A glycoprotein E gene-deleted bovine alphaherpesvirus 1 strain is attenuated and immunogenic for calves with passive immunity upon intranasal immunization / Cepa de alfaherpesvírus bovino 1 com deleção do gene da glicoproteína E é atenuada e imunogênica para bezerros com imunidade passiva após imunização intranasal

Vaccination has been used to prevent the losses associated with Bovine alphaherpesvirus 1 (BoHV-1) infection but passively acquired antibodies may compromise vaccine efficacy. Intranasal immunization (IN) of calves with modified live viral BoHV-1 vaccines has proven to overcome the acquired passive antibodies and confer adequate protection. Herein, we evaluated the safety and immunogenicity of a glycoprotein E-deleted Brazilian BoHV-1 strain (BoHV-1gEΔ) for IN immunization of calves. Ten 1-to-2 months-old calves with virus-neutralizing titers (VN) ranging from 2-64 were immunized IN with viable BoHV-1gEΔ (107.1 TCID50) and four remained as unvaccinated controls (VN titers 8-32). After IN immunization, calves presented a transient (2-6 days) mild nasal secretion and shed the vaccine virus in nasal secretions in low titers (<102.6TCID50/mL) for 4-8 days. Interestingly, the vaccinated calves did not show an increase in VN titers after vaccination. Rather, they presented a gradual reduction in serum VN antibodies in the following weeks - similarly to unvaccinated controls. Upon IN challenge with a virulent heterologous BoHV-1 strain at day 55 post-immunization (107.63TCID50), vaccinated calves shed significantly less virus from day 6 post-challenge onwards (p < 0.07) and for a shorter period of time than the controls (p < 0.0024). Importantly, both the duration and intensity of clinical signs were reduced in vaccinated animals. In addition, vaccinated calves showed an abrupt raise in VN titers post-challenge, indicating adequate immunological priming by vaccination. In summary, immunization of calves harboring passive antibodies with BoHV-1gEΔ by the IN route was able to prime the immunity to afford partial virological and clinical protection upon challenge.

A vacinação tem sido usada para prevenir perdas associadas à infecção pelo alfaherpesvírus bovino 1 (BoHV-1), embora anticorpos adquiridos passivamente possam comprometer a eficácia das vacinas. A imunização intranasal (IN) de bezerros com vacinas de BoHV-1 vivas modificadas pode contornar o obstáculo relacionado à presença de anticorpos adquiridos passivamente, conferindo proteção aos animais vacinados. Nesse contexto, avaliou-se a segurança e imunogenicidade de uma cepa brasileira de BoHV-1 com deleção no gene da glicoproteína E (BoHV-1gEΔ) na imunização IN de bezerros. Dez bezerros, de um a dois meses de idade e com títulos neutralizantes (VN) variando de 2-64, foram inoculados IN com BoHV-1gEΔ (107,1TCID50), e quatro permaneceram como controles não vacinados (títulos de VN 8-32). Após a instilação IN, os bezerros apresentaram secreção nasal transitória leve (2-6 dias) e excretaram o vírus vacinal nas secreções nasais em baixos títulos (<102,6TCID50/mL) por 4-8 dias. Interessantemente, os bezerros vacinados não apresentaram aumento nos títulos de anticorpos neutralizantes após a vacinação. Em vez disso, eles apresentaram uma redução gradual nos anticorpos neutralizantes séricos nas semanas seguintes - semelhante aos controles não vacinados. Após o desafio IN com uma cepa BoHV-1 virulenta heteróloga no dia 55 pós-imunização (107,63TCID50), os bezerros vacinados excretaram o vírus em títulos menores a partir do sexto dia pós-desafio (p < 0,07) e por um período de tempo menor do que o observado nos controles (p < 0,0024). É importante notar que tanto a duração quanto a intensidade dos sinais clínicos foram reduzidas nos animais vacinados. Além disso, os bezerros vacinados apresentaram um aumento abrupto nos títulos neutralizantes após o desafio, indicando uma imunização adequada por BoHV-1gEΔ. Em resumo, a imunização IN de bezerros com anticorpos passivos com a cepa BoHV-1gEΔ foi capaz de estimular a imunidade, proporcionando proteção virológica e clínica parciais após o desafio.

Proteinograma de ovelhas imunizadas com veneno detoxificado do escorpião Tityus serrulatus / Proteinogram of immunized sheep with detoxified Tityus serrulatus scorpion venom

Background: Scorpionism is a worldwide medical issue, especially relevant in the tropical and subtropical countries. Tityusserrulatus is the species responsible for most cases in Brazil. Antivenom administration to victims is the sole specific therapyobtained from donor animals. Most of these donors suffer with symptoms of the poisoning, debilitating their health andreducing their life expectancy. The aim of the present research was to evaluate whether the immunogens prepared fromthe crude and detoxified venom of T. serrulatus promoted different changes in fractionated sheep plasma proteins, duringa scorpion antivenom serum production.Materials, Methods & Results: Twelve sheep, healthy, mean weight of 30 kg, were distributed into 3 groups (n = 4): G1(control), G2 (crude venom) and G3 (detoxified venom). The adopted immunization protocol (first cycle) had 6 doses, 3using Freund’s adjuvant, with a 21-day interval between each one (day 0, 22 and 43), and 3 doses with no adjuvant (booster)and 0.2 mg of antigen (reinforcement), spaced 3 days between each other (day 50, 53 and 56). Group control (G1) received6 immunizations with phosphate buffered saline (PBS) associated with Freund’s adjuvant (1:1), while the other 2 groupsreceived 0.5 mg of venom (G2) and detoxified venom (G3), respectively, diluted in PBS, associated with the Freund adjuvant. The boosters were 1/3 of the initial dose, diluted only PBS. At baseline (T0) and at 24 and 48 h after immunization,all animals underwent clinical examinations. Blood samples were collected at day 0, 22, 43, 53 and 56 for proteinogramanalysis. Total protein, albumin and globulins fractions were measured. Plasma albumin concentration at T0 ranged from3.41-4.86 g/dL, with a mean value of 4.12 g/dL. There was no statistical difference between...

