DRC estágio 2 (DRC-2, n=10), grupo com DRC estágio 3 (DRC-3, n=13) e grupo com DRC estágio 4 (DRC-4, n=10). Os animais sadios ou com DRC foram submetidos a duas coletas de sangue, com intervalo de 24 horas (amostras repetidas), para obtenção de soro e plasma. Os valores de creatinina sérica, que definiram a classificação dos pacientes do controle, DRC-1, DRC-2, DRC-3 e DRC-4, que foram 1,02±0,02mg/dL; 1,06±0,05mg/dL; 1,80±0,03mg/dL; 3,39±0,21mg/dL e 6,00±0,28mg/dL, respectivamente. A determinação plasmática indireta de óxido nítrico (NO) foi realizada por meio da dosagem de nitrato/nitrito, através da técnia de quimioluminescência NO / ozono. Os dados foram submetidos à ANOVA para análise não paramétrica (Kruskal-Wallis) (P <0,05). Os resultados das concentrações plasmáticas de NO não diferiram significativamente quando comparados os dados do controle (10,81±0,51µM), DRC-1 (15,49±1,97µM), DRC-2 (19,82±3,31µM). No entanto, o NO plasmático do grupo DRC-3 (17,01±1,73µM) e DRC-4 (83,55±13,63µM), foi significativamente maior, em relação às médias dos cães sadios. Concluímos que a concentração plasmática de NO pode aumentar em cães com DRC e torna-se significativamente mais elevada nos estágios 3 e 4 da doença.(AU)

Increased nitric oxide plasma concentration in dogs with naturally acquired chronic renal disease

ABSTRACT: This study aimed to determine the amount of plasma nitric oxide in clinically stable dogs at different stages of chronic kidney disease (CKD). Five groups of dogs were studied, aged from 4 to 18, comprising of a control group composed of healthy animals (control n=17), group CKD stage 1 (DRC-1, n=12), group CKD stage 2 (CKD-2, n=10) group, CKD stages 3 (CRD-3, n=13) and Group CKD stage 4 (DRC-4, n=10). Dogs with CKD were clinically stable and received no treatment. Two blood samples were collected at 24 hours intervals (repeated measures) to obtain serum and plasma. The serum creatinine values were used to classify dogs as CG, CKD-1, CKD-2, CKD-3 and CKD-4, and were (1.02±0.02mg/dL), (1.07±0.04mg/dL), (1.81±0.03mg/dL), (3.40±0.15mg/dL) and (6.00±0.20mg/dL) respectively. The determination of nitric oxide (NO) was performed by dosing nitrate/nitrite indirectly, and used for measurement of nitrate according to the NO/ozone chemiluminescence. The data were submitted to ANOVA for nonparametric analysis(Kruskal-Wallis) (P 0.05). The concentration of plasmatic NO did not differ significantly among GC (10.81±0.51M), CKD-1 (15.49±1.97M) and CKD-2 (19.83±3.31M) groups. The plasma concentration of CKD-3 (17.02±1.73M) and CKD-4 (83.56±13.63M) was significantly higher compared with healthy dogs. In conclusion, the NO plasma concentration can increase in dogs with CKD and become significantly higher in stage 3 and 4 dogs.

RESUMO: A determinação de óxido nítrico no plasma em cães clinicamente estáveis em diferentes estágios da doença renal crônica (DRC) não foi estudada, constituindo este o objetivo do presente estudo. Foram estudados cinco grupos de cães, com idade variando entre quatro a 18 anos, compreendendo o grupo controle, composto por animais sadios (controle, n=17), grupo com DRC estágio 1 (DRC-1, n=12), grupo com DRC estágio 2 (DRC-2, n=10), grupo com DRC estágio 3 (DRC-3, n=13) e grupo com DRC estágio 4 (DRC-4, n=10). Os cães com DRC estavam com o quadro clínico estável e sem receber qualquer tipo de tratamento. Foram estudados cinco grupo de cães, com idade variando entre quatro a 18 anos, compreendendo o grupo controle, composto por animais sadios (controle, n=17), grupo com DRC estágio 1 (DRC-1, n=12), grupo com DRC estágio 2 (DRC-2, n=10), grupo com DRC estágio 3 (DRC-3, n=13) e grupo com DRC estágio 4 (DRC-4, n=10). Os animais sadios ou com DRC foram submetidos a duas coletas de sangue, com intervalo de 24 horas (amostras repetidas), para obtenção de soro e plasma. Os valores de creatinina sérica, que definiram a classificação dos pacientes do controle, DRC-1, DRC-2, DRC-3 e DRC-4, que foram 1,02±0,02mg/dL; 1,06±0,05mg/dL; 1,80±0,03mg/dL; 3,39±0,21mg/dL e 6,00±0,28mg/dL, respectivamente. A determinação plasmática indireta de óxido nítrico (NO) foi realizada por meio da dosagem de nitrato/nitrito, através da técnia de quimioluminescência NO / ozono. Os dados foram submetidos à ANOVA para análise não paramétrica (Kruskal-Wallis) (P 0,05). Os resultados das concentrações plasmáticas de NO não diferiram significativamente quando comparados os dados do controle (10,81±0,51M), DRC-1 (15,49±1,97M), DRC-2 (19,82±3,31M). No entanto, o NO plasmático do grupo DRC-3 (17,01±1,73M) e DRC-4 (83,55±13,63M), foi significativamente maior, em relação às médias dos cães sadios. Concluímos que a concentração plasmática de NO pode aumentar em cães com DRC e torna-se significativamente mais elevada nos estágios 3 e 4 da doença.

ALTERAÇÕES CARDIORRESPIRATÓRIAS E CONCENTRAÇÕES DE ÓXIDO NÍTRICO EM CÃES BRAQUICEFÁLICOS

Pelo presente, buscou-se relacionar as concentrações plasmáticas de nitrito/nitrato, como indicador da liberação de óxido nítrico (NO), bem como as variáveis morfofuncionais cardíacas com o grau de comprometimento e gravidade da síndrome em cães braquicefálicos. Para tal, foram utilizados 32 cães braquicefálicos, 16 machos e 16 fêmeas, com idade entre 1,5 a 11 anos e pesando de 6,7 a 33 kg, provenientes da rotina hospitalar. Os pacientes foram distribuídos em quatro grupos, sendo: Grupo 0: Grupo Controle, composto por cães braquicefálicos, com sídrome braquicefálica (SB) grau 0; Grupo 1: Animais braquicefálicos com SB grau I; Grupo 2: Animais braquicefálicos com SB grau II; Grupo 3: Animais braquicefálicos com SB grau III. Por meio do método estatístico multivariado de análise de componentes principais, observou-se que, dentre as variáveis avaliadas, o NO não apresentou relação (p > 0,05) com os parâmetros eletrocardiográficos e ecocardiográficos, nem com a gravidade da SB. Houve a formação de dois processos distintos: 1) Observou-se relação direta entre os parâmetros: comprimento do ventrículo direito (VD) em sístole e diástole; área VD (sístole e diástole) e diâmetro VD (sístole e diástole); 2) Observou-se relação inversa entre a distensibilidade do ramo direito da artéria pulmonar (DAP) e o grau da SB com a relação artéria pulmonar/aorta (AP/Ao). Mesmo sem apresentar interação com nenhum dos parâmetros analisados, o NO apresentou valores basais elevados para todos os grupos (Grupo 0: mediana = 11,9 M; variação10,021,0 M; Grupo 1: mediana = 17,4 M; variação, 9,936,9 M; Grupo 2: mediana = 12,3 M; variação, 8,140,1 M; Grupo 3: mediana = 17,4 M; variação, 10,646,4 M). Houve relação entre o grau da SB e remodelamento das câmaras direitas, averiguado por meio da análise ecocardiográfica qualitativa, frente às mensurações lineares. Pacientes braquicefálicos, com graus mais severos da SB, tendem a apresentar Cor Pulmonale.

