Effects of time-dependent degradation and freezing on biomechanical properties of healthy bovine jejunum / Efeitos da degradação dependente do tempo e do congelamento sobre as propriedades biomecânicas do jejuno bovino saudável

Degradation of bovine small intestine and respective effects on biomechanics have not been described to date. Biomechanical testing of intestinal tissues is often carried out within a few hours of donor death and tissue deterioration is not accounted for. Freezing is efficient for the preservation of several tissues; however, it may cause cellular damage. This study investigated the morphologic and biomechanical changes of bovine jejunum at different postmortem moments. Effects of freezing and thawing on morphology and biomechanical behavior were also examined. Macroscopic changes were first noted within eight hours of death. At this time, histologic changes also started to set in, and biomechanical tests revealed lower bursting pressure (203.10±46.14mmHg). At 12 hours, tissue rearrangement was noted, and bursting pressure increased (238.43±31.04mmHg). A second drop in pressure was detected at 18 hours (235.20±38.21mmHg), followed by a progressive drop until the end of the experimental period. Histologic changes revealed progressive deterioration. Mechanical resistance did not differ between thawed and fresh specimens. It was concluded that bovine jejunal specimens retain biomechanical resistance up to 6 hours after death. Freezing and thawing did not affect the mechanical resistance of the intestinal wall in this experimental model.

A degradação do intestino delgado de bovinos e seu efeito biomecânico não são descritos na literatura. Trabalhos que envolvem a biomecânica intestinal realizam os ensaios em poucas horas após o óbito dos doadores, sem avaliação de seu estado de deterioração. O congelamento é eficiente na conservação de vários tecidos, porém pode provocar danos em nível celular. Este estudo teve por objetivo avaliar a degradação morfológica e biomecânica do jejuno de bovinos em diferentes tempos post mortem. O efeito do congelamento e do descongelamento sobre essas características também foi avaliado. As primeiras alterações macroscópicas foram observadas oito horas após o óbito. No mesmo momento, se iniciaram as alterações histológicas e a menor pressão suportada ao teste biomecânico (203,10±46,14mmHg). A partir de 12 horas, o tecido sofreu um rearranjo, suportando maior pressão (238,43±31,04mmHg). Uma segunda queda foi detectada após 18 horas (235,20±38,21mmHg), seguida de redução progressiva até o término do experimento. As lesões histológicas foram progressivas e graduais. As amostras testadas após descongelamento não apresentaram diferença estatística quanto à resistência mecânica em comparação com os espécimes frescos. Concluiu-se que as amostras mantêm sua resistência biomecânica até 6 horas após o óbito. Também se mostrou que o congelamento e o descongelamento, nas condições testadas, não alteraram a resistência mecânica da parede intestinal.

Carcass characteristics and sensorial evaluation of meat from Nellore steers and crossbred Angus vs. Nellore bulls / Características de carcaça e avaliação sensorial da carne de novilhos Nelore e touros cruzados Angus vs. Nelore

This study evaluated animal performance, carcass characteristics and meat quality of 36-month old Nellore steers finished in pastures (n = 10) and 20-month old Angus vs. Nellore bulls finished in feedlot (n = 10). Final body weight, carcass weight, characteristics, conformation and fat thickness, were higher (p 0.05) throughout the ageing period for the Angus vs. Nellore bulls, but higher in meat from the Nellore steers (p 0.05) on meat a* value (redness). Likewise, ageing time had no effect on a* in both genetic groups, and genetic group had no effect (p > 0.05) on meat b* value (yellowness). On the other hand, b* was increased after day 7 of ageing for the bulls from the two genetic groups. Thawing and cooking losses were lower for Nellore steers after day 7 of aging (p 0.05) on lipid oxidation; however, lipid oxidation increased after day7. Meat from Nellore steers contained a higher percentage of saturated fatty acids (SFA), a lower percentage of unsaturated (UFA) and monounsaturated fatty acids (MUFA) and a similar percentage of polyunsaturated fatty acids (PUFA) than the meat from Angus vs. Nellore bulls.

Este estudo foi realizado para avaliar o desempenho animal, características de carcaça e qualidade da carne de novilhos Nelore terminados em pastagens e abatidos aos 36 meses de idade (n = 10) e machos não castrados Angus vs. Nelores abatidos aos 20 meses de idade (n = 10). O peso final, peso, características e conformação da carcaça e espessura de gordura de cobertura foram maiores (p 0,05) ao longo da maturação para os mestiços Angus vs. Nelores; enquanto que o valor de L* da carne dos novilhos Nelores aumentou (p 0,05) sobre o valor de a* (cor vermelha). Da mesma forma, o tempo de maturação não teve efeito (p > 0,05) para os animais dos dois grupos genéticos. O grupo genético não teve efeito (p > 0,05) sobre o valor de b* (cor amarela). Por outro lado, o tempo de maturação aumentou o valor de b* após o sétimo dia para os animais dos dois grupos genéticos. A perda por descongelamento e cocção foi menor (p 0,05) sobre a oxidação de lipídeos; no entanto, a oxidação de lipídeos aumentou após o sétimo dia.

Carcass characteristics and sensorial evaluation of meat from Nellore steers and crossbred Angus vs. Nellore bulls / Características de carcaça e avaliação sensorial da carne de novilhos Nelore e touros cruzados Angus vs. Nelore

This study evaluated animal performance, carcass characteristics and meat quality of 36-month old Nellore steers finished in pastures (n = 10) and 20-month old Angus vs. Nellore bulls finished in feedlot (n = 10). Final body weight, carcass weight, characteristics, conformation and fat thickness, were higher (p < 0.001) for the Nellore steers than for Angus vs. Nellore bulls. Water losses during chilling (24hours, 4oC) were lower (p < 0.05) for Nellore steers than for the Angus vs. Nellore bulls. Muscle percentage on the 6th rib was higher (p < 0.05) for the Nellore steers than for Angus vs. Nellore bulls; while bone percentage was lower (p < 0.05) for Nellore steers. After 7 and 14 days of ageing, the L* meat value was higher for the Nellore steers than for the Angus vs. Nellore bulls; the L* meat value was similar (p > 0.05) throughout the ageing period for the Angus vs. Nellore bulls, but higher in meat from the Nellore steers (p < 0.05). Genetic group had no effect (p > 0.05) on meat a* value (redness). Likewise, ageing time had no effect on a* in both genetic groups, and genetic group had no effect (p > 0.05) on meat b* value (yellowness). On the other hand, b* was increased after day 7 of ageing for the bulls from the two genetic groups. Thawing and cooking losses were lower for Nellore steers after day 7 of aging (p < 0.05). The meat of the Angus vs. Nellore bulls was more tender (p < 0.05) at all ageing times studied (1, 4, 7 and 14 days) than the meat of the Nellore steers. Genetic group had no effect (p > 0.05) on lipid oxidation; however, lipid oxidation increased after day7. Meat from Nellore steers contained a higher percentage of saturated fatty acids (SFA), a lower percentage of unsaturated (UFA) and monounsaturated fatty acids (MUFA) and a similar percentage of polyunsaturated fatty acids (PUFA) than the meat from Angus vs. Nellore bulls.(AU)

Este estudo foi realizado para avaliar o desempenho animal, características de carcaça e qualidade da carne de novilhos Nelore terminados em pastagens e abatidos aos 36 meses de idade (n = 10) e machos não castrados Angus vs. Nelores abatidos aos 20 meses de idade (n = 10). O peso final, peso, características e conformação da carcaça e espessura de gordura de cobertura foram maiores (p < 0,001) para os novilhos Nelores do que para os mestiços Angus vs. Nelores. As perdas de água durante o resfriamento (24 horas, 4º C) foram menores (p < 0,05) para os novilhos Nelores do que para os mestiços Angus vs. Nelores. A percentagem de músculo na 6ª costela foi maior (p < 0,05) para os novilhos Nelores do que para os mestiços Angus vs. Nelores; enquanto que a percentagem de osso foi menor (p < 0,05) para os novilhos Nelores. Após 7 e 14 dias de maturação, o valor de L* da carne foi maior (p < 0,05) para os novilhos Nelores do que para os mestiços Angus vs. Nelores. O valor de L* foi similar (p > 0,05) ao longo da maturação para os mestiços Angus vs. Nelores; enquanto que o valor de L* da carne dos novilhos Nelores aumentou (p < 0,05). O grupo genético não teve efeito (p > 0,05) sobre o valor de a* (cor vermelha). Da mesma forma, o tempo de maturação não teve efeito (p > 0,05) para os animais dos dois grupos genéticos. O grupo genético não teve efeito (p > 0,05) sobre o valor de b* (cor amarela). Por outro lado, o tempo de maturação aumentou o valor de b* após o sétimo dia para os animais dos dois grupos genéticos. A perda por descongelamento e cocção foi menor (p < 0,05) para os novilhos Nelores após o sétimo dia de maturação. A carne dos mestiços Angus vs. Nelores foi mais macia (p < 0,05) em todos os tempos de maturação (1, 4, 7 e 14 dias) do que a carne dos novilhos Nelores. O grupo genético não teve efeito (p > 0,05) sobre a oxidação de lipídeos; no entanto, a oxidação de lipídeos aumentou após o sétimo dia.(AU)

ADIÇÃO DE COLESTEROL LIGADO À CICLODEXTRINA NO PROCESSAMENTO DE ESPERMATOZOIDES EQUINOS CRIOPRESERVADOS E ADIÇÃO DE ESTIMULANTES DA MOTILIDADE NO PÓS DESCONGELAMENTO

Este estudo propôs avaliar o efeito da adição de colesterol ligado à ciclodextrina (CLC) antes do processo de criopreservação e estimulantes de motilidade após o descongelamento (Fert Talp - FT e Pentoxifilina - PTX), sobre a cinética espermática (MT, MP, RAP, VCL, VSL, VAP e LIN), integridade de membrana plasmática, produção de peróxido de hidrogênio intracelular, potencial mitocondrial, desestabilização da membrana plasmática e fertilidade in vivo. Foram criopreservados dois ejaculados de 12 garanhões e cada ejaculado foi subdividido em quatro grupos: G1 (sem CLC), G2 (1mg de CLC), G3 (1,5mg de CLC) e G4 (2mg de CLC). No experimento I o objetivo foi comparar os parâmetros espermáticos após a inclusão de CLC (G1-G4) e avaliar a longevidade celular pelo teste de Termorresitência - TTR após o descongelamento: imediatamente (T0), 40 minutos (T40), 80 minutos (T80) e 120 minutos (T120). Além disso, objetivou-se avaliar o potencial mitocondrial e a desestabilização da membrana. No experimento II o objetivo foi comparar os parâmetros espermáticos nos grupos anteriores (G1-G4), com e sem adição do estimulante FT (20% - v/v) após o descongelamento, quanto a longevidade celular (TTR - T0, T40, T80 e T120 minutos) e avaliar a produção de peróxido de hidrogênio intracelular. No experimento III o objetivo foi comparar os parâmetros espermáticos nos grupos anteriores (G1-G4), com e sem adição do estimulante PTX (20% - v/v) após o descongelamento, avaliar a longevidade celular (TTR - T0, T40, T80 e T120 minutos), avaliar a produção de peróxido de hidrogênio intracelular, o potencial mitocondrial e a desestabilização da membrana. Além disso, objetivou-se avaliar a fertilidade do sêmen criopreservado em três grupos: 1) Grupo controle (sem CLC); 2) Grupo 1,5mg de CLC; e 3) Grupo 1,5 mg de CLC + PTX. No experimento I, os grupos G3 e G4 apresentaram valores superiores de VCL, VSL e VAP. No T0 os parâmetros de MT e MP foram superiores no G3. Quanto ao potencial mitocondrial e a desestabilização da membrana não foram observadas diferenças significativas entre os grupos (p<0,05). No experimento II, a adição de FT foi benéfica à velocidade espermática (VCL, VSL e VAP) em alguns grupos experimentais e em tempos diferentes. O G2 com FT demonstrou maior percentual de células com membrana plasmática íntegra e sem peróxido de hidrogênio em comparação aos grupos sem adição do estimulante. No experimento III, a adição de PTX não foi benéfica aos parâmetros de cinética após o descongelamento ao decorrer do tempo em alguns grupos experimentais. No grupo G1 com PTX notou-se superioridade de células com membrana lesionada com peróxido de hidrogênio em comparação ao G4 com PTX e uma maior população celular com membranas íntegras sem peróxido de hidrogênio no grupo G4 com PTX em comparação ao G2 com PTX. A taxa de concepção nos grupos G1, G2 e G3 foram 50%, 66,7% e 66,7%, respectivamente. A adição de CLC melhorou os parâmetros cinéticos in vitro, sendo que as concentrações de 1,5 mg e 2 mg conferiram melhor resistência ao processo de criopreservação. A adição de FT conferiu longevidade e superioridade aos parâmetros de velocidade espermática. Em contrapartida, a adição do estimulante PTX, afetou a longevidade celular, demonstrando efeito prejudicial ao movimento espermático. Além disso, a inclusão de CLC não demostrou prejudicar a taxa de concepção em inseminações realizadas após a ovulação. Mediante os resultados encontrados no atual trabalho, pode-se concluir que as concentrações de CLC que melhor conferiram resistência aos espermatozoides ao processo de criopreservação com consequente incremento cinético às células espermáticas foram 1,5 mg e 2 mg. Os achados com a adição do estimulante FT, considerando-o estimulante de motilidade através do aumento no metabolismo celular, conferiu longevidade e superioridade aos parâmetros de velocidade espermática, sendo essa uma atribuição satisfatória além de conferir também maiores populações celulares com membrana plasmática íntegra sem a produção de peróxido de hidrogênio. Em contrapartida a adição do estimulante PTX, afetou a longevidade celular, demonstrando efeito prejudicial ao movimento espermático. E quanto a fertilidade do sêmen criopreservado, os resultados encontrados com a utilização de colesterol ligado a ciclodextrina não interferiu na fertilidade. Dessa forma, o colesterol ligado à ciclodextrina é benéfico à célula espermática ao processo de criopreservação, entretanto a adição de estimulante causou efeitos divergentes, aumentando os parâmetros e a longevidade celular (FT) ou diminuindo os parâmetros de cinética com o tempo (PTX).

