Perfil proteico de oócitos caninos / Protein profile of canine oocytes

O presente estudo foi conduzido para caracterizaro proteoma de oócitos caninos. Oócitos foram coletados de 120 cadelas e apenas os COCs grau 1 foram selecionados para o cultivo in vitro. Após o cultivo, os oócitos foram submetidos à extração de proteínas. As proteínas foram digeridas com tripsina e analisadas por espectrometria de massa. Trinta e quatro proteínas foram identificadas nos oócitos caninos. Estas proteínas foram agrupadas em três categorias de acordo com a sua função biológica, molecular e localização celular. Quanto ao processo biológico, foram encontradas diversas proteínas envolvidas no ciclo celular, fertilização, regulação da transcrição e via de sinalização. A análise da ontologia do gene revelou alta porcentagem de proteínas envolvidas na atividade de ligação. Com base na análise da rede proteína-proteína usando a plataforma STRING, observou-se que a vimentina apresentou interações com as CASP3, CASP6, CASP7 e CASP8, envolvidos na apoptose. O componente de complemento C3, interagiu com receptores do complemento, como CR1 e CR2. A proteína de ligação retinol 4 interagiu com precursores de retinol. Actina esteve intimamente relacionada com as proteínas cofilinas 1e 2. A queratina 10 interagiu com a proteína CDK9 relacionada ao processo de sinalização celular. Essas proteínas são essenciais para o desenvolvimento completo de oócitos e fertilização. O presente estudo contém a primeira descrição da composição proteica dos oócitos caninos. A construção de bibliotecas de proteínas de oócitos, para cada espécie, estabelecerá as bases para a compreensão e o mapeamento dos eventos cruciais que definem a competência dos oócitos.

The present study was conducted to characterize the major proteome of canine oocytes. Ovaries were collected from 120 bitches and only Grade 1 COCs were selected for in vitro culture. After in vitro maturation, oocytes were subjected to protein extraction. Proteins were then trypsin-digested and analyzed by tandem mass spectrometry. Thirty-four proteins were identified in the canine oocytes. These proteins have been grouped into three different categories according to their biological, molecular function and cellular localization. With regard to biological process, we found many proteins involved in cell cycle, fertilization, transcription regulation and signaling pathway. The gene ontology analysis also revealeda high percentage of proteins involved in binding activity. Based on protein–protein network analysis using STRING platform, we found that vimentin presents links with CASP3, CASP6, CASP7 and CASP8, which are involved in apoptosis. Complement component C3, interacted with complement receptors, such as CR1 and CR2. Retinol-binding protein 4 interacted with retinol precursors. Actin potentially interacted with cofil in protein 1 and 2. Keratin 10, in turn, had interacted with CDK9, which are involved in pathway signaling. These proteins are essentials for the complete oocyte development and fertilization. In summary, the present study contains the first description of the main protein composition of canine oocytes. Construction of libraries of oocyte proteins, for each especies, will set the foundations for understanding and mapping the crucial events that define oocyte competence.

Perfil proteico de oócitos caninos / Protein profile of canine oocytes

O presente estudo foi conduzido para caracterizaro proteoma de oócitos caninos. Oócitos foram coletados de 120 cadelas e apenas os COCs grau 1 foram selecionados para o cultivo in vitro. Após o cultivo, os oócitos foram submetidos à extração de proteínas. As proteínas foram digeridas com tripsina e analisadas por espectrometria de massa. Trinta e quatro proteínas foram identificadas nos oócitos caninos. Estas proteínas foram agrupadas em três categorias de acordo com a sua função biológica, molecular e localização celular. Quanto ao processo biológico, foram encontradas diversas proteínas envolvidas no ciclo celular, fertilização, regulação da transcrição e via de sinalização. A análise da ontologia do gene revelou alta porcentagem de proteínas envolvidas na atividade de ligação. Com base na análise da rede proteína-proteína usando a plataforma STRING, observou-se que a vimentina apresentou interações com as CASP3, CASP6, CASP7 e CASP8, envolvidos na apoptose. O componente de complemento C3, interagiu com receptores do complemento, como CR1 e CR2. A proteína de ligação retinol 4 interagiu com precursores de retinol. Actina esteve intimamente relacionada com as proteínas cofilinas 1e 2. A queratina 10 interagiu com a proteína CDK9 relacionada ao processo de sinalização celular. Essas proteínas são essenciais para o desenvolvimento completo de oócitos e fertilização. O presente estudo contém a primeira descrição da composição proteica dos oócitos caninos. A construção de bibliotecas de proteínas de oócitos, para cada espécie, estabelecerá as bases para a compreensão e o mapeamento dos eventos cruciais que definem a competência dos oócitos.(AU)

The present study was conducted to characterize the major proteome of canine oocytes. Ovaries were collected from 120 bitches and only Grade 1 COCs were selected for in vitro culture. After in vitro maturation, oocytes were subjected to protein extraction. Proteins were then trypsin-digested and analyzed by tandem mass spectrometry. Thirty-four proteins were identified in the canine oocytes. These proteins have been grouped into three different categories according to their biological, molecular function and cellular localization. With regard to biological process, we found many proteins involved in cell cycle, fertilization, transcription regulation and signaling pathway. The gene ontology analysis also revealeda high percentage of proteins involved in binding activity. Based on protein–protein network analysis using STRING platform, we found that vimentin presents links with CASP3, CASP6, CASP7 and CASP8, which are involved in apoptosis. Complement component C3, interacted with complement receptors, such as CR1 and CR2. Retinol-binding protein 4 interacted with retinol precursors. Actin potentially interacted with cofil in protein 1 and 2. Keratin 10, in turn, had interacted with CDK9, which are involved in pathway signaling. These proteins are essentials for the complete oocyte development and fertilization. In summary, the present study contains the first description of the main protein composition of canine oocytes. Construction of libraries of oocyte proteins, for each especies, will set the foundations for understanding and mapping the crucial events that define oocyte competence.(AU)

The role of Kisspeptin in bovine in vitro embryo production / Efeito da Kisspeptina na produção in vitro de embriões bovinos

The aim of this study was to investigate the effect of Kisspeptin (Kp) on the medium used in different stages of in vitro production of bovine embryo (IVEP), evaluating cleavage (CR) and blastocyst (BR) rates. The study was divided into three experiments that analyzed, respectively, the action of Kp on in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) of bovine embryos. In experiment 1, the oocytes were matured in IVM medium and distributed into the following treatments: maturation (IVM Control, n = 102), maturation with addition of 10-7 M Kp (Kp 10-7 IVM, n = 90), and hormone-free maturation luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) with the addition of 10-7M Kp (No hormones + Kp 10-7, n = 84), following maturation to normal stages of IVEP. In experiment 2, the oocytes were fertilized in IVF medium, in the following treatments: TALP-FERT without Kp (Control IVF, n = 103) and TALP-FERT with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7 IVF, n = 119), usually following the other steps. Finally, in the third experiment, the oocytes passed through all phases and were divided into IVC in two treatments: SOF medium without Kp (Control IVC, n = 109) and SOF medium with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7, N = 106). The data were analyzed by PROC GLIMMIX of the SAS program. In experiment 1, the means of CR and BR were similar (P > 0.05) between treatments (IVM Control76.47% and 37.25%, Kp 10-7 MIV80% and 33.33%, and No hormones + Kp 10-770.24% and 30.95%, respectively). In experiment 2, the means of CR were similar for the IVF Control and Kp 10-7 IVF groups (P > 0.05), 76.70% and 86.55% respectively. But, the mean of the BR of the group Kp 10-7 IVF was 38.66%, which was higher (P 0.05) were similar between the IVC Control and Kp 10-7 IVC groups (CR 83.50% and 78.30%, and BR 26.60% and 23.60%, respectively)...

Objetivou-se com esse estudoinvestigar o efeito da Kisspeptina (Kp) nos meios base utilizados nas etapas da Produção in vitro de Embriões (PIVE) bovinos, avaliando as taxas de clivagem (TC) e blastocistos (TB). O estudo foi dividido em três experimentos, sendo respectivamente analisado em cada um a ação da Kp na maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. No experimento 1 os oócitos foram maturados em meio base MIV, distribuídos nos seguintes tratamentos: maturação (Controle MIV, n=102), maturação com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 MIV, n=90) e maturação sem hormônios LH e FSH com adição de 10-7M de Kp-10 (Sem hormônios + Kp 10-7, n=84), seguindo após a maturação para as etapas normais da PIVE. No experimento 2 os oócitos foram fecundados em meio base da FIV, nos seguintes tratamentos:TALP-FERT sem Kp (Controle FIV, n = 103) e TALP-FERT com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 FIV, n = 119), seguindo normalmente pelas outras etapas. Finalmente, no terceiro experimento os oócitos passaram por todas as fases e foram divididos no CIV em 2 tratamentos: meio SOF sem Kp (Controle CIV, n = 109) e meio SOF com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 3, n = 106). Os dados foram analisados pelo PROC GLIMMIX do programa SAS. No experimento 1 as médias das TC e TB foram semelhantes (P > 0,05) entre os tratamentos Controle MIV 76,47% e 37,25%, Kp 10-7 MIV 80% e 33,33% e Sem hormônios + Kp 10- 7 70,24% e 30,95%, respectivamente. No experimento 2 as médias das TC foram semelhantes para os grupos Controle FIV e Kp 10-7 FIV (P > 0,05), sendo 76,70% e 86,55%, respectivamente. Porém, a média da TB do grupo Kp 10-7 FIV 38,66%, foi superior (P 0,05) também foram similares entre os tratamentos Controle CIV e Kp 10-7 CIV...