The present study sought to relate the plasma concentrations of nitrite/nitrate as an indicator of nitric oxide (NO) release, as well as cardiac morphofunctional variables with the degree of impairment and severity of the syndrome in brachycephalic dogs. For this purpose, 32 brachycephalic dogs, 16 males and 16 females, aged between 1.5 and 11 years and weighing 6.7 to 33 kg, from the hospital routine were used. The patients were distributed into four groups, as follows: Group 0: Control Group, composed of brachycephalic dogs, with grade 0 brachycephalic syndrome (BS); Group 1: Brachycephalic animals with grade I BS; Group 2: Brachycephalic animals with grade II BS; Group 3: Brachycephalic animals with BS grade III. Through the multivariate statistical method of principal component analysis, it was observed that, among the variables evaluated, NO was not associated (p > 0.05) with the electrocardiographic and echocardiographic parameters, nor with the severity of BS. There was the formation of two distinct processes: 1) There was a direct relationship between the parameters: length of the right ventricle (RV) in systole and diastole; RV area (systole and diastole) and RV diameter (systole and diastole); 2) An inverse relationship was observed between the distensibility of the right branch of the pulmonary artery (DAP) and the degree of BS with the pulmonary artery/aorta ratio (PA/Ao). Even without interaction with any of the analyzed parameters, NO showed high baseline values for all groups (Group 0: median = 11.9 M; bias 10.021.0 M; Group 1: median = 17.4 M; bias, 9.936.9 M; Group 2: median = 12.3 M; bias, 8.140.1 M; Group 3: median = 17.4 M; bias, 10.646, 4 M). There was a relationship between the degree of BS and remodeling of the right chambers, verified through qualitative echocardiographic analysis, compared to linear measurements. Brachycephalic patients, with more severe degrees of BS, tend to have Cor Pulmonale.

EFEITO DO POTENCIAL MITOCONDRIAL DOS ESPERMATOZOIDES BOVINOS NA PRODUÇÃO in vitro DE EMBRIÕES

O uso de biotécnicas da reprodução vem sendo utilizado como ferramenta para melhorar tanto a eficiência reprodutiva quanto maximizar o uso de animais geneticamente superiores. O Brasil é responsável por 29% da produção in vitro de embriões bovinos (PIVE) no mundo. Apesar da extensa utilização desta biotécnica, existem pontos críticos que limitam a sua eficiência. Fatores relacionados à qualidade de oócitos, o ambiente in vitro (mais exposto ao O2 atmosférico) e efeito touro (atributos espermáticos). Os atributos espermáticos vêm sendo relacionados com a fertilidade. Estudos têm relacionado o potencial de membrana mitocondrial (m) com o estresse oxidativo, sendo essa associação ora positiva ora negativa para a fecundação. Acredita-se que essa seja influenciada por outras características espermáticas associadas. Com isso, formulou-se a hipótese de que o m é um atributo dependente dos demais atributos relacionados à qualidade espermática, sendo que o Alto Perfil espermático quando associado com o Maior m, condiciona um ambiente mais ativo e oxidativo durante a fecundação in vitro (FIV). Esse ambiente mais exacerbado é deletério, diminuindo a taxa de blastocistos. No entanto, espermatozoides de Baixo Perfil associados a um Maior m, proporcionam um ambiente menos ativo e menos exacerbado, portanto maiores taxa de blastocistos. O objetivo deste trabalho foi avaliar como o m e os atributos relacionados ao perfil espermático interferem nas taxas de PIVE e na resposta antioxidante destes embriões. Portanto, foram realizadas manipulações de PIVE, análises dos parâmetros espermáticos por citometria de fluxo, cinética espermática (CASA), atividade mitocondrial (DAB), estresse oxidativo e detecção de óxido nítrico (NO.), análise de expressão de genes antioxidantes nos embriões. Além disso, foram realizadas análises de compostos associados a mitocôndria (ADT, ATP, NADH, FADH2) e peroxidação lipídica (4-HNE) por cromatografia líquida em amostras de espermatozoides e meio de FIV, respectivamente. Os resultados demonstram que apesar de ter sido observado relação de dependência do m com os demais atributos espermáticos, a relação encontrada entre o m e o Perfil espermático foi contrária a esperada na hipótese proposta. Ou seja, o Alto Perfil associado ao Maior m apresentou maiores taxas na PIVE. Assim como o Baixo Perfil com Maior m apresentou as piores taxas na PIVE. O Perfil espermático influenciou mais na PIVE do que a diferença de m. Quanto ao status oxidativo nos espermatozoides, não foram observadas diferenças entre os grupos estudados. As diferenças relacionadas ao metabolismo mitocondrial foram associadas à análise de DAB, e uma via compensatória foi observada no grupo de Menor m. Os baixos níveis de NO. detectados no meio de FIV foram associados com maiores índices de fertilidade in vitro. Para análise de expressão gênica, GPx4 foi mais expressa no grupo de Baixo Perfil espermático, demonstrando um desequilíbrio da resposta antioxidante no grupo de menor qualidade espermática. Não foi possível a detecção dos compostos relacionados ao metabolismo mitocondrial e peroxidação lipídica por cromatografia líquida. Portanto mais estudos, com metodologias mais sensíveis para essa detecção, devem ser realizados para que esses compostos sejam detectados e associados com o m, para melhor entendimento da função mitocondrial na PIVE.

Reproductive biotechnologies have been used as a tool to improve both reproductive efficiency and maximize the use of genetically superior animals. Brazil is responsible for 29% of the in vitro production of bovine embryos (IVP) in the world. Despite the extensive use of this biotechnology, there are critical points that limit its efficiency. These factors relate to oocyte quality, in vitro environment (exposure to atmospheric O2) and the bull effect (sperm attributes). Sperm attributes have been associated with fertility. Studies have related the mitochondrial membrane potential (m) with oxidative stress, with this association being either positive or negative for fertilization. This is believed to be influenced by other associated sperm characteristics. Thus, it is hypothesized that m is an attribute dependent on the other attributes related to sperm quality, and the high sperm profile, when associated with the higher m, leads to a more active and oxidative environment during in vitro fertilization (IVF). This exacerbated environment is harmful, decreasing the rate of blastocyst formation. However, low profile sperm associated with a higher m provides a less active and less exacerbated environment, therefore resulting in higher rates of blastocyst formation. The objective of this work was to evaluate how m and attributes related to the sperm profile interfere in the PIVE rates and in the antioxidant response of these embryos. Therefore, IVP manipulations, analysis of sperm parameters by flow cytometry, sperm kinetics (CASA), mitochondrial activity (DAB), oxidative stress and detection of nitric oxide (NO.), and analysis of expression of antioxidant genes in embryos were performed. In addition, analyses of compounds associated with mitochondria (ADT, ATP, NADH, FADH2) and lipid peroxidation (4-HNE) were performed by liquid chromatography on samples of sperm and IVF medium, respectively. The results demonstrate that although a relationship of dependence of m with the other sperm attributes was observed, the relationship found between m and the sperm profile was contrary to what was expected in the proposed hypothesis. In other words, the high profile sperm associated with higher m resulted in higher rates of IVP. The low profile with the Higher m presented the worst rates of IVP. The sperm profile influenced IVP more than the m differences. Regarding the oxidative status in sperm, no differences were observed between the groups studied. Differences related to mitochondrial metabolism were associated with the analysis of DAB, and a compensatory pathway was observed in the group of lower m. Lower levels of NO detected in the IVF medium were associated with higher in vitro fertility rates. For gene expression analysis, Gpx4 had higher expression in the low sperm profile group, demonstrating an imbalance of the antioxidant response in the group with lower sperm quality. It was not possible to detect compounds related to mitochondrial metabolism and lipid peroxidation by liquid chromatography. Therefore, more studies, with more sensitive methodologies for this detection, should be carried out and associated with m, for a better understanding of mitochondrial function in IVP.