The current study proposed to evaluate the effect of the addition of cholesterol bound to cyclodextrin (CLC) before the cryopreservation process and motility stimulants post thawed (fert talp FT and pentoxifylline PTX) on the spermatic kinetics (MT, MP, RAP, VCL, VSL, VAP and LIN), membrane integrity, production of intracellular hydrogen peroxide, mitochondrial potential, destabilization of the plasma membrane and in vivo fertility. Two ejaculates of 12 stallions were cryopreserved; subdivided into four experimental groups: G1 (no CLC); G2 (1 mg of CLC), G3 (1.5 mg of CLC) and G4 (2 mg of CLC). In experiment I, the objective was to compare spermatic parameters after the inclusion of CLC (G1-G4), to evaluate cell longevity through the thermoresistance test - TTR post thawed: immediately (T0), 40 minutes (T40), 80 minutes (T80) and 120 minutes (T120). In addition, mitochondrial potential and membrane destabilization were evaluated. In experiment II the objective was to compare spermatic parameters after the inclusion of CLC (G1-G4) and the addition of the stimulant FT, to evaluate cell longevity (TTR) post thawed (T0, T40, T80 and T120) and to evaluate the production of intracellular hydrogen peroxide. In experiment II the objective was to compare spermatic parameters in the groups (G1-G4), with and without the addition of the stimulant FT (20% - v/v) post thawed, as to the cellular longevity (TTR T0, T40, T80 and T120 minutes) and to evaluate the production of intracellular hydrogen peroxide. In experiment III the objective was to compare spermatic parameters in the groups (G1-G4), with and without the addition of the stimulant PTX (20% - v/v) post thawed, to evaluate cellular longevity (TTR - T0, T40, T80 and T120 minutes), to evaluate the production of intracellular hydrogen peroxide, the mitochondrial potential and the membrane destabilization. In addition, to evaluate the fertility of the cryopreserved semen in three groups: 1) Control group: no cholesterol addition; 2) Group cholesterol: 1.5 mg, and 3) Group cholesterol 1.5 mg + PTX. In experiment I, groups G3 and G4 presented superior values of VCL, VSL and VAP. In T0, the parameters of MT and MP were superior in G3. As to mitochondrial potential and membrane destabilization, no meaningful differences were observed between the groups (p<0.05). In experiment II, the addition of FT was beneficial to spermatic speed (VCL, VSL and VAP) in some experimental groups and in different times. G2 with FT has demonstrated higher percentage of cells with intact membrane and without hydrogen peroxide in comparison to groups without the addition of the stimulant. In experiment III, the addition of PTX was not beneficial to the kinetics parameters post thawed along time in some experimental groups. In the group G1 with PTX it was observed superiority in cells with injured membrane and with hydrogen peroxide in comparison to G4 with PTX and a higher cell population with intact membranes and without hydrogen peroxide in the group G4 with PTX in comparison to G2 with PTX. The conception rate in the groups G1, G2 and G3 was, respectively, 50%, 66.7% and 66.7%. In this way, it is possible to conclude that the addition of the cholesterol bounded to cyclodextrin is beneficial to the spermatic cell in the cryopreservation process, however, the addition of stimulants post thawed has caused divergent effect. The stimulant FT has provided longevity and superiority to the spermatic velocity parameters. In contrast, the addition of the stimulant PTX has compromised the cellular longevity. In addition, the inclusion of CLC has not affected the conception rate in inseminations carried out after the ovulation.

ADIÇÃO DE CARNOSINA COMO ANTIOXIDANTE EM SÊMEN BOVINO CONGELADO

A criopreservação de sêmen é uma tecnologia de grande importância na área reprodutiva, por possibilitar melhor disseminação genética de touros, consequentemente aumentando a produtividade dos rebanhos comercias nacionais, por ser a técnica com maior custo-benefício é a mais utilizada, porém ainda se tem algumas dificuldades a qual deve-se solucionar para obter maior produção. A excessiva produção de radicais livres após o descongelamento é uma delas, com o objetivo amenizar os danos causados pelas moléculas dos radicais livres adicionou-se a proteína carnosina que possui propriedades antioxidativas ao diluente de congelação. Foram utilizados os ejaculados de 5 touros da raça nelore de idade superior a 24 meses com fertilidade comprovada, cada animal foi coletado 3 vezes somando-se 15 ejaculados, posteriormente cada amostra foi subdividida em a 4 parcelas: Grupo controle (sem carnosina), CAR1 (100ng/ml), CAR2 (200ng/ml) e CAR3(300ng/ml), as amostras foram envasadas em palhetas de 0,5ml com concentração de 30 milhões de espermatozoides vivos e submetidas ao processo de congelamento lento convencional, onde as palhetas foram acomodadas em uma caixa térmica sob refrigeração de 5ºC por 4 horas, passado o tempo de resfriamento as palhetas foram relocadas para uma caixa de isopor com nitrogênio líquido a uma distância de 5cm da superfície do liquido por 20 minutos e posteriormente mergulhadas no nitrogênio líquido a uma temperatura de -196ºC e armazenadas em botijão criogênico. Todas as amostras foram submetidas as análises em dois momentos, após o descongelamento a 37ºC por 30 segundos (M0) e após o teste de termo regulação rápida (M30) onde uma parcela da amostra é incubada a 46ºC por 30 minutos. Em ambos os momentos as amostras passaram por avaliação pelo CASA para análise da cinética espermática e pela avaliação do citômetro de fluxo para averiguar as injúrias estruturais ocasionadas pelos radicais livres. As avaliações estatísticas foram realizadas através do software SAS utilizando a análise de variância entre os grupos. Não houve alterações nos padrões de motilidade gerais, porém as médias do grupo mais concentrado (300ng/ml) foi observado taxas de células vivas melhores no momento de descongelamento (controle = 55,56 ± 22,37 e CAR3 = 60,91 ± 19,38). A carnosina não demostrou estatisticamente efetividade na proteção contra os danos causados pelos radicais livres em nenhuma das concentrações utilizadas, porém também não ocasionaou danos as células espermáticas.

The cryopreservation of a technology of great importance in the reproductive area, as it allows a better genetic dissemination of bulls, is consequently impaired in the tests of herds of national traders, as it is the most cost-effective technique, it is the most used, but still has some difficulties to qualify problems for greater production. An excessive production of free radicals after thawing is one of them, with the objective of causing damage caused by free radical molecules, applied to a fleshy protein that has antioxidant properties and freezing diluents. Ejaculates from 5 bulls aged over 24 months with proven fertility were used, each animal was collected 3 times with the command 15 ejaculates, afterwards each sample was subdivided into 4 parcels: Control group (without carnosine), CAR1 (100ng / ml), CAR2 (200ng / ml) and CAR3 (300ng / ml), as the samples were packaged in 0.5 ml palettes with a concentration of 30 million live sperm and subjected to a conventional slow freezing process, where the palettes were accommodated in a thermal box under 5ºC refrigeration for 4 hours, after the cooling time as reeds were relocated to a Styrofoam box with liquid nitrogen at a distance of 5cm from the liquid surface for 20 minutes and after drying in liquid nitrogen at a temperature of -196ºC and stored in a cryogenic cylinder. All samples were subjected to analysis in two moments, after thawing at 37ºC for 30 seconds (M0) and after the rapid thermodynamics test (M30) where a portion of the sample is incubated at 46ºC for 30 minutes. At both times, the tests were evaluated by CASA for analysis of sperm kinetics and by the evaluation of the flow cytometer for average, according to injuries occasionally shown by free radicals. How the statistics were performed using the SAS software, using an analysis of variation between groups. There were no changes in the general mobility patterns, however the media of the most concentrated group (300ng / ml) were observed better live cell rates at the time of thawing (control = 55.56 ± 22.37 and CAR3 = 60.91 ± 19 38). Carnosine does not demonstrate statistically effectiveness in protecting against damage caused by free radicals in any of the applications used, but it also does not cause damage such as sperm cells.

QUALIDADE DE CARNE DE BOVINOS SUBMETIDOS A DIFERENTES ESTRATÉGIAS DURANTE A RECRIA E TERMINAÇÃO

Nosso objetivo foi avaliar o efeito da estratégia de suplementação durante a fase de recria na qualidade da carne de bovinos terminados em pasto mais concentrado ou confinamento. Cento e vinte machos não castrados [10 ± 2 meses de idade e 256,54 ± 28,92 kg de peso vivo (PC) inicial] foram blocados por peso e aleatoriamente designados para os tratamentos em design fatorial 2 × 2, dois suplementos durante a fase de recria: mineral (ad libitum MIN) ou proteína + energia (0,3% PC/ animal/ dia PRE) e dois sistema de terminação: pasto mais suplementação com concentrado (2% PC/ animal/ dia - PAST); e confinamento (25:75 %; silagem de milho: concentrado - FLOT). Depois de 285 dias os bovinos (503,89 ± 56,61 kg) foram abatidos em frigorifico comercial, a carcaça foi dividida medialmente do esterno e da coluna, resultando em duas metades semelhantes. Amostras (10g) do Longíssius thoracis (LT) foram removidas imediatamente depois do abate, entre a 12ª e 13ª costela de cada animal e congeladas (nitrogênio líquido) para: atividade de enzima lipogênica e relativa abundancia de RNAm associado com metabolismo de lipídeos, analisados por qRT-PCR os genes alvos incluíram PPAR, SREBP1c, SCD1, ACC LPL, FBP4, CPT2, ACOX e PPAR. Após 24 horas de resfriamento de carcaça, o pH foi mesurado entre a 12ª e 13ª costela do LT. A gordura subcutânea e cinco bifes de 2,54 cm do LT (entre a 9ª a 13ª costela) foram coletados para análises: perfil de ácido graxo, composição química, força de cisalhamento, comprimento de sarcômero, índice de fragmentação miofibrilar, perda de descongelamento, perda de cocção, capacidade retenção de água, cor de gordura, mioglobina, oxidação lipídica e parâmetros de cor que foram avaliados nos dia 1, 4, 7, 10, 14 de exposição ao oxigênio a 0 ± 4°C. O sistema FLOT aumentou (P < 0,050) a espessura de gordura subcutânea (7,01 vs. 3,07 mm), o comprimento de sarcômero (1,59 vs. 1,42 µm) e diminuiu (P < 0,050) a força de cisalhamento da carne (36,29 vs. 43,20 N), enquanto o grupo do PAST mostrou maior (P < 0,050) capacidade retenção de água (68,16 vs. 64,32%), gordura amarela (16,66 vs. 14,30), concentração de mioglobina (4,56 vs. 3,95 mg/g de carne). A carne dos bovinos alimentados com MIN durante a fase de crescimento seguidos pela terminação FLOT mostraram aumento (P < 0,050) da oxidação lipídica comparado aos bovinos do MIN seguidos do sistema PAST (0.35 vs. 0.27 mg/kg de carne). Durante o tempo de armazenamento, a carne dos bovinos alimentados com MIN seguido pelo sistema PAST mostraram menores (P < 0,050) valores de L* comparados com os outros tratamentos. Nos dias, 4 e 7 de display, o grupo FLOT tiveram aumento (P < 0,050) de a* e C* na carne comparado ao PAST. Os animais do sistema PAST mostraram menores (P < 0,050) valores de b* comparado ao FLOT (12,17 vs. 13,40, respectivamente). O sistema FLOT aumentou (P < 0,050) o conteúdo de lipídeo na carne do que o PAST (2,72 vs. 1,49%, respectivamente). Os animais alimentados com MIN seguidos da terminação FLOT mostraram um aumento (P < 0,050) dos ácidos C12:0, C14:0, e C16:0, o que levou a um aumento da concentração do total de ácido graxo saturado. Os bovinos terminados no sistema FLOT tiveram maior (P < 0,050) concentração do total de ácido graxo monoinsaturado coincidindo com o aumento (P < 0,050) da expressão do gene SCD1 no musculo em comparação ao sistema PAST. A carne dos bovinos do sistema FLOT mostrou diminuição (P < 0,050) de C18:2n6, C20:3n6, C20:4n6, C20:5n3, razão n6/n3, e isocitrato desidrogenase em comparação ao sistema PAST. Além disso, os bovinos alimentados com PRE seguidos pela terminação FLOT tiveram maior (P < 0,050) expressão de CPT2 no musculo, enquanto que a suplementação MIN seguido pelo sistema PAST mostraram diminuição (P < 0,050) de SREBP1c, aumento (P < 0,050) da expressão de CPT2 e PPAR no musculo. Em geral, esses resultados sugerirem que os atributos relacionados com a maciez da carne não foram afetados pela fase de crescimento. O sistema PAST diminuiu a maciez e luminosidade da carne, mas esses atributos ainda mostraram dentro dos padrões aceitos na indústria de carne. Além disso, o sistema FLOT aumentou o lipídio intramuscular em comparação com o sistema PAST, mas os animais alimentados com MIN durante a fase de crescimento acompanhado do sistema PAST apresentaram maior expressão de genes relacionados à degradação lipídica e menores genes relacionados à síntese de lipídios.