The role of Kisspeptin in bovine in vitro embryo production / Efeito da Kisspeptina na produção in vitro de embriões bovinos

The aim of this study was to investigate the effect of Kisspeptin (Kp) on the medium used in different stages of in vitro production of bovine embryo (IVEP), evaluating cleavage (CR) and blastocyst (BR) rates. The study was divided into three experiments that analyzed, respectively, the action of Kp on in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) of bovine embryos. In experiment 1, the oocytes were matured in IVM medium and distributed into the following treatments: maturation (IVM Control, n = 102), maturation with addition of 10-7 M Kp (Kp 10-7 IVM, n = 90), and hormone-free maturation luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) with the addition of 10-7M Kp (No hormones + Kp 10-7, n = 84), following maturation to normal stages of IVEP. In experiment 2, the oocytes were fertilized in IVF medium, in the following treatments: TALP-FERT without Kp (Control IVF, n = 103) and TALP-FERT with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7 IVF, n = 119), usually following the other steps. Finally, in the third experiment, the oocytes passed through all phases and were divided into IVC in two treatments: SOF medium without Kp (Control IVC, n = 109) and SOF medium with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7, N = 106). The data were analyzed by PROC GLIMMIX of the SAS program. In experiment 1, the means of CR and BR were similar (P > 0.05) between treatments (IVM Control76.47% and 37.25%, Kp 10-7 MIV80% and 33.33%, and No hormones + Kp 10-770.24% and 30.95%, respectively). In experiment 2, the means of CR were similar for the IVF Control and Kp 10-7 IVF groups (P > 0.05), 76.70% and 86.55% respectively. But, the mean of the BR of the group Kp 10-7 IVF was 38.66%, which was higher (P < 0.05) than that of the FIV Control group, which was 31.07%. In the third experiment, the means of CR and BR (P > 0.05) were similar between the IVC Control and Kp 10-7 IVC groups (CR 83.50% and 78.30%, and BR 26.60% and 23.60%, respectively)...(AU)

Objetivou-se com esse estudoinvestigar o efeito da Kisspeptina (Kp) nos meios base utilizados nas etapas da Produção in vitro de Embriões (PIVE) bovinos, avaliando as taxas de clivagem (TC) e blastocistos (TB). O estudo foi dividido em três experimentos, sendo respectivamente analisado em cada um a ação da Kp na maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. No experimento 1 os oócitos foram maturados em meio base MIV, distribuídos nos seguintes tratamentos: maturação (Controle MIV, n=102), maturação com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 MIV, n=90) e maturação sem hormônios LH e FSH com adição de 10-7M de Kp-10 (Sem hormônios + Kp 10-7, n=84), seguindo após a maturação para as etapas normais da PIVE. No experimento 2 os oócitos foram fecundados em meio base da FIV, nos seguintes tratamentos:TALP-FERT sem Kp (Controle FIV, n = 103) e TALP-FERT com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 FIV, n = 119), seguindo normalmente pelas outras etapas. Finalmente, no terceiro experimento os oócitos passaram por todas as fases e foram divididos no CIV em 2 tratamentos: meio SOF sem Kp (Controle CIV, n = 109) e meio SOF com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 3, n = 106). Os dados foram analisados pelo PROC GLIMMIX do programa SAS. No experimento 1 as médias das TC e TB foram semelhantes (P > 0,05) entre os tratamentos Controle MIV 76,47% e 37,25%, Kp 10-7 MIV 80% e 33,33% e Sem hormônios + Kp 10- 7 70,24% e 30,95%, respectivamente. No experimento 2 as médias das TC foram semelhantes para os grupos Controle FIV e Kp 10-7 FIV (P > 0,05), sendo 76,70% e 86,55%, respectivamente. Porém, a média da TB do grupo Kp 10-7 FIV 38,66%, foi superior (P < 0,05) ao grupo controle FIV 31,07%. No terceiro experimento as médias das TC e TB (P > 0,05) também foram similares entre os tratamentos Controle CIV e Kp 10-7 CIV...(AU)

Avaliação da maturação nuclear de oócitos bovinos submetidos a três diferentes sistemas de incubação / Evaluation of nuclear maturation of bovine oocytes submitted to three different incubation systems

This study aimed to evaluate three different incubation systems in nuclear maturation of bovine oocytes.Follicles of 2 to 8 mm in diameter were aspirated for obtaining cumulus-oocyte complexes (COCs). Thereafter,COCs were subjected to in vitro maturation (IVM) in TCM-199 medium supplemented at 38.5 °C for 23 h indifferent incubation systems: bench incubator with high oxygen (20% O2 in air), bench incubator with lowoxygen (5% O2) and portable incubator with low oxygen. After IVM, cumulus cells were removed and oocyteswere stained with Hoechst 33342. The slides were analyzed by a fluorescence microscope and the oocytes wereclassified into: degenerated (DG), metaphase I (MI) and metaphase II (MII). No difference (P > 0.05) wasobserved among the rates of DG, MI and MII for the different incubation systems. Therefore, the use of portableincubation system is a viable alternative for in vitro maturation of bovine oocytes.(AU)

Avaliação da maturação nuclear de oócitos bovinos submetidos a três diferentes sistemas de incubação / Evaluation of nuclear maturation of bovine oocytes submitted to three different incubation systems

This study aimed to evaluate three different incubation systems in nuclear maturation of bovine oocytes.Follicles of 2 to 8 mm in diameter were aspirated for obtaining cumulus-oocyte complexes (COCs). Thereafter,COCs were subjected to in vitro maturation (IVM) in TCM-199 medium supplemented at 38.5 °C for 23 h indifferent incubation systems: bench incubator with high oxygen (20% O2 in air), bench incubator with lowoxygen (5% O2) and portable incubator with low oxygen. After IVM, cumulus cells were removed and oocyteswere stained with Hoechst 33342. The slides were analyzed by a fluorescence microscope and the oocytes wereclassified into: degenerated (DG), metaphase I (MI) and metaphase II (MII). No difference (P > 0.05) wasobserved among the rates of DG, MI and MII for the different incubation systems. Therefore, the use of portableincubation system is a viable alternative for in vitro maturation of bovine oocytes.

EFEITO DE DIFERENTES SISTEMAS DE MATURAÇÃO NO ACÚMULO DE LIPÍDIOS EM OVÓCITOS BOVINOS

Trabalhos recentes têm demonstrado que a maturação in vitro (MIV) acarreta um maior acúmulo de lipídios no ovócito, o que se reflete na qualidade dos embriões produzidos. Esse acúmulo pode ser devido a retirada prematura dos ovócitos dos folículos ou ao ambiente in vitro propriamente dito, já que não ocorre quando os ovócitos são maturados in vivo. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de três sistema de maturação: in vitro (MatV), in vivo (MatS) e Transferência intrafolicular de ovócitos imaturos (TIFOI; MatT), no acúmulo de lipídios em ovócitos bovinos. Os ovócitos foram maturados, em seus respectivos sistemas de maturação, por vinte e duas horas e, apenas os ovócitos com a presença do corpúsculo polar foram utilizados para as análises. A presença e quantificação de lipídios foi realizada pela coloração com Bodipy 493/503 em Microsocopia Confocal e por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET). Foi também avaliada a expressão de genes relacionados ao metabolismo de lipídios por PCR em tempo real (qPCR) (Acyl-CoA Synthetase Short Chain Family Member 2, ACSS2; Fatty Acid Elongase 1, ELOVL1; Fatty Acid Binding Protein 3, FABP3). Dados relativos à cinética de maturação nuclear, quantificação do acúmulo de gotas lipídicas e expressão gênica, foram analisados pelo teste Qui-quadrado, ANOVA (GLIMMIX) e KruskalWallis, respectivamente. Para todas as análises um nível de significância de 5% (p<0,05%) foi considerado. A média da área ocupada pelos lipídios nos ovócitos imaturos (IMA; 13% ±1.9) foi similar (p>0,05%) aos ovócitos maturados in vivo (MatS= 16% ± 1,7 e MatT= 12% ± 1,9). Entretanto, nos ovócitos maturados in vitro (MatV), houve um aumento no acúmulo de lipídios (24% ±1,9) durante a maturação sendo maior do que nos outros grupos (p<0,001). Na avaliação ultraestrutural os ovócitos MatV apresentaram uma maior presença de lipídios. Contudo, todos os grupos foram semelhantes quanto a organização dos grânulos corticais e mitocôndrias. A expressão dos genes ACSS2, ELOVL1 e FABP3 foram semelhantes entre os grupos MatS e MatT (p > 0,05%), contudo, os ovócitos MatS também foram semelhantes (p > 0,05%) aos MatV. Pela primeira vez, foi demonstrado que ovócitos maturados pela TIFOI são semelhantes aos ovócitos maturados in vivo, quanto ao acúmulo de lipídios, o que implica na superior qualidade quando comparado com os in vitro. Este novo método de maturação abre novas possibilidades para as biotecnologias que necessitam da maturação de ovócitos como a PIVE, criopreservação de ovócitos e embriões, clonagem e transgenia.