ÓXIDO NÍTRICO PLASMÁTICO INDIRETO EM CÃES COM HIPERTENSÃO PULMONAR SECUNDÁRIA OU NÃO À DOENÇA CARDÍACA ESQUERDA

O óxido nítrico (ON) é uma molécula volátil regulada pela enzima óxido nítrico sintase (NOS). Participa de muitas funções no organismo, como no coração, pulmão, encéfalo e rins. Fisiologicamente, está relacionado à regulação dos vasos sanguíneos associado a outros mediadores, como a endotelina 1 e prostaciclinas, garantindo nos pulmões uma circulação de baixa pressão, baixa resistência e alta capacitância, promovida pelo seu efeito vasodilatador. A liberação de NO pelo endotélio ocorre pela força de cisalhamento do sangue no vaso sanguíneo. Na hipertensão pulmonar (HP), em seres humanos, há desregulação dos vasoconstritores e vasodilatadores na circulação pulmonar, onde a diminuição da biodisponibilidade do ON promove um efeito vasoconstritor responsável pelo aumento da pressão arterial pulmonar. Essa tese foi desenvolvida com o objetivo de promover mais esclarecimento sobre a fisiopatologia da HP e o papel do ON na espécie canina por meio do embasamento teórico que contempla uma revisão de literatura, bem como por meio da pesquisa prospectiva que avaliou a concentração de ON plasmático pelo método de quimioluminescência NO/ozônio pela dosagem de nitrito/nitrato em cães com HP secundária à doença do lado esquerdo do coração (LHD) ou não secundária à doença cardíaca esquerda. O estudo incluiu 35 cães com probabilidade de HP estimada pelo exame ecocardiográfico do ventrículo direito, átrio direito e artéria pulmonar e classificada em baixa, intermediária ou alta de acordo com os critérios propostos pelo consenso de HP canina. Além disso, o exame ecocardiográfico permitiu também classificar a HP secundária à LHD (n=18 cães), e não secundária à LHD os cães sem remodelamento atrial esquerdo (n=17 cães). O valor de ON foi maior nos cães com HP secundária à LHD (p=0.002), enquanto que a diferença não foi significativa em relação à probabilidade baixa, intermediaria ou alta de HP. Em conclusão, o presente estudo mostrou que a maior concentração de NO nos cães com HP secundária a LHD permitiu diferenciá-los dos cães com HP sem remodelamento cardíaco esquerdo, Entretanto, não foi possível diferenciar a probabilidade de HP com base na concentração de NO, embora houvesse uma tendência a aumentar a concentração do NO à medida que a probabilidade de HP e o remodelamento atrioventricular direito aumentasse.

Nitric oxide (NO) is a volatile molecule regulated by the enzyme nitric oxide synthase (NOS). It participates in many functions in the body, such as in the heart, lung, brain and kidneys. Physiologically, it is related to the regulation of blood vessels associated with other mediators, such as endothelin 1 and prostacyclins, ensuring a low pressure, low resistance and high capacitance circulation in the lungs, promoted by its vasodilator effect. The release of NO by the endothelium occurs by the shear force of the blood in the blood vessel. In pulmonary hypertension (PH), in humans, there is dysregulation of vasoconstrictors and vasodilators in the pulmonary circulation, in which the decrease in NO bioavailability promotes a vasoconstrictor effect responsible for the increase in pulmonary arterial pressure. This doctoral thesis was developed with the aim of providing further clarification on the pathophysiology of PH and the role of NO in the canine species through a theoretical basis that includes a literature review and a prospective study. This research evaluated the plasma NO concentration by the NO/ozone chemiluminescence method by measuring nitrite/nitrate in dogs with PH secondary to left heart disease (LHD) or not secondary to left heart disease. The evaluation was performed in 35 dogs with probability of PH estimated by echocardiographic examination of the right ventricle, right atrium and pulmonary artery and classified as low, intermediate or high according to the criteria proposed by the consensus of canine PH. The echocardiographic examination also allowed classifying PH secondary to LHD (n=18 dogs), and not secondary to LHD, dogs without left atrial remodeling (n=17 dogs). The ON value was higher in dogs with HP secondary to LHD (p=0.002), as the difference was not significant in relation to low, intermediate or high probability of HP. In conclusion, the present study showed that the higher concentration of NO in dogs with PH secondary to LHD enabled the differentiation of dogs with PH without left cardiac remodeling. However, it was not possible to differentiate the probability of PH based on the concentration of NO, although there was a tendency to increase the concentration of NO as the probability of PH and right atrioventricular remodeling increased.

ESTUDO IN VITRO DA RESPOSTA DE MACRÓFAGOS NA INFECÇÃO COM MICROSPORUM CANIS

Os dermatófitos são fungos importantes para a saúde pública, são transmitidos entre animais e seres humanos causando zoonoses. Microsporum canis é o principal agente das dermatofitoses em cães e gatos. A imunidade inata desempenha importante papel frente à infecção contra dermatófitos; entretanto, existem poucos estudos sobre a relação entre resposta imune inata e M. canis. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade fagocítica, microbicida e imunomoduladora de macrófagos desafiados com microconídios de M. canis. Macrófagos murinos, tratados ou não com LPS (1µg/ml), foram infectados com M. canis na proporção de 0,25:1 (microconídios/macrófagos) e cultivados por 30 min, 1 h, 3 h e 6 h. Após cada intervalo, as lamínulas foram coletadas e coradas por Giemsa, contando-se duzentas células e calculando-se a porcentagem de macrófagos que internalizaram pelo menos um microconídio. O sobrenadante foi coletado para medir os níveis de citocinas e óxido nítrico, e checou-se a viabilidade celular e o perfil dos macrófagos durante a infecção. A porcentagem de fagocitose aumentou no transcorrer do tempo, atingindo o máximo às 6 h. A porcentagem de macrófagos não estimulados com LPS que fagocitaram microconídios foi de 28,0%, 33,5%, 62,5% e 71,5%, respectivamente em 30 min, 1 h, 3 h e 6 h. Nos macrófagos estimulados com LPS esta porcentagem foi de 34,5%, 47,5%, 67,0% e 74,0%, respectivamente nos intervalos de 30 min, 1 h, 3 h e 6 h. A produção de óxido nítrico foi similar em ambos, macrófagos estimulados ou não com LPS. Níveis de TNF aumentaram no transcorrer do tempo em macrófagos desafiados com M. canis estimulados ou não com LPS, quando comparados com macrófagos não infectados (p<0,05). Níveis superiores de IL-6 foram produzidos por macrófagos estimulados com LPS e infectados com M. canis no intervalo de 1 h (p<0,05). A viabilidade celular diminuiu com o tempo, com o pico de morte dos macrófagos às 6 h. O teste de microbicidade mostrou que, mesmo após a fagocitose, os microconídios de M. canis permaneciam viáveis dentro dos macrófagos. Os macrófagos mostraram um perfil M2, o qual produz uma tendência de resposta anti-inflamatória que favorece o crescimento fúngico. Macrófagos apresentaram alta atividade fagocítica frente o M. canis, a qual aumentou quando previamente estimulados com LPS. Estímulo com LPS também aumentou a produção de citocinas, sugerindo uma modulação na resposta à infecção. O aumento na produção das citocinas pró-inflamatórias TNF- e IL-6 que são importantes no recrutamento de novas células fagocíticas e na resolução da infecção, foi observado nos macrófagos desafiados com M. canis. Os resultados sugerem que, apesar dos macrófagos apresentarem atividade fagocítica e produção de citocinas quando desafiados com M. canis, sua viabilidade e a atividade microbicida são prejudicadas, não sendo capazes de controlar a infecção.