Selection and characterization of peptides mimetic to Campylobacter fetus subsp. venerealis using phage display / Seleção e caracterização de peptídeos miméticos a Campylobacter fetus subsp. venerealis usando phage display

ABSTRACT: Bovine genital campylobacteriosis (BGC) is a venereal and subclinical disease that affects the fertility of cattle herds, and it is caused by Campylobacter fetus subsp. venerealis . This study selected peptides mimetic to the BGC-causing agent from a phage library. Phage display is a technique that applies bacteriophage libraries that reveal peptides fused to the viral capsid in biological selections against target proteins. Biopannings were performed for biological selection in the phage library using rabbit hyperimmune serum and C. fetus subsp. venerealis protein extract. Five selected heptapeptides were considered mimetic to Cfv-NCTC 10354 based on the results of bioinformatics analysis and assays with hyperimmune serum and cervicovaginal mucus obtained from heifers. ALASLPL and LSYLFPP were the most reactive peptides and considered promising as possible mimetic immunogens for C. fetus subsp. venerealis.

RESUMO: Campilobacteriose Genital Bovina (CGB) é uma doença venérea e subclínica que causa problemas reprodutivos em rebanhos, causada por Campylobacter fetus subsp. venerealis. Este trabalho teve como objetivo selecionar peptídeos miméticos ao agente da CGB de uma biblioteca de fagos. Phage display é uma técnica que aplica bibliotecas de bacteriófagos que expõem peptídeos fusionados ao capsídeo viral em seleções biológicas contra proteínas alvo. Biopannings foram realizados para seleção biológica na biblioteca de fagos por meio de soro hiperimune de coelho e extrato proteico de C. fetus subsp. venerealis. Cinco heptapeptídeos selecionados foram considerados miméticos para Cfv-NCTC 10354 a partir de análises de bioinformática e ensaios com soro hiperimune e muco cérvico-vaginal de novilhas. ALASLPL e LSYLFPP foram os peptídeos mais reativos e considerados promissores como possíveis imunógenos miméticos para C. fetus subsp. venerealis.

Selection and characterization of peptides mimetic to Campylobacter fetus subsp. venerealis using phage display / Seleção e caracterização de peptídeos miméticos a Campylobacter fetus subsp. venerealis usando phage display

Bovine genital campylobacteriosis (BGC) is a venereal and subclinical disease that affects the fertility of cattle herds, and it is caused by Campylobacter fetus subsp. venerealis . This study selected peptides mimetic to the BGC-causing agent from a phage library. Phage display is a technique that applies bacteriophage libraries that reveal peptides fused to the viral capsid in biological selections against target proteins. Biopannings were performed for biological selection in the phage library using rabbit hyperimmune serum and C. fetus subsp. venerealis protein extract. Five selected heptapeptides were considered mimetic to Cfv-NCTC 10354 based on the results of bioinformatics analysis and assays with hyperimmune serum and cervicovaginal mucus obtained from heifers. ALASLPL and LSYLFPP were the most reactive peptides and considered promising as possible mimetic immunogens for C. fetus subsp. venerealis.

Campilobacteriose Genital Bovina (CGB) é uma doença venérea e subclínica que causa problemas reprodutivos em rebanhos, causada por Campylobacter fetus subsp. venerealis. Este trabalho teve como objetivo selecionar peptídeos miméticos ao agente da CGB de uma biblioteca de fagos. Phage display é uma técnica que aplica bibliotecas de bacteriófagos que expõem peptídeos fusionados ao capsídeo viral em seleções biológicas contra proteínas alvo. Biopannings foram realizados para seleção biológica na biblioteca de fagos por meio de soro hiperimune de coelho e extrato proteico de C. fetus subsp. venerealis. Cinco heptapeptídeos selecionados foram considerados miméticos para Cfv-NCTC 10354 a partir de análises de bioinformática e ensaios com soro hiperimune e muco cérvico-vaginal de novilhas. ALASLPL e LSYLFPP foram os peptídeos mais reativos e considerados promissores como possíveis imunógenos miméticos para C. fetus subsp. venerealis.

Selection and characterization of peptides mimetic to Campylobacter fetus subsp. venerealis using phage display / Seleção e caracterização de peptídeos miméticos a Campylobacter fetus subsp. venerealis usando phage display

Bovine genital campylobacteriosis (BGC) is a venereal and subclinical disease that affects the fertility of cattle herds, and it is caused by Campylobacter fetus subsp. venerealis . This study selected peptides mimetic to the BGC-causing agent from a phage library. Phage display is a technique that applies bacteriophage libraries that reveal peptides fused to the viral capsid in biological selections against target proteins. Biopannings were performed for biological selection in the phage library using rabbit hyperimmune serum and C. fetus subsp. venerealis protein extract. Five selected heptapeptides were considered mimetic to Cfv-NCTC 10354 based on the results of bioinformatics analysis and assays with hyperimmune serum and cervicovaginal mucus obtained from heifers. ALASLPL and LSYLFPP were the most reactive peptides and considered promising as possible mimetic immunogens for C. fetus subsp. venerealis.(AU)

Campilobacteriose Genital Bovina (CGB) é uma doença venérea e subclínica que causa problemas reprodutivos em rebanhos, causada por Campylobacter fetus subsp. venerealis. Este trabalho teve como objetivo selecionar peptídeos miméticos ao agente da CGB de uma biblioteca de fagos. Phage display é uma técnica que aplica bibliotecas de bacteriófagos que expõem peptídeos fusionados ao capsídeo viral em seleções biológicas contra proteínas alvo. Biopannings foram realizados para seleção biológica na biblioteca de fagos por meio de soro hiperimune de coelho e extrato proteico de C. fetus subsp. venerealis. Cinco heptapeptídeos selecionados foram considerados miméticos para Cfv-NCTC 10354 a partir de análises de bioinformática e ensaios com soro hiperimune e muco cérvico-vaginal de novilhas. ALASLPL e LSYLFPP foram os peptídeos mais reativos e considerados promissores como possíveis imunógenos miméticos para C. fetus subsp. venerealis.(AU)