We aimed to evaluate the effects of three maturation systems: in vitro (MatV), in vivo (MatS), and intrafollicular transfer of immature oocytes (IFIOT; MatT), on the accumulation of lipid droplets in bovine oocytes. Lipid evaluations were performed by Confocal Microscopy (Bodipy 493/503) and Transmission Electron Microscopy (TEM). The expression of genes related to lipid metabolism (Acyl-CoA Synthetase Short Chain Family Member 2, ACSS2; Fatty Acid Elongase 1, ELOVL1; Fatty Acid Binding Protein 3, FABP3) was quantified by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). The area occupied by lipids of IMA groups (13% ± 1.9) was similar (p > 0.05%) to those in vivo (MatS = 16% ± 1.7 and MatT = 12% ± 1.9). However, lipids increased in the oocytes of the MatV group (24% ± 1.9), with this increase being higher than that in the other groups (p < 0.001). In the ultrastructural evaluations, MatV oocytes also showed the highest lipid content. The expression of ELOVL1 and FABP3 were similar for MatS and IFIOT groups (p > 0.05%). However, transcript level for ACSS2 gene was lower in IFIOT oocytes than in MatV oocytes. Our results indicated, for the first time, that oocytes matured by IFIOT are similar to those matured in vivo, regarding lipid accumulation, which indicates better quality when compared to in vitro.

Effect of transport temperature of ovaries on in vitro maturation of canine oocytes collected in different stages of the estrous cycle / Influência da temperatura de transporte de ovários na maturação in vitro de oócitos caninos coletados em diferentes estágios do ciclo estral

This study evaluated the influence of estrous cycle stage and transport temperature of ovaries on in vitro maturation of canine oocytes. The bitches were categorized into two groups based on stage of estrus cycle: diestrus or anestrus. One ovary of each pair collected was transported in saline solution at 4°C while the other was transported at 37°C. Thus, ovarian tissue was sliced in PBS to release cumulus oocyte complexes (COCs). A total of 345 COCs (n = 186 oocytes from ovaries of bitches in anestrus and 159 in diestrus) were cultivated in TCM 199 supplemented with HEPES, sodium pyruvate, cysteine, follicle stimulating hormone (FSH), human chorionic gonadotropin (hCG), estrogen (E2) and epidermal growth factor (EGF). After 72h of maturation, the COCs were denuded, fixed and stained to assess nuclear maturation. The Fisher test was applied to examine the differences between the groups. The significance level adopted was 0.05. The oocytes obtained from the ovaries from bitches in diestrus transported at 4°C shown increased frequency of oocytes in metaphase II stage than those maintained at 37°C (p 0.01). Similarly, there was increased frequency of oocytes in metaphase II (11.1%) stage from the ovaries of bitches in anestrus and transported at 4°C, than those maintained at 37°C (p 0.05). It was concluded that transport temperature influences the results of canine oocyte viability and in vitro maturation, regardless of reproductive stage of the female.(AU)

Foi avaliada a influencia do ciclo estral e temperatura de transporte de ovários na maturação in vitro de oócitos caninos. As cadelas foram categorizadas em dois grupos baseados no estagio do ciclo estral anestro ou diestro. Um ovário por par coletado foi transportado em solução fisiológica 0,9% a 4°C enquanto o outro foi transportado a 37°C. Então, os ovários foram seccionados em PBS para a liberação dos complexos cumulus oocito (COCs). Um total de 345 COCs (n = 186 oocitos obtidos de cadelas em anestro e 159 em diestro) foi cultivado em TCM 199 suplementado com HEPES, piruvato de sódio, cisteina, hormônio folículo estimulante (FSH), gonadotrofina coriônica humana (hCG), estrógeno (E2) e fator de crescimento epidermal (EGF). Apos 72h de maturação, os COCs foram desnudados, fixados e corados para avaliação da maturação nuclear. O teste de Fisher foi utilizado para avaliar as diferenças entre os grupos. O nível de significância adotado foi de 0,05. Os oócitos obtidos de cadelas em diestro transportados a 4°C apresentaram maior frequência de oócitos no estagio de metáfase II (21,1%) que os mantidos na temperatura de 37°C (p 0,01). De forma similar, houve maior frequência de oócitos nos estágios de metáfase II (11,2%) nos ovários obtidos de cadelas em anestro e transportados a 4°C que nos ovários mantidos a 37°C (p 0,05). Concluiu-se que a temperatura de transporte influencia os resultados de viabilidade oocitária canina e a maturação in vitro, independentemente do estagio reprodutivo da fêmea.(AU)

EFEITO DA ANGIOTENSINA (1-7) NA MATURAÇÃO E EMBRIÕES IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS

A produção in vitro (PIV) está inclusa na terceira geração das tecnologias de reprodução assistida e consiste na interação entre o espermatozoide e o oócito fora do trato reprodutivo da fêmea, com a formação de um novo indivíduo. Entretanto vários fatores intraovarianos que regulam as etapas de desenvolvimento, maturação folicular e ovulação são ainda desconhecidos e podem ser responsáveis por alguns insucessos de tais biotécnicas. Os peptídeos do Sistema Renina-Angiotensina, tais como a angiotensina (1-7), que já tiveram sua presença, produção e alguns efeitos descritos nos ovários) mas que apresentam ainda funções pouco esclarecidas. Novas perspectivas sobre os fatores que influenciam a qualidade dos embriões produzidos e os mecanismos envolvidos na maturação a partir da adição de diferentes concentrações de Angiotensina (1-7) na PIV da espécie bovina. Folículos ovarianos foram aspirados e os CCOs foram distribuídos entre quatro tratamentos: Controle (C), 10-1 (T1), 10-3 (T2), 10-5 M (T3) de angiotensina (1-7) no meio de maturação in vitro para verificar os estágios de meiose e desenvolvimento embrionário. A adição do peptídeo angiotensina (1-7) no meio de maturação in vitro não proporcionou taxas superiores de metáfase II em relação ao grupo Controle. No desenvolvimento embrionário, a angiotensina (1-7) não melhorou a clivagem nem a quantidade de embriões totais, o grupo 10-1µM proporcionou quantitativo superior de blastocistos iniciais. No entanto, mais análises são necessárias para elucidar as ações realizadas pela angiotensina (1-7) na produção in vitro de embriões bovinos.

In vitro production (IVP) is included in the third generation of assisted reproduction technologies and consists of the interaction between sperm and oocyte outside the female reproductive tract, with the formation of a new individual. However, several intraovarian factors that regulate the stages of development, follicular maturation and ovulation are still unknown and may be responsible for some failures of such biotechniques. Renin-Angiotensin System peptides, such as angiotensin (1-7), which have had their presence, production and some effects described in the ovaries) but still have poorly understood functions. New perspectives on the factors that influence the quality of the embryos produced and the mechanisms involved in the maturation from the addition of different angiotensin (1-7) concentrations in the bovine IVP. Ovarian follicles were aspirated and the COCs were distributed among four treatments: Control (C), 10-1 (T1), 10-3 (T2), 10-5 M (T3) angiotensin (1-7) in the maturation medium. in vitro to verify the stages of meiosis and embryonic development. The addition of angiotensin peptide (1-7) in the in vitro maturation medium did not provide higher metaphase II rates than the Control group. In embryonic development, angiotensin (1-7) did not improve cleavage or the amount of total embryos, the 10-1µM group provided superior amount of initial blastocysts. However, further analysis is needed to elucidate the actions performed by angiotensin (1-7) in the in vitro production of bovine embryos.

UTILIZAÇÃO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Um dos aspectos relevantes a se considerar para o sucesso durante a produção in vitro (PIV) de embriões é a constituição dos meios que compõem as etapas da biotecnologia reprodutiva. Os meios precisam suprir as necessidades metabólicas tanto dos gametas, durante a maturação oocitária e capacitação espermática, quanto do embrião durante as primeiras divisões celulares. A maior parte dos protocolos de PIV utiliza algum soro sanguíneo na composição dos meios como fonte de hormônios, proteínas, fatores de crescimento e nutrientes. Por outro lado, o soro contém citocinas, vitaminas e muitas outras substâncias que podem afetar a maturação, a fertilização e o desenvolvimento embrionário. Diversos trabalhos vêm reportando a utilização de Plasma Rico em Plaquetas (PRP) como alternativa para utilização de soros fetais durante o cultivo de células, principalmente de células tronco. Outros estudos demonstraram que o PRP está repleto de fatores de crescimento, como FGF, TGF, PDGF, IGF e EGF, bem como fatores de ligação como fibrinogênio e serotonina, vitais para a cultura celular e foliculogênese. Portanto, este trabalho tem por objetivo avaliar a utilização de PRP em substituição ao soro fetal bovino (SFB) durante a maturação de oócitos utilizados na produção in vitro de embriões bovinos. Os complexos cúmulos-oócitos (CCOs) foram distribuídos nos seguintes grupos experimentais durante a maturação in vitro (MIV): Grupo G1 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP); Grupo G2 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP mais 5% de SFB); Grupo G3 (Meio de MIV com adição de 5% de SFB); e grupo G4 (Meio de MIV sem adição de PRP e/ou SFB); . Após 20 horas de maturação, os CCOs foram passados para a placa de fecundação contendo o meio TALP FERT livre de soros. Aproximadamente 24 horas após a fertilização, os prováveis zigotos foram transferidos para gotas com meio SOF (Synthetic fluid oviduct) contendo 10% de SFB. foram avaliadas as taxas de clivagem e formação de blastocistos nos dias 2 e 7, do desenvolvimento embrionário, respectivamente. Também foi avaliada a qualidade dos CCOs maturados a partir da análise de expressão gênica de alguns marcadores genéticos. Os resultados demonstraram que não houveram diferenças significativas em relação aos grupos experimentais no tocante a taxas de produção de embriões (tanto nas primeiras clivagens quanto na formação de blastocistos) evidenciando que o PRP pode se tornar uma alternativa mais barata na PIVE em comparação ao SFB.