Dermatophytes are important fungi for public health, as they are transmitted between animals and humans causing zoonoses. Microsporum canis is the main agent of dermatophytosis in dogs and cats. Innate immunity plays an important role in the establishment of dermatophytic infection; however, there are few studies on the relationship between innate immune response and M. canis. Thus, the aim of this work was to evaluate the phagocytic, microbicidal and immunomodulatory capacity of macrophages challenged with M. canis microconidia. Murine macrophages, treated or not with LPS (1µg /ml), were infected with M. canis in a ratio of 0.25:1 (microconidia/macrophages) and incubated for 30 min, 1 h, 3 h, and 6 h. After each interval, the coverslips were collected and stained by Giemsa, counting two hundred cells and calculating the percentage of macrophages that internalized at least one microconidium. The supernatant was collected to measure cytokine and nitric oxide levels, and cell viability and macrophage profile during infection were checked. The percentage of phagocytosis increased over time, peaking at 6 h. The percentage of non-stimulated LPS macrophages that phagocytosed microconidia was 28.0%, 33.5%, 62.5%, and 71.5%, respectively at 30 min, 1 h, 3 h, and 6 h. In LPS-stimulated macrophages, these percentages were 34.5%, 47.5%, 67.0%, and 74.0%, respectively at 30 min, 1 h, 3 h, and 6 h intervals. Nitric oxide production was similar in both macrophages stimulated or not with LPS. TNF- levels increased over time in macrophages challenged with M. canis stimulated or not with LPS when compared to uninfected macrophages (p <0.05). Higher levels of IL-6 were produced by LPS-stimulated and M. canis-infected macrophages within 1 h (p <0.05). Cell viability decreased over time with macrophages death peak at 6 h. Microbicity test showed that even after phagocytosis, M. canis microconidia remained viable within the macrophages. Macrophages showed an M2 profile, which produces a tendency of anti-inflammatory response that favors fungal growth. Macrophages showed high phagocytic activity against M. canis, which increased when previously stimulated with LPS. LPS stimulation also increased cytokine production, suggesting a modulation in the response to infection. Increased production of pro-inflammatory cytokines TNF- and IL-6, which are important in recruiting new phagocytic cells and resolving the infection, was observed in macrophages challenged with M. canis. The results suggest that, although macrophages present phagocytic activity and cytokine production when challenged with M. canis, their viability and microbicidal activity are impaired and unable to control infection.

Efeito do suco do fruto de Morinda citrifolia Linn. em macrófagos RAW264.7 estimulados por LPS e na inflamação aguda induzida por carragenina em modelo experimental murino.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do suco do fruto de Morinda citrifolia (noni) em macrófagos RAW 264.7 e no modelo experimental murino de inflamação aguda induzida por carragenina. Nos ensaios in vitro foram utilizados macrófagos RAW 264.7 tratados com suco de noni nas concentrações de 125, 250 e 500 g/mL e estimulados com LPS, com posterior análise da produção de nitrito e citotoxidade. Nos ensaios in vivo foram realizados os modelos de edema de pata e peritonite induzida por carragenina em camundongos BALB/c submetidos ao tratamento com suco de M. citrifolia nas concentrações de 250, 500, 1000 mg/kg, ou dexametasona (5 mg/kg). No modelo de edema de pata, foi avaliada a redução do edema, enquanto no modelo de peritonite, foram avaliados a contagem celular total do lavado peritoneal e do sangue, além dos níveis de IL-1 no soro. Na avaliação in vitro do suco de M. citrifolia não foi observada toxicidade nas concentrações e/ou estimulações trabalhadas. Quanto à dosagem de nitrito, os macrófagos tratados com o suco na concentração de 500 g/mL apresentaram menor produção de óxido nítrico. No edema de pata induzido por carregenina, as concentrações 250, 500 mg/kg e 1g/kg do suco produziram uma redução do edema de respectivamente 38,46%, 46,66% e 52,82%, no intervalo de quatro horas. Na peritonite induzida por -carragenina, os animais tratados com o suco do fruto de M. citrifolia na concentração de 1000 mg/kg apresentaram uma redução significativa no número de leucócitos, demonstrando a atividade anti-inflamatória do suco do fruto de M. citrifolia. Os resultados obtidos nos permitem concluir que o suco do noni possui atividade anti-inflamatória dose dependente, sendo a concentração de 1000 mg/kg mais eficiente.

The aim of this study was to evaluate the effect activity of Morinda citrifolia (noni) fruit juice in RAW 264.7 macrophages, and in the murine experimental model on acute inflammation induced by -carrageenan. In the in vitro assays, RAW 264.7 macrophages were treated with noni juice at concentrations of 125, 250 and 500 g/mL and later stimulated with LPS, with subsequent analysis of nitrite production and cytotoxicity. In the in vivo assays, the models of paw edema and peritonitis induced by -carrageenan in BALB/c mice submitted to treatment with M. citrifolia juice at the concentrations of 250, 500 mg/mL and 1g/kg, or dexamethasone (5 mg/kg). In the paw edema model, the edema reduction was evaluated, while in the peritonitis model, the total cell count of the peritoneal lavage and blood, as well as serum IL-1 levels, were evaluated. No cytotoxicity of M. citrifolia juice was observed in vitro study in all concentrations and / or worked stimulations. Regarding nitrite dosage, the macrophages treated with the juice at 500 g/mL presented lower production of nitric oxide. In the paw edema model, noni juice 250, 500 mg/kg, and 1 g/kg produced edema reduction of, respectively, 38.46%, 46.66% and 52.82%, within four hours. In the -carrageenan-induced peritonitis model, the animals treated with M. citrifolia juice at 1 g/kg showed a significant reduction in the leukocytes count, M. citrifolia fruit juice showed an anti-inflammatory activity. The results obtained we conclude that noni juice has a dose-dependent anti-inflammatory activity, the concentration of 1000 mg / kg more efficient.

Participação da via L-arg/NO/GMPc na capacitação in vitro e seu impacto no perfil proteômico de espermatozoides bovinos