Our objective was to evaluate the supplementation strategy during the growing phase on the meat quality of bulls finished in pasture plus concentrate or feedlot. One hundred and twenty young bulls uncastrated males [10 ± 2 month old and 256.54 ± 28.92 kg of body weight (BW)] were blocked by weight and randomly assigned to treatments in 2 × 2 factorial design, two supplements during the growing phase: mineral (ad libitum - MIN) or Protein + Energy (0.3% BW/ animal/ day - PE) and two finishing system: pasture plus concentrate (2% BW/ animal/ day - PAST) or feedlot (25:75; corn silage: concentrate - FLOT). After 285 days the bulls (503.89 ± 56.61 kg) were slaughtered, the carcasses were divided medially from the sternum and the spine, resulting in two similar halves. The Longissimus thoracis (LT) sample (10 g) was removed immediately after slaughtered between 12th and 13th ribs from each animal and frozen (liquid nitrogen) for: lipogenic enzyme activity and relative abundance of mRNA associated with lipid metabolism measured by qRT-PCR, target genes include PPAR, SREBP1c, SCD1, ACC, LPL, FBP4, CPT2, ACOX, and PPAR. After 24 h carcass chilling, the pH was measured between the 12th and 13th ribs of the LT. The fat thickness and five steaks of 2.54 cm from LT (between the 9th and 13th ribs) were collected for fatty acid profile, chemical composition, shear force, sarcomere length, myofibrillar fragmentation index, thawing loss, cooking loss, water holding capacity, fat color, myoglobin, lipid oxidation and meat color which was measured on days, 1, 4, 7, 10 and 14 storage time exposed to oxygen at 0 ± 4°C. The FLOT system increased (P < 0.050) the fat thickness (7.01 vs. 3.07 mm), sarcomere length (1.59 vs. 1.42 µm), and decreased the meat shear force (36.29 vs. 43.20 N), while the PAST group showed higher (P < 0.050) water holding capacity (68.16 vs. 64.32%), yellowness fat (16.66 vs. 14.30), myoglobin concentration (4.56 vs. 3.95 mg/g of meat). The meat of bulls fed with MIN during the growing phase following by FLOT finishing showed increased (P < 0.050) of lipid oxidation compared to bulls from MIN following by PAST system (0.35 vs. 0.27 mg/kg of meat). During the storage time, the meat of bulls fed with MIN following by PAST system showed lower (P < 0.050) L* value compared to the other treatments. On days, 4 and 7 of the display, the FLOT group had increased (P < 0.050) of a* and C* in meat compared to PAST. The bulls from PAST system showed lower (P < 0.050) b* value compared to FLOT (12.17 vs. 13.40, respectively). The FLOT group had (P < 0.050) higher lipid content than PAST (2.72 vs 1.49%, respectively). The bulls fed with MIN following by FLOT system showed an increase (P < 0.050) of C12:0, C14:0, and C16:0 which led to greater saturation fatty acid total concentration. The bulls finished in FLOT system had higher (P < 0.050) monounsaturated fatty acid total concentration coinciding with the up-regulated (P < 0.050) of gene expression of SCD1 compared to PAST system. The meat of bulls from FLOT system showed a decrease (P < 0.050) of C18:2n6, C20:3n6, C20:4n6, C20:5n3, n6/n3 ratio and isocitrate dehydrogenase compared to PAST system. In addition, the animals fed with PRE following by FLOT finishing had higher (P < 0.050) CPT2 expression, while the MIN supplementation following by PAST system showed decreased (P < 0.050) of SREBP1c, increased (P < 0.050) CPT2 and PPAR expression. Globally, these results suggested which the attributes relationship with tenderness meat was not affected by the growing phase. The PAST system decreased the tenderness and lightness of meat, but these attributes still showed within the acceptable standards of the meat industry. In addition, the FLOT system increased the intramuscular lipid compared to PAST system, but the animals fed with MIN during the growing phase following by PAST showed greater genes expression related to lipid degradation and lower gene expression related with synthesis of lipids.

Influência da degradação tempo-dependente e do processo de congelamento e descongelamento sobre as características histológicas e biomecânicas do jejuno de bovinos hígidos

A degradação do intestino delgado de bovinos sadios, bem como seu efeito sobre a resistência biomecânica, não são descritos na literatura. Trabalhos que envolveram a biomecânica intestinal realizaram os ensaios em poucas horas após o óbito dos doadores, sem avaliação de seu estado de deterioração. O congelamento é eficiente na conservação de vários tecidos, porém, pode provocar danos ao nível celular nos tecidos ricos em água. Este estudo teve por objetivo avaliar a degradação morfológica e biomecânica do jejuno de bovinos em diferentes tempos post mortem, bem como o efeito do congelamento e descongelamento sobre estas características. Foram coletados segmentos de jejuno de seis animais, e fragmentos destes segmentos foram fixados em formol em diferentes tempos post morten (0, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 36, 48 horas) para avaliação histológica. Em outra fase, mais 20 segmentos foram coletados e submetidos a teste biomecânico em diferentes tempos post morten (0, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 36, 48 horas), além do mesmo teste após congelamento e descongelamento. As primeiras alterações macroscópicas foram observadas com oito horas após o óbito. Mesmo momento em que surgiram os primeiros sinais de lesão estrutural ao exame histológico. Este também foi o momento de menor pressão suportada ao teste biomecânico. A partir de 12 horas o tecido sofreu rearranjo estrutural, voltando a suportar maior pressão, seguida de queda gradual após 18 horas. As lesões histológicas se apresentaram de maneira progressiva e gradual. As amostras testadas após descongelamento não apresentaram diferença estatística quanto à resistência mecânica em comparação com os espécimes frescos. Independente do aspecto morfológico, as amostras de todos os tempos, assim como as descongeladas, apresentaram resistência muito superior às consideradas fisiológicas ou patológicas.

The degradation of the small intestine of healthy cattle, as well as its effect on biomechanical resistance are not described in the literature. Studies involving intestinal biomechanics perform tests within hours of donor death, without evaluating its deterioration state. Freezing is effective in conserving various tissues, but can cause cellular damage to water-rich tissues. This study aimed to evaluate the morphological and biomechanical degradation of the bovine jejunum at different post mortem times, as well as the effect of freezing and thawing on these characteristics. Jejunum segments were collected from six animals, and fragments of these segments were fixed in formaldehyde at different post morten moments (0, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 36, 48 hours) to histologic evaluation. In another phase, 20 other segments were collected and submitted to biomechanical testing at different post morten times (0, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 36, 48 hours) beyond the same test after freezing and thawing. The first macroscopic changes were observed at eight hours after death. The same time that the first signs of structural damage appeared at the histological examination. This was also the moment of least pressure supported by the biomechanical test. Within12 hours the tissue was rearranged again to withstand greater pressure, which gradually decreased after 18 hours. The histological lesions were progressive and gradual. Samples tested after thawing showed no statistical difference in mechanical strength compared to fresh specimens. Regardless of the degree of morphological aspect, samples time, as well as thawed ones, all of them presented resistance higher than those considered physiological or pathological.

Criopreservação do sêmen de Jundiá Amazônico (Leiarius marmoratus) e refrigeração de sêmen equino

Este estudo avaliou os efeitos da adição de goma xantana no diluente de resfriamento de sêmen equino e de dois protocolos distintos de criopreservação de sêmen de peixes Leiarius marmoratus, sobre parâmetros de qualidade espermática analisados in vitro. No experimento realizado nas amostras de sêmen da espécie equina, (n=20) armazenadas sob refrigeração (5°C) os grupos experimentais foram: controle (Kenney) e controle adicionado de goma xantana (0,01%, 0,12% e 0,25%). Parâmetros espermáticos, como motilidade, funcionalidade mitocondrial e integridade da membrana, acrossoma e DNA foram avaliados após 0h, 24h, 48h e 72h de armazenamento. Nos experimentos realizados nas amostras de sêmen dos peixes da espécie L. marmoratus (n=8) foram utilizados dimetilsulfóxido (DMSO): 5, 10, 15 e 20% e trealose: 50, 100, 150, 200mM. As amostras foram diluídas (1:9 v/v), congeladas em recipiente de vapor de nitrogênio (dryshipper), e armazenadas em nitrogênio líquido a -196°C. Após o descongelamento foram analisados parâmetros de motilidade espermática (CASA), tempo de motilidade, integridade de membrana, DNA e funcionalidade mitocôndria. No experimento realizado nas amostras de sêmen da espécie equina a motilidade espermática diminuiu ao longo do período de resfriamento no grupo que recebeu 0,25% de goma xantana em comparação com o grupo controle (60.5 e 44.73% respectivamente). Nos experimentos realizados nas amostras de sêmen dos peixes da espécie L. marmoratus, com o uso de protocolo de criopreservação baseado na utilização de diferentes concentrações de DMSO, quanto as motilidades totais e progressivas, linha curva de velocidade (VCL), linha reta de velocidade (VSL) e linearidade, o tratamento contendo 5% de DMSO apresentou resultados inferiores aos tratamentos contendo 15 e 20% de DMSO (P<0,05). O tratamento contendo 10% de DMSO não diferiu dos demais tratamentos (P>0,05). Já no protocolo baseado no uso da trealose, motilidades totais e progressivas superiores foram observadas nos grupos que receberam as maiores concentrações 150mM (22,9 e 17,7%, respectivamente) e 200mM (31,4 e 26,3%, respectivamente) (P <0,05) quando comparadas aos demais grupos, no entanto, não diferindo do tratamento com trealose 100mM (18,6 e 15,3%, respectivamente). Assim, nas condições testadas nesse estudo a adição de goma xantana não é prejudicial à estrutura espermática equina, apesar de reduzir a motilidade total das células. O DMSO não foi eficiente para preservar a qualidade seminal do sêmen dos peixes da espécie L. marmoratus. Além disso o tratamento com trealose em altas concentrações demonstraram resultados superiores quando comparados a outros tratamentos em parâmetros de motilidade in vitro para L. marmoratus.

This study assessed the effects on sperm quality when Xanthan gum was added to stallion sperm in a cooling protocol and two cryoprotectants added to fish semen (Leiarius marmoratus) in two freezing protocols. The stallion semen (n=20) samples were stored cooled (5°C) using different concentrations of xanthan gum added to the standard extender (Kenney): control (no xanthan added), 0.01%, 0.12%, and 0.25%). Sperm parameters, such as motility, mitochondrial function, membrane integrity, acrosome integrity, and DNA integrity, were analyzed after 0, 24, 48, and 72 hours of storage. In the fish species L. marmoratus (n=8), semen samples were diluted in dimethyl sulfoxide (DMSO) at 5, 10, 15, and 20% concentrations and in trehalose at 50, 100, 150, and 200 mM concentrations. Samples were diluted (1:9, v/v), frozen in nitrogen vapor vessel (dry shipper), and stored in liquid nitrogen vessel at -196°C. The semen parameters sperm motility (CASA), motility duration, membrane integrity, DNA, and mitochondrial function were assessed post-thawing. Regarding the cooling protocol, the sperm motility was decreased during cooling process in the group 0.25% xanthan gum when compared to the control group (60.5% and 44.73%, respectively). The cryopreservation protocol using trehalose at 50 mM obtained 15.6 and 9.5 % of total and progressive motilities, respectively, being these results inferior to the treatments containing trehalose at 150 mM (22.9 and 17.7%, respectively) and 200 mM (31.4 and 26.3%, respectively) (P<0.05). However, it did not differ from treatment with trehalose at 100 mM (18.6 and 15.3 of total and progressive motilities respectively). In the cryopreservation protocol using DMSO, the parameters total and progressive motilities, velocity curved line (VCL), velocity straight line (VSL) and linearity (LIN) were inferior in the treatment at 5% DMSO concentration when compared to treatments containing DMSO at 15 and 20% concentrations (P<0.05). Treatment containing DMSO at 10% did not differ from other treatments (P>0.05). Therefore, in these experimental conditions the addition of xanthan gum to stallion sperm is not harmful to the sperm cell structure, despite of reducing total motility. DMSO was not efficient to preserve semen quality and the addition of trehalose at high concentrations exhibited superior results when compared to other treatments in in vitro motility parameters in L. marmoratus.