One of the relevant aspects to be considered for success during the in vitro production (IVP) of embryos is the constitution of the means that make up the stages of reproductive biotechnology. The media must meet the metabolic needs of both gametes, during oocyte maturation and sperm formation, and of the embryo during the first cell divisions. Most IVP protocols use some blood serum in the composition of the media as a source of hormones, proteins, growth factors, and nutrients. On the other hand, the serum contains cytokines, vitamins and many other substances that can affect maturation, fertilization, and embryonic development. Several studies have reported the use of Platelet Rich Plasma (PRP) as an alternative to the use of fetal sera during cell culture, mainly stem cells. Other studies have shown that PRP is full of growth factors, such as FGF, TGF, PDGF, IGF, and EGF, as well as binding factors such as fibrinogen and serotonin, which are vital for cell culture and folliculogenesis. Therefore, this work aims to evaluate the use of PRP to replace fetal bovine serum (SFB) during the maturation of oocytes used in the in vitro production of bovine embryos. Cumulus-oocyte complexes (CCOs) were distributed in the following experimental groups during in vitro maturation (IVM): Group G1 (IVM medium with addition of 5% PRP); Group G2 (MIV medium with addition of 5% PRP plus 5% SFB); Group G3 (MIV medium with addition of 5% SFB); and group G4 (MIV medium without addition of PRP and/or SFB). After 20 hours of maturation, the CCOs were passed to the fertilization plate containing the serum-free TALP FERT medium. Approximately 24 hours after fertilization, the probable zygotes were transferred to drops with SOF (Synthetic fluid oviduct) medium containing 10% SFB. the rates of cleavage and blastocyst formation were evaluated on days 2 and 7, of embryonic development, respectively. The quality of matured CCOs was also evaluated from the analysis of gene expression of some genetic markers. The results demonstrated that there were no significant differences in relation to the experimental groups regarding embryo production rates (both in the first cleavages and in the formation of blastocysts), showing that PRP can become a cheaper alternative in PIVE compared to SFB

The seasonal and ovarian status effects on in vitro production of domestic cat embryos between Equator and Tropic of Capricorn / Efeitos da sazonalidade e da condição ovariana sobre a produção in vitro de embriões de gatos domésticos em uma região entre o Equador e o Trópico de Capricórnio

From the Tropic of Capricorn to Equator, the seasonality of domestic cat is known to be absent, i.e., these animals are considered non-seasonal breeders at these regions. We hypothesized that this particularity might have some influence on in vitro embryo production. The aim of this experiment was to determine the percentage of cleavage and morulae and blastocyst formation produced from oocytes recovered from queen ovaries of three distinct status - follicular, luteal or inactive - during two different reproductive seasons experienced by cats in southeast of Brazil (22°53'09" S and 48°26'42" W) - non breeding season (NBS), comprehending January to March; and breeding season (BS), August to October. Thirty queens were neutered. [...] During NBS, from a total of 272 (inactive), 162 (luteal) and 134 (follicular) fertilized oocytes, the percentage of cleaved zygotes, morulae and blastocysts derived from inactive ovaries were 24.63, 16.54 and 8.09 respectively; for those derived from luteal ovaries, the percentage was 21.6, 12.96 and 8.64, and for those from follicular ovaries, they were 24.62, 16.41 and 8.21. Considering BS, from a total of 102 (inactive), 198 (luteal) and 86 (follicular) fertilized oocytes, the relative frequency (%) of cleaved zygotes, morulae and blastocysts derived from inactive ovaries were 64.7, 41.17 and 23.53 respectively; for those derived from luteal ovaries, the percentage was 64.14, 40.41 and 23.73, and for those from follicular ovaries, they were 63.95, 39.54 and 24.41. The results of this experiment demonstrate that no statistically significant difference (P<0.05) was verified in the frequency of cleaved embryos and morulae and blastocyst formation when comparing the three ovarian conditions in the same season. However the breeding season presented better results considering cleavage and morulae and blastocyst formation.(AU)

Do Trópico de Capricórnio ao Equador, sabe-se que a sazonalidade no gato domestico é ausente, i.e., estes animais são considerados reprodutores não sazonais nestas regiões. [...] O objetivo deste experimento foi determinar a porcentagem de clivagem e formação de mórulas e blastocistos produzidos a partir de oócitos recuperados de ovários de gatas em três condições - folicular, lútea ou inativa - durante duas estações reprodutivas pelas quais gatas passam na região sudeste do Brasil (22°53'09" S e 48°26'42" O) - estação não reprodutiva (ENR), que compreende os meses de janeiro a março; e estação reprodutiva (ER), agosto à outubro. Trinta gatas foram castradas. [...] Durante a ENR, de um total de 272 (inativo), 162 (lútea) e 134 (folicular) oócitos fertilizados, a porcentagem de clivagem de zigotos, formação de mórulas e de blastocistos derivados de ovários inativos foi 24,63, 16,54 e 8,09 respectivamente; para aqueles oriundos de ovários na condição lútea, a porcentagem foi de 21,6, 12,96 e 8,64, e para aqueles provenientes de ovários na fase folicular, foi de 24,62, 16,41 e 8,21. Considerando a ER, de um total de 102 (inativo), 198 (lútea) e 86 (folicular) oócitos fertilizados, a frequência relativa (%) de zigotos clivados, mórulas e blastocistos derivados de ovários na condição inativa foi de 64,7, 41,17 e 23,53 respectivamente; para aqueles oriundos de ovários na condição lútea, a porcentagem foi de 64,14, 40,41 e 23,73, e para aqueles provenientes de ovários na fase folicular, foi de 63,95, 39,54 e 24,41. Os resultados deste experimento demonstraram que não houve diferença estatística significante (P < 0.05) na frequência de embriões clivados e na formação de mórulas e blastocistos quando comparadas as três condições ovarianas dentro da mesma estação. Entretanto, a ER apresentou resultados melhores considerando as taxas de clivagem e formação de mórula e de blastocisto se comparada à ENR.(AU)

Efeito do fator de crescimento epidermal (EGF) na maturação in vitro de oócitos caninos / Effect of epidermal growth factor (EGF) on in vitro maturation of canine oocyte

Este trabalho leve o objetivo de avaliar a influência do EGF na maturação in vitro (MIV) de cadelas. Realizou-se o transporte dos ovários em solução de cloreto de sódio 0,9%, que foram seccionados em solução salina fosfato temponado (PBS) e os complexos cumulus oócitos (COCs) selecionados em meio de cultura de tecidos (TCM) 199 suplementado com HEPES. Foram coletados 405 oócitos grau 1 de cadelas em anestro e diestro. Os oocitos provenientes das duas fases do ciclo estral foram submetidos a dois tratamentos: meio com adição de 10ng/mL do fator de crescimento epidermal (EGF) (T) e meio sem suplementação (C). Depois de 72 horas de maturação, os COCs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos dos ovários da fase de diestro do grupo T demonstraram maior porcentagem (18,8%) de oócitos no estágio de metáfase II (M-II), em relação ao grupo C (1,3%) (p < 0,01). Nos oócitos obtidos da fase de anestro houve diferença (p < 0,05) entre os grupos, observando-se menor parcela (4,1%) de oócitos no estágio de vesícula germinativa (VG) no grupo T, quando comparado ao grupo C (16,1%). Comparando-se as diferentes fases reprodutivas, em meios suplementados com EGF, foi observada diferença (p < 0,05) apenas nos oócitos obtidos da fase de diestro em relação ao estágio de M-II. Dessa maneira, a suplementação no meio de maturação na concentração de 10 ηg/mL, neste estudo, exerceu influência positiva apenas na MIV de oócitos caninos oriundos da fase de diestro, incrementando os índices de M-II nessa espécie.(AU)

This work aimed to evaluate the influence of EGF on canine oocyte in vitro maturation (IVM). We carried out the transport of the ovaries in sodium chloride 0.9% solution, which were cut into phosphate-buffered saline (PBS) and the cumulus oocyte complexes (COCs) selected in tissue culture medium (TCM), supplemented with 199 HEPES. A total of 405 grade 1 oocytes were collected from bitches in anestrus and diestrus. Oocytes from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium with addition of 10 ηg/mL epidermal growth factor (EGF) (T) and medium without supplementation (C). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the ovaries of the diestrus phase of the T group demonstrated higher percentage (18.8%) of oocytes at metaphase II stage (M-II) than C group (1.3%) (p < 0.01). The oocytes from anestrus phase demonstrated difference (p < 0.05) between the groups, observing smaller proportion (4.1%) of oocytes at the stage of germinal vesicle (GV) in group T compared to group C (16.1%). Comparing the different reproductive status in media supplemented with EGF difference (p < 0.05) was observed only in oocytes diestrus phase relative to the stage of M-II. Thus, supplementation on maturation medium at a concentration of 10 ηg/mL of EGF in this study had positive influence only on IVM of canine oocytes obtained from diestrus phase, increasing the levels of M-II in this species.(AU)