A L-arginina (L-arg) tem sido utilizada nos estudos em reprodução animal por ser precursora da síntese de óxido nítrico (NO). O NO por sua vez desempenha um papel importante em espermatozoides, nas vias de sinalização que levam à fosforilação de proteínas, evento necessário à capacitação espermática. Entretanto faltam estudos moleculares que caracterizem as proteínas relacionadas a esse processo e que justifiquem os efeitos positivos do NO observado em estudos anteriores na capacitação espermática in vitro em bovinos. Portanto, esse estudo teve por objetivo principal caracterizar o proteoma dos espermatozoides bovinos após a capacitação in vitro com adição de L-arg. Além disso, objetivou-se elucidar se os efeitos da L-arg durante a capacitação espermática de bovinos são relacionados à ativação da via NO/GMPc/PKG1. Em um primeiro estudo, objetivou-se caracterizar as proteínas, pela espectrometria de massas, de espermatozoides capacitados in vitro com L-arg ou não (controle) e relacionar esses achados com a qualidade espermática, avaliada pela integridade de membrana, atividade mitocondrial, motilidade/vigor espermático e percentual de capacitação. No segundo estudo, objetivou-se elucidar se o tratamento L-arg/NO durante a capacitação espermática in vitro de bovinos, tem ação pela via NO/GMPc/PKG1. Para isso, os espermatozoides foram tratados com L-arg, Rp-8-Br-PET-cGMPS (RP, inibidor seletivo da PKG1) ou o PTIO (quelante do NO), e o GMPc foi avaliado pelo ensaio de ELISA. Em ambos os estudos, os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste SNK com 5% de probabilidade. No primeiro estudo, todas as características de qualidade avaliadas foram melhores no grupo com L-arg em relação ao controle (P<0,05). Além disso, 367 proteínas foram encontradas, das quais 40 foram diferencialmente expressas entre o grupo com L-arg e o controle, e uma (AKAP3) foi expressa exclusivamente no grupo com L-arg (P<0,05). No segundo estudo, efeitos negativos foram encontrados nos espermatozoides tratados com PTIO e RP em relação ao controle na capacitação espermática (P<0,05), enquanto que na motilidade/vigor, o tratamento com PTIO teve a menor taxa em relação ao controle e demais tratamentos (P<0,05). Na dosagem do GMPc intracelular, observou-se que a concentração foi menor nos tratamentos PTIO e L-arg + PTIO, mas foi mais alto nos tratamentos RP e L-arg + RP em relação ao controle e à L-arg (P<0,05). Com esses resultados, podemos concluir que em bovinos: 1) o sistema L-arg/NO tem um papel importante sobre a qualidade espermática e capacitação espermática, mas independente da via GMPc/PKG1; e 2) foi observado um padrão diferencial de expressão de proteínas entre tratamento e controle, que pode estar diretamente ligado aos mecanismos moleculares envolvidos na ação da L-arg sobre a capacitação in vitro em bovinos.

L-arginine (L-arg) has been used in animal reproduction studies as a precursor of the synthesis of nitric oxide (NO). NO plays an important role in spermatozoa, in the signaling pathways that lead to protein phosphorylation, a necessary event for sperm capacitation. However, molecular studies that characterize the proteins related to this process and that justify the positive effects of NO observed in previous studies on in vitro sperm capacitation in cattle are lacking. Therefore, this study aimed to characterize the bovine sperm proteome after the in vitro capacitation with addition of L-arg. In addition, we aimed to elucidate whether the effects of L-arg during bovine sperm capacitation are related to NO/cGMP/PKG1 pathway activation. In a first study, the objective was to characterize the proteins by mass spectrometry of capacitated sperm in vitro with L-arg (treatment) or not (control) and to relate these findings with the sperm quality, evaluated by membrane integrity, mitochondrial activity, sperm motility/vigor and percentage of capacitation. In the second study, the objective was to elucidate whether the L-arg/NO treatment during the in vitro sperm capacitation of cattle, acts via NO/cGMP/PKG1 signaling pathway. For this, sperm were treated with L-arg, Rp-8-Br-PET-cGMPS (RP, selective inhibitor of PKG1) or PTIO (NO chelator) were used, and cGMP was evaluated by ELISA assay. In both studies, the data were submitted to analysis of variance and the means compared by the SNK test with 5% probability. In the first study, all the quality characteristics evaluated were better in the L-arg group compared to the control (P<0.05). In addition, 367 proteins were found, of which 40 were differentially expressed between L-arg group and control, and one (AKAP3) was expressed exclusively in the L-arg group (P<0.05). In the second study, negative effects were found in the sperm treated with PTIO and RP compared to the control in the sperm capacitation (P<0.05), whereas in the motility/vigor, the treatment with PTIO had the lowest rate compared to the control and other treatments (P<0.05). In the intracellular cGMP measurement, it was observed that the concentration was lower in the PTIO and L-arg + PTIO treatments, but was higher in the RP and L-arg + RP treatments compared to the control and L-arg (P<0.05). With these results, we can conclude that in bovines: 1) the L-arg/NO system plays an important role on sperm quality and sperm capacitation, but independent of the cGMP/PKG1 signaling pathway; and 2) a differential protein expression pattern was observed between treatment and control, which may be directly related to the molecular mechanisms involved in the action of L-arg on in vitro sperm capacitation in cattle.

Evaluation of the effects of S-methylisothiourea hemisulfate, an inducible nitric oxide synthase inhibitor, on the healing of colonic anastomosis in rats / Avaliação dos efeitos da S-metilisotiouréia, um inibidor da enzima óxido nítrico sintase induzível, na cicatrização de anastomoses colônicas em ratos

PURPOSE: To evaluate the effects of S-methylisothiourea hemisulfate (SMT) on the healing of colonic anastomosis in rats. METHODS: Sixty rats Wistar were distributed into two groups of 30 animals: experimental (E) and control C). The animals of experimental group received intraperitoneal SMT at 50mg/kg/dose every 12 hours for 72 hours. The control group received intraperitoneal saline at the same volume of SMT. The rats were subdivided into subgroups groups of 10 for euthanasia on the third, seventh, and 14th postoperative days (POD). We evaluated clinical and weight evolution, breaking strength and histopathology; also, a blood sample was collected for serum dosage of nitrite/nitrate. RESULTS: There was more vascular neoformation (p=0.006) and granulation (p=0.002) in the E3 group, and more mononuclear infiltrates in the C3 group (p=0.041). There was also more edema in the C14 group (p=0.008). There was no statistically significant difference in breaking strength, nitrite/nitrate dosage, and the remaining histopathological parameters. CONCLUSION: The use of S-methylisothiourea hemisulfate improved the healing of colonic anastomosis in rats on the third postoperative day by accelerating the proliferative stage of healing, but without interfering with the breaking strength of the anastomosis.(AU)

OBJETIVO: Avaliar os efeitos do hemissulfato de S-metilisotiouréia (SMT) na cicatrização de anastomoses colônicas em ratos no terceiro, sétimo e 14° dia de pós-operatório (DPO). MÉTODOS: Sessenta ratos Wistar foram distribuídos em dois grupos: experimental (E) e controle (C), com 30 animais cada. No grupo experimental foi administrado SMT 50mg/kg/dose, intraperitoneal a cada 12 horas por 72 horas. O grupo controle recebeu NaCl a 0,9%. Os ratos foram subdivididos em grupos de 10 para eutanásia no terceiro, sétimo e 14° DPO. Avaliou-se a evolução clínica e o peso dos animais, a resistência tênsil e histopatologia da anastomose, e a dosagem de nitrito/nitrato no soro. RESULTADOS: Houve mais neoformação vascular (p=0,006) e de granulação (p=0,002) no grupo E3, e maior infiltração de mononucleares no grupo C3 (p=0,041). Houve também mais edema no grupo C14 (p=0,008). Não houve diferença estatisticamente significativa na resistência tênsil, a dosagem de nitrito / nitrato, e os restantes parâmetros histopatológicos. CONCLUSÃO: A utilização do hemissulfato de S-metilisotiouréia acelerou a cicatrização das anastomoses colônicas, a melhoria ocorreu no terceiro DPO: verificou-se que a fase proliferativa da cicatrização foi acelerada. Não houve interferência na resistência tênsil das anastomoses.(AU)

RELAÇÃO ENTRE AS IMUNOMARCAÇÃO PARA INOS, CARGA PARASITÁRIA, PARASITEMIA E SUAS LESÕES EM DIFERENTES ÓRGÃOS DE RATOS WISTAR EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS COM TRYPANOSOMA EVANSI