Mix de óleos de cravo, mamona e caju e composto microencapsulado de Eugenol, Timol e Vanilina na suplementação de bovinos terminados em pastagem de aveia e azevém: Desempenho e qualidade da carne

No sistema de terminação de bovinos em semi confinamento são necessárias estratégias nutricionais para que ocorra a redução do ciclo produtivo. A suplementação com aditivos pode ser uma dessas medidas para auxiliar no aproveitamento dos alimentos e produzir carne de qualidade. De modo geral, estas substâncias são ionóforos ou antibióticos. Todavia, essas substâncias estão proibidas na União Europeia e em vias de proibição nos Estados Unidos. Desta forma, é necessário o desenvolvimento de substâncias alternativas e seguras na alimentação animal. Assim sendo, os aditivos naturais tornaram-se objetivos de várias pesquisas no mundo. Entre esses aditivos, os óleos essenciais e os óleos vegetais têm merecido destaque. Entretanto, para sua adição na alimentação animal é necessário caracterizar os vários produtos de plantas, bem como conhecer o modo de ação destas substâncias, que possuem comprovado efeito flavorizante, estimulante da secreção enzimática, ação antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória, antiparasitária, antiviral, entre outras. Ainda mais, esses compostos têm uma ampla variedade de efeitos sobre a qualidade da carne, podendo retardar o processo de oxidação aumentando o tempo de vida útil, além de serem incorporados nos músculos e poder contribuir na saúde do consumidor, incluindo efeitos positivos sobre as doenças cardiovasculares, alguns tumores, processos inflamatórios, e em geral, doenças nas quais ocorre uma proliferação descontrolada de radicais livres. Este trabalho foi realizado para avaliar o desempenho animal, as características de carcaça e a qualidade da carne de 40 novilhos mestiços (½ Bons Mara x ½ Nelore) com cerca de 20 meses de idade, peso corporal inicial médio de 416,9 ± 5,56, sem adição (controle) ou com níveis (1.500, 3.000, 4.500 ou 6000 mg/dia/animal) de uma mistura de aditivos naturais (AN), contendo óleo essencial de cravo, óleo de mamona, óleo de caju e uma mistura de princípios ativos microencapsulados de eugenol, timol e vanilina durante 80 dias sobre o desempenho animal e qualidade da carne. Os resultados sugerem que, embora o uso da mistura de óleos não tenha modificado o ganho de peso dos animais, o suplemento teve efeito curvo linear na ingestão de forragem, e consequentemente na matéria seca, proteína bruta, fibra em detergente neutro e carboidratos não fibrosos. A maior ingestão de matéria seca foi observado no tratamento com 1.500 mg e a menor ingestão no tratamento com 6.000 mg. A digestibilidade da proteína foi menor e dos carboidratos não fibrosos foi maior nos tratamentos com AN em todas as dosagens. Um aumento nas concentrações de nitrogênio amoniacal ruminal, e nos ácidos graxos voláteis propiônico e isovalérico foram observados nos tratamentos com AN em todas as dosagens. Não foram observadas diferenças nos parâmetros macroscópicos do líquido ruminal (movimentos ruminais, cor, odor, consistência, sedimentação e flutuação, potencial redox e contagem e viabilidade de protozoários). As características de carcaça não foram alteradas pelos tratamentos, mas houve alteração na composição corporal, aumentando a deposição muscular nos animais suplementados com AN. Os tratamentos não tiveram efeito nas perdas por gotejamento da carcaça. As perdas de descongelamento/armazenamento, cozimento, textura, cor, atividade antioxidante e oxidação lipídica foram avaliadas ao longo do tempo de armazenamento em embalagem a vácuo nos dias 1, 7 e 14 e foram observadas diferenças. Houve um efeito quadrático nas perdas por descongelamento/armazenamento no primeiro dia de armazenamento da carne, sendo que o tratamento controle perdeu menos líquido que os demais. No entanto, nas perdas por cocção esse mesmo tratamento no sétimo dia de armazenamento perdeu mais líquidos. A força de cisalhamento foi similar entre os tratamentos no dia 1 e no dia 7 de armazenamento. No dia 14, foi observado um efeito linear; a carne do tratamento controle estava mais macia. Um efeito linear na luminosidade da carne foi observado. A carne de animais do tratamento controle estava mais clara e potencialmente mais atraente para o consumidor no dia 1 de armazenamento. Após 7 e 14 dias de armazenamento, as carnes foram semelhantes entre os tratamentos. Os parâmetros de intensidade de vermelho e amarelo não foram alterados. No entanto, ao avaliar o potencial antioxidante da carne, observou-se que no dia 1 de armazenamento houve um maior número de compostos fenólicos e uma maior atividade antioxidante (DPPH e FRAP) nos tratamentos com AN. Apesar dos valores mais altos de oxidação lipídica serem notados no primeiro dia de armazenamento nos tratamentos que receberam AN na dieta, foi observado também que tratamentos com maiores dosagens de aditivos retardaram a oxidação lipídica ao longo do tempo de armazenamento. O tempo de armazenamento afetou as perdas por descongelamento/armazenamento, perdas por cocção, textura, cor e oxidação lipídica. No entanto esses resultados são devido ao processo de proteólise. Em conjunto, estes resultados sugerem que a mistura de aditivos naturais tem potencial no uso na alimentação animal e pode melhorar a estabilidade da carne, no entanto, ainda devem ser estudados com relação a dose a ser empregada em animais a pasto.

In the grazing system for cattle, nutritional strategies are necessary to shorten the production cycle; supplementation with additives can be used to maximize nutrient use and meat quality. In general, these substances are ionophores or antibiotics. However, these substances are banned in the European Union and limited use in the United States. In this way, the development of safe alternative substances in animal feed is necessary. Thus, natural additives are the subject of much research around the world. Among these additives, essential oils and vegetable oils has greater prominence. However, for their addition in animal feed it is necessary to characterize the various plant products as well as to know the mode of action of these substances. These substances have proven flavoring effect, stimulating enzymatic secretion, antimicrobial action, antioxidant, anti-inflammatory, antiparasitic, antiviral, among other actions. Furthermore, these compounds have a many of effects on the quality of the meat, which can slow down the oxidation process and increase the shelf life, as well as being incorporated into the muscles and contributing to consumer health, including positive effects on cardiovascular diseases, some tumors, inflammatory processes, and in general, diseases in which there is an uncontrolled proliferation of free radicals. The objective of the study was to evaluate the animal performance, carcass characteristics and meat quality. Forty 20-month old crossbred steers (Bons Mara x Nellore) of initial body weight 416.9 ± 5,56 kg, without addition (control) or levels (1500, 3000, 43500 or 6000 mg / day / animal) of a mixture of natural additives (NA) containing clove essential oil, castor oil, cashew oil and a blend of microencapsulated active ingredients of eugenol, vanillin and thymol for 79 days. The results suggest that, although the use of the oil mixture did not modify the animals' weight gain, the supplement had a quadratic effect on forage intake, and consequently on dry matter, crude protein, neutral detergent fiber and non-fibrous carbohydrates. The greatest intake of dry matter was observed in treatment with 1500 mg and the smallest consumption in treatment with 6000 mg. Protein digestibility was smaller and non-fibrous carbohydrates were greater in AN treatments at any dosage. An increase in ruminal ammoniacal nitrogen concentrations and in propionic and isovaleric volatile fatty acids were observed in AN treatments at any dosage. No marked differences were observed in the macroscopic parameters of ruminal fluid (ruminal movements, color, odor, consistency, sedimentation and flotation, redox potential and counting and viability of protozoa). The carcass characteristics were not altered by the treatments, but there was a change in the body composition, increasing the muscular deposition in the animals supplemented with AN. The treatments had no effect on drip losses. The thawing/ ageing losses, cooking losses, texture, color, antioxidant and lipid oxidation were evaluated over the storage time in a vacuum package for 1, 7 and 14 days and differences were observed. There was a quadratic effect observed in the thawing/ageing losses on the first day of storage of the meat, and the control treatment lost less liquid than the others. However, in cooking losses that same treatment on the seventh day of storage lost more liquids. The shear force was similar between treatments on day 1 and day 7 of storage. At day 14, a linear effect was observed, and the meat from the control treatment was tender. A linear effect on meat lightness was observed. The meat from control treatment animals was clearer and potentially more attractive to the consumer on day 1 storage. After 7 and 14 days of storage, the meats were similar between the treatments. The redness and yellowness parameters were not changed. However, when evaluating the antioxidant potential of the meat, it was observed that on day 1 of storage there was a greater number of phenolic compounds and a greater antioxidant activity (DPPH and FRAP) in AN treatments. Although greater values of lipid oxidation were observed on the first day of storage in treatments receiving AN in the diet, it was also observed that treatments with greater dosages of additives delayed lipid oxidation throughout the storage time. The storage time affected the losses by thawing/ageing losses, cooking losses, texture, color and lipid oxidation, however these results are expected due to the proteolysis process. Taken together, these results suggest that the mixture of natural additives has potential use in animal feed and may improve meat stability; however, they should still be studied with respect to dose-response.

USO DE INOCULANTE MICROBIANO EM SILAGENS DE GRÃOS DE MILHO E DE SORGO REIDRATADOS PARA OVINOS EM CRESCIMENTO

A presente dissertação foi elaborada com base em dois experimentos. No primeiro, avaliou-se a utilização de inoculante microbiano em relação a melhora no consumo voluntário e na digestão dos nutrientes das dietas, e avaliar a substituição do milho pelo sorgo em relação ao desempenho, e sobre as alterações sensoriais na carne de cordeiros terminados em confinamento. Foram utilizados 28 cordeiros machos não castrados F1 Dorper × Santa Inês, com peso corporal médio inicial de 20,0±0,7 kg e idade entre três e quatro meses. Inicialmente, quatro animais foram abatidos e tomados como referência para estimar o peso de corpo vazio (PCVZ) inicial dos animais remanescentes no experimento. Os demais 24 animais foram distribuídos em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 × 2, e cada grupo foi alimentado com uma das dietas composta por dois tipos de grãos ensilados e reidratados: milho (MR) ou sorgo (SR), adicionados (I) ou não de inoculante microbiano (composto de Lactobacillus plantarum, Propionibacterium acidipropionici e sacarose), com seis repetições. Os grãos de milho e sorgo foram reidratados para 65% de matéria seca, sendo ensilados em toneis plásticos. O volumoso foi a silagem de milho. O experimento foi dividido em três períodos de 28 dias. As digestibilidades das dietas foram avaliadas dos 35º aos 40º dias e 75° aos 80º dias do período experimental, utilizando-se a fibra em detergente neutro indigestível (FDNi) para estimar a excreção fecal. Ao final dos 84 dias, todos os animais foram abatidos. Não houve interação (P > 0,05) entre tipo de grão e inoculante para nenhumas das variáveis avaliadas. Os consumos de matéria seca (MS), e dos nutrientes assim como dos nutrientes digestíveis totais (NDT) não foram influenciados pelo tipo de grão (milho ou sorgo) ou pela presença de inoculante (P > 0,05). Os coeficientes de digestibilidade para MS e demais nutrientes, também não foram alterados (P > 0,05) pelo tipo de grão ou pela inclusão de inoculante microbiano. O ganho médio diário (GMD), o rendimento de carcaça (RC), a eficiência alimentar (EA) e os atributos qualitativos da carne como perdas por cocção (PCc), descongelamento (PD) e total (PT), maciez (FC), pH, acabamento de gordura (EGS) e cor, também não foram influenciados pelo tipo de grão ou pela presença do inoculante microbiano (P > 0,05). Conclui-se que as dietas contendo silagem de grãos reidratados de milho ou sorgo foram igualmente eficientes para a terminação de ovinos e que o inoculante microbiano utilizado não foi capaz de promover melhorias no desempenho produtivo de ovinos. No segundo experimento, avaliou-se utilização de inoculante microbiano, o processamento na forma de reidratação e ensilagem dos grãos de milho e sorgo em relação à melhora da digestão do amido e digestão dos nutrientes das dietas, no crescimento microbiano ruminal e a retenção de nitrogênio no organismo do animal. Foram utilizados cinco ovinos não castrados com peso médio inicial de 30,0±2,4 kg distribuídos em um delineamento em quadrado latino 5 × 5, em esquema fatorial 2 × 2 + 1, constituídos por dois tipos de grãos reidratados: milho (MR) ou sorgo (SR), adicionados (I) ou não de inoculante microbiano e um tratamento contendo milho moído (M). Os grãos de milho e sorgo no tratamento de reidratação alcançou 65% de matéria seca, sendo ensilados em toneis plásticos. O volumoso utilizado foi a silagem de milho. O experimento teve a duração de 105 dias, dividido em cinco períodos de 21 dias cada, sendo 14 dias para adaptação e sete dias para coleta de amostras. Houve interação (P < 0,05) entre tipos de grãos e uso de inoculante microbiano apenas para a digestibilidade do amido, dentre as variáveis testadas. O consumo de MS, dos demais nutrientes e dos nutrientes digestíveis totais (NDT), assim como os coeficientes de digestibilidade não foram influenciados pela interação (P > 0,05) tipo de grão (milho ou sorgo) e adição ou não de inoculante. Adicionalmente, não se observaram efeito (P > 0,05) do tipo de grão, inoculante (P > 0,05) e do tipo de processamento (M vs grãos de milho e sorgo reidratados (GR; P > 0,05). Entretanto, a digestibilidade do amido, apresentou interação (P < 0,05) entre tipo entre tipos de grãos e uso de inoculante microbiano, e também, foram influenciados (P < 0,05) pelo tipo de grão (milho ou sorgo), inclusão de inoculante e tipo de processamento (seco ou reidratado), sendo maior a digestibilidade do amido dos grãos que passaram pelo processamento de reidratação e uso de inoculante. Não houve efeito de interação entre tempo e dietas experimentais (P > 0,05) sobre os valores de pH no fluido ruminal; no entanto, observou-se efeito de tempo sobre esta variável (P < 0,05). Adicionalmente, não se observaram efeitos de interação entre tipo de grão e inoculante (P > 0,05), efeito do tipo de grão (P > 0,05), inoculante e do tipo de processamento (M vs GR). Não houve efeito de interação entre tempo e dietas experimentais (P > 0,05) sobre as concentrações de N-NH3 no fluido ruminal; no entanto, observou-se efeito de tempo sobre esta variável (P < 0,05). Adicionalmente, observou-se efeitos (P < 0,05) para o tipo de processamento (M vs GR), em que os grãos reidratados obtiveram maiores médias. O balanço de nitrogênio e eficiência microbiana não foram influenciados pela interação (P > 0,05) tipos de grãos e adição ou não de inoculante. Também, não se observou efeito (P > 0,05) sobre tipo de grão, inoculante (P > 0,05) e do tipo de processamentos (M vs GR; P > 0,05). Conclui-se que dietas contendo grãos processados na forma seca ou reconstituída foram igualmente eficientes no funcionamento do rúmen, que o tipo de grãos também não altera os parâmetros ruminais e que o inoculante microbiano utilizado não foi capaz de promover melhorias na digestibilidade das dieta de ovinos.