Efeitos da redução ou substituição do soro fetal bovino por outros compostos na maturação in vitro de oócitos bovinos / Effects of reduction or replacement of fetal calf serum by other compounds during in vitro maturation of bovine oocytes

A utilização do soro fetal bovino (SFB), embora bastante disseminada na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, apresenta limitações por ser um meio indefinido e por causar efeitos que prejudicam a qualidade desses embriões. Por esse motivo, nos últimos anos, grande parte das pesquisas relacionadas à PIV está voltada para a substituição do SFB por outros compostos nos meios de cultura. No presente estudo, foram utilizados como compostos protéicos a albumina sérica bovina livre de ácidos graxos (BSA-FAF) e um produto comercial denominado fluido embriônico (FE) de maneira isolada ou em diferentes combinações e concentrações, com objetivo de substituir ou diminuir a concentração do SFB durante a maturação in vitro (MIV). [...] Ademais, o G3 também apresentou diminuição na taxa de maturação nuclear quando comparado ao G4. Quanto à maturação citoplasmática, nos grupos G2, G7, G6 e G3, houve redução (p<0,05) das taxas para 43,9por cento, 43,2 por cento, 43,1 por cento e 36,5 por cento, respectivamente, quando comparadas ao meio controle (G1), que permitiu a obtenção de valores médios de 62,4 por cento. Por outro lado, nos grupos G8, G4 e G5, a taxa de maturação citoplasmática não foi afetada com a redução do SFB, onde 59,3 por cento, 51,3 por cento e 50,8 por cento dos oócitos apresentaram os GC dispostos na periferia, respectivamente. Os resultados obtidos pelo teste de contrastes ortogonais complementam os obtidos na avaliação da maturação nuclear e migração de grânulos corticais, mostrando a necessidade do SFB durante a MIV, mesmo que em baixas concentrações, e a possibilidade de diminuir a sua concentração associando-o a BSA-FAF e/ou FE. Dessa forma, conclui-se que é possível reduzir a concentração de SFB no meio de MIV para até 3,5% sem prejuízo significativo aos índices de maturação nuclear e citoplasmática.(AU)

The use of fetal calf serum (FCS), although widely employed during in vitro production (IVP) of bovine embryos, has limitations. FCS is an undefined media and may have harmful effects on the quality of embryos. For this reason, in recent years, research efforts aimed at improving IVP of bovine embryos, have focused at the replacement of FCS by alternative compounds in culture media. In this study, fatty acid free bovine serum albumin (BSA-FAF) and embryonic fluid (EF) were used separately or in combination, in different concentrations, to replace or reduce the concentration of FCS during in vitro maturation (IVM). [...] Moreover, G3 also showed inferior nuclear maturation rate when compared to G4. Regarding cytoplasmic maturation, the rates were reduced to 43.9 percent, 43.2 percent, 43.1 percent and 36.5 percent in G2, G7, G6 and G3 groups, respectively, compared to the control group (G1; 62.4 percent). On the other hand, in the groups G8, G4 and G5, maturation rates were not affected by reduction of FCS, where 59.3 percent, 51.3 percent and 50.8 percent of the oocytes displayed CG arranged peripherally, respectively. The results obtained by the orthogonal contrast test are in accordance with the ones from the evaluation of the nuclear maturation and cortical granules migration. These data show the need of FCS on the MIV, even in low concentrations, and the possibility of decrease its concentration by associating it with BSA-FAF and/or EF. Therefore, we concluded that it is possible to reduce the concentration of FCS in IVM medium to a concentration of 3.5 percent without affecting nuclear and cytoplasmic maturation rates.(AU)

Produção in vitro de embriões ovinos: avanços e desafios / In vitro production of sheep embryos: advances and challenges

A produção in vitro (PIV) de embriões é uma ferramenta interessante, que pode ser aplicada na tentativade transpor as limitações inerentes à espécie ovina, como a estacionalidade reprodutiva, a inseminação artificialtranscervical, a variabilidade na resposta aos protocolos de superovulação, as falhas na fertilização, bem como anecessidade de cirurgia para coleta e transferência de gametas e embriões. Os embriões produzidos podem sertransferidos para receptoras ou criopreservados para uso futuro. As taxas de desenvolvimento embrionário invitro ainda são significativamente inferiores, quando comparadas à situação in vivo, o que pode ser atribuído adeficiências tanto na maturação nuclear quanto na citoplasmática, além do bloqueio do desenvolvimentoembrionário. A composição dos meios de cultivo e as condições de incubação estabelecidas interferem demaneira contundente no sucesso dessa biotécnica. Nesse contexto, a suplementação com antioxidantes e fatoresde crescimento durante as diferentes etapas da PIV tem sido amplamente utilizada visando ao aprimoramento datécnica e da qualidade dos embriões obtidos. Nesta revisão, serão discutidos os avanços e os desafios dessabiotécnica, aplicada a ovinos, nas diferentes etapas compreendidas.(AU)

In vitro production (IVP) of embryos is an interesting tool that can be applied in an attempt toovercome the main limitations of a wider application in ovine reproduction, we can cite the naturally occurringanoestrus period, the variability of response to superovulatory treatments, the fertilization failure and the needfor surgery for the collection and transfer of gametes and embryos. The embryos can be transferred to recipientsor cryopreserved for future use. The in vitro production of embryos is still significantly lower when compared toin vivo, which can be attributed to compromised nuclear and cytoplasmic maturation and embryonicdevelopment failure. The composition of the culture media and the incubation conditions established mayinterfere with the success of this biotechnology. In this context, supplementation with antioxidants and growthfactors during the different stages of IVP production has been widely used in order to improve the technique andquality of embryos. This paper reviews the advances and challenges of this biotechnology in sheep, analyzing thedifferent stages included.(AU)

ACETILAÇÃO DAS HISTONAS E SUA RELAÇÃO COM A AQUISIÇÃO DA COMPETÊNCIA EM OVÓCITOS BOVINOS

Considerando que em bovinos muitos dos ovócitos aspirados e utilizados para a produção in vitro de embriões (PIVE) ainda não adquiriram a competência para o desenvolvimento deve-se buscar alternativas que possam aumentar essa competência e, consequentemente, a eficiência da PIVE. A acetilação de histonas regula a transcrição gênica e parece estar relacionada com a aquisição de competência ovocitária. Entretanto, pouco se sabe se alterando o status de acetilação das histonas é possível alterar o nível de competência de ovócitos. Portanto, objetivou-se determinar o padrão de acetilação de histonas em ovócitos de diferentes competências antes, durante e após a maturação in vitro (MIV), e, avaliar se o uso do scriptaid (inibidor de HDAC) antes e após a retomada da meiose afeta a competência de desenvolvimento. No artigo 1, complexo cumulus-ovócito (COCs) foram obtidos a partir de folículos de 1-3mm, considerados menos competentes (IC) e de 6-8mm, mais competentes (CP). Ovócitos de ambos os grupos foram retirados da MIV as 0, 8 e 24h para avaliações de expressão gênica (HAT1, KAT2A, HDAC1, HDAC2, HDAC3) e imunofluorescência. Apesar do nível de acetilação não ter sido diferente em ovócitos de diferentes competências (P>0.05), o grupo CP apresentou transcrição do gene HAT1 de 0 para 8 horas (P<0.05), e maior quantidade de transcritos da HDAC1 às 8 horas em relação ao grupo IC (P<0.05). No artigo 2 COCs foram submetidos a pré-maturação (PMIV) por 6 horas na presença ou ausência de scriptaid (inibidor de HDAC). COCs foram distribuídos em 5 grupos: T1- MIV por 22h, T2- PMIV por 6h e MIV por 22h, T3-PMIV com scriptaid por 6h e MIV por 22h, T4-PMIV por 6h e MIV com scriptaid por 22h, e T5-PMIV com scriptaid por 6h e MIV com scriptaid por 22h. Maturação nuclear, expressão gênica, expansão das células do cumulus e desenvolvimento e qualidade embrionária foram analisados. Somente o gene HAT1 apresentou diferença de expressão em ovócitos de diferentes tratamentos. Em relação ao desenvolvimento embrionário em D7, T4 e T5 apresentaram taxas mais baixas de blastocistos (P<0.05) em relação aos outros tratamentos. Não foi observado nenhum efeito quando o scriptaid foi utilizado em ovócitos menos competentes (P>0.05). Conclui-se que o padrão de expressão gênica de genes relacionados a acetilação de histonas está relacionado a competência ovocitária. Porém, o uso de scriptaid durante a PMIV e /ou MIV não melhora a competência de desenvolvimento.