Clostridium perfringens α and ß recombinant toxoids in equine immunization / Toxóides recombinantes α e ß de Clostridium perfringens na imunização de equinos

Clostridium perfringens is considered one of the main causative agents of superacute enterocolitis, usually fatal in the equine species, due to the action of the ß toxin, and is responsible for causing severe myonecrosis, by the action of the α toxin. The great importance of this agent in the equine economy is due to high mortality and lack of vaccines, which are the main form of prevention, which guarantee the immunization of this animal species. The aim of this study was to evaluate three different concentrations (100, 200 and 400µg) of C. perfringens α and ß recombinant toxoids in equine immunization and to compare with a group vaccinated with a commercial toxoid. The commercial vaccine was not able to stimulate an immune response and the recombinant vaccine was able to induce satisfactory humoral immune response in vaccinated horses, proving to be an alternative prophylactic for C. perfringens infection.(AU)

Clostridium perfringens é considerado um dos principais agentes causadores de enterocolites superagudas, geralmente fatais na espécie equina, devido à ação da toxina ß, além de ser responsável por causar quadros graves de mionecrose, pela ação da toxina α. A grande importância desses agentes na equinocultura, deve-se a elevada mortalidade e a inexistência de vacinas, principal forma de prevenção, que garantam a imunização dessa espécie animal. O objetivo deste trabalho foi avaliar três diferentes concentrações (100, 200 e 400µg) dos toxóides recombinantes α e ß de C. perfringens na imunização de equinos, bem como comparar com um grupo vacinado com um toxóide comercial. A vacina comercial não se mostrou capaz de estimular uma resposta imune e a vacina recombinante foi capaz de induzir resposta imune humoral satisfatória em equinos vacinados, provando ser uma alternativa profilática para infecção por C. Perfringens.(AU)

Clostridium perfringens α and ß recombinant toxoids in equine immunization / Toxóides recombinantes α e ß de Clostridium perfringens na imunização de equinos

Clostridium perfringens is considered one of the main causative agents of superacute enterocolitis, usually fatal in the equine species, due to the action of the ß toxin, and is responsible for causing severe myonecrosis, by the action of the α toxin. The great importance of this agent in the equine economy is due to high mortality and lack of vaccines, which are the main form of prevention, which guarantee the immunization of this animal species. The aim of this study was to evaluate three different concentrations (100, 200 and 400µg) of C. perfringens α and ß recombinant toxoids in equine immunization and to compare with a group vaccinated with a commercial toxoid. The commercial vaccine was not able to stimulate an immune response and the recombinant vaccine was able to induce satisfactory humoral immune response in vaccinated horses, proving to be an alternative prophylactic for C. perfringens infection.(AU)

Clostridium perfringens é considerado um dos principais agentes causadores de enterocolites superagudas, geralmente fatais na espécie equina, devido à ação da toxina ß, além de ser responsável por causar quadros graves de mionecrose, pela ação da toxina α. A grande importância desses agentes na equinocultura, deve-se a elevada mortalidade e a inexistência de vacinas, principal forma de prevenção, que garantam a imunização dessa espécie animal. O objetivo deste trabalho foi avaliar três diferentes concentrações (100, 200 e 400µg) dos toxóides recombinantes α e ß de C. perfringens na imunização de equinos, bem como comparar com um grupo vacinado com um toxóide comercial. A vacina comercial não se mostrou capaz de estimular uma resposta imune e a vacina recombinante foi capaz de induzir resposta imune humoral satisfatória em equinos vacinados, provando ser uma alternativa profilática para infecção por C. Perfringens.(AU)

Construction and characterization of a recombinant vaccine encoding the nucleocapsid protein gene of avian infectious bronchitis virus / Construção e caracterização de uma vacina recombinante codificando o gene da proteina do nucleocapsideo do virus da bronquite infecciosa das galinhas

A vacinação é a forma mais utilizada para prevenir a bronquite infecciosa causada pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Contudo, as vacinas convencionais são incapazes de diferenciar aves infectadas de vacinadas. No presente trabalho foi construído, caracterizado, e avaliado como candidato vacinal, um adenovírus recombinante expressando o gene N do IBV. O gene N foi clonado em um adenovírus humano tipo 5 defectivo e transfectado para as células HEK-293A para gerar rAd5_N. Após o vetor ser obtido como esperado e a confirmação da expressão da proteína N em HEK-293ª, foi realizada inoculação pela via oculo-nasal na dose de 10 7 TCID 50 /0,1mL para imunização de galinhas livres de patógenos específicos (SPF). A resposta imunológica do Ad5_N e a proteção contra o desafio ao IBV foram avaliadas e comparadas com uma vacina viva comercial. Não foram detectados anticorpos anti-IBV em aves vacinadas com o Ad5_N. A vacina comercial induziu anticorpos detectáveis a partir do 7º dia pós-vacinal. Em aves vacinadas com o Ad5_N não houve aumento na expressão de IFNγ. Neste estudo, o rAd5_N obtido não conferiu proteção contra desafio com IBV-M41. Os resultados indicam a necessidade de avaliar adenovírus recombinantes expressando outros genes do IBV.(AU)

Construction and characterization of a recombinant vaccine encoding the nucleocapsid protein gene of avian infectious bronchitis virus / Construção e caracterização de uma vacina recombinante codificando o gene da proteina do nucleocapsideo do virus da bronquite infecciosa das galinhas