The present dissertation was elaborated based on two experiments. In the first one was evaluated the effect of the microbial inoculant and the substitution of maize by sorghum on voluntary consumption and nutrient digestion of diets, performance, and sensorial changes in the meat of lambs finished in confinement. Were used 28 male lambs, not castrated F1 Dorper × Santa Inês, with initial body weight of 20,0 ± 0,7 kg, and age between three and four months. Initially, four animals were slaughtered and taken as reference to estimate the initial empty body weight (EBW) of the animals remaining in the experiment. The remaining 24 animals were distributed in a completely randomized design in a 2 × 2 factorial scheme, and each group was fed with one of the diets composed of two types of grains ensiled and rehydrated corn (RC) or sorghum (RS), added (A) or not of inoculant microbial (compound of Lactobacillus plantarum, Propionibacterium acidipropionici and sucrose), with six replicates. The corn and sorghum grains were rehydrated to 65% of dry matter, being ensiled in plastic sherds. The volume was corn silage. The experiment was divided into three periods of 28 days. The digestibilities of the diets were evaluated from the 35 th to the 40 th day, and from the 75th to the 80th day of the experimental period, using the indigestible neutral detergent fiber (INDF) to estimate fecal excretion. At the end of the 84 days, all animals were slaughtered. There was no interaction (P > 0,05) between grain type and inoculant for any of the evaluated variables. Consumption of dry matter (DM) and nutrients as well as total digestible nutrients (TDN) were not influenced by the type of grain (corn or sorghum) or by the presence of inoculant (P > 0,05). The digestibility coefficients for DM and other nutrients were also not altered (P > 0,05) by grain type or by the inclusion of microbial inoculant. The average daily gain (ADG), carcass yield (CY), feed efficiency (FE) and the qualitative attributes of the meat as cooking losses (CL), thawing (TL) and total, softness (FC), pH, fat finishing (FF) and color were also not influenced by the type of grain or by the presence of the microbial inoculant (P > 0,05). It was concluded that the diets containing rehydrated grain silage of maize or sorghum were equally efficient for the finishing of sheep and that the microbial inoculant used was not able to promote improvements in the productive performance of sheep. In the second experiment, the use of microbial inoculant was evaluated in the processing, in the rehydration and ensilage of maize and sorghum grains and on the digestion of the starch and other nutrients of the diets, microbial growth and retention of nitrogen in the animal's organisms.Were used five uncastrated lambs with an initial average weight of 30.0 ± 2.4 kg distributed in a 5 × 5 Latin square design, in a 2 × 2 + 1 factorial scheme, consisting of two types of rehydrated grains corn (RC) or sorghum (RS), added (A) or not of microbial inoculant and a treatment containing ground corn (C). The maize and sorghum grains in the rehydration treatment reached 65% dry matter, being ensiled in plastic barrels. The volume used was corn silage. The experiment lasted 105 days, divided into five periods of 21 days each, being 14 days for adaptation and seven days for sample collection. There was interaction (P < 0,05) between grain types and use of microbial inoculant only for starch digestibility, among the variables tested. Consumption of (DM), of others dietary constituents and total digestible nutrients (TDN), as well as the digestibility coefficients were not influenced by the type of grain (corn or sorghum) interaction (P > 0,05) and addition or absence of inoculant. In addition, no effect (P > 0,05) of the grain type was observed, and the type of processing (dry corn grains vs rehydrated corn and sorghum grains (RG; P > 0,05) However, the digestibility of the starch presented interaction (P < 0.05) between grain types and the use of microbial inoculant, and was also influenced by the (P < 0,05) type of processing (dry or rehydrated), being greater the digestibility of starch obtained for the grains that went through the processing of rehydration and use of inoculant. There was no interaction effect between time and experimental diets (P > 0,05) on pH values in the ruminal fluid however, we observed a time effect on this variable (P < 0,05). In addition, no interaction effects were observed between grain type and inoculant (P> 0.05), effect of grain type (P > 0,05), inoculant and type of processing (C vs RG). There was no interaction effect between time and experimental diets (P > 0,05) on the concentrations of N-NH3 in the ruminal fluid. However, we observed a time effect on this variable (P < 0,05). In addition, an effect (P < 0,05) was observed for the type of processing (C vs RG), in which the rehydrated grains obtained higher averages. Nitrogen balance and microbial efficiency were not influenced by the interaction (P > 0,05), grain types and addition or not of inoculant. Also, no effect (P > 0,05) was observed on grain type, inoculant (P > 0,05) and type of processing (C vs RG; P > 0,05). It is concluded that diets containing grains processed in dry or reconstituted form were equally efficient in rumen function, that the type of grains also does not alter the ruminal parameters, and that the microbial inoculant used was not able to promote improvements in the digestibility of sheep diets.

Efeito da utilização do inibidor U73122 sobre congelabilidade de sêmen ovino

ARRAIS, Aline Matos. Efeito da Inibição da Fosfolipase C pelo U73122 Sobre o Sêmen Ovino. 2016. 51p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária). Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2016. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do U73122 sobre a congelabilidade do sêmen ovino, uma vez que este reagente pode evitar a capacitação prematura e reação acrossomal induzidas durante o processo de criopreservação. Para isso, ejaculados de quatro carneiros da raça Santa Inês foram obtidos com auxílio de vagina artificial. No ensaio I, espermatozoides de quatro ejaculados, in natura, foram submetidos à incubação de 4h a 37°C, suplementados ou não com as concentrações de 10, 20 ou 30M do U73122, na presença ou ausência do glicerol. Parâmetros cinéticos foram avaliados ao decorrer da incubação, a fim de verificar o comportamento dos espermatozoides pelo uso do reagente, e selecionar doses a serem utilizadas durante a criopreservação. Dezesseis ejaculados foram utilizados no ensaio II, os quais foram criopreservados com diluentes Botubov® fração única, acrescidos ou não do reagente U73122 nas concentrações de 10 e 20M. As amostras descongeladas foram avaliadas quanto à cinética espermática, pelo sistema Computer Assisted Sperm Analysis (CASA), e quanto à integridade de membranas pela associação de sondas fluorescentes iodeto de propídeo, PSA-FITC e JC-1. Adicionalmente, foram realizadas avaliações da capacitação espermática e reação acrossomal com o uso da sonda fluorescente hidrocloreto de clortetraciclina (CTC) antes e após as amostras de sêmen criopreservadas serem submetidas à indução da capacitação in vitro durante 4h de incubação a 37°C. Todos os resultados foram submetidos à análise de variância e ao teste de diferença mínima significativa (DMS) de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. O tratamento dos espermatozoides in natura com diferentes concentrações do U73122, durante incubação de 4h a 37°C, revelou um efeito dose e tempo-dependente sobre a utilização deste reagente em espermatozoides. Além disso, a presença do glicerol potencializou o efeito tóxico do U73122 sobre as células. Nos espermatozoides criopreservados, o U73122 não afetou nenhum dos parâmetros cinéticos avaliados pelo sistema CASA, nem o número dos espermatozoides com as membranas plasmáticas, acrossomais e mitocondriais íntegras (PIAIC) ou lesadas (PLALS). As avaliações realizadas imediatamente após o descongelamento mostraram que a utilização de 10 ou 20M do inibidor reduziu o percentual de espermatozoides capacitados e com acrossoma reagido em relação ao grupo controle (p<0,05). Após a indução da capacitação in vitro, houve uma redução (p<0,05) do número de espermatozoides não capacitados em todos os tratamentos sugerindo um efeito reversível do U73122 sobre os processos de capacitação espermática e reação acrossomal. Conclui-se que o uso de 10 M do reagente U73122 não altera a cinética dos espermatozoides in natura, e que, concentrações de 10 ou 20 M deste reagente podem ser utilizadas em diluentes para criopreservação, uma vez que previnem a capacitação prematura e reação acrossomal induzidas durante este processo, sem alterar a cinética e a integridade das membranas espermáticas.

ARRAIS, Aline Matos. Effect of U73122 inhibitor on freezing ability of ram semen. 2016. 51p. Dissertation (Master of Veterinary Medicine). Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2016. The aim of this study was to evaluate the effect of U73122 on freezing ability of ram semen, since this reagent could prevent premature capacitation and acrosome reaction induced during the cryopreservation process. For this, ejaculates from 4 Santa Ines rams were obtained with the aid of artificial vagina and were used in two experiments. In experiment I, in natura sperm from 4 ejaculated were subjected to incubation at 37°C during 4h, supplemented or not with concentrations of 10, 20 or 30M of U73122 in the presence or absence of glycerol. Kinetic parameters were evaluated during the incubation, in order to verify the behavior of sperm by the use of the reagent, and selecting doses to be used during cryopreservation. Sixteen ejaculates were used in the experiment II, which were cryopreserved with Botubov® extender only fraction increased or not U73122 reagent in concentrations of 10 and 20M. Thawed samples were evaluated for sperm kinetics using the "Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) system, and for membranes integrity by the association of fluorescent probes propidium iodide, PSA-FITC and JC-1. In addition, capacitation and acrosome reaction were evaluated using fluorescent probe hydrochloride chlortetracycline (CTC) before and after the cryopreserved semen samples undergoing induction in vitro capacitation for 4h of incubation at 37°C. The data were submitted to analysis of variance and least significant difference test (DMS) of Tukey at 5% probability. The treatment of in nature spermatozoa with different concentrations of U73122 for 4h incubation at 37°C, revealed a dose-effect and time dependent on the use of this reagent in spermatozoa. Furthermore, the presence of glycerol potentiated the toxic effect of U73122 on the cells. In cryopreserved sperm, the U73122 did not affect any of the kinetic parameters evaluated by CASA system, nor the number of sperm with the plasma membrane, acrosomal and mitochondrial you merge (PIAIC) or injured (PLALS). The evaluations carried out immediately after thawing showed that the use of 10 or 20M of inhibitor reduced the percentage of capacitated sperm and acrosome reacted in the control group (p>0.05). After induction of in vitro capacitation, there was a decrease (p<0.05) in the number of uncapacitated sperm in all treatments suggesting a reversible effect of U73122 on sperm capacitation process and acrosome reaction. In conclusion, that the use of 10 uM of U73122 reagent does not alter the kinetics of sperm in natura and, 10 or 20 uM concentrations of this reagent can be used in diluents for cryopreservation, since they prevent premature capacitation and acrosome reaction induced during this process, without altering the kinetics and the integrity of the sperm membrane.

CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE TAMBAQUI Colossoma macropomum EM MACROPALHETAS

A criopreservação de sêmen de peixes é uma ferramenta para a otimização do manejo reprodutivo, a formação de bancos de germoplasma e o desenvolvimento de programas de melhoramento genético. O sucesso dessa técnica depende do domínio e o equilíbrio de vários fatores que envolvem os processos de coleta, diluição, envase, congelamento e descongelamento. Protocolos de criopreservação sêmen de tambaqui já foram desenvolvidos utilizando palhetas de 0,5mL no envase, no entanto, o elevado volume de sêmen produzido e alta fecundidade da espécie sugere o armazenamento em recipientes de maior volume para a aplicação na produção em larga escala. Com isso, o objetivo do presente estudo foi estabelecer um protocolo de criopreservação seminal do tambaqui em macropalhetas de 4,0mL, a partir da definição de um meio diluidor, tempo de equilíbrio e a melhor relação entre temperatura e o tempo de descongelamento do sêmen. O sêmen coletado foi diluído, envasado em macropalhetas, congelado em vapor de nitrogênio líquido no botijão dryshipper e armazenadas em botijão criogênico a -196°C. No primeiro experimento, foram testadas diferentes composições do meio diluidor (M1 - 5% de metilglicol; M2 - 5% de metilglicol + 5% de gema de ovo; M3 - 10% de metilglicol; M4 - 10% de metilglicol + 5% de gema de ovo; M5 - 15% de metilglicol; M6 - 15% de metilglicol + 5% de gema de ovo) e três tempos de equilíbrio (4, 20 e 40 minutos). No segundo experimento, foram avaliadas diferentes velocidades de descongelamento do sêmen em banho-maria, sobre a qualidade espermática (30ºC por 50s - T1; 30ºC por 80s - T2; 60ºC por 25s - T3 e 60ºC por 40s - T4). Ao final do estudo concluiu-se, que o protocolo ideal para a criopreservação do sêmen do tambaqui em macropalhetas de 4,0mL consiste na diluição do sêmen na proporção de 1:9 (v:v) em um meio composto por 5% de metilglicol e 5% de gema de ovo, os quais devem permanecer em contato por 4 minutos até que sejam submetidos ao processo de congelamento em botijão dry-shipper. O descongelamento das amostras deve ser realizado em banho-maria a 60°C por 25s.