Considering that in cattle many of the oocytes aspirated and used for the in vitro production of embryos (PIVE) have not yet acquired the competence for the development one must look for alternatives that can increase this competence and, consequently, the efficiency of the PIVE. Histone acetylation regulates gene transcription and appears to be related to the acquisition of oocyte competence. However, little is known if altering the status of histone acetylation, it is possible to alter the competence level of oocytes. The aim of this study was to determine the histone acetylation pattern in oocytes of different abilities before, during and after in vitro maturation (IVM), and to evaluate whether the use of scriptaid (HDAC inhibitor) before and after meiosis resumption development competence. In article 1, cumulus-oocyte complex (COCs) were obtained from follicles 1-3mm, considered less competent (IC) and 6-8mm, more competent (CP). Oocytes from both groups were removed from the IVM at 0, 8 and 24h for gene expression evaluations (HAT1, KAT2A, HDAC1, HDAC2, HDAC3) and immunofluorescence. Although the acetylation level was not different in oocytes of different abilities (P> 0.05), the CP group presented transcription of the HAT1 gene from 0 to 8 hours (P <0.05), and higher amount of HDAC1 transcripts at 8 hours in relation to the IC group (P <0.05). In article 2 COCs were submitted to pre-maturation (PIVM) for 6 hours in the presence or absence of scriptaid (HDAC inhibitor). COCs were distributed in 5 groups: T1-MIV for 22h, T2-PIVM for 6h and IVM for 22h, T3-PIVM with scriptaid for 6h and MIV for 22h, T4-PIVM for 6h and MIV with scriptaid for 22h, and T5- PIVM with scriptaid for 6h and MIV with scriptaid for 22h. Nuclear maturation, gene expression, cumulus cell expansion, and embryonic development and quality were analyzed. Only the HAT1 gene showed expression difference in oocytes from different treatments. In relation to the embryonic development in D7, T4 and T5 presented lower rates of blastocysts (P <0.05) in relation to the other treatments. No effect was observed when the scriptaid was used in less competent oocytes (P> 0.05). We conclude that the gene expression pattern of histone acetylation related genes is related to oocyte competence. However, using scriptaid during PIVM and/or IVM does not improve development competence.

Produção in vitro de embriões ovinos: avanços e desafios / In vitro production of sheep embryos: advances and challenges

A produção in vitro (PIV) de embriões é uma ferramenta interessante, que pode ser aplicada na tentativade transpor as limitações inerentes à espécie ovina, como a estacionalidade reprodutiva, a inseminação artificialtranscervical, a variabilidade na resposta aos protocolos de superovulação, as falhas na fertilização, bem como anecessidade de cirurgia para coleta e transferência de gametas e embriões. Os embriões produzidos podem sertransferidos para receptoras ou criopreservados para uso futuro. As taxas de desenvolvimento embrionário invitro ainda são significativamente inferiores, quando comparadas à situação in vivo, o que pode ser atribuído adeficiências tanto na maturação nuclear quanto na citoplasmática, além do bloqueio do desenvolvimentoembrionário. A composição dos meios de cultivo e as condições de incubação estabelecidas interferem demaneira contundente no sucesso dessa biotécnica. Nesse contexto, a suplementação com antioxidantes e fatoresde crescimento durante as diferentes etapas da PIV tem sido amplamente utilizada visando ao aprimoramento datécnica e da qualidade dos embriões obtidos. Nesta revisão, serão discutidos os avanços e os desafios dessabiotécnica, aplicada a ovinos, nas diferentes etapas compreendidas.

In vitro production (IVP) of embryos is an interesting tool that can be applied in an attempt toovercome the main limitations of a wider application in ovine reproduction, we can cite the naturally occurringanoestrus period, the variability of response to superovulatory treatments, the fertilization failure and the needfor surgery for the collection and transfer of gametes and embryos. The embryos can be transferred to recipientsor cryopreserved for future use. The in vitro production of embryos is still significantly lower when compared toin vivo, which can be attributed to compromised nuclear and cytoplasmic maturation and embryonicdevelopment failure. The composition of the culture media and the incubation conditions established mayinterfere with the success of this biotechnology. In this context, supplementation with antioxidants and growthfactors during the different stages of IVP production has been widely used in order to improve the technique andquality of embryos. This paper reviews the advances and challenges of this biotechnology in sheep, analyzing thedifferent stages included.

CULTIVO IN VITRO DE OÓCITOS MAMÍFEROS: EFEITO DA TEMPERATURA DE TRANSPORTE DE OVÁRIO, DO SISTEMA DE CULTIVO FOLICULAR E DE INIBIDORES DA RETOMADA DA MEIOSE

Os objetivos da presente tese foram: 1) Determinar o efeito da temperatura de transporte (4 vs 33 ºC) sobre a morfologia, crescimento folicular, viabilidade, maturação oocitaria, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) de folículos pré-antrais e antrais iniciais caprinos isolados e cultivados por 18 dias (Fase I); 2) Avaliar as taxas de sobrevivência e ativação de folículos primordiais caprinos após 7 dias de cultivo in vitro em um sistema tridimensional na ausência (folículos primordiais isolados inclusos em Alginato - 0,8%) ou na presença de tecido ovariano (Fase II); 3) Avaliar as taxas de sobrevivência, ativação e crescimento folicular após 7 dias de cultivo in vitro de fragmentos ovarianos babuínos (Fase III) inclusos em diferentes matrizes (Alginato - 1% ou polyethyleneglycol-vinyl sulfone (PEG-VS) - 5%); 4) Investigar o efeito de diferentes concentrações de Cilostamida (10 e 20 M) e tempos de exposição (6 e 12 horas) durante a MIV de oócitos bovinos e caprinos (Fase IV). Na Fase I, os ovários caprinos foram transportados individualmente em MEM-HEPES a 4 ou 33 °C. Posteriormente, os folículos foram cultivados in vitro por 18 dias e os complexos cumulus-oócito (CCO) maturados por 32 horas. Na Fase II, os folículos primordiais caprinos inclusos em Alginato (10 folículos/gota), ou envoltos em tecido ovariano (in situ) encapsulado ou não em Alginato, foram cultivados por 7 dias. Na Fase III, os folículos babuínos previamente criopreservados foram cultivados por 10 dias incluso em tecido ovariano (in situ), na presença ou ausência de matrizes extracelulares (PEG-VS vs Alginato) e de FSH. Por fim, na Fase IV, CCOs caprinos e bovinos foram cultivados por 30 horas, iniciando com a adição da Cilostamida (10 ou 20 M) e/ou parede folicular por 6 ou 12 horas durante a pré-maturação in vitro (PMIV) antes da MIV (24 ou 18h). O melhor resultado para produção de oócitos totalmente crescidos e retomada meiótica foi obtido utilizando baixa (4 °C) para folículos pré-antrais e alta (33 °C) para folículos antrais iniciais (Fase I). Folículos primordiais caprinos isolados e encapsulados em Alginato apresentaram maiores percentuais de ativação folicular quando comparado aos demais tratamentos (Fase II). Na Fase III, a adição de FSH ao meio de cultivo no tratamento com matrizes (PEG-VS e Alginato) promoveu uma melhora na sobrevivência dos folículos pré-antrais babuínos inclusos em tecido ovariano após 10 dias cultivo in vitro. Na Fase IV, a combinação da concentração/tempo de exposição à Cilostamida durante a PMIV retardou a progressão meiótica apenas na espécie bovina após 6 e 12 horas de cultivo. Como conclusão, a temperatura de transporte afetou diferencialmente o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais e folículos antrais iniciais caprinos (Fase I); cultivo de folículos primordiais caprinos isolados e inclusos em Alginato permitiu uma melhor taxa de ativação folicular (Fase II). Em babuínos, utilização de matrizes extracelulares na presença de FSH melhorou a sobrevivência folicular após 10 dias de cultivo in vitro (Fase III). Por fim, na Fase IV, a Cilostamida retardou de forma concentração dependente a retomada da meiose somente na espécie bovina.

The objectives of this thesis were: 1) To determine the effect of transport temperature (4 vs 33ºC) on morphology, follicular growth, viability and oocyte maturation, and production of reactive oxygen species (ROS) of preantral and early antral follicles goats for 18 days in vitro culture (Phase I); 2) to evaluate follicular survival and activation rates after 7 days of in vitro culture in a three-dimensional system in the absence (isolated primordial follicles and included in Alginate - 0.8%) or in the presence of ovarian tissue (Phase II); 3) To investigate the survival, activation and follicular growth after 7 days of in vitro culture of ovarian fragments of baboons (Phase III) included in different matrices (Alginate - 1% or poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG) - 5%); 4) Investigate the effect of different concentrations of Cilostamida (10 and 20 M) and exposure times (6 and 12 hours) during IVF of bovine and goat oocytes (Phase IV). In Phase I, goat ovaries were individually transported in MEM-HEPES at 4 or 33 ° C. Subsequently, the follicles were cultured in vitro for 18 days and cumulus-oocyte (CCO) complexes matured for 32 hours. In Phase II, the primordial goat follicles included in Alginate (10 follicles / drop), or wrapped in ovarian tissue (in situ) encapsulated or not in Alginate, were cultured for 7 days. In Phase III, pre-cryopreserved baboon follicles were cultured for 10 days in ovarian tissue (in situ), in the presence or absence of extracellular matrices (PEG-VS vs. Alginate) and FSH. Finally, in the Phase IV, the goat and cattle COCs were cultured for 30 hours, starting with in vitro pre-maturation (IVPM) for 6 or 12 hours before IVM (24 or 18h). The best result for the production of fully-grown oocytes and meiotic resumption was obtained using low (4 ° C) for preantral follicles and high (33 ° C) for initial antral follicles (Phase I). Phase II results showed that caprine primordial follicles isolated and encapsulated in Alginate presented satisfactory rates of survival and higher percentages of follicular activation when compared to the other treatments. In the Phase III, treatments containing medium supplemented with FSH associated and extracellular matrices (Alginate and PEG-VS) promoted an improvement in the survival of baboon preantral follicles included in the ovarian tissue after 10 days in vitro culture. In the Phase IV, the combination of concentration/exposure time to cilostamide during IVPM delayed the meiotic progression only in the bovine species after 6 and 12 hours of culture. In conclusion, the transport temperature differentially affected the in vitro development of preantral follicles and initial antral follicles (Phase I); the in vitro culture of isolated goat primordial follicles enclosed in Alginate allowed a better rate of follicular activation (Phase II); In baboons, the use of extracellular matrices in the presence of FSH improved follicular survival after 10 days of in vitro culture (Phase III). Finally, in the Phase IV, the cilostamide delayed in a concentration/dependent manner the meiotic resumption in bovine species only.