A vacinação é a forma mais utilizada para prevenir a bronquite infecciosa causada pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Contudo, as vacinas convencionais são incapazes de diferenciar aves infectadas de vacinadas. No presente trabalho foi construído, caracterizado, e avaliado como candidato vacinal, um adenovírus recombinante expressando o gene N do IBV. O gene N foi clonado em um adenovírus humano tipo 5 defectivo e transfectado para as células HEK-293A para gerar rAd5_N. Após o vetor ser obtido como esperado e a confirmação da expressão da proteína N em HEK-293ª, foi realizada inoculação pela via oculo-nasal na dose de 10 7 TCID 50 /0,1mL para imunização de galinhas livres de patógenos específicos (SPF). A resposta imunológica do Ad5_N e a proteção contra o desafio ao IBV foram avaliadas e comparadas com uma vacina viva comercial. Não foram detectados anticorpos anti-IBV em aves vacinadas com o Ad5_N. A vacina comercial induziu anticorpos detectáveis a partir do 7º dia pós-vacinal. Em aves vacinadas com o Ad5_N não houve aumento na expressão de IFNγ. Neste estudo, o rAd5_N obtido não conferiu proteção contra desafio com IBV-M41. Os resultados indicam a necessidade de avaliar adenovírus recombinantes expressando outros genes do IBV.(AU)

Safety and immunogenicity of a glycoprotein E gene-deleted bovine herpesvirus 1 strain as a candidate vaccine strain / Atenuação e imunogenicidade de uma cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 1 defectiva na glicoproteína E

A glycoprotein E-deleted Brazilian bovine herpesvirus 1 (BoHV-1gE) was tested regarding to safety and immunogenicity. Intramuscular inoculation of young calves with a high virus dose did not result in clinical signs or virus shedding during acute infection or after dexamethasone administration. Calves vaccinated once IM (group I) or subcutaneously (group II) with live BoHV-1gE or twice with inactivated virus plus aluminum hydroxide (group IV) or Montanide (group V) developed VN titers of 2 to 8 (GMT:2); 2 to 4 (GMT:1.65); 2 to 16 (GMT:2.45) and 2 to 128 (GMT:3.9), respectively. All BoHV-1gE vaccinated calves remained negative in an anti-gE ELISA. Lastly, six young calves vaccinated with live BoHV-1gE and subsequently challenged with a virulent BoHV-1 strain shed less virus and developed only mild and transient nasal signs comparing to unvaccinated calves. Thus, the recombinant BoHV-1gE is safe and immunogenic for calves and allows for serological differentiation by a gE-ELISA test.(AU)

Um isolado brasileiro de herpesvírus bovino tipo 1, contendo uma deleção na glicoproteína E (gE - BoHV-1gE) foi submetido a testes para avaliar a sua segurança e imunogenicidade em bovinos. Bezerros foram submetidos à inoculação intramuscular com uma alta dose viral e não demonstraram sinais clínicos ou excreção viral durante a fase aguda ou após tentativa de reativação viral pela administração de dexametasona. Bezerros que receberam uma dose do vírus vivo, contendo a deleção na gE, pela via intramuscular (grupo I) ou pela via subcutânea (grupo II) ou duas doses do vírus inativado utilizando o adjuvante hidróxido de alumínio (grupo IV) ou Montanide (grupo V), desenvolveram títulos de anticorpos neutralizantes de 2 a 8 (GMT: 2); 2 a 4 (GMT: 1,65); 2 a 16 (GMT: 2,25) e de 2 a 128 (GMT: 3,9), respectivamente. Todos os bezerros vacinados se mantiveram soronegativos quando utilizado um kit ELISA específico para a gE. Para o teste de segurança, seis bezerros foram vacinados com o vírus vivo BoHV-1gE, sendo estes posteriormente desafiados com uma cepa virulenta de BoHV-1. Estes bezerros excretaram menos vírus e desenvolveram apenas sinais clínicos moderados e transitórios quando comparados com dados coletados de quatro animais não-vacinados. Com base nestes resultados, podemos confirmar que o vírus do BoHV-1 que contém a deleção na gE (BoHV-1gE) é seguro e suficientemente imunogênico para bezerros e permite a diferenciação sorológica entre os animais vacinados e infectados perante a a um teste ELISA commercial específico para a gE.(AU)

Safety and immunogenicity of a glycoprotein E gene-deleted bovine herpesvirus 1 strain as a candidate vaccine strain / Atenuação e imunogenicidade de uma cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 1 defectiva na glicoproteína E

A glycoprotein E-deleted Brazilian bovine herpesvirus 1 (BoHV-1gEΔ) was tested regarding to safety and immunogenicity. Intramuscular inoculation of young calves with a high virus dose did not result in clinical signs or virus shedding during acute infection or after dexamethasone administration. Calves vaccinated once IM (group I) or subcutaneously (group II) with live BoHV-1gEΔ or twice with inactivated virus plus aluminum hydroxide (group IV) or Montanide™ (group V) developed VN titers of 2 to 8 (GMT:2); 2 to 4 (GMT:1.65); 2 to 16 (GMT:2.45) and 2 to 128 (GMT:3.9), respectively. All BoHV-1gEΔ vaccinated calves remained negative in an anti-gE ELISA. Lastly, six young calves vaccinated with live BoHV-1gEΔ and subsequently challenged with a virulent BoHV-1 strain shed less virus and developed only mild and transient nasal signs comparing to unvaccinated calves. Thus, the recombinant BoHV-1gEΔ is safe and immunogenic for calves and allows for serological differentiation by a gE-ELISA test.(AU)