Cryopreservation of fish semen is a key to optimization of reproductive management, the formation of germplasm bank and the development of genetic improvement programs. The success of this technique depends on the management and balance of several factors such as the collection, dilution, packaging, freezing and thawing. Tambaqui semen cryopreservation protocols have been developed using 0.5 mL straws on packaging. However, the high volumes of semen produced and the elevated taxes of fecundity are presented by this specie, it is necessary to use larger volume storage containers for application to large-scale production. The objective of this study was to establish a tambaqui semen cryopreservation protocol in large straw 4,0mL, from the definition of cryosolution, equilibration time and the best ratio between temperature and time semen thawing. The semen collected was diluted, packaged in large straws, frozen in liquid nitrogen which was conditioned in dry-shipper and stored in cryogenic cylinder at -196 °C. In the first experiment, different cryosolutions (M1 - 5% 5% methylglycol; M2 - 5% 5% methylglycol+ 5% egg yolk; M3 - 10% 5% methylglycol; M4 - 10% 5% methylglycol + 5% egg yolk; M5 - 15% 5% methylglycol; M6 - 15% de 5% methylglycol + 5% egg yolk) and three equilibration times (4, 20 and 40 minutes) were tested. In the second experiment, different relation between temperature and time thawing on sperm quality (30ºC for 50s T1; 30ºC for 80s - T2; 60ºC for 25s - T3 e 60ºC for 40s - T4) were evaluated. In conclusion, this study showed that the ideal protocol for cryopreservation of tambaqui semen in large straw 4,0mL is made by diluting semen at a ratio of 1: 9 (v: v) in a medium composed of 5% methylglycol and 5% egg yolk. Both of them must have remained in contact with each other for 4 minutes until both were subjected to freezing in dry-shipper. The thawing of samples required to be performed in a water bath at 60 ° C for 25s.

Avaliação do binômio tempo/temperatura de preparações proteicas em uma unidade de alimentação e nutrição

As Unidades de Alimentação e Nutrição (UAN) tem como finalidade administrar a produção de refeições nutricionalmente equilibradas com padrão higiênicossanitário satisfatório, em particular os alimentos de origem animal, por conta de sua complexa composição. O estudo teve como objetivo avaliar o binômio tempo/temperatura do fluxo de produção de pratos proteicos presentes no cardápio de uma UAN. A pesquisa foi realizada de forma descritiva observacional, transversal, com coleta de dados primários em uma UAN de uma empresa multinacional do segmento de vidros. O acompanhamento do tempo e as medições de temperatura das preparações foram realizados durante as etapas de produção. Constataram-se temperaturas inadequadas no recebimento em 60% das carnes. Na etapa de descongelamento foi observado que 20% das carnes encontrava-se com temperatura acima do estabelecido, porém todas que foram mantidas refrigeradas após descongelamento apresentaram temperaturas inadequadas. No pré-preparo 40% das carnes foram manipuladas por um período superior ao recomendado pela legislação vigente. Na etapa de cocção, ao considerar a faixa de tempo/temperatura estabelecida, verificou-se que 100% das amostras estavam de acordo com a determinação. Durante a distribuição, 20% das carnes apresentaram temperaturas inadequadas. A somatória das inadequações representa um alto risco de contaminação e consequentemente interfere na segurança dos alimentos. Dessa forma foi proposto como medidas de melhoria um controle mais rigoroso por parte dos funcionários que realizam as etapas de preparo dos alimentos proteicos e o menor porcionamento da carne a ser manipulada no pré-preparo.(AU)

Units of Food and Nutrition (UFN) aims to manage the production of nutritionally balanced meals with standard hygienic and sanitary satisfactory. It particularl the animal origin meats, because of its complex composition. The study aimed to evaluate the binomial time / temperature of the flow of production of food protein present in the menu of a UFN. The survey was conducted in a descriptive, observational, and cross-sectional primary data collection in a UFN in a multinational company in the segment of glasses. The monitoring time and temperature measurements were made during the preparation stages of production. Inadequate temperatures were verified in the reception in 60% of the meats. In the defrosting step it was observed that 20% of the meats were with temperature above the established, however all that were maintained refrigerated after defrosting they presented inadequate temperatures. In the pre preparation 40% of the meats were manipulated by a period greater than recommended by law. In step of cooking, when considering the established time and temperature, it was found that 100% of the samples were in accordance with the determination. During the distribution, 20% of the meats presented inadequate temperatures. The amount of mismatches represents a high risk of contamination and therefore interfere in food safety. It was proposed a stricted conduct for the employees to perform step by step on food preparation and the lowest protein portion of the meat during the preparation.(AU)

CRIOPRESERVAÇÃO EM PALHETAS DE FIBROBLASTOS BOVINOS SUBMETIDOS Á PRESSÃO NEGATIVA

LIPOSKI, Diana de Matia. Criopreservação em palhetas de fibroblastos bovinos submetidos à pressão negativa. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal área de concentração: produção animal)- Universidade do Estado de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Lages, 2015. A criopreservação de células somáticas vem se destacando não apenas como aliada na preservação de germoplasma, mas também na manutenção de genótipos utilizados para a indução de pluripotencia, formação de linhagens e clonagem por transferência nuclear. O estudo dos efeitos do estresse controlado em gametas ou células somáticas tem demonstrado que, além de proporcionar maior sobrevivência em condições experimentais, outros parâmetros podem ser influenciados, como por exemplo, o padrão de crescimento em cultivo. Para isto, fibroblastos bovinos de primeira passagem, obtidos por procedimento padrão de explantação de cartilagem, foram distribuídos uniformemente em quatro grupos experimentais conforme descrito a seguir: Fibroblastos em cultivo foram submetidos por 4 minutos à pressão negativa de 200, 500 e 800 mbar, imediatamente (PN0h) ou 3horas antes (PN3h) do congelamento, realizado em solução padrão (10% DMSO em D-MEM). Após a tripsinização, as células eram envasadas em uma concentração de 1 x 106 células/mL, em palhetas de 0,25 mL, num volume total de 200 L. As palhetas eram seladas e estabilizadas em geladeira (5-7 C) por 30 minutos, expostas ao vapor de nitrogênio (4 cm acima da superfície) por 5 minutos, e então mergulhadas no mesmo. O descongelamento era realizado em banho-maria a 36 °C por 20 segundos. Fibroblastos não submetidos à pressão foram utilizados como controles congelado (CC) e fresco (FC). Foram avaliados a viabilidade pós-congelamento, e posteriormente o índice de replicação, baseado no tempo de duplicação da população (PDT) celular, com intervalos de 24h e duração de 8 dias. A cada avaliação, um poço de cada grupo era tripsinizado sendo o número de células viáveis determinado em câmara hemocitométrica, após a coloração com Azul de Trypan. O PDT foi determinado utilizando-se o algoritmo disponível online (http://www.doubling-time.com): TD = t x lg2/(lgNt lgN0). Os dados foram submetidos à ANOVA e teste T Student, com 5% de significância. A sobrevivência celular média dos grupos controle (89,8%) e PN500 0h (88,1%) foram superiores aos outros grupos. O tempo médio de PDT de todas as células congeladas foi 33,2h; o tempo de PDT foi semelhante nos grupos fresco (27,5 ± 0,35 h), controle congelado (30,1 ± 2,3 h) e PN500 0h (32,4 ± 1,6 h), o menor tempo foi observado no grupo PN800 0h (21,9 h). As palhetas plásticas se mostraram adequadas para o congelamento de fibroblastos bovinos, não sendo observados efeitos negativos da submissão à pressão negativa imediatamente antes do congelamento, sendo os valores de 200 e 500 mbar os que possibilitaram as melhores taxas de crescimento. Muito embora o emprego de pressão negativa não tenha aumentado a criotolerância de fibroblastos bovinos, determinou mudanças no comportamento destas células durante o cultivo pós-descongelamento. Novas avaliações devem ser realizadas para avaliar a qualidade das células submetidas à pressão negativa, no desenvolvimento de clones animais.

LIPOSKI, Diana Matia. Thesis (Master in Animal Science - area animal production) Universidade do estado de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Lages, 2015. The cryopreservation of somatic cells has been highlighted not only in the preservation of germplasm, but also in the maintenance of genotypes used for the induction of pluripotency, development of strains and cloning by nuclear transfer. The study of the effects of controlled stress in somatic cells or gametes have shown that, in addition to providing increased survival under experimental conditions, it may influence other parameters like the growth pattern in culture. Bovine fibroblasts obtained by standard procedure from a cartilage explant were evenly distributed in four experimental groups as described below: fibroblasts in culture were subjected for 4 minutes to negative pressure 200, 500 and 800 mbar, immediately (PN0h) or 3 hours before (PN3h) freezing, performed in a standard solution (10% DMSO in D-MEM). After trypsinization, the cells were loaded in 0.25 mL straws in a concentration of 1 x 106 cells / mL, and total volume of 200 L. The straws were sealed and stabilized in a refrigerator (5-7 °C) for 30 minutes, and then exposed to nitrogen vapor (4 cm above the surface) for 5 minutes when were dipped therein. Thawing was performed in a water bath at 36 °C for 20 seconds. Fibroblasts not subjected to pressure were used as frozen (CC) and fresh (FC) controls. There was evaluated the post-thaw viability and subsequently the cell replication index, based on the population doubling time (PDT) performed each 24 h intervals, during 8 days. At each evaluation, the cells of one well of each group were trypsinized and the number of viable cells determined by hemocytometric chamber after staining with Trypan Blue. PDT was determined using the algorithm available online (http://www.doubling-time.com): TD = t x lg2/(lgNt lgN0). Data were submitted to ANOVA and T student test, with 5% significance level. The average cell survival of control group (89.8%) and PN500 0h (88.1%) were higher than all other groups. The PDT average time of all frozen cells was 33.2 h. The PDT time was similar in fresh (27.5 ± 0.35 h), frozen control (30.1 ± 2.3 h) and PN500 0h (32.4 ± 1.6 h) groups. The lowest PDT time was observed in the PN800 0h (21,9h) group. The freezing in plastic straws with 10% DMSO was adequate to cryopreserve bovine fibroblasts allowing high survival rates. It was not observed negative effects of submission to the negative pressure just before freezing, and the level of 200 and 500 mbar resulted in growth rates similar to the obtained with fresh fibroblasts. Although the negative pressure has not increased cryotolerance in bovine fibroblasts, it determined changes in the behavior of these cells during the post-thaw culture. New evaluations should be performed to assess cells subjected to negative pressure in the development of animal clones.