EFEITOS DAS PROSTAGLANDINAS E2 E F2 NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OVÓCITOS BOVINOS

O presente estudo teve como objetivo elucidar o envolvimento das Prostaglandinas (PGs) E2 e F2 na maturação in vitro (MIV) de ovócitos bovinos. Nos primeiros experimentos, avaliou-se a cinética de maturação nuclear e o perfil de expressão de genes envolvidos na atividade dessas PGs (PTGS2, PTGES1, PTGER2 e AKR1B1) nas células do cumulus (CCs) de ovócitos bovinos de diferentes competências, antes a após a maturação. Os complexos cumulus-ovócitos (CCOs) foram obtidos de folículos dissecados de 1,0-2,9 mm (ovócitos incompetentes; INC) e 6,0-8,0 mm (ovócitos competentes; COM), e o grupo controle, da aspiração folicular de folículos de 3-8 mm (CTL). Para a cinética os CCOs foram desnudados, fixados, corados com lacmoide e avaliados quanto ao estágio de maturação nuclear. Já para a determinação do nível de transcritos os CCOs foram desnudados e as CCs coletadas para a análise por RT-qPCR. No terceiro experimento, o efeito da suplementação do meio de maturação com PGE2 e PGF2 foi avaliado. Os CCOs, aspirados de folículos de 3-8mm foram selecionados e distribuídos em cinco tratamentos: T1 (meio de maturação; CTL); T2 (meio de maturação suplementado com 10M de NS398 -inibidor específico da PTGS2); T3 (meio de maturação suplementado com 1M de PGE2 e 10M NS398); T4 (meio de maturação suplementado com 1M de PGF2 e 10M NS398); T5 (meio de maturação suplementado com 1M de PGE2, 1M PGF2 e 10M NS398). Após 24 horas de MIV, os CCOs foram avaliados quanto ao grau de expansão das CCs e, posteriormente, foram fecundados e cultivados in vitro até o D7 de desenvolvimento. Avaliou-se as taxas de clivagem em D2 e de blastocistos em D6 e D7. Os blastocistos de D7 foram avaliados quanto ao número total de células e a porcentagem de células com fragmentação do DNA. Os dados de taxa de maturação e desenvolvimento embrionário foram analisados pelo teste do Qui-quadrado, os de padrão de expressão gênica por análise de variância e teste de Tukey, e para a fragmentação do DNA (TUNEL), foi utilizado o teste de Tukey. Os resultados mostraram que ovócitos de diferentes competências apresentaram cinética de maturação nuclear semelhante (P>0,05). Durante a MIV a abundância relativa do RNAm para o gene PTGS2 nas CCs aumentou (P<0,05) no grupo INC, enquanto a de PTGES1 aumentou (P<0,05) nos grupos INC e COM. O nível de transcritos de AKR1B1 diminuiu (P<0,05) no grupo INC e o de PTGER2 não variou (P>0,05). Quando comparados no mesmo momento de maturação, o nível de transcritos de todos os genes avaliados foi semelhante (P>0,05) entre os grupos, tanto às 0 quanto as 24 horas de MIV. Com exceção do gene PTGS2 que apresentou menor expressão às 24 horas no grupo COM do que os grupos INC e CTL. Os tratamentos não afetaram (P>0,05) a expansão das CCs, a taxa de clivagem nem a qualidade embrionária, mas promoveram uma diminuição (P<0,05) nas taxa de blastocistos dos grupos tratados com PGs. Com base nos resultados conclui-se que apesar da suplementação do meio de maturação com PGE2 e PGF2 ter efeito prejudicial no desenvolvimento embrionário, os genes relacionados à atividade dessas PGs são diferencialmente expressos durante a maturação, e o gene PTGS2 se mostrou um bom marcador da competência dos CCOs maturos.

The present study aimed to elucidate the involvement of Prostaglandins E2 and F2 on the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. In the first experiments, we evaluated the kinetics of nuclear maturation and the expression profile of genes involved in the activity of these PGs (PTGS2, PTGES1, PTGER2 and AKR1B1) in cumulus cells (CCs) of bovine oocytes of different competences, before and after maturation. The cumulus-oocyte complexes (CCOs) were obtained from dissected follicles of 1.0-2.9 mm (incompetent oocytes; INC) and 6.0-8.0 mm (competent oocytes; COM), and from aspirated 3-8 mm diameter follicles as the control (CTL). For the kinetics, CCOs were denuded, fixed, stained with lacmoid and evaluated for meiotic stage. For the determination of the level of transcripts CCOs were denuded and CCs collected for the analysis by RT-qPCR. In the third experiment, the effect of the supplementation of maturation medium with PGE2 and PGF2 was evaluated. The CCOs aspirated from 3-8mm follicles were selected and distributed into five treatments: T1 (maturation medium; CTL); T2 (maturation medium supplemented with 10M of NS398 - PTGS2 specific inhibitor); T3 (maturation medium supplemented with 1M PGE2 and 10M NS398); T4 (maturation medium supplemented with 1M of PGF2 and 10M NS398); T5 (maturation medium supplemented with 1M PGE2, 1M PGF2 and 10M NS398). After 24 hours of IVM, CCOs were evaluated for CCs expansion and were subsequently fertilized and cultured in vitro up D7 of development. Cleavage and blastocyst rate at D6 and D7, total cells number and percentage of cells with DNA fragmentation were evaluated. Maturation and embryonic development data were analyzed by Chi-square test, gene expression by analysis of variance and Tukey's test and DNA fragmentation by Tukey's test. The results showed that oocytes of different competences presented similar nuclear maturation kinetics (P> 0.05). The relative abundance of PTGS2 gene in the CCs increased (P <0,05) during IVM in INC group, while that of PTGES1 increased (P <0.05) in INC and COM groups. Level of AKR1B1 transcripts was lower (P <0.05) in the INC group than in the other groups and that of PTGER2 did not change among them (P> 0.05). When gene expression was compared among groups at the same time of maturation, transcript levels of all genes evaluated were similar (P> 0.05) between the groups, at both 0 and 24 hours of IVM, exception for PTGS2 gene that presented lower expression at 24 hours in the COM group than in the INC and CTL groups. Treatments did not affect the expansion of CCs, cleavage rate nor the embryonic quality (P> 0.05), but promoted a decrease (P <0.05) in the blastocyst rates on the PGs treated groups. Based on the results it can be concluded that although the supplementation of the maturation medium with PGE2 and PGF2 has detrimental effect on the embryonic development, genes related to the activity of these PGs are differentially expressed during maturation. In addition, PTGS2 gene showed to be a good marker for competence of mature CCOs

AVALIAÇÃO DA TÉCNICA DE VITRIFICAÇÃO DE OVÁRIOS DE CAMUNDONGOS DA LINHAGEM B6D2 F1 PERTENCENTES AO INSTITUTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA EM BIOMODELOS - ICTB

Esta dissertação teve como objetivo testar o protocolo de vitrificação de fragmentos ovarianos de camundongos de linhagem híbrida, pertencentes ao Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos (ICTB)/Fiocruz. Para tanto, se estabeleceu o protocolo de coleta e maturação in vitro dos oócitos provenientes de ovários a fresco e vitrificados e avaliaram-se as estruturas após fertilização in vitro, com 24, 48, 72 e 96 horas de cultivo embrionário. Fêmeas da linhagem B6D2F1 foram eutanasiadas para remoção dos ovários (n=60) e foram divididas em 3 grupos: Grupo 1- (n=30 animais) Oócito provenientes de ovários vitrificados, maturados e fertilizados in vitro de ovários fragmentados (metade) (n=120). Grupo 2 (n=15 animais) (controle 1)- Oócito provenientes de ovários coletados a fresco, maturados e fertilizados in vitro. Grupo 3 (n=15)(controle 2) Oócitos maturados in vivo coletados no oviduto pósovulação e fertilizados in vitro. A viabilidade da técnica foi verificada pela desvitrificação dos ovários, coleta e seleção dos oócitos, maturação in vitro oocitária e fecundação in vitro. O resultado do desenvolvimento embrionário in vitro de cada grupo foi avaliado pelo teste de Qui-quadrado (BioStat 5.0). Recuperou-se 123, 224 e 328 oócitos nos G1, G2 e G3, respectivamente. Foram observadas diferenças significativas nas taxas de clivagem às 24 horas (embriões com 2 células ou mais) entre G1 (8%) e G2 (32%) (p<0.1) e G1 e G3 (49%) (p<0.05), mas não entre G2 e G3 (p>0.05). Para as taxas de blastocistos, às 96 horas, os grupos G1, G2 e G3 apresentaram respectivamente 6%, 11% e 46%, diferindo significativamente entre eles (p<0.05). Concluiu-se que os protocolos de vitrificação e maturação oocitária in vitro, com posterior fertilização in vitro utilizados são alternativas para a produção de embriões de camundongos in vitro.