Um isolado brasileiro de herpesvírus bovino tipo 1, contendo uma deleção na glicoproteína E (gE - BoHV-1gEΔ) foi submetido a testes para avaliar a sua segurança e imunogenicidade em bovinos. Bezerros foram submetidos à inoculação intramuscular com uma alta dose viral e não demonstraram sinais clínicos ou excreção viral durante a fase aguda ou após tentativa de reativação viral pela administração de dexametasona. Bezerros que receberam uma dose do vírus vivo, contendo a deleção na gE, pela via intramuscular (grupo I) ou pela via subcutânea (grupo II) ou duas doses do vírus inativado utilizando o adjuvante hidróxido de alumínio (grupo IV) ou Montanide™ (grupo V), desenvolveram títulos de anticorpos neutralizantes de 2 a 8 (GMT: 2); 2 a 4 (GMT: 1,65); 2 a 16 (GMT: 2,25) e de 2 a 128 (GMT: 3,9), respectivamente. Todos os bezerros vacinados se mantiveram soronegativos quando utilizado um kit ELISA específico para a gE. Para o teste de segurança, seis bezerros foram vacinados com o vírus vivo BoHV-1gEΔ, sendo estes posteriormente desafiados com uma cepa virulenta de BoHV-1. Estes bezerros excretaram menos vírus e desenvolveram apenas sinais clínicos moderados e transitórios quando comparados com dados coletados de quatro animais não-vacinados. Com base nestes resultados, podemos confirmar que o vírus do BoHV-1 que contém a deleção na gE (BoHV-1gEΔ) é seguro e suficientemente imunogênico para bezerros e permite a diferenciação sorológica entre os animais vacinados e infectados perante a a um teste ELISA commercial específico para a gE.(AU)

Heterologous expression, protein folding and antibody recognition of a neurotoxin from the Mexican coral snake Micrurus laticorallis

Background The cysteine-rich neurotoxins from elapid venoms are primarily responsible for human and animal envenomation; however, their low concentration in the venom may hamper the production of efficient elapid antivenoms. Therefore, the aim of the present study was to produce fully active elapid neurotoxic immunogens for elapid antivenom production. Method Cysteine-rich neurotoxins showed recombinant expression in two strains of E. coli, and were purified using affinity chromatography and reverse-phase HPLC (rpHPLC). Results The cDNA of the four disulfide-bridged peptide neurotoxin Mlat1 was cloned into a modified expression vector, pQE30, which was transfected into two different E. coli strains. The recombinant toxin (HisrMlat1) was found only in inclusion bodies in M15 strain cells, and in both inclusion bodies and cytoplasm in Origami strain cells. The HisrMlat1 from inclusion bodies from M15 cells was solubilized using guanidine hydrochloride, and then purified by rpHPLC. It showed various contiguous fractions having the same molecular mass, indicating that HisrMlat1 was oxidized after cell extraction forming different misfolded disulfide bridge arrangements without biological activity. In vitro folding conditions of the misfolded HisrMlat1 generated a biologically active HisrMlat1. On the other hand, the HisrMlat1 from the cytoplasm from Origami cells was already soluble, and then purified by HPLC. It showed a single fraction with neurotoxic activity; so, no folding steps were needed. The in vitro folded HisrMlat1 from M15 cells and the cytoplasmic soluble HisrMlat1from Origami cells were indistinguishable in their structure and neurotoxicity. Rabbit polyclonal antibodies raised up against biologically active HisrMlat1 recognized the native Mlat1 (nMlat1) from the whole venom of M. laticorallis. In addition, HisrMlat1 was recognized by horse polyclonal antibodies obtained from the immunization of elapid species from sub-Saharan Africa. Conclusion HisrMlat1 shows increased biological activities compared to the native peptide, and may be used as an immunizing agent in combination with other toxic components such phospholipases type A2 for elapid antivenom production.(AU)

Heterologous expression, protein folding and antibody recognition of a neurotoxin from the Mexican coral snake Micrurus laticorallis

The cysteine-rich neurotoxins from elapid venoms are primarily responsible for human and animal envenomation; however, their low concentration in the venom may hamper the production of efficient elapid antivenoms. Therefore, the aim of the present study was to produce fully active elapid neurotoxic immunogens for elapid antivenom production. Method Cysteine-rich neurotoxins showed recombinant expression in two strains of E. coli, and were purified using affinity chromatography and reverse-phase HPLC (rpHPLC). Results The cDNA of the four disulfide-bridged peptide neurotoxin Mlat1 was cloned into a modified expression vector, pQE30, which was transfected into two different E. coli strains. The recombinant toxin (HisrMlat1) was found only in inclusion bodies in M15 strain cells, and in both inclusion bodies and cytoplasm in Origami strain cells. The HisrMlat1 from inclusion bodies from M15 cells was solubilized using guanidine hydrochloride, and then purified by rpHPLC. It showed various contiguous fractions having the same molecular mass, indicating that HisrMlat1 was oxidized after cell extraction forming different misfolded disulfide bridge arrangements without biological activity. In vitro folding conditions of the misfolded HisrMlat1 generated a biologically active HisrMlat1. On the other hand, the HisrMlat1 from the cytoplasm from Origami cells was already soluble, and then purified by HPLC. It showed a single fraction with neurotoxic activity; so, no folding steps were needed. The in vitro folded HisrMlat1 from M15 cells and the cytoplasmic soluble HisrMlat1from Origami cells were indistinguishable in their structure and neurotoxicity. Rabbit polyclonal antibodies raised up against biologically active HisrMlat1 recognized the native Mlat1 (nMlat1) from the whole venom of M. laticorallis. In addition, HisrMlat1 was recognized by horse polyclonal antibodies obtained from the immunization of elapid species from sub-Saharan Africa. Conclusion HisrMlat1 shows increased biological activities compared to the native peptide, and may be used as an immunizing agent in combination with other toxic components such phospholipases type A2 for elapid antivenom production.(AU)

Heterologous expression, protein folding and antibody recognition of a neurotoxin from the Mexican coral snake Micrurus laticorallis