MEMBRANA PLASMÁTICA: CRIOPRESERVAÇÃO E CAPACITAÇÃO DE ESPERMATOZÓIDES EQUINOS

Esta tese compreende quatro capítulos. Todos os estudos aqui relatados foram executados na Colorado State University (CSU), em Fort Collins-CO/USA. Foram utilizados sêmen de seis garanhões com idade entre 15 e 21 anos, das raças Puro-Sangue Inglês, Quarto de Milha e Árabe; estabulados no Laboratório de Reprodução Equina da CSU. Capítulo 1: dividido em três experimentos. Experimento 1: objetivou-se avaliar efeito do tratamento com 2 mg de ciclodextrina carregada com colesterol e estigmastanol (CCC , CCE); 1, 2 e 3 mg de ciclodextrina carregada com óleo de salmão (S1, S2 e S3) e com óleo de semente de linho (L1, L2 e L3) nas motilidades total (MT) e progressiva (MP) dos espermatozóides após descongelamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos (p>0,05). Experimento 2: objetivou-se avaliar MT e MP do sêmen tratado com diferentes fontes de lipídeos sonicados em meio Whittens Modificado (MW), após congelamento convencional e congelamento precedido por choque pelo frio; e avaliar efeito do tratamento com 2 mg de CCC e CCE sobre motilidades após choque pelo frio. Os tratamentos usando lipídeos foram: 3 e 6 mg de óleo de salmão (S3 e S6), de óleo de semente de linho (L3 e L6), de gema de ovo de galinha (G3 e G6), de óleo fígado de bacalhau (B3 e B6) e de óleo de açafrão (A3 e A6). Nenhum dos tratamentos utilizando lipídeos melhorou motilidade após congelamento convencional (p>0,05). Para o sêmen submetido a 0 ºC por 30 minutos, os tratamentos G6, CCC e CCE melhoraram MT e MP (p<0,05). Experimento 3: utilizou-se cromatografia gasosa para avaliar eficiência dos tratamentos em alterar o perfil de ácidos graxos da membrana espermática. Os tratamentos foram: 6 g de óleo de semente de linho diluído em etanol (L1); 2 mg de ciclodextrina carregada com óleo de semente de linho (L2) e 6 mg de óleo de semente de linho sonicado em MW (L3). Nenhum dos tratamentos foi capaz de alterar o perfil de ácidos graxos da membrana espermática (p>0,05). Capítulo 2:objetivou-se mensurar quantidade de colesterol e estabelecer a relação colesterol:fosfolipídeos na membrana plasmática de células espermáticas tratadas com diferentes quantidades de CCC (0, 2, 4, 6 e 8 mg). Foram utilizados kit comercial (Cholesterol Liquicolor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA) para mensuração do colesterol e ensaio de ferrotiocianato de amônio para mensuração dos fosfolipídeos totais. A quantidade de colesterol encontrada nas células tratadas com 0, 2, 4, 6 e 8 mg de CCC foram respectivamente 0,22; 0,58; 0,77; 0,91 e 1,07 g/106 de espermatozóides, e a relação colesterol:fosfolipídeos para os mesmos tratamentos foram 0,39; 0,72; 1,0; 1,16 e 1,36. A quantidade de colesterol na membrana foi maior a partir do uso de 2 mg de CCC (p<0,05), e a relação colesterol:fosfolipídeos a partir do tratamento com 4 mg de CCC (p<0,05). Capítulo 3: neste estudo o objetivo foi avaliar o comportamento do sêmen sem tratamento (CT) ou tratado com 20% de plasma seminal (PS) e 40 M de PC-12 (PC) em eventos ligados à capacitação espermática durante incubação por 30 minutos (avaliações foram feitas no tempo 0 T0, 5 T5, 15 T15 e 30 minutos T30). Para isso cada um dos tratamentos foi submetido a quatro diferentes corantes: 1- CoroNa Green, que quantifica sódio intracelular (CG); 2- Fluo-3, que quantifica cálcio intracelular (Fluo); 3- FITC-PNA, que quantifica reação acrossômica (FP) e 4- Merocianina, que caracteriza fluidez/desorganização da membrana plasmática (Mero). Yo-Pro-1 ou iodeto de propídeo foram utilizados para avaliar integridade de membrana plasmática. As amostras foram lidas em citometria de fluxo. O tratamento com PC-12 aumentou o percentual de células com acrossoma reagido, detectada na avaliação aos 30 minutos. Este percentual, de 33%, foi maior que o dos demais tratamentos no mesmo tempo (CT: 13% e PS: 4%) e superior aos percentuais para o próprio PC-12 nos tempos 0 (7%), 5 (9%) e 15 minutos (16%). Com relação à fluidez da membrana plasmática não houve diferença no percentual de células com merocianina elevada entre os diferentes tratamentos, nem entre um mesmo tratamento ao longo do tempo (p>0,05). O estudo revelou efluxo de sódio das células espermáticas equinas viáveis após 15 minutos de incubação, sendo que nos tempos 15 e 30 minutos o percentual de celulas positivas para CG foram menores para tratamento com plasma seminal (8,8 e 4,8%) e maiores para tratamento com PC-12 (36 e 15,4%), em relação ao controle (23,6 e 11,8%, p<0,05). Após 15 minutos de incubação o sêmen dos três tratamentos apresentou percentual de células positivas para Fluo superior ao tempo 0, porém o plasma seminal retardou a entrada deste íon nas células, visto que, no T15 percentual de células Fluo+ foi menor que nos outros tratamentos (CT: 87%; PS: 59% e PC: 95%, p<0,05), voltando a se igualar no tempo 30 minutos (CT: 98%%; PS: 85% e PC: 97%, p>0,05). O meio MW utilizado foi capaz de induzir efluxo de sódio e influxo de cálcio, alterações que caracterizam capacitação espermática. Capítulo 4: os objetivos aqui foram avaliar eficiência de diluidores a base de gema de ovo (Lactose-EDTA) ou gema de ovo associada a leite em pó (FR5 modificado FR5M) e eficiência do glicerol (GLI) ou da combinação deste com metilformamida (MF) em manter MT e MP dos espermatozóides após congelamento usando diferentes protocolos (0: congelamento sem resfriamento; 20: resfriamento em palhetas por 20 minutos a 5 ºC antes do congelamento; 120T: resfriamento do sêmen em tubos por 120 minutos a 5 ºC; 120P: resfriamento do sêmen em palhetas por 120 minutos a 5 ºC). O FR5M preservou melhor a MP de células espermáticas em todos os protocolos de congelamento utilizados, mostrando benefício da combinação da gema de ovo com leite em pó no diluente de congelamento (15%, 21%, 26% e 25% para 0, 20, 120T e 120P, respectivamente, vs. 9%, 14%, 19% e 17%, para lactose-EDTA, p<0,05). A utilização de Lactose-EDTA 5%GLI apresentou resultados superiores para MT e MP se comparado ao mesmo diluidor com 3%MF + 2%GLI, o que mostra que o glicerol é um crioprotetor que pode ser utilizado em diferentes protocolos de congelamento (MT para Lactose-EDTA 5%GLI = 33%, 45%, 56% e 53% para 0, 20, 120T e 120P vs. 20%, 30% 35% e 36% para Lactose-EDTA 3%MF+ 2%GLI, p<0,05; MP para Lactose-EDTA 5%GLI = 19% e 17% para 120T e 120P vs. 11% e 10% para Lactose-EDTA 3%MF+ 2%GLI, p<0,05). O resfriamento do sêmen antes do congelamento pode ser realizado tanto em tubos quanto em palhetas de 0,5 mL, sem prejuízos às motilidades total e progressiva do sêmen após congelamento.

This thesis is compounded by four chapters. All work reported here were performed at Colorado State University (CSU), located in Fort Collins, CO / USA. Six stallions between 15 and 21 years old (Thoroughbred, Quarter Horse and Arabian breeds) and stabled at Equine Reproduction Laboratory at CSU were used in all experiments. Chapter 1: comprised by three experiments. Experiment 1: aimed to evaluate the effects on total motility (TM) and progressive motility (PM) after semen thawing from treatments with 2 mg of cyclodextrin-loaded-cholesterol and 2 mg of cyclodextrin-loaded-stigmastanol (CLC, CLS); 1, 2 and 3 mg of cyclodextrin-loaded-salmon oil (S1, S2 and S3); and 1, 2 and 3 mg of cyclodextrin-loaded-flax seed oil (F1, F2, and F3). No differences among treatments were detected (p>0.05). Experiment 2: aimed to evaluate TM and PM of semen treated with different sonicated lipids into Modified Whittens Medium (MW), after conventional freezing and freezing preceded by cold shock, and assess the effect of treatment with 2 mg of CLC and CLS on motility after cold shock. Treatments using lipids were: 3 and 6 mg of salmon oil (S3 and S6); 3 and 6 mg of flax seed oil (F3, F6); 3 and 6 mg of egg yolk (E3 and E6); 3 and 6 mg of cod liver oil (C3 and C6), 3 and 6 mg of safflower oil (SF3 and SF6). None of the lipid treatments improved motility after conventional freezing (p>0.05). For semen subjected to 0 °C for 30 minutes, TM and PM increased in semen treated with E6, CLC and CLS (p<0.05). Experiment 3: gas chromatography was used to evaluate effectiveness of treatments in altering the sperm membrane fatty acid profile. The treatments were: 6 g of flax seed oil diluted with ethanol (F1); 2 mg of cyclodextrin-loaded- flax seed oil (F2) and 6 mg of flax seed oil sonicated in MW (F3). None of the treatments was able to change fatty acid profile in the sperm membrane (p>0.05). Chapter 2: aimed to measure the amount of cholesterol and to establish the cholesterol:phospholipids ratio in plasma membrane of fresh equine sperm cells treated with different amounts of CLC (0, 2, 4, 6 and 8 mg). A commercial kit was used to measure cholesterol (Cholesterol Liquicolor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA) and an ammonium ferrothiocyanate assay for total phospholipids measurement. Amount of cholesterol found for cells treated with 0, 2, 4, 6 and 8 mg CLC were, respectively, 0.22; 0.58; 0.77; 0.91 and 1.07 micrograms/106 sperm, and cholesterol:phospholipids ratios to the same treatments were 0.39; 0.72; 1.0; 1.16 and 1.36, respectively. Increase in cholesterol amount was observed when 2 mg of CLC was used (p<0.05), and cholesterol:phospholipids ratio was higher with 4 mg of CLC (p<0.05). Chapter 3: in this study the objective was to evaluate the response of fresh equine semen without treatment (CT) or treated with 20% of seminal plasma (SP) and 40 M PC-12 (PC) in events related to sperm capacitation during incubation for 30 minutes (evaluations made at time 0 - T0, 5 - T5, 15 T15 and 30 minutes - T30). Each treatment was subjected to four different dyes: 1- CoroNa Green, which measures intracellular sodium (CG); 2- Fluo-3, which measures intracellular calcium (Fluo); 3- FITC-PNA, which measures acrosome reaction (FP) and 4- Merocyanine, which characterizes plasma membrane fluidity/destabilization (Mero). Yo-Pro-1 or propidium iodide were used to assess cell membrane integrity. Samples were read in flow cytometry. An increased percentage of cells with reacted acrosome was observed in semen treated with PC-12 at T30. This proportion (33%) was higher than the other treatments at the same time (CT: 13% and SP: 4%) and higher than the proportion for PC-12 at T0 (7%), T5 (9%) and T15 (16%). There was no difference in the percentage of cells with high merocyanine between different treatments or between the same treatment over time (p>0.05). The study showed sodium efflux after 15 minutes incubation, and at times 15 and 30 minutes the percentage of positive cells for GC were lower in SP treatment (8.8 and 4.8%) and higher for PC-12 (36 and 15.4%) compared to the CT (23.6 and 11.8%, p <0.05). At T15 the semen of all treatments showed higher proportion of Fluo positive cells than T0, but seminal plasma delayed entry of the ion into the cells, since at T15 Fluo proportion of positive cells was lower than the other treatments (CT: 87%; SP: 59% and PC: 95%, p<0.05) and became similar at T30 (CT = 98%, SP= 85% and PC=97%, p> 0.05). The semen extender used was able to inducing sodium efflux and calcium influx, changes characterizing sperm capacitation. Chapter 4: the objectives were to evaluate efficiency of an egg yolkbased medium (lactose-EDTA) or egg yolk associated with powdered milk (modified FR5 - MFR5), and efficiency of glycerol (GLY) or a combination between GLY and dimethylformamide (MF) to maintain TM and PM sperm after freezing using different protocols (0: no cooling; 20: cooling straws for 20 minutes at 5 °C before freezing; 120T: cooling in tubes for 120 minutes at 5 °C; and 120P: cooling in straws for 120 minutes at 5 °C). MFR5 preserved PM in all freezing protocols, showing the benefit of the combination of egg yolk with powdered milk for freezing diluent (15%, 21%, 26% and 25% for 0, 20, 120T and 120P, respectively, vs. 9%, 14%, 19% and 17% for lactose-EDTA, p<0.05). The use of lactose-EDTA 5%GLY showed superior results for TM and PM if compared to the same medium with 3%MF + 2%GLY, indicating that glycerol is a cryoprotectant that can be used in several different freezing protocols (TM for Lactose-EDTA 5%GLY = 33%, 45%, 56% and 53% for 0, 20, 120T and 120P vs. 20% 30% 35% and 36% for LactoseEDTA 3%MF + 2%GLY, p <0.05; MP for Lactose-EDTA 5%GLY = 19% and 17% at 120T and 120P vs. 11% and 10% for Lactose-EDTA 3%MF + 2%GLY, p<0.05). The cooling before freezing can be performed either in tubes as in 0.5 mL straws for 120 minutes, without damage to total and progressive motility of thawed semen.

PRODUÇÃO DE CARNE OVINA EM DIFERENTES SISTEMAS DE ALIMENTAÇÃO

Objetivou-se avaliar a viabilidade técnica da terminação de cordeiros em confinamento com dieta exclusiva de concentrado ou a pasto e o efeito destas dietas nas características da carcaça, qualidade da carne e implicações nas condições de bem-estar dos animais. Foram utilizados cordeiros cruza Texel e Ile de France. A dieta dos animais confinados foi constituída de 77,4% de grão de milho; 20,2% de farelo de soja; 1,4% de calcário calcítico e 1,0% de bicarbonato de sódio. No sistema a pasto, foi utilizada pastagem natural na recria e azevém (Lolium multiflorum Lam.) na terminação. Em relação à viabilidade técnica, o sistema de confinamento foi superior, apresentou maior ganho médio diário, melhores valores de conversão e eficiência alimentar, número menor de dias para chegar ao peso de abate e melhores características de carcaça. A quantidade de bicarbonato de sódio utilizada na dieta do confinamento, não foi suficiente para regular o pH ruminal. Em relação à qualidade da carne, o sistema de alimentação não influenciou o pH final da carcaça, as perdas por descongelamento e cocção, a elasticidade e a cor da carne. A carne produzida em confinamento foi mais macia. Em relação ás características da carne que se relacionam com a saúde do consumidor, a carne ovina produzida a pasto foi superior, uma vez que apresentou 40,8% menos gordura, maior teor de proteína, menor teor de colesterol, maior percentual de ácidos graxos de cadeia longa e muito longa, de ácidos graxos n-3, melhor relação n6:n3 e melhores índices de aterogenicidade e trombogenicidade. Em relação ao comportamento, os animais terminados em confinamento reduziram o tempo de ruminação, aumentaram comportamento estereotipado e apresentaram apetite depravado. Quando avaliados em relação aos parâmetros fisiológicos, após 51 dias de dieta exclusiva de concentrado, os animais do confinamento apresentaram níveis superiores de cortisol sérico em relação aos animais em recria na pastagem natural. O sistema de terminação a pasto apresenta maior percentual de conformidades em relação aos protocolos mundias de bem-estar animal e teoria das cinco liberdades. Os sistemas de alimentação utilizados apresentam viabilidade técnica para terminação de cordeiros em diferentes épocas do ano e influenciam caracteristicas de carcaça, de qualidade da carne e relacionadas ao bem-estar dos animais, originando carnes e carcaças com características diferentes.