This work aimed test a protocol for ovarian fragments vitrification of a hybrid strain mouse, provided from Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos (ICTB)/Fiocruz. For this goal, a protocol for the collection and in vitro maturation of oocytes from fresh and vitrified ovaries was established and embryonic structures were evaluated after fertilization, at 24, 48, 72 and 96 hours of culture. Females of B6D2F1 strain were euthanized for ovarian removal (n = 60) and divided into 3 groups: Group 1 (n = 30) ovaries were fragmented (half) (n = 120), vitrified, matured and fertilized; Group 2 (control 1/n = 15) - in vitro fertilization of oocytes matured in vitro from fresh ovaries and Group 3 (control 2/n=15) - oocytes collected from the ampulla region and in vitro fertilization of oocytes matured in vivo. The viability of the technique was verified by ovarian thawing, oocyte collection and selection, oocyte in vitro maturation and in vitro fertilization. In vitro embryo development of each group was evaluated by the Chi-square test (BioStat 5.0). A hundred twenty three, 224 and 328 oocytes were recovered from G1, G2 and G3, respectively. Significantly differences were observed in the rates of cleavage at 24 hours (embryos with 2 cells or more) between G1 (8%) and G2 (32%) (p <0.1) and G1 and G3 (49%) (p <0.05) but not between G2 and G3 (p>0.05). Blastocysts were observed at 96 hours and presented 6%, 11% and 46%, respectively for G1, G2 and G3, differing significantly (p <0.05). It was concluded that the protocols of vitrification, in vitro maturation or oocyte maturation with subsequent in vitro fertilization used were available for the production of mouse in vitro embryos.

ACÚMULO DE TRANSCRITOS EM CÉLULAS DO CUMULUS CULTIVADAS NA PRESENÇA DO PRECURSOR DO PEPTÍDEO NATRIURÉTICO TIPO C E SEUS EFEITOS SOBRE A MATURAÇÃO E AQUISIÇÃO DA COMPETÊNCIA DO OÓCITO NA ESPÉCIE BOVINA

Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito do precursor do peptídeo natriurético tipo C (NPPC) durante o cultivo de pré-maturação in vitro (pré-MIV) de oócitos bovinos sobre: 1) a progressão da maturação nuclear; 2) a expressão gênica das células do cumulus e 3) a aquisição da competência do oócito para o desenvolvimento embrionário in vitro. Os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram pré-MIV com 100 nM NPPC por 8 horas (grupo NPPC) e, ao final do período, foram lavados para completa remoção do NPPC e submetidos à MIV por 22h. Após 8h de pré-MIV e após 8h de pré-MIV seguidas de 22h de MIV (duração total do cultivo = 30h) foram avaliadas a progressão da maturação nuclear e a expressão relativa de mRNA nas células do cumulus. O grupo controle (C) foi maturado na ausência de NPPC por até 30h, e as mesmas avaliações anteriores foram realizadas imediatamente após a remoção do ambiente folicular (C0), após 8h de cultivo (C8), após 22h de cultivo (C22) e após 30h de cultivo (C30). Em outro experimento, cujos tratamentos foram idênticos aos supramencionados, os oócitos foram fecundados ao término da MIV e foi avaliado o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos. Após 8h de cultivo de pré-MIV, a análise da progressão da meiose demonstrou que o grupo C0 apresentou 58,9% de estruturas com configuração de GV1, enquanto que o grupo C8 apresentou apenas 13,9% de estruturas nesta configuração (P<0,05). A proporção de GV1 no grupo NPPC foi semelhante a ambos estes grupos (22,8%; P>0,05). Por outro lado, o grupo C8 apresentou maior taxa de GV3 em relação ao C0 (53,1% vs. 3,62%; P<0,05), sem diferenças com o grupo NPPC (38,7%; P>0,05). Ao final do cultivo de MIV, não foi observada diferença entre os grupos (C22 vs. NPPC vs. C30) com relação à maturação nuclear, todavia, houve maior taxa de oócitos degenerados no C30 em comparação com C22 (11,4% vs. 2,8%; P<0,05). A análise da expressão relativa de genes das células do cumulus após 8h de pré-MIV com NPPC evidenciou aumento (P<0,05) na expressão de genes relacionados à expansão destas células (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 e VCAN), à maturação oocitária (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) e ao desenvolvimento embrionário (IGF1R, KRT8 e LUM). Ao final do cultivo de MIV, observou-se no grupo NPPC que o gene PTX3, relacionado à expansão das células do cumulus, além dos genes AREG e BDNF, relacionados à maturação oocitária, e o gene LUM, relacionado ao desenvolvimento embrionário estavam mais expressos em comparação com o grupo C30 (P<0,05). Com relação ao desenvolvimento embrionário, os grupos experimentais não apresentaram diferença (P>0,05) quanto à taxa de clivagem (média de 73,22%). Embora o grupo NPPC não tenha diferido (P>0,05) de C22 e C30 quanto à taxa de blastocistos, houve diferença entre C22 e C30 (69,3 vs. 37,4; P<0,05). Todavia, não houve diferença entre os grupos com relação ao número de células totais (blastômeros) e apoptóticas (P>0,05). Em conclusão, o cultivo de pré-MIV de oócitos bovinos por 8h com 100nM NPPC não bloqueou a retomada da meiose, mas a progressão da meiose ocorreu de forma mais lenta e impediu o envelhecimento e degeneração dos oócitos. O cultivo de oócitos por tempo prolongado (30h) na ausência de NPPC foi prejudicial para o desenvolvimento embrionário, mas o tratamento com NPPC (8h pré-MIV+22h MIV = duração total de 30h) reverteu parcialmente este índice.

The aim of this study was to evaluate the effect of the C-type natriuretic peptide precursor (NPPC) during pre in vitro maturation culture (pre-IVM) of bovine oocytes on: 1) nuclear maturation progress; 2) gene expression in cumulus cells and 3) acquisition of competence for in vitro embryo development. Cumulus oocyte complexes (COCs) were pre-IVM with 100 nM NPPC for 8 hours (NPPC group) and then were washed for the complete removal of NPPC and submitted to IVM for 22h. After 8h pre-IVM followed by 22h IVM (total culture time = 30h) oocytes were evaluated for nuclear maturation progress and cumulus cells for relative mRNA expression. Control group (C) was IVM in the absence of NPPC for up to 30h and the same evaluations were made immediately after follicle removal (C0) and after 8h (C8), 22h (C22) and after 30h of culture (C30). In another experiment with the same treatment, the oocytes were fertilized at the end of IVM and embryo development to the blastocyst stage was evaluated. After 8 hours of pre-IVM culture, meiosis progression analysis showed 58.9% of oocytes in GV1 configuration in C0, while C8 had only 13.9% (P<0.05). The GV1 rates in NPPC did not differ from any group (22.8%; P>0.05). On the other hand, C8 showed higher rates of GV3 in comparison with C0 (53.1% vs. 3.62%; p<0.05) and no differences compared to NPPC (38.7%; P<0.05). At the end of IVM culture, no differences between groups (C22 vs. NPPC vs. C30) were observed in nuclear maturation, however, higher rates of degenerated oocytes were observed in C30 in comparison with C22 (11.4% vs. 2.8%; P<0.05). The relative gene expression analysis in cumulus cells after 8h pre-IVM with NPPC showed an up-regulation in genes related to cumulus cells expansion (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 and VCAN), oocyte maturation (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) and embryo development (IGF1R, KRT8 and LUM). At the end of IVM culture, the cumulus cells expansion related gene, PTX3, the oocyte maturation genes, AREG and BDNF, and the embryo development gene, LUM, were up-regulated in NPPC in comparison with C30 (p<0.05). Regarding embryo development, the cleavage rates did not differ in experimental groups (mean around 73,22%). Besides, blastocyst rates did not differ between NPPC (P>0.05) and the other groups, but there was a difference between C22 and C30 (69.3 vs. 37.4%; P<0.05). There was no difference between the groups in total cell number (blastomeres) and apoptotic cells (P<0.05). In conclusion, the pre-IVM culture of bovine oocytes for 8h with 100nM NPPC did not block meiosis resumption, but meiosis progression occurred more slowly and prevented aging and degeneration of the oocytes. The prolonged time of oocyte culture (30h) in the absence of NPPC was detrimental to embryo development, but NPPC treatment (8h pre-IVM + 22h IVM = total duration of 30h) partially reversed this effect.