Trypanosoma evansi acomete diversas espécies de animais em todo o mundo. A infecção se caracteriza por intensa parasitemia associada a anemia, que evolui para lesões teciduais atribuídas à resposta autoimune do hospedeiro. O objetivo desse estudo foi avaliar a evolução da infecção experimental pelo Trypanosoma evansi até as fases mais tardias da infecção, a partir das lesões patológicas, estresse oxidativo tecidual, parasitemia e parâmetros hematológicos. Para tal, os ratos infectados com T. evansi foram eutanasiados aos 7, 14, 21, 28 e 35 dias após a inoculação (DAI), os animais foram anestesiados, e posteriormente colhidos 5 ml de sangue intracardíaco com anticoagulante etileno diamino tetra acetato de sódio (EDTA). Os achados histopatológicos foram avaliados de acordo com o tipo de lesão e a incidência de T. evansi, sendo descrita a localização da lesão e determinada a intensidade por escores. O estresse oxidativo foi avaliado a partir da resposta imune celular por imunomarcações da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) de imunohistoquímica. A carga parasitária foi detectada pela imunomarcação do parasita pela mesma técnica. Foi notada uma acentuada anemia no DAI 21. No baço, a hiperplasia linfoide em todos os momentos, evidenciando-se no DAI 35. No coração, presença de parasitas no interior de vasos e câmaras ventriculares, no DAI 21 e infiltrado inflamatório polimorfonuclear em todos os momentos, porém, extremamente acentuado no DAI 28. Nos rins notou-se a presença do parasita a partir do DAI 14 associado a uma nefrose tóxica. Nos pulmões poucos parasitas, espessamento de septos alveolares, hemorragia em todo período da infecção e infiltrado inflamatório polimorfonuclear. Nos linfonodos poplíteos com parasitas a partir do DAI 28 e intensa presença de mastócitos (MCs) em DAI 21. No encéfalo, foi observado a descontinuidade da barreira hematoencefálica, em DAI 21. Os resultados foram importantes para elucidar a infeção por tripanossomíases, e o hospedeiro nos diferentes momentos diante desse cenário. Em todos os órgãos foram detectados a presença de parasita por imuno-histoquimica, apresentando maior intensidade em DAI21, e nos próximos momentos reduzindo significamente. Assim como a intensidade de células imunomarcadas para o óxido nítrico foi alta entre DAI14 e DAI 21 e após esse momento reduziram. Os dados mostram que o óxido nítrico pode lesionar os tecidos do hospedeiro como o parasita, e assim reduzindo a carga parasitária.

Trypanosoma evansi affects several species of animals worldwide. The infection is characterized by intense parasitemia associated with anemia, which evolves to tissue lesions attributed to the host's autoimmune response. The objective of this study was to evaluate the evolution of the experimental infection by Trypanosoma evansi until the later stages of the infection, from the pathological lesions, tissue oxidative stress, parasitemia and hematological parameters. To that end, mice infected with T. evansi were euthanized at 7, 14, 21, 28 and 35 days after inoculation (DAI), animals were anesthetized, and 5 ml of intracardiac blood was then collected with anticoagulant ethylene diamine tetraacetate sodium (EDTA). The histopathological findings were evaluated according to the type of lesion and the incidence of T. evansi. The location of the lesion was described and the intensity determined by scores. Oxidative stress was evaluated from the cellular immune response by immunostaining of the enzyme inducible nitric oxide synthase (iNOS) immunohistochemistry. The parasite load was detected by immunolabeling the parasite by the same technique. It was noted a marked anemia in DAI 21. In the spleen, lymphoid hyperplasia at all times, evidenced in DAI 35. In the heart, presence of parasites inside vessels and ventricular chambers, in DAI 21 and polymorphonuclear inflammatory infiltrate in all However, the presence of the parasite from the DAI 14 associated with a toxic nephrosis was observed in the kidneys. In the lungs few parasites, thickening of alveolar septa, hemorrhage throughout the infection period and polymorphonuclear inflammatory infiltrate. In popliteal lymph nodes with parasites from DAI 28 and intense presence of mast cells (MCs) in DAI 21. In the brain, the discontinuity of the blood-brain barrier was observed in DAI 21. The results were important to elucidate the infection by trypanosomiasis, and the different moments in front of this scenario. In all organs the presence of parasite was detected by immunohistochemistry, showing a greater intensity in DAI21, and in the next moments reducing significantly. As well as the intensity of cells immunolabelled for nitric oxide was high between DAI14 and DAI 21 and after that time reduced. The data show that nitric oxide can injure host tissues like the parasite, and thus reduce parasitic burden.

L-arginine in the ischemic phase protects against liver ischemia-reperfusion injury / A L-arginina durante a fase isquêmica protege o fígado das lesões de isquemia e reperfusão

PURPOSE: To investigate the effects of intravenous L-arginine (LG) infusion on liver morphology, function and proinflammatory response of cytokines during the early phase of ischemia-reperfusion injury (IRI). METHODS: Thirty rabbits were subjected to 60 minutes of hepatic ischemia and 120 minutes of reperfusion. An intravenous injection of saline or L-arginine was administered five minutes before the ischemia and five minutes before initiating the reperfusion and at the 55th and 115th minutes after the ischemia. Samples were collected for histological analysis of the liver and measurements of the serum AST, ALT and LDH and the cytokines IL-6 and TNF-alpha. RESULTS: It was observed a significant reduction of sinusoidal congestion, cytoplasmic vacuolization, infiltration of polymorphonuclear leukocyte, nuclear pyknosis, necrosis and steatosis in liver tissue, as well as AST, ALT and LDH after injection of LG in the ischemia (p <0.001). Lower levels of IL-6 and TNF-alpha were associated with LG infusion during ischemia. Higher levels these proteins were observed in animals receiving LG during reperfusion. CONCLUSION: L-arginine protects the liver against ischemia/reperfusion injury, mainly when is administered during the ischemic phase.(AU)

OBJETIVO: Investigar os efeitos da infusão endovenosa da L-arginina (LG) na morfologia, função e resposta de citocinas pró-inflamatórias do fígado durante a fase precoce da lesão de isquemia e reperfusão (IRI). MÉTODOS: Trinta coelhos foram submetidos a 60 minutos de isquemia hepática e 120 minutos de reperfusão. Foi administrada injecção intravenosa de solução salina ou L-arginina aos cinco minutos antes de iniciar a isquemia e cinco minutos antes de iniciar a reperfusão e aos 55 e 115 minutos após o início da isquemia. Realizou-se análise histológica do fígado e dosagens séricas de AST, ALT, LDH, citocinas IL-6 e TNF-alfa. RESULTADOS: Ocorreu redução significante da congestão sinusoidal, vacuolização citoplasmática, infiltração de leucócitos polimorfonucleares, picnose nuclear, necrose e esteatose no tecido hepático, assim como nos níveis de AST, ALT e LDH após a injeção da LG na isquemia (p<0,001). Níveis mais baixos de IL-6 e TNF-alfa foram associados com a infusão LG durante a isquemia. Níveis mais elevados dessas proteínas foram observados nos animais que receberam LG durante a reperfusão. CONCLUSÃO: A L-arginina protegeu o fígado contra a lesão de isquemia e reperfusão principalmente quando administrada durante a fase de isquemia.(AU)

Atividade antibacteriana de nanopartículas poliméricas doadoras de óxido nítricocontra Staphylococcus aureus e Escherichia coli