The cysteine-rich neurotoxins from elapid venoms are primarily responsible for human and animal envenomation; however, their low concentration in the venom may hamper the production of efficient elapid antivenoms. Therefore, the aim of the present study was to produce fully active elapid neurotoxic immunogens for elapid antivenom production. Method Cysteine-rich neurotoxins showed recombinant expression in two strains of E. coli, and were purified using affinity chromatography and reverse-phase HPLC (rpHPLC). Results The cDNA of the four disulfide-bridged peptide neurotoxin Mlat1 was cloned into a modified expression vector, pQE30, which was transfected into two different E. coli strains. The recombinant toxin (HisrMlat1) was found only in inclusion bodies in M15 strain cells, and in both inclusion bodies and cytoplasm in Origami strain cells. The HisrMlat1 from inclusion bodies from M15 cells was solubilized using guanidine hydrochloride, and then purified by rpHPLC. It showed various contiguous fractions having the same molecular mass, indicating that HisrMlat1 was oxidized after cell extraction forming different misfolded disulfide bridge arrangements without biological activity. In vitro folding conditions of the misfolded HisrMlat1 generated a biologically active HisrMlat1. On the other hand, the HisrMlat1 from the cytoplasm from Origami cells was already soluble, and then purified by HPLC. It showed a single fraction with neurotoxic activity; so, no folding steps were needed. The in vitro folded HisrMlat1 from M15 cells and the cytoplasmic soluble HisrMlat1from Origami cells were indistinguishable in their structure and neurotoxicity. Rabbit polyclonal antibodies raised up against biologically active HisrMlat1 recognized the native Mlat1 (nMlat1) from the whole venom of M. laticorallis. In addition, HisrMlat1 was recognized by horse polyclonal antibodies obtained from the immunization of elapid species from sub-Saharan Africa. Conclusion HisrMlat1 shows increased biological activities compared to the native peptide, and may be used as an immunizing agent in combination with other toxic components such phospholipases type A2 for elapid antivenom production.

Canarypox virus expressing infectious bursal disease VP2 protein as immunogen for chickens

Canarypox viruses (CNPV) carrying the coding sequence of VP2 protein from infectious bursal disease virus (IBDV) were obtained. These viruses were able to express VP2 protein in vitro and to induce IBDV-neutralizing antibodies when inoculated in specific pathogen-free chickens demonstrating that CNPV platform is usefulness to develop immunogens for chickens.

Canarypox virus expressing infectious bursal disease VP2 protein as immunogen for chickens

Canarypox viruses (CNPV) carrying the coding sequence of VP2 protein from infectious bursal disease virus (IBDV) were obtained. These viruses were able to express VP2 protein in vitro and to induce IBDV-neutralizing antibodies when inoculated in specific pathogen-free chickens demonstrating that CNPV platform is usefulness to develop immunogens for chickens.(AU)

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE E PREVENÇÃO DA INFECÇÃO CONGÊNITA EM CAMUNDONGOS BALB/c IMUNIZADOS COM AS SUBUNIDADES RECOMBINANTES rsNcSAG4 e rsNcGRA1 DERIVADAS DE Neospora caninum

Neospora caninum é um protozoário de distribuição mundial e grande impacto econômico relacionado à infecção no rebanho bovino, que está associada a falha reprodutiva e também a redução da produtividade. Atualmente, não há tratamento ou vacina disponível. Diversos antígenos do protozoário possuem características imunogênicas potenciais, e dentre estes estão as proteínas NcGRA1 e NcSAG4. No sentido de avaliar a imunogenicidade vacinal destes antígenos, duas subunidades recombinantes foram construídas por predição de epítopos imunogênicos e denominados rsNcGRA1 e rsNcSAG4. As subunidades foram expressas em Komagataella phaffii, purificados e caracterizados quanto a sua antigenicidade. As vacinas foram formuladas como imunógenos monovalentes ou combinações em pares, onde diferentes concentrações foram avaliadas em associação ao uso do adjuvante saponina, e então foram avaliados em camundongos da linhagem Balb/c gestantes submetidas ao desafio com taquizoítos (NC1). Em todos os grupos imunizados, foi verificada a resposta imune específica contra as respectivas proteínas com pico de produção após três imunizações. As formulações contendo as subunidades combinadas destacaram uma potencialização na resposta da produção de anticorpos, sugerindo um efeito sinérgico e atingindo os melhores resultados, onde o efeito da estimulação do sistema imune pela ação das subunidades não foi relacionado a nenhum efeito adverso. Foi demonstrado o predomínio de uma resposta Th2 com produção de IgG1, IL6 e IFN. A utilização das subunidades rsNcSAG4 e rsNcGRA1 utilizadas em uma formulação combinada, na dose de 50µg de antígeno, foram capazes de induzir uma resposta humoral significativa com redução na manifestação clínica, mortalidade e transmissão vertical. Os resultados demonstraram que a vacinação com as subunidades recombinantes desenvolvidas foi capaz de induzir uma resposta imune protetora contra N. caninum em camundongos Balb/c e apontam para investigações futuras em modelo ruminante.

Neospora caninum is a protozoan of worldwide distribution and great economic impact related to infection in the bovine herd, which is associated with reproductive failure and also the reduction of productivity. Currently, there is no treatment or vaccine available. Several protozoan antigens have potential immunogenic characteristics, among which are NcGRA1 and NcSAG4 proteins. In order to evaluate the immunogenicity of these antigens, two recombinant subunits were constructed by predicting immunogenic epitopes and named rsNcGRA1 and rsNcSAG4. The subunits were expressed in Komagataella phaffii, purified and characterized for their antigenicity. Vaccines were formulated as monovalent immunogens or combinations in pairs, where different concentrations were evaluated in association with the use of adjuvant saponin, and were then evaluated in pregnant Balb/c mice challenged with tachyzoites (NC1). In all immunized groups, the specific immune response against the respective peak-producing proteins was verified after three immunizations. The formulations containing the combined subunits highlighted a potentiation in the response of the antibody production, suggesting a synergistic effect and reaching the best results, where the effect of stimulation of the immune system by the action of the subunits was not related to any adverse effect. The predominance of a Th2 response with IgG1, IL6 and IFN production was demonstrated. The use of the rsNcSAG4 and rsNcGRA1 subunits used in a combined formulation at a dose of 50 g of antigen were able to induce a significant humoral response with reduction in clinical manifestation, mortality and vertical transmission. The results demonstrated that vaccination with the recombinant subunits developed was able to induce a protective immune response against N. caninum in Balb/c mice and point to future investigations in a ruminant model.