The objective was to assess the technical feasibility of finishing lambs fed exclusively concentrate in feedlot or on pasture and the effect of these diets on carcass characteristics, meat quality and implications in terms of the welfare of animals. Lambs, crosses Texel and Ile de France were used. The diet of the confined animals consisted of 77.4% of corn grain; 20.2% of soybean meal; 1.4% of limestone, and 1.0% of sodium bicarbonate. In the pasture finishing system, natural pasture + annual ryegrass were used. Regarding the technical feasibility, the feedlot system was superior, showed greater weight gain, better conversion rates and feeding efficiency, fewer days to reach slaughter weight and better carcass characteristics. The amount of sodium bicarbonate used in the feedlot diet was not sufficient to regulate ruminal pH. Regarding the quality of the meat, the feeding system did not influence the carcass final pH, losses for defrosting and cooking elasticity and meat color. The meat produced in feedlot was more tender. Regarding types of meat characteristics that relate to consumer health, the lamb meat produced on pasture was superior, since it had 40.8% less fat, higher protein content, lower cholesterol content, higher percentage of fatty acids of long and very long chain, n-3 fatty acids, best n6: n3 ratio and best atherogenicity and thrombogenicity rates. As for the behavior, the animals finished in feedlot reduced rumination time, increased stereotyped behavior and showed depraved appetite; when assessed in relation to physiological parameters after 51 days fed exclusive concentrate, animals in feedlot had higher levels of serum cortisol in relation to animals rearing on the natural pasture. The pasture finishing system has a higher percentage of compliance in relation to world protocols of animal walfare and five freedom theory. The feeding systems used have technical feasibility for finishing lambs in different seasons and influence carcass characteristics, meat quality and related to animal welfare, resulting in meat and carcass with different characteristics.

VITRIFICAÇÃO DE MÓRULAS COMPACTAS Mus musculus: EFEITO DO TEMPO DE EQUILÍBRIO E DO PRÉ-RESFRIAMENTO DA SOLUÇÃO DE VITRIFICAÇÃO.

To test in vitro and in vivo the effects of the length of equilibration time and precooling of the vitrification solution, 715 mouse morulae, from strain CF1 Swiss Albino, were cryopreserved by vitrification in 2 Experiments. In Experiment I (n=417) morulae were vitrified in 4 treatments, using 2 equilibration times (5 and 10 min) in the intracellular vitrification solution (VSa) composed of 10% glycerol + 20% 1,2 propanediol and 2 temperatures (4 and 20° C) in the extracellular vitrification solution (VSb) composed of 25% glycerol + 25% 1,2 propanediol. The statistical analysis did not show significative differences among the 4 treatments after thawing and culture in vitro whitin 15 minutes (TI =97%; TII =92%; TIII=92,8%; TIV=94%), 24 hours (TI =90,2%; TII =84%; TIII=83,5%; TIV=89,2%) and 48 hours (TI =79,4%; TII =75%; TIII=73,2%; TIV=77,4%). In Experiment II, 298 Mus musculus morulae were vitrified in 2 treatments. In TI embryos were equilibrated for 5 min in VSa and placed in straws containing the VSb at 20°C. In TII embryos were equilibrated for 10 min in VSa and placed in straws containing the VSb at 4°C. Considering only the pregnant recipients, the implantation rate was 54,2%(TI), 52,7%(TII) and 56,1% (controls), not differing among treatments, although the fetal development rate obtained with TII (45,9%) was significantly higher than TI (30,5%). Data indicate that the lenght of equilibration time and precooling of vitrification solution affected the postthaw in vivo survival of vitrified Mus musculus morulae.

Setecentas e quinze mórulas compactas de Mus musculus da cepa Suíço Albina foram vitrificadas, em dois experimentos, para avaliar, in vitro e in vivo, o efeito do tempo de equilíbrio e do pré-resfriamento da solução de vitrificação na sobrevivência após descongelamento. No experimento I (n =417) as mórulas foram vitrificadas em 4 tratamentos utilizando-se dois tempos de equilíbrio (5 e 10 minutos) na solução de vitrificação intracelular composta por 10% de glicerol + 20% de 1,2 propanediol (SVa) e duas temperaturas (4 e 20° C) na solução de vitrificação extracelular composta por 25% de glicerol + 25% de 1,2 propanediol (SVb). A análise estatística não demonstrou diferenças significativas entre os 4 tratamentos, após o descongelamento e cultivo in vitro aos 15 minutos (TI=97%; TII =92%; TIII=92,8%; TIV=94%), 24 horas (TI =90,2%; TII =84%; TIII =83,5%; TIV=89,2%) e 48 horas (TI =79,4%; TII =75%; TIII =73,2% e TIV=77,4%). No experimento II, 298 mórulas foram vitrificadas em 2 tratamentos. No TI foram utilizados 5 minutos de equilíbrio na SVa e SVb a 20°C e no TII 10 minutos na SVa e SVb a 4° C. Considerando apenas as receptoras prenhes, o índice de implantações foi de 54,2% (TI), 52,7% (TII) e 56,1% (frescos), não diferindo entre os tratamentos. Porém o índice de fetos obtido com o TII (45,9%) foi significativamente maior do que o índice obtido com TI (30,5%). A duração do tempo de equilíbrio e o pré-resfriamento da solução de vitrificação influenciaram o desenvolvimento in vivo das mórulas vitrificadas.

VITRIFICAÇÃO DE MÓRULAS COMPACTAS Mus musculus: EFEITO DO TEMPO DE EQUILÍBRIO E DO PRÉ-RESFRIAMENTO DA SOLUÇÃO DE VITRIFICAÇÃO

To test in vitro and in vivo the effects of the length of equilibration time and precooling of the vitrification solution, 715 mouse morulae, from strain CF1 Swiss Albino, were cryopreserved by vitrification in 2 Experiments. In Experiment I (n=417) morulae were vitrified in 4 treatments, using 2 equilibration times (5 and 10 min) in the intracellular vitrification solution (VSa) composed of 10% glycerol + 20% 1,2 propanediol and 2 temperatures (4 and 20° C) in the extracellular vitrification solution (VSb) composed of 25% glycerol + 25% 1,2 propanediol. The statistical analysis did not show significative differences among the 4 treatments after thawing and culture in vitro whitin 15 minutes (TI =97%; TII =92%; TIII=92,8%; TIV=94%), 24 hours (TI =90,2%; TII =84%; TIII=83,5%; TIV=89,2%) and 48 hours (TI =79,4%; TII =75%; TIII=73,2%; TIV=77,4%). In Experiment II, 298 Mus musculus morulae were vitrified in 2 treatments. In TI embryos were equilibrated for 5 min in VSa and placed in straws containing the VSb at 20°C. In TII embryos were equilibrated for 10 min in VSa and placed in straws containing the VSb at 4°C. Considering only the pregnant recipients, the implantation rate was 54,2%(TI), 52,7%(TII) and 56,1% (controls), not differing among treatments, although the fetal development rate obtained with TII (45,9%) was significantly higher than TI (30,5%). Data indicate that the lenght of equilibration time and precooling of vitrification solution affected the postthaw in vivo survival of vitrified Mus musculus morulae.

Setecentas e quinze mórulas compactas de Mus musculus da cepa Suíço Albina foram vitrificadas, em dois experimentos, para avaliar, in vitro e in vivo, o efeito do tempo de equilíbrio e do pré-resfriamento da solução de vitrificação na sobrevivência após descongelamento. No experimento I (n =417) as mórulas foram vitrificadas em 4 tratamentos utilizando-se dois tempos de equilíbrio (5 e 10 minutos) na solução de vitrificação intracelular composta por 10% de glicerol + 20% de 1,2 propanediol (SVa) e duas temperaturas (4 e 20° C) na solução de vitrificação extracelular composta por 25% de glicerol + 25% de 1,2 propanediol (SVb). A análise estatística não demonstrou diferenças significativas entre os 4 tratamentos, após o descongelamento e cultivo in vitro aos 15 minutos (TI=97%; TII =92%; TIII=92,8%; TIV=94%), 24 horas (TI =90,2%; TII =84%; TIII =83,5%; TIV=89,2%) e 48 horas (TI =79,4%; TII =75%; TIII =73,2% e TIV=77,4%). No experimento II, 298 mórulas foram vitrificadas em 2 tratamentos. No TI foram utilizados 5 minutos de equilíbrio na SVa e SVb a 20°C e no TII 10 minutos na SVa e SVb a 4° C. Considerando apenas as receptoras prenhes, o índice de implantações foi de 54,2% (TI), 52,7% (TII) e 56,1% (frescos), não diferindo entre os tratamentos. Porém o índice de fetos obtido com o TII (45,9%) foi significativamente maior do que o índice obtido com TI (30,5%). A duração do tempo de equilíbrio e o pré-resfriamento da solução de vitrificação influenciaram o desenvolvimento in vivo das mórulas vitrificadas.

Crioconservação de embriões de tambaqui (Colossoma macropomum)

A criopreservação do material genético de peixes tornou uma ferramenta imprescindível, tanto para conservação de biodiversidade como para produção. No entanto, estocar embriões de peixes em nitrogênio líquido (-196ºC) e conservar por tempo indeterminado ainda não é possível. Recentemente, a evolução nas pesquisas com criopreservação possibilitou estocar embriões a ?8ºC, por até 24 horas. Este fato aponta a possibilidade de criopreservar embriões de peixe, e a biotécnica de resfriamento por curto período já tem aplicações práticas. O presente estudo teve como objetivo avaliar a eficiência de diferentes crioprotetores nos processos da criopreservação (congelação, vitrificação e resfriamento) de embriões de tambaqui (Colossoma macropomum). Embora parte dos objetivos propostos tenha sido alcançados, nos testes de criopreservação, somando ao esclarecimento dos aspectos importantes quanto aos danos causados aos embriões, existem ainda muitas etapas para tornar viável a criopreservação de embriões de peixes. Nos testes, foram identificadas injúrias nos embriões em todas as etapas do processo de congelação, sendo a fase com maior incidência na estabilização em -35ºC e após a submissão em nitrogênio líquido e posterior descongelamento. No momento do ?seeding? (indução a cristalização a -7ºC), além de menor ocorrência de injúrias, maior porcentagem de embriões com córion foram verificados. As curvas de resfriamento nos testes de congelação não evitaram a formação de cristais de gelo, o que inviabilizou a congelação dos embriões de C. macropomum. No experimento de vitrificação, o metanol 20% com dois minutos de exposição pré-imersão ao nitrogênio líquido preservou o córion e algumas estruturas celulares. Embora tenha evitado maiores danos não foi suficiente para evitar a mortalidade dos embriões, o que abre perspectivas para continuidade nos estudos em criopreservação de embriões de peixes. Etilenoglicol, DMSO e glicerol foram tóxicos nas concentrações mais elevadas (20 e 30%), não sendo interessante para a vitrificação dos embriões de C. macropomum. Nos testes de resfriamento a -8ºC, os tratamentos com etilenoglicol, glicerol e DMSO associados à sacarose não resultaram em respostas satisfatórias. Para armazenar embriões de C. macropomum a -8°C, por um período de seis horas, sugere-se soluções crioprotetoras com sacarose 17% associada ao metanol 10%

Congelamento ultra-rápido de embriões bovinos com etilenoglicol associado ou não a trealose / Ultra-rapid freezing of bovine embryos with ethylene glycol with or without trehalose

A criopreservação tem fundamental importância na armazenagem, transporte, controle sanitário e comércio de embriões. O método de congelamento rápido convencional de embriões bovinos ainda apresenta entraves como o tempo de execução e o alto valor comercial do equipamento. Com a finalidade de minimizar tempo de congelamento e os custos, avaliou-se o efeito da trealose no congelamento ultra-rápido de embriões bovinos com etilenoglicol. Noventa e sete (n=97) embriões bovinos produzidos in vivo foram congelados pelo método ultra-rápido com 3,0M de etilenoglicol e 3,0M de etilenoglicol + 0,3M de trealose. Os embriões foram distribuídos aleatóriamente em dois tratamentos. No tratamento 1 (T1) quarenta e seis (n= 46) embriões foram expostos à solução de 3,0M de etilenoglicol em solução de manutenção Emcare(ICP) e cinqüenta e um (n= 51) embriões foram congelados com 3,0M de etilenoglicol associado a 0,3M de trealose em solução de manutenção Emcare. Os embriões foram mantidos na solução de congelamento por 2 minutos, envasados em palhetas de 025cc, expostos ao vapor de nitrogênio por 20 segundos e submersos no nitrogênio líquido. Após o descongelamento, os embriões foram transferidos para receptoras previamente sincronizadas, resultando aos 28 dias, em 7 (15,21%) gestações no T1 e 7 (13,72%) no T2. Não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos. O acréscimo de trealose ao etilenoglicol mostrou-se viável para a transferência direta dos embriões, porém o índice de concepção obtido ainda não permite sua indicação no congelamento comercial de embriões bovinos

Cryopreservation is currently the universal method for embryo storage, transport, sanitary control and trading. The conventional bovine embryo freezing method still has some drawbacks such as the freezing period and costs of the freezing equipment. In order to decrease costs and time, the effect of thealose on ultra-rapid freezing with ethylene glycol was evaluated. Ninety seven in vivo produced bovine embryos were randomly distributed in two treatments for ultra-rápid deep freezing with 3.M ethylene glycol (T1; n= 46) and 3.M ethylene glycol + 0.3M trehalose (T2; n= 51). In T1, embryos were exposed to a 3.0M ethylene glycol in Emcare (ICP) holding media and in T2 to a 3.0M ethylene glycol plus 0.3M trehalose in Emcare holding media. Embryos of both treatments were kept for 2 minutes in the freezing solutions; loaded in 0,25cc straws and there after they were exposed to N2 vapor during 20 seconds to be plunged immediately into liquid nitrogen. After thawing, embryos were transferred to previously synchronized recipients resulting at 28 days in 7 (15.21%) pregnancies in T1 and also 7 (13.72%) in T2. No significant difference was detected between treatments (P>0.05). The trehalose and ethylene glycol solution is suitable for direct transfer of bovine embryos. However, the conception rate obtained in this study do not allow its indication for commercial embryo freezing