A mastite bovina é uma grave enfermidade veterinária que causa grande perda para a indústria de laticínios em todo o mundo. Ela é uma das principais doenças infecciosas, e é de difícil tratamento e controle. Além disso, o surgimento de bactérias multirresistentes que causam a mastite tem complicado o seu controle. O radical livre óxido nítrico (NO) é um potente agente antimicrobiano. Assim, o objetivo deste estudo foi sintetizar partículas poliméricas doadoras de NO, e avaliar a atividade antibacteriana contra cepas de Staphylococcus aureus (MBSA) e Escherichia coli (MBEC) isoladas de mastite bovina. Quinze isolados de MBSA e quinze de MBEC foram obtidos de vacas com mastite bovina subclínica e clínica. Partículas poliméricas biocompatíveis compostas de alginato/quitosana, ou quitosana/tripolifosfato de sódio (TPP), foram sintetizadas e utilizadas para encapsular o ácido mercaptosuccínico (MSA), que é uma molécula contendo tiol. A nitrosação de grupo tiol em partículas contendo MSA formaram as partículas S- nitroso-MSA, que são doadores de NO. A cinética de liberação das partículas de S- nitroso-MSA mostrou liberação de NO constante e controlada durante várias horas. A atividade antibacteriana das partículas liberadoras de NO foi avaliada pela incubação das nanopartículas com uma cepa de MBSA multirresistente, o qual é responsável por causar mastite bovina. Ensaios de atividade anti-biofilme na formação e em biofilmes maduros foram realizados utilizando as cepas de S. aureus e as partículas poliméricas de S-nitroso-MSA liberadoras de NO. A concentração mínima inibitória das partículas de S-nitroso-MSA-alginato/quitosana contra cepas de MBSA variou de 125 a 250 µg/mL. As mesmas nanopartículas apresentaram atividade anti-biofilme nas concentrações de 250 e 500 µg/mL para as cepas de MBSA. Os resultados indicam que o uso de partículas poliméricas doadoras de NO é uma interessante alternativa para combater a resistência bacteriana no tratamento e prevenção da mastite bovina.

Bovine mastitis is a serious veterinary disease that causes great loss to the dairy industry worldwide. It is a major infectious disease and is difficult to manage and control. Furthermore, emerging multidrug resistant bacteria that cause mastitis have complicated such management. The free radical nitric oxide (NO) is a potent antimicrobial agent. Thus, the aims of this study were to prepare and evaluate the antibacterial activity of nitric oxide-releasing polymeric particles against Staphylococcus aureus (MBSA) and Escherichia coli (MBEC), which were isolated from bovine mastitis. Fifteen MBSA isolates and fifteen MBEC were collected from subclinical and clinical bovine mastitis. Biocompatible polymeric particles composed of alginate/chitosan or chitosan/sodium tripolyphosphate (TPP) were prepared and used to encapsulate mercaptosuccinic acid (MSA), which is a thiol-containing molecule. Nitrosation of thiol groups of MSA-containing particles formed S-nitroso- MSA particles, which are NO donors. The NO release kinetics from the S-nitroso- MSA particles showed sustained and controlled NO release over several hours. The antibacterial activity of NO-releasing particles was evaluated by incubating the particles with an MBSA multi-resistant strain, which is responsible for bovine mastitis. Anti-biofilm activity assays on the formation and mature biofilms were performed using nitric oxide-releasing S-nitroso-MAS polymeric particles and S. aureus strains. The minimum inhibitory concentration for S-nitroso-MSA-alginate/chitosan particles against MBSA ranged from 125 g/mL to 250 g/mL. The same nanoparticles showed anti-biofilm activity at the concetrations of 250 e 500 µg/mL against MBSA strains. The results indicate that NO-releasing polymeric particles are an interesting approach to combating bacteria resistance in bovine mastitis treatment and prevention.

Methylene blue administration in the compound 48/80-induced anaphylactic shock: hemodynamic study in pigs / Administração de azul de metileno no choque anafilático induzido por composto 48/80: estudo hemodinâmico em suínos

PURPOSE: To verify if the methylene blue (MB) administration prevents and/or reverses the compound 48/80 (C48/80)-induced anaphylactic shock in pigs. METHODS: Female Dalland pigs were anesthetized and had the hemodynamic parameters recorded during the necessary time to administer some drugs and observe their effect. The animals were randomly assigned to one of the five groups: 1) control; 2) MB: the animals received a bolus injection of MB (2 mg/kg) followed by continuous infusion of MB (2.66 mg/Kg/h delivered by syringe infusion pump); 3) C48/80: the animals received a bolus injection of C48/80 (4 mg/kg); 4) C48/80+MB: the animals received a bolus injection of C48/80 (4 mg/kg) and 10 minutes after the C48/80 administration the animals received a bolus injection of MB (2 mg/kg) followed by continuous infusion of MB (2.66 mg/Kg/h delivered by syringe infusion pump); 5) MB+C48/80: the animals received a bolus injection of MB (2 mg/kg) and 3 minutes later they received a bolus injection of C48/80 (4 mg/kg). RESULTS: The intravenous infusion of MB alone caused no changes in the mean arterial pressure (MAP) showing that the administered MB dose was safe in this experimental model. The C48/80 was effective in producing experimental anaphylactic shock since it was observed a decrease in both MAP and cardiac output (CO) after its administration. The MB did not prevent or reverse the C48/80-induced anaphylactic shock in this model. In fact, the MAP of the animals with anaphylactic shock treated with MB decreased even more than the MAP of the animals from the C48/80 group. On the other hand, the C48/80-induced epidermal alterations disappeared after the MB infusion. CONCLUSION: Despite our data, the clinical manifestations improvement brings some optimism and does not allow excluding the MB as a possible therapeutic option in the anaphylactic shock.(AU)

OBJETIVO: Verificar se a administração de azul de metileno (AM) previne e/ou reverte o choque anafilático induzido por composto 48/80 (C48/80) em suínos. MÉTODOS: Porcos fêmeas Dalland foram anestesiados e tiveram os parâmetros hemodinâmicos registados durante o tempo necessário para administrar algumas drogas e observar seu efeito. Os animais foram aleatoriamente destribuídos em um dos cinco grupos: 1) controle, 2) AM: os animais receberam uma injeção em bolus de AM (2mg/kg), seguido de infusão contínua de AM (2,66mg/Kg /h por bomba de infusão de seringa); 3) C48/80: os animais receberam uma injeção em bolus de C48/80 (4mg/kg); 4) C48/80 + AM: os animais receberam uma injeção em bolus de C48/80 (4mg/kg) e 10 minutos após a administração de C48/80 os animais receberam uma injeção em bolus de AM (2mg/kg), seguido de infusão contínua de AM (2,66mg/kg/h por bomba de infusão de seringa); 5) AM+C48/80: os animais receberam uma injeção em bolus de AM (2mg/kg) e três minutos depois, receberam uma injeção em bolus de C48/80 (4mg/kg). RESULTADOS: A infusão intravenosa de AM não causou mudanças na pressão arterial média (PAM), mostrando que a dose de AM administrada foi segura neste modelo experimental. O C48/80 foi eficaz na indução do choque anafilático experimental, uma vez que foi observada redução na PAM e débito cardíaco (DC), após a sua administração. O AM não preveniu ou reverte o choque anafilático induzido por C48/80 neste modelo. Na verdade, a PAM dos animais com choque anafilático tratados com AM diminuiu mais do que o PAM dos animais do grupo C48/80. Por outro lado, as alterações epidérmicas induzidas pelo C48/80 desapareceu após a infusão do AM. CONCLUSÃO: Apesar dos resultados a melhora clínica das manifestações anafiláticas permite considerar a possibilidade do azul de metileno como opção terapêutica no tratamento do choque anafilático.(AU)

Effects of Rut-bpy (Cis-[Ru(bpy)2(SO3)(NO)]PF 6), a novel nitric oxide donor, in L-NAME-induced hypertension in rats / Efeitos do Rut-bpy (Cis-[Ru(bpy)2(SO3)(NO)]PF 6), um novo doador de óxido nítrico, na hipertensão induzida com L-NAME em ratos