Assessment of the effectiveness of the PPD-mallein produced in Brazil for diagnosing glanders in mules

To assess the potency of the PPD-mallein produced in Brazil, five animals were from a property identified as a focus of glanders. These animals had suggestive clinical signs of the disease and the other five, from a property free from glanders, showed no clinical signs and were serology negative (control group). PPD-mallein from Burkholderia mallei was obtained by precipitation with trichlo-roa-cetic acid and ammonium sulfate. The animals were inoculated according to the criteria established by Department of Agriculture, Livestock and Supply (MAPA) for the diagnosis of glanders. After 48 h of application of PPD-mallein, there was swelling in the area of application, presence of ocular secretion and tears in sick animals. The control group showed no inflammatory reaction at the site of inoculation of PPD-mallein. This immunogen produced in Brazil and still being tested was effective for identifying the infection in true positive animals and excluding the truly negative ones, being a new possibility for diagnosis and control of glanders.(AU)

PROSPECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTÍGENOS MIMÉTICOS DE AFLATOXINA OBTIDOS POR PHAGE DISPLAY COM VALIDAÇÃO DO POTENCIAL IMUNOGÊNICO

A biotecnologia de phage display pode ser utilizada em uma grande variedade de aplicações, como a seleção de fagos que mimetizam a aflatoxina, um metabólito fúngico que compromete a saúde pública e a produção animal, causando doença hepática severa, neoplasias e perdas econômicas. Na técnica de phage display, bibliotecas de fagos podem ser rastreadas para seleção de peptídeos ligantes de anticorpos: a vacinação com estes fagos induz a produção de anticorpos anti-peptídeo que também podem reconhecer o antígeno original. Desta forma, os objetivos do presente trabalho foram selecionar clones altamente reativos miméticos de aflatoxina B1, buscando o desenvolvimento de imunógenos capazes de induzir a produção de anticorpos anti-aflatoxina. As adequações da técnica de phage display previamente estabelecida permitiram a prospecção dos clones miméticos de aflatoxina 3P8, 3P13, 3P16, 3P20, 3P23 e 3P30 que foram ligantes de anticorpo monoclonal anti-AFB1. Os resultados dos imunoensaios executados indicaram a alta especificidade de peptídeos expressos por estes fagos em mimetizar in vitro as características imunológicas correspondentes à AFB1 em anticorpo específico anti-AFB1. Desta forma, foi observado que a reatividade do fago com o anticorpo foi dependente das concentrações de fago estabelecidas, assim como não houve reatividade frente a moléculas irrelevantes. Fagos expressando mimotopos de baixa reatividade (como o fago 3P25 e o fago silvestre) não foram capazes de estabelecer esta condição, indicando que os mimotopos selecionados corresponderam complementarmente ao sítio de ligação ao antígeno em anticorpo anti-AFB1. A partir da sequência aminoacídica obtida dos mimotopos selecionados, QTDLDYLHPLINSWN, o peptídeo mimético de aflatoxina foi sintetizado e conjugado à molécula carreadora para validação do potencial imunogênico. O resultado das estratégias de imunização com mimotopos e peptídeo sintético indicou que os imunógenos foram eficientes na indução de anticorpo anti-peptídeo que também foi capaz de reconhecer o antígeno original. Portanto, o mimetismo molecular do peptídeo selecionado por phage display foi confirmado, permitindo o emprego do fago como imunógeno para o desenvolvimento de uma vacina de subunidades, através do encapsulamento em nanopartículas de quitosana. Este biopolímero permitiu a administração intranasal do imunógeno e o reconhecimento do antígeno pelo sistema imune de mucosa, configurando uma plataforma eficiente na indução de anticorpos específicos anti-aflatoxina. A proposta desse modelo vacinal para o controle de micotoxinas constitui uma nova linha de pesquisa na medicina veterinária e uma alternativa para o desenvolvimento da produção animal. Posteriormente, esta abordagem racional poderá ser aplicada a outras micotoxinas que afetam as populações humana e animal.

Phage display biotechnology is a widely applied technology, and has been proven as useful tool in selecting peptides epitopes that mimic antigens such as aflatoxin, a fungal metabolite that compromises animal production and human health, leading to severe liver intoxication, cancer and economic losses. By phage display technique, phage libraries could be screened for selection of mimotopes, small peptides that structurally mimic a given antibody-binding site of an epitope. Active immunization based on these mimotopes induced antibodies that recognized the mimicked epitope. In the study reported herein highly reactive clones that mimicry the immunological specificity of aflatoxin B1 were selected, seeking the development of immunogens capable to induce the production of anti-aflatoxin antibodies. Through adaptations of the previously established phage display technique the 3P8, 3P13, 3P16, 3P20, 3P23 and 3P30 clones were selected for being antigen-binding site specific ligands in anti-AFB1 monoclonal antibody. The immunoassays performed indicated high specificity of phage-displayed peptides in mimicking in vitro the immunological characteristics corresponding to AFB1 in specific antibody. The specificity was defined by the ability of a clone to be identified only by its cognate target anti-AFB1 monoclonal and polyclonal antibodies among different irrelevant ligands. Any clone showed specificity for BSA or irrelevant murine IgG. However, some clones 3P4, 3P5 and 3P16 exhibited recognition against the irrelevant monoclonal and rabbit polyclonal antibodies, which indicates that these clones were less specific than other selected clones. The affinity-selected phages exhibited a concentration-dependence profile: the reduction on phage concentration from 1011 to 108 pfu mL-1 causes a decreased reactivity towards the anti-AFB1 monoclonal antibody, while any interference was observed with the irrelevant phage 3P25 or WTP. These results also indicate that the phage-displayed peptides represented the binding site of the aforementioned antibody. Therefore, the peptide sequence of the selected mimotopes, QTDLDYLHPLINSWN, was synthesized and conjugated to protein carriers to validate the immunogenic potential. Immunization of mice with phage-displayed mimotopes and synthetic peptide suggested that the immunogens were efficiently specific in the induction of anti-AFB1 antibodies. Thus, the molecular mimicry of selected peptide was confirmed as an immunogen for development of epitope-based vaccine by encapsulation of bacteriophage into chitosan nanoparticles. This biopolymer allowed the intranasal administration of the immunogen and recognition of the antigen by the mucosal immune system, providing an efficient platform for the induction of specific anti-aflatoxin antibodies. The proposal of a vaccine model for the control of mycotoxins establishes a new research line in veterinary medicine and an alternative for the development of animal production. Hereafter, this rational approach may be applied to other mycotoxins that affect human and animal populations.

Produção e Purificação de Toxinas e Antitoxinas Clostridiais

O objetivo deste trabalho foi produzir, purificar e avaliar as toxinas e antitoxinas C e D de Clostridium botulinum, beta e épsilon de Clostridium perfringens, bem como compará-las aos padrões existentes utilizados pelos órgãos oficiais, visando suas utilizações em pesquisas para a produção de novas vacinas, desenvolvimento e implementação de métodos alternativos para diagnóstico e controle de vacinas clostridiais. A produção das toxinas foi realizada por meio do cultivo das estirpes em meios específicos para cada espécie em biorreator de bancada. As toxinas C e D de C. botulinum foram purificadas por filtração em gel. A toxina beta de C. perfringens tipo C foi purificada por meio de cromatografia por afinidade metálica, utilizando o zinco como agente quelante. A toxina épsilon de C. perfringens tipo D foi purificada por cromatografia de troca aniônica. As imunoglobulinas G e Y foram produzidas pela múltipla imunização de ovinos e galinhas, respectivamente, com as toxinas purificadas inativadas e conjugadas ao adjuvante de Freund. Posteriormente, as IgG foram purificadas por meio das precipitações por ácido caprílico e sulfato de amônio; e as IgY foram purificadas pela precipitação por sulfato de amônio. As toxinas C e D de C. botulinum foram purificadas ao nível de várias bandas em gel de SDS-PAGE, as quais representam as toxinas, suas subunidades e proteínas auxiliares associadas. A toxina beta de C. perfringens tipo C foi purificada ao nível de uma banda de alta intensidade em gel, e poucas bandas com alto peso molecular e de fraca intensidade que podem se tratar de formas oligomerizadas da toxina. A toxina épsilon de C. perfringens tipo D foi purificada ao nível de uma banda de altíssima intensidade em gel de SDS-PAGE, e poucas bandas de alto peso molecular e de baixíssimas intensidades. As toxinas padrões produzidas por este estudo apresentaram rendimentos proteicos e purezas superiores aos padrões oficiais. As IgG e IgY produzidas e purificadas obtiveram altos títulos, evidenciando a qualidade dos imunógenos e da purificação das imunoglobulinas. Além disso, apresentaram altos índices de avidez, maiores que os índices dos padrões oficiais, evidenciando a qualidade superior dos insumos produzidos por este estudo. O presente trabalho produziu insumos, toxinas e antitoxinas clostridiais, com altos graus de pureza e de qualidade superior aos insumos oficiais nacionais, podendo ser utilizados para o desenvolvimento de novos métodos diagnósticos, vacinas e metodologias de controle da qualidade das vacinas.

The objective of this work was to produce, purify and analyze the toxins and antitoxins C and D from Clostridium botulinum, beta and epsilon from Clostridium perfringens, as well as to compare them to the existing standards used by the official organs, aiming their uses in research for the production of new vaccines, development of alternative diagnostic methods and quality control of vaccines. The production of the toxins was carried out by fermentation of the strains in specific media for each species in a bench bioreactor. C. botulinum C and D toxins were purified by gel filtration. C. perfringens type C beta toxin was purified by immobilized-metal affinity chromatography using zinc as a chelating agent. C. perfringens type D epsilon toxin was purified by anion exchange chromatography. Immunoglobulins G and Y were produced by multiple immunization of sheep and chickens, respectively, with inactivated purified toxins in Freund's adjuvant. Subsequently, IgG were purified by precipitation by caprylic acid and ammonium sulfate, and the IgY were purified by ammonium sulfate precipitation. C. botulinum C and D toxins were purified to the level of several SDS-PAGE gel bands, which represent the toxins, their subunits and accessory proteins associated. C. perfringens type C beta toxin was purified to the level of a high intensity gel band, and few bands of high molecular weight and low intensity which may be oligomerized forms of the toxin. C. perfringens type D epsilon toxin was purified to the level of a very high intensity gel band, and few bands of high molecular weight and very low intensities. The standard toxins produced by this study showed higher yields of protein and higher purity when compared to the official standards. The produced and purified IgG and IgY obtained high titers, revealing the quality of the immunogens and purification methods. In addition, they presented high avidity indexes, higher than the indexes of the official standards, indicating the superior quality of the products generated by this study. The present work produced clostridial toxins and antitoxins with high purity levels and superior quality when compared to the official national ones, and they can be applied for the development of new diagnostic methods, vaccines and methodologies for quality control of vaccines.