PURPOSE: To evaluate the effect of Rut-bpy (Cis-[Ru(bpy)2(SO3)(NO)]PF 6), a novel nitric oxide donor in Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)-induced hypertensive rats. METHODS: Twenty-four male Wistar rats were randomly assigned to four groups (n=6), named according to the treatment applied (G1-Saline, G2-Rut-bpy, G3-L-NAME and G4-L-NAME+Rut-bpy). L-NAME (30 mg/Kg) was injected intraperitoneally 30 minutes before the administration of Rut-bpy (100 mg/Kg). Mean abdominal aorta arterial blood pressure (MAP) was continuously monitored. RESULTS: Mean arterial blood pressure (MAP) in G3 rats rose progressively, reaching 147±16 mmHg compared with 100±19 mm Hg in G1 rats (p<0.05). In G4 rats, treated with L-NAME+Rut-bpy, MAP reached 149+11 mm Hg while in G2 rats, treated with Rut-bpy, MAP values were 106±11 mm Hg. In G1 rats these values decreased progressively reaching 87+14 mm Hg after 30 minutes. An important finding was the maintenance of the MAP throughout the experiment in G2 rats. CONCLUSION: Rut-bpy does not decrease the MAP in L-Name induced hypertensive rats. However, when it is used in anesthetized hypotensive rats a stable blood pressure is obtained.(AU)

OBJETIVO: Avaliar o efeitos do Rut-bpy (Cis-[Ru (bpy)2(SO3)(NO)] PF6), um novo doador de óxido nítrico, em ratos hipertensos induzidos pelo éster metílico de N-nitro-L-arginina (L-NAME). MÉTODOS: Vinte e quatro ratos Wistar machos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos (n = 6), nomeados de acordo com o tratamento aplicado (G1-Salina, G2-Rut-bpy, G3-L-NAME e G4-L-NAME+Rut -bpy). L-NAME (30 mg / Kg) foi injetado por via intraperitoneal 30 minutos antes da administração de Rut-bpy (100 mg / kg). A pressão arterial média (PAM) da aorta abdominal foi monitorada continuamente. RESULTADOS: A pressão arterial média (PAM) em ratos do grupo G3 subiu progressivamente, chegando a 147 ±16 mm Hg, em comparação com 100 ±19 mm Hg em ratos do G1 (p <0,05). Em ratos G4, tratados com L-NAME + Rut-bpy, a PAM atingiu 149±11 milímetros de Hg, enquanto no G2 (ratos tratados com Rut bpy) os valores da PAM foram 106 ±11 mm Hg. No G1 esses valores decresceram progressivamente, atingindo 87±14 mm Hg após 30 minutos. Um achado importante foi a manutenção da PAM durante todo o experimento em ratos do grupo G2. CONCLUSÃO: O uso de Rut bpy não diminui a PAM em ratos hipertensos por L-NAME. No entanto, quando ele é usado em ratos anestesiados, hipotensos, uma pressão arterial estável é obtida.(AU)

Modelo in vitro para o estudo da resposta de macrófagos desafiados com Malassezia furfur ou Malassezia pachydermatis

As leveduras lipofílicas, Malassezia pahydermatis e Malassezia furfur, fazem parte do microbioma cutâneo, vivendo em uma relação comensal com os hospedeiros; mas, diante de fatores predisponentes podem assumir comportamento patogênico e causar graves infecções invasivas no homem, especialmente em neonatos prematuros submetidos à administração de nutrição parenteral suplementada com lipídios. Nas infecções, em particular naquelas invasivas, pouco se sabe a respeito da resposta imunológica inata ou adaptativa desencadeada pelas espécies de Malassezia. Sendo a fagocitose um importante mecanismo da resposta imune foi objetivo deste trabalho padronizar modelo de fagocitose in vitro por macrófagos da linhagem RAW 264.7 desafiados por M. furfur e M. pachydermatis, comparando-se o comportamento das duas espécies e avaliando-se a produção de óxido nítrico e citocinas durante o processo de fagocitose. Macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7 foram desafiados com cepas de M. furfur CBS-1878 e M. pachydermatis CBS-1696, nas razões de 5:1 e 2:1 (razão leveduras:macrófagos) em intervalos de leitura de 6h, 24h e 48h após os desafios, determinando-se os índices fagocíticos. Realizou-se nos mesmos intervalos de tempo, a dosagem de óxido nítrico por método colorimétrico e de citocinas pró- e anti-inflamatórias (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IFN- e TNF-) por citometria de fluxo. Os resultados mostraram maior índice fagocítico na razão de 5:1, tanto para M. pachydermatis quanto para M. furfur, no intervalo de 24 h. Foram observadas diferenças entre as espécies, verificando-se índices fagocíticos superiores quando os macrófagos foram desafiados com M. pachydermatis. Nas leituras de fagocitose às 48h, houve evasão das leveduras, detectando-se grande proliferação dos micro-organismos e morte de macrófagos, particularmente ante M. pachydermatis. Houve grandes variações na produção de óxido nítrico pelos macrófagos, nos diferentes intervalos de tempo, ante as duas espécies e dentre as citocinas pesquisadas nos sobrenadantes das culturas de macrófagos infectados com M. pachydermatis e M. furfur, apenas foram detectadas TNF- e IL-4, em que macrófagos infectados com M. furfur determinaram maior produção da citocina pró-inflamatória TNF- e com M. pachydermatis, aumento da produção da citocina anti-inflamatória IL-4. A ocorrência de fagocitose de M. furfur e M. pachydermatis por macrófagos in vitro e a presença de citocinas pró- e anti-inflamatórias reforçam o caráter dinâmico da relação destas leveduras com o hospedeiro.

Malassezia pahydermatis and Malassezia furfur are lipophilic yeasts of the cutaneous microbiome, living in an interface between pathogenic and commensal organisms. These organisms are occasionally responsible for serious invasive infections in humans, especially in preterm infants undergoing supplemental lipid supplementation. In invasive infections, little is known about the innate or adaptive immune response triggered by the Malassezia species. Since phagocytosis is an important mechanism mediating the adaptive immune response, it is important to be better clarified.. Our The aim of this research was to standardize phagocytosis model in vitro by RAW 264.7 lineage murine macrophages challenged by M. furfur and M. pachydermatis, comparing the behavior of the two species and oxide nitric and cytokine production resulting from the phagocytic process. Murine macrophages were challenged with CBS-1878 M. furfur and CBS-1696 M. pachydermatis in concentrations of 5:1 and 2:1 (yeasts:macrophages ratio) M. furfur in reading intervals of 6h, 24h and 48h following the challenges, to determine the phagocytic indexes. Evaluation of oxide nitric and pro- and anti-inflammatory cytokines (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IFN- and TNF-) concentrations were performed in the same intervals, respectively, by colorimetric method and flow cytometry. Results showed a higher phagocytic index at a 5:1 concentration and 24h interval, both for M. pachydermatis and M. furfur. Differences were observed between species: M. pachydermatis-infected macrophages had superior phagocytic indexes. Phagocytosis evaluation at 48h, showed yeast evasion, significant microorganisms proliferation and macrophage death, particularly by M. pachydermatis. Significant variations in the macrophage oxide nitric production were observed at the different time intervals in both species. Only TNF- and IL-4 cytokines were detected in the supernatant of M. pachydermatis and M. furfur macrophage-infected cultures. M. furfur-inoculated macrophages presented increased TNF- pro-inflammatory cytokine production, while M. pachydermatis-inoculated macrophages had increased IL-4 anti-inflammatory cytokine production. Macrophage phagocytosis of M. furfur and M. pachydermatis in vitro and the presence of pro- and anti-inflammatory cytokines reinforce the dynamic character of the relationship between these yeasts and the host.